（微生物学专业论文）碳源代谢阻遏子bbcre1影响球孢白僵菌生长、产孢和毒力.pdf

中文摘要 碳源代谢阻遏子b b c r e l 影响球孢白僵菌生长、产孢和毒力 微生物学专业硕士研究生蒋小东 指导教师：裴炎教授 张永军研究员 中文摘要 许多昆虫病原真菌具有腐生和寄生两种生活方式。真菌腐生和寄生生活方式的转变受到 碳、氮源等营养因素的调控，其相关基因表达模式也因生活方式的转换发生变化。球孢白僵 菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 是一种重要的害虫生防真菌，研究其生活方式转换的机理，对于了 解其营寄生生活或侵染致病相关的基因表达模式具有重要意义。 c c r ( c a r b o nc a t a b o l i t er e p r e s s i o n ) 是一类功能上保守的真菌碳源代谢阻遏因子，对真菌 的腐生和寄生生活方式转换具有重要影响。而有关c c r 相关基因在球孢白僵菌中尚无相关研 究。为此，本研究从球孢白僵菌中成功克隆了一个碳源代谢阻遏子c c r 同源基因b b c r e l ， 通过s o u t h e r n 杂交及表达特性研究，分析b b c r e l 可能的功能；进一步通过反义r n a 技术和 超量表达b b c r e l 基因，研究该基因在球孢白僵菌中的功能，为揭示球孢白僵菌碳源代谢的 分子机理提供依据。 序列分析表明，b b c r e l 含有一个1 2 6 3b p 的开放阅读框，编码4 2 0 个氨基酸，推测其分子量 为4 6 0k d a ，等电点为9 9 1 。推钡l j b b c r e l 蛋白含有两个典型的c y s 2 h 醯锌指结构域和穿核识别 序列( p n s r r g n k ) ，与金龟子绿僵菌、构巢曲霉、碳色孢腔菌、灰葡萄孢菌和核盘菌的碳 源代谢阻遏子的相似性分别为7 3 、5 1 、4 9 、5 4 和5 4 。 s o u t h e r n 杂交结果表明，b b c r e l 基因在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。利用 r e a l - t i m ep c r 对其表达特性进行了分析，结果表明，b b c r e l 的表达受到葡萄糖的调控，该表 达特性与上游序列存在两个可能的碳源代谢阻遏因子结合位点( c t c c a g 和c c c c g - c ) 相吻 合。由此推测，b b c r e l 基因与球孢白僵菌碳源代谢密切相关。 为进一步探索该基因的功能，本文通过超量表达和反义抑制球孢白僵菌的b b c r e l 基因， 分析了转化子在不同碳源条件下的生长、产孢、水解酶基因的表达以及对毒力的影响。主要 结果如下： 两南大学硕+ 学位论文 1 b b c r e l 基因影响球孢向僵菌对不同碳源的利用。在木糖和乙醇作为唯一碳源的条件 下，反义抑制b b c r e l 的转化子生长速率和产孢量明显高于野生型菌株，而超量表达b b c r e l 的转化子的菌落生长速率和产孢量则明显低于野生菌株；在葡萄糖作为唯一碳源条件下，各 菌株之间差异不显著。 2 球孢白僵菡降解昆虫体壁p r l 类蛋白酶基因的表达受到b b c r e l 的调控。在葡萄糖作 为唯一碳源的条件下，反义抑制b b c r e l 的转化子表达降解昆虫体壁p r l 类蛋白酶的活性明显 升高，而超量表达b b c r e l 的转化子的p r l 类蛋白酶活性明显低于野生菌株。 3 b b c r e l 基因是影响球孢白僵菌毒力的重要因子。生物测定结果表明。反义抑制 b b c r e l 明显提高了球孢自僵菌毒力。而超量表达b b c r e l 的转化子的毒力则显著降低。在1 l o7 个r a l 孢子浓度下，而反义抑制b b c r e l 的转化子对桃蚜的致死中时比野生菌株缩短了 1 0 1 1 小时，而超量表达b b c r e l 的转化子对桃蚜的致死中时比野生型菌株延长了6 - 8 小时。 研究结果表明，b b c r e l 与球孢白僵菌对不同碳源的利用、毒力相关基因表达以及毒力密 切相关。 关键词：球孢白僵菌碳源代谢阻遏因子酶活毒力 i i a b s t r a c t b b c r e l ，ac a r b o nc a t a b o l i t er e p r e s s o r ，i n f l u e n c e st h e g r o w t h ，c o n i d i a ly i e l da n dv i r u l e n c ei nb e a u v e r i ab a s s i a n a c a n d i d a t e ：j i a n gx i a o d o n g a d v i s o r ：p r o f p e iy a n p r o f z h a n gy o n g i u n a b s t r a c t b e a u v e r i ab s i a n ai n f e c t si n s e c tp e s t so f c o m m e r c i a li m p o r t a n c e ，a n dc o n