（生物化学与分子生物学专业论文）丝光绿蝇幼虫分泌物抗菌肽的纯化.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：幺盟避 签字日期：丑年月丝日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、 使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。 签字日期：咀年月坐日 丝光绿蝇幼虫分泌物抗菌肽的纯化 硕士研究生 指导教师： 指导小组： 专业名称： 孔凡胜 辛毅教授 马郁芳教授 生物化学与分子生物学 摘要 抗菌肽是一种使生物体免受微生物感染、并与免疫相关的多肽。这 些多肽能够抑制细菌感染并且几乎对宿主不产生毒性及过敏反应等副作 用。因此，作为潜在的新型安全抗生物或除虫剂，抗菌肽可以被应用于 医药和农业领域。本文以丝光绿蝇幼虫为研究对象，试图从幼虫中分离 出抗菌肽，为把这些多肽开发成抗菌药物做前期的准备。 本论文从建立丝光绿蝇幼虫活性检测手段入手，研究了影响酶活性 的多种因素，确定了纯化的最佳条件，设计出一套可行的实验方案，对 丝光绿蝇幼虫分泌物抗菌肽进行了纯化，取得了以下结果： 1 比较了抗菌活性成分检测方法，结果证明浊度法最为灵敏。 2 确认了丝光绿蝇分泌物中抑菌成分为蛋白类物质。本文选择了 d e a e s e p h a r o s e 离子交换层析作为初级纯化手段，优化了 d e a e s e p h a r os e 梯度洗脱条件。 3 对系列层析方法进行了优化组合。第一步采用d e a e s e p h a r o s e 离 子交换层析分离，收集活性组分进行第二步s u p e r d e x 7 5 凝胶过滤层析 分离，同时用电泳检测分离纯化的效果。纯化产物经s d s p a g e 银染显 色方法呈单一蛋白质条带。 关键词：抗菌肽丝光绿蝇分泌物 p u r i f i c a t i o no fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d ef r o mt h el a r v a l s e c r e t i o n s0 fl u c i l i as e r i c a t a m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：k o n gf a n s h e n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rx i n y i v i c e s u p e r v i s o r ：m ay u f a n g m a j o r ：b i o c h e m i s t ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y a b s t r a e t a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sa r eag r o u po fi m m u 、n e r e l a t e dp e p t i d e st h a t p r o t e c tt h eh o s tf r o mm i c r o b i a li n f e c t i o n t h e s e p e p t i d e ss u p p r e s sb a c t e r i a l i r i f e c t i o n sb u th a v em i n i m a lt o x i ca n da l l e r g i cs i d ee f f e c t st o t h eh o s t ， t h u s ，a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sm a yp o t e n t i a l l y b e a p p l i e d t o d r u g d e v e l o p m e n ta n da g r i c u l t u r e a sn e wa n ds a f ea n t i b i o t i c so rb i o c o n t r o l a g e n t s i ti sv e r yi m p o r t a n ta n dv a l u a b l e t oi s o l a t ea n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s f r o ml u c i l i as e r i c a t aa n dt od e v e l o pt h e s ep e p t i d e si n t oa n t i b a c t e r i a la g e n t t h eu l t i m a t eg o a lo ft h i sp r o j e c ti st op u r i f ye n z y m ef o rp r o v i d i n g g e n e t i c i n f o r m a t i o nf o rc l o n i n gt h eg e n ec o d i n g f o r t h e p e p t i d eb y m o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e s t h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n sh a v eb e e nd r a w nf r o mt h i se x p e r i m e n t ： 1 a n t i b a c t e r i a la s s a yw a st e s t e da n dc o n f i r m e df o rm e a s u r e m e n to f t u r b i d o m e t r i c ( t b ) a s s a ya st h ed e t e c t i o no fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d ea c t i v i t y 2 t h ea n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c