s e q u e n t l yh a sb e e n e x t e n s i v e l ys t u d i e d a sab i o l o g i c a lc o n t r o l a g e n to rm y c o p a r a s i t e l i k em a n yf i m g a l i n s e c t p a t h o g e n s ，置b a s s i a n ai saf a c u l t a t i v e p r o p h y t ew i t hb o t hf r e e - l i v i n g ( s a p r o p h y t i c ) a n di n s e c t p a t h o g e n i cl i f e - s m g t h eg e n ee x p r e s s i o np a t t e r n si nr e s p o n s et ot h ed i f f e r e n tl i f e s t y l e sm a i n l y d e p e n do nc a r b o na n dn i t r o g e n $ o u l c e s t ou n d e r s t a n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fl i f e s t a g e s t r a n s i t , i ti sn e c e s s a r yt oe l u c i d a t et h eg a n ee x p r e s s i o np r o f i l e so f b b a s s i a n ai np a t h o g e n i c i t y c a r b o nc a t a b o l i t er e p r e s s i o n ( c c r ) p l a y si m p o r t a n tr o l e si nt h es h i t ! tb 咖c e np a r a s i t i c a la n d s a p r o p h y t i cl i f e - s t a g e s h o w e v e r , t h em e c h a n i s mo f c c ri nb b a s s mi se s s e n t i a l l yu n k n o w n t o e l u c i d a t et h ef u n c t i o no fc c ri nb b a 3 s a ，b b c r e i ，ah o m o l o go fa s p e r g i l l u an i d u l a m c c r - r d a t a dg e n ec r e a , w a si s o l a t e df r o mt h i sf u n g a lp a t h o g e n b b c r e le n m a i n a da l lo p e nr e a d i n gf r a n l eo f 1 2 6 3b p ，e n c o d i n ga4 2 0 - a np r o t e i nw i t ha c a l c u l a t e dm o l e c u l a rm a s so f4 6 0k d aa n dap lo f9 9 1 l i k eo t h e rf u n g a lc r e ap r o t e i n s ，t h e d e d u c e db b c m lp r o t e i nh a dt w oc 2 h 2z i n cf i n g e rr e g i o n sa n dan u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l t h e b b c r e lp r o t e i ns h a r e di d e n t i t i e so f7 3 ，5 1 ，5 4 ，5 4 a n d4 9 w i t hc r e ap r o t e i n sf r o m m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e , a n i d u l a n s ，b o t r y t 妇c i n e m a , s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u ma n dc o c h b o b o l u s e a r b o n u m ，r e s p e c t i v e l y s o u t h e r na n a l y s i si n d i c a t e dt h a tb b c r e lw a sp r e s e n ta sas i n g l ec o p yi n 且b a s s i a n ag a n o m e t w op u t a t i v ec r e a ( e a r b u n - r e s p o n s er e g u l a t o r ) - b i n d i n gs i t e sw e r ef o u n di nu p s t r e a ms e q u e n c eo f t h i sg e n e c o n s i s t e n t l y , r e a l - t i m ep c rs h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fb b c r e lw a sr e p r e s s e db y g l u c o s e , s u g g e s t i n gt h a tb b c r e lw a si n v o l v e di nc a r b o nm e t a b o l i s mi n 丑b a s s i a n a t h et r a n s f o r m a n t se x p r e s s i n gs a l s ea n da n t i - s e n s eb b c r e li n 丑b a s s i a n aw 鼬u s e dt o i n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n so f t h i sg e n e t h em a i nr e s u l t sa r c f o l l o w i n g s ： 1 b b c r e la f f e c t e dt h eu t i l i z a t i o no fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e si n & b s i m n w i t hg y l o s eo r i i i 两南大学硕十学佛论文 e t h a n o la ss o l ec a r b o ns o u r c e ，c o l o n yg r o w t hr a t ea n dc o n i d i a ly i e i do f a n t i s e n s ot r a n s f o r m a n t s a n t i - e r e - 2 8a n da n t i - c r e 一5 4w e r ea l lh i g h e rt h a nt h a to f t h ew i d e - t y p es t r a i n ；b u tc o l o n yg r o w t h r a t ea n dc o n i d i a ly i e l do f t h eo v e r e x p r e s s i n gt r a n s f o r m a n t so - c r e - 0 1a n do - c r e - 0 7h a dr e d u c e d h o w e v e r , n od i s t i n g u i s h a b l ed i f f e r e n c ei nc o l o n yg r o w t hr a t ea n dc o n i d i a ly i e l dw a sf o u n d a m o n gt h e s et r a n s f o r m a n t se n dw i l d - t y p eb b a s s i c m a 刚t a i mw h e ng l u c o s ew a su s e da ss o l e c a r b o ns o u l r 七 2 b b c r e ls i g n i f i c e n n yi n h a b i t e dt h ee x p r e s s i o no fc u t i c l e - d e g r a d i n gh y d r o l y a s oo f 且b a s s i a n a w i t hg l u c o s ea ss o l ec a r b o ns o r r c o ，t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fp r l l i k ep r o t e a s ew a sr e p r e s s e di n t h e w i l d - t y p es t r a i n ；o n t h ec o n t r a s t , t h el e v e lw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nt h e a n f i s e n s e - b b c r e l 缸 a n s f o r m a n t s 3 b b c r e lw a sr e l a t i v et ot h ev i r u l e n c eo f b , b a s s i a n aa g a i n s tm y z u a p e r s i c a e t h em e d i a nl e t h a l t i m e ( l t 曲o fb ，b a s s i a n aw a ss h o r t e n e d1 0 - 1 1h o u r sb ya n t h g l n ee x p r e s s i n gb b c r e l a n d p r o l o n g e d6 - 8h o u r sb yo v e r c x p r e s s i n gb b c r e lo v e rt h a to f t h ec o n t r o l , w i t ht h ec o n c e n t r a t i o n o fl x l 0 7c o n i d i a m 1 t h er e s u l t si nt h i ss t u d ys u g g e s t e dt h a tb b c r e lg o n ew f l $ i n v o l v e di nc a r b o nc a t a b o f i t ea n d 咖l c ei nb e a u v e r i ab a s s i a n a k e yw o r d s ：b e a u v e r i ab a s s i a n a c a r b o ne a t a b o l i t er e p r e s s o re n z y m a t i ca c t i v i t y v i r a l e n e e i v 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 昆虫病原真菌研究现状 长期以来，由于世界人口剧增，人们一味追求高产农业，在以此为主要目的 传统农业生产过程中，化学农药具有对有害生物高效、速效、操作方便、适应性 广、防治彻底以及经济效益显著等特点，在病虫害综合防治体系中占有重要地位。 但是由于长期的反复使用和滥用，所引起的诸如环境污染、农药残留、食品安全、 害虫的抗性和对天敌昆虫的伤害等问题越来越为突出，还伴随出现了农业生产成 本上升，防治效果下降等消极影响。总之，长期依赖和大量使用有机合成化学农 药，将会给人类的健康和生态平衡等方面带来更多的负面影响，尤其是在进入 w t o 以后我国农业面对日趋激烈的国际竞争，也将对农业经济实现可持续发展 带来许多不利的影响。 因此，为了缓解目前出现的化学农药所带来的“3 w 问题( 即：残留性r e s i d u e ， 抗性r e s i s t a n c e 和再猖獗r e s u r g e n c e ) ，以生物防治为主的害虫综合防治策略正越 来越受到人们的普遍重视。生物防治的研究和应用将迎来前所未有的历史机遇和 技术挑战，产业发展前景十分广阔。 生物农药通常包括微生物农药( 如细菌、病毒和真菌等) 、农用抗生素、植 物源农药、生化农药( 如动物激素、植物生长调节剂等) 、天敌农药( 如天敌昆 虫等) 和转基因农药( 如抗病虫草的转基因植物等) 等几大类。 昆虫病原真菌是自然环境中可以有效控制昆虫种群数量的重要因子之一。同 其它用于生物防治的微生物相比，昆虫病原真菌是唯一能够通过表皮主动侵染昆 虫的微生物类群( l a j e ka n ds t l e g e r , 1 9 9 4 ) ，因而在防治刺吸式口器害虫方面具有 独特的优势。昆虫病原真菌还具有寄主范围广，对人、动植物、天敌昆虫安全， 对环境友好，害虫不易产生抗性等优点，在生物农药研究领域引起了广泛的关注。 目前已显示出良好的应用前景。 利用真菌防治害虫的研究和应用工作一直受到国内外的广泛关注，1 8 9 0 年， 美国堪萨斯州第一次用白僵菌防治麦长蝽，此后在许多国家：如国际生防组织使 用黄绿绿僵菌防治沙漠蝗虫，美国引进舞毒蛾噬虫霉防治舞毒蛾，巴西使用金龟 子绿僵菌防治甘薯沫蝉，我国利用球孢白僵菌在南方地区大面积防治林区松毛虫 和东北地区防治玉米螟等，均取得了显著效果。 昆虫病原真菌的寄主范围广，而且种类繁多。目前已发现杀虫真菌约有1 0 0 多属、8 0 0 多种，涉及到半知菌亚门和子囊菌亚门等。目前研究应用的主要种类 有白僵菌、绿僵菌、拟青霉、莱氏野村菌、汤普森被毛孢、轮枝菌核座壳孢菌等。 白僵菌是目前研究最多、普及面最广和应用最为广泛的昆虫病原真菌之一， 西南大学硕十学何论文 i i i i i 其寄主昆虫种类达1 5 个目1 4 9 科5 2 1 个属7 0 7 个种，还有1 3 种螨类也受到寄生。迄今 为止，世界上相继注册了多个球孢自僵菌分生孢子产品，如：前苏联的 b o v e r i n ”、 捷克的 b o v e r o l ”、美国的 m y c o e i d e ”等。我国的白僵菌生产、使用虽然已有4 0 多 年的历史，在剂型的研究和商业化过程方面也取得了显著成果，但与世界上现有 的水平有一定差距，至今尚未有正式登记注册的产品问世。 目前我国正在致力于开展昆虫病原真菌菌种资源收集、高毒力菌株筛选、生 产与剂型化工艺、杀虫真菌致病机理以及利用基因工程进行毒力菌株改造等方面 的研究工作，以期在昆虫病原真菌的研究与应用方面获得突破。 1 2 昆虫病原真菌致病机理以及水解酶的作用 1 2 1 昆虫病原真菌致病机理 研究昆虫病原真菌的侵染机制，对于筛选高效杀虫菌株以及认识昆虫病 原微生物相互关系均有重要意义。昆虫体壁是昆虫体躯的最外层结构，使表皮硬 化形成特有的外骨骼结构。昆虫体壁由里向外分为底膜、皮细胞层和表皮层。最 外层的表皮层是几层性质很不相同的非细胞组织组成，自外向内还可区分为上表 皮、外表皮和内表皮三层。主要成分有蛋白质、几丁质、脂类以及蜡质等等，其 中以蛋白质为主。其主要作用是保持昆虫的体形和着生体壁肌。除此以外，昆虫 的体壁还具有重要的保护作用，一方面可以防止体内水分的蒸发，以保持体内水 分平衡，另一方面可防止外来物质的侵入，如：防止杀虫剂和菌类物质的侵入， 因此在使用昆虫病原真菌杀虫剂防治害虫时最主要的是要考虑到如何破坏体壁中 的上表皮和外表皮，以增强杀虫的效力。 昆虫病原真菌是唯一一类能够主动侵染寄主的病原微生物，侵染过程大致可 划分为以下几步：分生孢子在目标昆虫体壁附着并开始萌发产生芽管；接受 外界环境的刺激后，在芽管的顶端形成附着胞和侵入钉等侵染结构；凭借机械 压力的作用刺入上表皮，穿透体壁直接进入昆虫的血腔；菌丝在其中酵母状生 长充满虫体体腔，使寄主致死；最后在合适的条件下又从昆虫体壁长出并产生 分生孢子并开始新一轮侵染( c l a r k s o ne t a l 。1 9 9 6 ) 。在整个侵染过程中，昆虫病 原真菌主要是依靠酶解作用和机械压力侵入寄主，感染并致死寄主。在侵入寄主 过程中，它们遭遇到的主要障碍是以蛋白质为主、几丁质和脂类等物质构成的昆 虫体壁。真菌穿透寄主体壁可能通过孢子萌发形成的芽管或侵入钉机械压力的作 用，或是通过酶的降解或某些代谢酸等多种因素的作用而实现。影响侵入过程的 因素较多，但病原真菌分泌的各种胞外酶对体壁的降解被认为是最主要的。 1 2 2 水解酶的作用 2 第一章文献综述 缩短昆虫病原真菌侵染寄主体壁的时间，是提高其对害虫的毒力主要途径之 一。研究昆虫病原真菌的侵染机制，对于筛选高效杀虫菌株以及认识昆虫病 原微生物相互关系均有重要意义。在侵染过程中，昆虫病原真菌主要是通过其特 有的侵染结构产生的机械压力和分泌的一系列水解酶作用于昆虫体壁，最终达到 侵染寄主的目的。昆虫病原真菌在侵染体壁过程中分泌的水解酶，与昆虫体壁成 分相对应，主要分泌蛋白酶、几丁质酶和脂酶等水解酶，这些酶均可以被昆虫体 壁主要成分诱导。昆虫表皮降解酶一旦作用于靶标部位，便逐渐将体壁结构物质 降解而形成病菌进入寄主血腔的通道，对促进真菌穿透昆虫体壁、在血细胞及其 它组织降解与昆虫机体免疫的诱导并引起致病发挥着重要作用，是一类重要的毒 力因子( s t l e g e r e t a l 1 9 9 7 ) 。 在所有的水解酶系中，胞外蛋白酶被认为是昆虫致病过程中的一个重要毒力 因子。这主要是因为：第一，蛋白质是昆虫体壁的主要结构成分，占体壁成分的 7 0 以上，而胞外蛋白酶在降解昆虫体壁过程中起着非常重要的作用；第二，胞 外蛋白酶还能降解寄主体内抗真菌物质，减弱寄主的免疫响应；第三，胞外蛋白 酶还能起到一种毒素的作用，可减弱昆虫血细胞对昆虫病原真菌的吞噬和吸附能 力( 邓米霞等，2 0 0 6 ) 。因此，目前胞外蛋白酶也是研究较多水解酶系之一。 已知的蛋白质降解酶系主要分为内切蛋白酶和外切蛋白酶。其中内切蛋白酶 主要包括胰凝乳蛋白酶( c h y m o e l a s t a 舱，称为p r l ) ，由于其性质与枯草杆菌蛋白 酶相似，因而又称为类枯草杆菌蛋白酶( 彭国雄等，2 0 0 0 ) ，其专一性底物为 s u c - a l a - a l a p r o p h e - n z ：和胰蛋白酶( t w p s i n - l i k e p r o t e a s e ，p r 2 ) ，其专一性底物 为b e n p h e - v a l a r g - n a ( 裴炎等，2 0 0 0 ) 。昆虫病原真菌胰凝乳弹性蛋白酶p r l 是 由真菌孢子在昆虫表皮萌发过程中形成的附着孢产生的一种能迅速降解寄主表皮 蛋白的丝氨酸类蛋白酶( c l a r k s o n e t a l 。1 9 9 6 ) ，对昆虫体壁的结构蛋白具有很强 的降解能力，能够促进真菌的入侵，在整个降解过程中起主要作用，其活力与昆 虫病原真菌的致病力密切相关，在病原真菌降解寄主体壁过程中起主要作用( s t l e g e re la 1 ，1 9 9 4 ；s t l e g c re ta 1 ，1 9 9 6 a ) 。在体外实验中，当在液体培养基中添 加昆虫体壁作为唯一碳源和氮源培养金龟子绿僵菌的时候，p r l 受到昆虫体壁的诱 导( s c r e e nse t a l ，1 9 9 7 ) 。当病原真菌侵入虫体后，p 订还能激活昆虫多酚氧化酶 系，使酚类物质大量被氧化为醌类物质，最终因醌类物质积累过多而导致昆虫自 毒死亡( s t l e g e ra n dr o b e r t s ，1 9 9 7 ) ，因此，p 订活性强弱通常被认为是决定昆虫 病原真菌侵染能力大小的一个主要指标。但是，到目前为止p r l 受特异性诱导的昆 虫体壁中的蛋白质成分还没有被鉴定出来。 s t l e g e r 等( 1 9 9 6 a ) 首先将绿僵菌的p r l 基因导入野生型菌株超量表达，结果 显著提高了菌株毒力。球孢白僵菌对寄主的入侵主要也是通过附着胞的机械压力 3 西南大学硕十学位论文 和水解酶的降解作用共同来实现的。球孢白僵菌是昆虫病原真菌的典型代表，胡 景江和樊美珍( 1 9 9 6 ) 研究表明球孢白僵菌的胞外蛋白酶活力是构成毒力的主要 因素之一。球孢白僵菌的胞外蛋白酶的产生是受一个诱导一抑制调节系统的调控， 这可能也是在侵染寄主的过程中调节昆虫表皮降解速率最有效的方式( 翟锦彬等， 1 9 9 5 ) 。球孢白僵菌的胞外蛋白酶在侵染过程中的作用主要包括表皮降解和血淋巴 中酚原氧化酶的激活。因此，胞外蛋白酶的产量多少与活性高低关系到侵染力， 甚至人们试图将其作为菌株毒力的指标( 胡景江等，1 9 9 6 ；冯明光等，1 9 9 8 ；唐 晓庆等，1 9 9 6 ) 。室内测定也表明，球孢白僵菌胞外蛋白酶活性较高的菌株，松 毛虫死亡率高，而产孢量与菌株毒力之间没有明显相关性( 樊美珍，1 9 9 4 ) 。m i c h a e l 等( 1 9 9 0 ) 在研究丑b a s s i a n a 不同菌株对蚱蜢的毒力时得出了同样的结论。方卫国 ( 2 0 0 3 ) 将p r l 类蛋白酶c d e p 1 基因导入野生型菌株超量表达，也取得了相同的效 果。以上研究结果表明，利用基因工程超量表达类枯草杆菌蛋白酶p r l 类基因，是 提高菌株毒力的有效途径之一。 在对p r l 类蛋白酶的表达研究中发现，其表达主要受生长基质中碳源和氮源 的影响，受到寄主营养的诱导，但受到葡萄糖的抑制。前人研究发现，昆虫病原 真菌中的金龟子绿僵菌的p r l 基因，是编码丝氨酸蛋白酶，这种酶在昆虫体壁存 在的情况下，具有很高的活性，但是其合成受到碳源和氮源的抑制。昆虫体壁经 氯仿、二乙醚处理过的去碳氢化合物、甘油脂、甾醇类的体壁残留物能够诱导p r l 产生，但是氢氧化钾去蛋白的沙漠蝗( s c h i s t o c e r c ag r e g a r r i a ) 体壁残留物却不能 诱导p r l 的产生。在加有丙氨酸的寄主体壁上，金龟子绿僵菌只会形成徒长菌丝， 此时，p r l 的合成及侵染结构形成受到抑制( s t l e g e re ta 1 ，1 9 9 2 ) 。张永军等 ( 2 0 0 0 ) 报道，类枯草杆菌蛋白酶具有被昆虫体壁诱导表达的特性，以蝉蜕和蝇 蛆壳为诱导物，均可诱导总蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶p r l 的高水平表达。同样， 在球孢白僵菌中n a n 0 3 和组氨酸对蛋白酶c d e p 1 的表达没有影响，丙氨酸可以 部分阻遏c d e p 1 的表达，但是c d e p 1 的表达受到葡萄糖的阻遏( 方卫国，2 0 0 3 ) 。 由此可见，蛋白酶受葡萄糖的阻遏，但是受昆虫体壁的诱导。 除蛋白质以外，几丁质也是昆虫体表的重要组成成分，也是昆虫防止机械损 伤和抵御外来微生物入侵的主要屏障之一，因此几丁质酶同样也是影响昆虫病原 真菌致病力的一个重要因子。几丁质酶是一种诱导酶，昆虫病原真菌在以昆虫体 壁作为唯一碳氮源的培养基中在后期表达几丁质酶，这是因为只有在昆虫体壁的 蛋白质被降解后才能露出几丁质，才能诱导几丁质酶的表达。 方卫国等( 2 0 0 5 ) 研究发现，在球孢白僵菌中利用遗传转化方法高效表达几 丁酶基因b b c h i t l 能够显著提高球孢白僵菌的毒力。在孢子浓度为l x l 07 、5 x 1 0 7 个m l 时，几丁酶肋西f f j 基因重组菌株1 4 和1 - 8 的致死中时l t ( m e d i a nl e t h a lt i m e ) 分 4 第一章文献综述 别比野生型菌株缩短了1 9 8 、1 7 5 及1 4 6 、2 1 2 ；在8 4 h r 和9 6 h r 时，它们的 致死中浓度l c 5 0 ( m e d i a nl e t h a l 咖c 即仃嘶0 1 1 ) 也是显著低于野生型菌株。s t l e g e r 等人通过实验发现，在含有几丁质的培养基中，几丁质酶的活性很高，而其他物 质如果胶、木聚糖、纤维素等诱导时，则没有同样的效果( s t l e g e r e t a l ，1 9 9 6 1 0 ) 。 在哈茨木霉( t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m ) 中几丁质酶基因昭珀q 表达也受到葡萄糖 的强烈抑制，但在饥饿条件或含几丁质的真菌细胞壁存在时阻遏作用则会消除 ( m e r e e d e se t a l ，2 0 0 1 ) 。方卫国等人通过研究也发现，克隆得到的球孢白僵菌几 丁质酶基因b b c h t 和肋砌汜的表达也受葡萄糖阻遏( 方卫国，2 0 0 3 ) 。 综上所述，水解酶是昆虫病原真菌侵染寄主过程中的一类重要致病因子，而 水解酶的表达主要受到病原真菌营养条件的影响，编码水解酶的基因主要是受葡 萄糖的抑制，而受寄主体壁营养的诱导。因此，对真菌中碳源代谢阻遏反应的作 用、与其相关基因表达调控的研究，有助于我们进一步研究昆虫病原真菌的致病 原因和阐明昆虫病原真菌的侵染机制的多样性。 1 3 真菌的碳源代谢阻遏作用 1 3 1 碳源代谢 碳源是微生物可利用营养元素中的一种，因为微生物细胞中的许多成分都是 由碳元素构成的，同时碳源又为微生物提供能量，供它们运动和进行各项生命活 动。能被各种微生物利用的碳源种类极其广泛，从简单的无机含碳化合物如二氧 化碳、碳酸盐等比较复杂的有机物( 糖类、醇类、酸类等) ，更为复杂的有机大 分子如蛋白质、核酸等，都能被微生物作为碳源分解利用。 不同营养类型的微生物利用不同的碳源。异养型微生物以有机物作为碳源和 能源，其中糖类是微生物最好的碳源，尤其是葡萄糖，其次是醇类、有机酸类和 脂类等。在糖类利用中，单糖优于双糖，己糖优于戊糖，淀粉优于纤维素，纯多 糖优于杂多糖和其他聚合物。 葡萄糖是大多数生物首选的碳源和能量来源。除了作为一种重要的营养元素 外，葡萄糖还扮演了生长激素的角色，可以调节细胞的生长、代谢以及发育等多 方面。一个真核细胞是如何感应葡萄糖及其信号的出现，这些信号如何影响细胞 的发育过程，还有如何优先利用碳源，这些问题的解决是最基础的，但目前仍所 知甚少。在哺乳动物中，葡萄糖感应、信号传导和代谢的缺陷导致了严重的和普 遍的代谢紊乱，如糖尿病。在病原真菌中，葡萄糖作为一种重要的碳源与致病性 直接相关，因此，研究葡萄糖对其他碳源代谢的阻遏过程具有很重要的意义( s a b 硫 o z e a na n dm a r kj o h n s t o n , 1 9 9 9 ) 。 5 两南大学硕十学位论文 1 3 2 碳源代谢阻遏作用机理 在微生物中，通常在葡萄糖等易代谢碳源存在的条件下，大量基因的转录受 到抑制。这些基因主要是一些用来分解代谢其他碳源所需的水解酶基因，常常在 葡萄糖存在的条件下，在很低的水平表达或是不表达，而这些被抑制利用的碳源 在葡萄糖存在的条件下是不被微生物优先利用的。这一现象即被称为“葡萄糖阻遏 作用”( c a r b o nc a t a b o l i t er e p r e s s i o n , c c r ) 或是“葡萄糖效应”( r o n n eh 。1 9 9 5 ) 。 m o n o d 在研究大肠杆菌对混合碳源利用的实验中，发现培养基中葡萄糖含量 较高时，细菌首先利用葡萄糖，阻遏利用其它碳源的水解酶类的合成( r o n n eh 。 1 9 9 5 ) 。然而，这种葡萄糖阻遏效应并不是由葡萄糖直接引起的，而可能是由葡 萄糖的代谢物引起。现在的研究普遍认为这种阻遏作用是由葡萄糖磷酸化所引起 的。在这个过程中，c a m p ( 环腺苷酸) 是关键控制因子，葡萄糖的磷酸化降低 了其表达水平。c a m p 浓度降低时，影响结合，不能转录。即使有诱导剂存在， 也不能合成分解其它糖的酶，只有葡萄糖消耗完，c a m p 水平上升，才能开始转 录和合成。 前入研究表明，在真菌中同样也存在葡萄糖阻遏作用，但是其机理与细菌完 全不同，真菌中的葡萄糖抑制作用并不受c a m p 表达水平下降的调节。在真菌中， 葡萄糖是能量代谢过程中非常重要的碳源之一，因此，在葡萄糖存在的条件下， 可以抑制一系列相对次要碳源代谢基因的表达。这种调控机制主要是通过引起相 应m i a 浓度的下降，以及其翻译速度的下降，或是蛋白质降解速率的上升而实现 降低水解酶表达水平的。而m r n a 的浓度依赖于相应基因的转录速率和m r n a 的稳 定性。由此可见，葡萄糖对基因的影响主要发生在转录水平上( j u a n a m g a n c e d o 1 9 9 8 ) 。 在碳源丰富的营养条件下，真菌生长旺盛，其中葡萄糖是其首选且优先利用 的碳源。当葡萄糖存在时，真菌利用其他碳源所需的水解酶的合成和表达则受到 抑制，保持在很低的水平，或是根本不表达，从而影响对其他碳源的利用，只有 当葡萄糖被完全利用或是去除后，真菌才能开始利用其他碳源( j u a a am g a n e e d o 1 9 9 8 ) 。也就是说真菌中的碳源代谢阻遏作用通常是在葡萄糖的诱导下可以抑制 部分基因的转录，这些葡萄糖抑制基因常常是代谢其他碳源所必需的( y 6 she t 耐， 2 0 0 4 ) 。 1 3 3 碳源代谢阻遏作用在其它真菌中的研究进展 真菌在生长和发育过程中可以通过多样化的代谢途径利用不同的碳源，而且 具有优先利用葡萄糖等单糖的机制。早期研究表明，在酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 和构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 中都存在一类碳源代谢阻遏调控机 6 第一章文献综述 制，主要是通过碳源代谢阻遏蛋白与一些目的基因的启动子特异序列 5 - s y g g r g 3 ( s o r g ，y = c o r ta n d r = ao r g ) 结合，从而实现抑制目的基因的 转录( l u t f i y y a la n dj o h n s t o n m 。1 9 9 6 ) 。编码这一类阻遏蛋白的基因已经在多种 真菌中克隆得到，如酿酒酵母( sc e r e v i s i a e ) 中的m i g i 基因，构巢曲霉( 彳n i d u l a n s ) 中的c r e d 基因，核盘菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 中的e r e l 基因( v a n t a r de t 甜。 1 9 9 9 ) 和里氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) ( i l m e nme ta 1 ，1 9 9 6 ) 中的c r e l 基因 等等。这一类基因产物，即碳源代谢阻遏蛋白是一类c y s 2 h i s 2 类锌指结构蛋白( h u z 甜a 1 ，1 9 9 5 ) ，它可以与一系列受葡萄糖抑制的基因的启动子区域结合，从而抑 制其表达。在抑制目的基因转录的过程中，需要启动子含有一段富含g c 的特异 序列，一般为( g c ) ( c 厂r ) g g g g 。 酿酒酵母( c e r e v i s i a e ) 中的m i g l 具有两个锌指结构域，第一个锌指区域 具有三个g ( g a ) g 区域，第二个锌指区域具有三个( c 把) ( c 厂r ) g 区域。两 个区域都具有三个特异性氨基酸残基，第一个区域的2 l 位和1 5 位上是精氨酸， 在1 8 位上是组氨酸，而在第二个区域的相同位置上分别是精氨酸和谷氨酸 ( l u n d i nme t a l 1 9 9 4 ) 。在对构巢曲霉( 4 n i d u l a n s ) 的c r e a 基因的核苷酸序 列进行分析发现，其也含有两个c y s 2 h i s 2 类的锌指结构，通过与m i g l ( 酵母中与 碳源代谢抑制相关的蛋白) 序列比对发现，其锌指结构的氨基酸序列与m i g l 具 有8 4 的相似性( d o w z e rc ea n dk e l l yj m ，1 9 9 1 ) 。在对c r e a 的表达特性研究 中发现：在碳源缺陷型的培养基中培养野生型菌株，然后在添加单糖几分钟后发 现，构巢曲霉受到诱导，开始出现一段很强的但是短暂的c r e a 转录物合成的增 强过程，随后由于碳源的抑制效应，c r e a 转录水平开始下降。然而，在相同的实 验条件下，对c r e a 缺失突变株的c r e a 表达特性研究发现，c r e a 的转录并不受 碳源的抑制，而是一直处于较高的表达水平( s t r a u s sj 甜耐，1 9 9 9 ) 。 目前除了在酿酒酵母( c e r e v i s i a e ) 和构巢曲霉( an i d u l a n s ) 中，碳源代 谢阻遏子的研究较为广泛外，在其它多种病原真菌中也有相关报道。植物病原真 菌核盘菌( ss c l e r o t i o r u m ) 中的碳源代谢阻遏基因c r e l ( v a u t a r de t a l ，1 9 9 9 ) ， 编码4 2 9 个氨基酸，与构巢曲霉的c r e a 蛋白具有5 9 的相似性。g & a l d i n e ( 1 9 9 9 ) 等在研究核盘菌( ss c l e r o t i o r u m ) 中c r e l 的表达特性时发现，c r e l 的合成受到 自然界中胞外碳源的调节，c r e l 高水平的表达受到葡萄糖的诱导。v a u t a r d ( 1 9 9 9 ) 等利用核盘菌中的c r e l 对构巢曲霉的c r e a 3 0 缺失突变子进行互补实验，结果表 明c r e i 可以从功能上对构巢曲霉的c r e a 3 0 缺失突变子进行互补。通过对c r e l 的氨基酸序列分析，发现其具有两个c y s 2 h i s 2 锌指结构，与酿酒酵母中的葡萄糖 阻遏子m i g l p 和m i 9 2 p 非常相似。而且，c r e l 蛋白存在一些和m i g l p 相似的活 性基序，但是进行互补实验后发现，c r e i 却不能对酿酒酵母的m i g 缺失突变子在 7 两南大学硕十学位论文 功能上进行互补这也说明葡萄糖阻遏反应途径在酵母和丝状真菌中有很大的差 异。l l m e n m ( 1 9 9 6 ) 等在对里氏木霉( zr e e s e i ) 的碳源代谢阻遏基因c r e l 研究 过程中发现，c r e l 基因编码一个c y s 2 h i s 2 类d n a 结合锌指蛋白，与构巢曲霉中 的c r e a 蛋白具有4 6 的相似性。c r e l 的启动子含有几个序列元件与之前构巢 曲霉中的c l e a 的结合位点相同。在以丰富碳源为培养条件时，里氏木霉( z r e e s e i ) q m 9 4 1 4 的c r e l 的m r n a 水平是不变的，但是当葡萄糖作为唯一碳源时， 其表达水平则会下降。这些结果也充分说明c r e l 的表达受到葡萄糖的抑制，并且 存在自我调控机制。 d e v i t ( 1 9 9 7 ) 和v a u t a r d ( 1 9 9 9 ) 等分别在酿酒酵母和核盘菌中发现，c r e a 类蛋白是通过核内外的穿梭机制行使其功能的，该机制受到葡萄糖的调控。在酿 酒酵母中m i g l p 的亚细胞定位受葡萄糖的调节，在培养基中添加了葡萄糖几分钟 后，m i g l p 蛋自从细胞质穿透核膜进入细胞核，抑制基因的转录；当葡萄糖耗尽 后，m i g l p 则迅速被运输到细胞质中，解除对基因的抑制作用。v a u t a r d 在对核盘 菌的c r e a 蛋白研究中发现，通过将c r e l 和g f p 融合后，转入核盘菌，然后进 行显微观察，根据亚细胞定位实验结果说明：当加入葡萄糖几分钟后，c r e a 蛋白 从细胞质穿透核膜进