ei nl a r v a ls e c r e t i o n so fl u c i l i as e r i c a t a w a sp r o v e da sp e p t i d e s d e a e s e p h a r o s ei o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw a s u t i l i z e da sp r i m a r ym e t h o da n di t sg r a d i e n te l u t i o nc o n d i t i o nw a so p t i m i z e d 3 ，t oc o m p l e t ep u r i f i c a t i o no ft h ea n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ，as e r i e s o f c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw a sc o m b i n e da sd e a e _ s e p h a r o s ei o ne x c h a n g e f o l l o w e db ys u p e r d e x 7 5g e lf i l t r a t i o n t h ep u r i t yo fp u r i f i e dp e p t i d ew a s c h e c k e db ys d s p a g e ，a n dt h ep e p t i d es h o w e das i n g l eb a n d k e yw o r d s ：a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s l u c i l i as e r i c a t as e c r e t i o n s 2 丝光绿蝇幼虫分泌物抗菌肽的纯化 硕士研究生： 指导教师： 指导小组： 专业名称： 孔凡胜 辛毅教授 马郁芳教授 生物化学与分子生物学 刖瞢 抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ，a m p s ) 有两大类：一类是非核糖体合成 的抗菌肽，是由细菌、真菌和链霉菌等分泌的具有抗菌活性的肽类物质，如 短杆菌肽、多黏菌素和杆菌肽等。它们主要是由细菌产生，并经结构修饰而 获得，这类抗菌肽是在肽合成酶的作用下合成的( s t e i ne ta 1 ，1 9 9 6 ) t 1 1 。另 一类是由核糖体合成的天然抗菌肽，是生物机体在抵御病原微生物的防御 反应过程中所产生的一类抗微生物短肽，是宿主防御病原微生物入侵的重 要分子屏障。这些肽类是由基因编码、宿主细胞产生的一类抗菌分子，是有 机体在进化过程中为适应环境、求得生存而最早产生的免疫活性分子 ( p a p a g i a n n i ，2 0 0 3 ) t 。瑞典科学家b o m a n 等( 1 9 7 2 ) e 列首先从天蚕蛹中发现 抗菌肽，他们以惜古比天蚕h y a l o p h o r ac e e r o p i a 为实验材料，通过注射蜡状 芽孢杆菌b a c i l l u sc e r e u s 诱导产生抗菌肽( 天蚕素c e c r o p i n s ) , 后来又从家 蚕、柞蚕、蓖麻蚕等多种昆虫中分离到抗菌肽( f a y e e ta 1 ，1 9 7 5 ) 4 1 ，从此昆 虫的免疫研究进入了一个崭新的发展时期。该类物质分子量较小，具有对热 稳定、水溶性好、广谱抗菌等特点( 翟朝阳，1 9 9 6 ) t 5 1 ，而且与抗生素的抗菌机 理完全不同，已成为转基因抗病动植物的基因来源和新型抗菌、抗癌药物研 究开发的目标，有着广阔的发展前景i 6 “。目前已经有人在家蝇幼虫的虫体 和蛹i s , 9 中纯化出抗菌肽，并利用基因工程的方法表达了抗菌肽。 目前，蛆清疮术的临床研究【】n 忆】被普遍开展，丝光绿蝇幼虫分泌物 经大连大学整形外科临床研究证实，对于顽固感染获得良好的治疗效果， 本实验建立了一套新的，高灵敏的抗菌肽活性检测方法，首次从丝光绿蝇 ( 1 u c i l i as e r i a t a ) 分泌物中纯化出抗菌肽。 第一章抗菌肽活性检测方法的建立 抗菌肽是一类具有抗菌作用的生物活性短肽，对其活性的检测主要从 其功能上考虑，检测其对细菌的抑制作用。作为一种多肽，其本身的活性 受到温度、p h 、浓度、离子强度等多种外界条件的影响。因此，其活性 的检测比较困难。同时，抗菌肽在分泌物中的浓度较低，并且分泌物中也 有多种其它蛋白类物质或其它营养物质，对细菌的生长有促进作用，所以 在对其活性的检测时就会受到较多因素的干扰。因此有必要建立一种灵敏 的活性检测方法。 l 用浊度法检测丝光绿蝇幼虫分泌物的抑菌活性1 3 l 1 1 1 幼虫 丝光绿蝇三龄幼虫由大连大学附属医院中心实验室提供。 1 1 2 菌种 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌由大连医科大学微生物学教研 室惠赠。 1 1 3 主要试剂 l b 培养基( 美国i n v i t r o g e n g i b c o 公司) ； t s b 培养基( 北京陆桥技术有限责任公司) ： 胰蛋白胨( 美国i n v i t r o g e n g i b c o 公司) ； 氨苄青霉素( a m p ) ( s i g m a 公司) ； 考马斯亮蓝g2 5 0 ( 上海试剂供应站分装) ； 牛血清白蛋白( 华美生物工程公司) ； 其它试剂为国产分析纯试剂。 1 1 4 主要仪器 g l 2 0 a 全自动高速冷冻离心机( 湖南仪器仪表厂离心机厂) ； b i o f u g es t r a t o s 全能型高性能台式冷冻离心机( 德国h e r a o u s 公司) ； 电子分析天平( 上海天平仪器厂) ； 微量加样器( 法国g i l s o n 公司) ； 真空冷冻干燥机( 美国t h e r m o 公司) ； 酶标仪( 美国t h e r m o 公司) ； o 2 2 u m 一次性滤器( 美国p a l l 公司) 。 1 1 5 方法 1 1 5 1 丝光绿蝇幼虫分泌物的收集】 取3 龄幼虫放入牛奶中脱色5 小时，取出幼虫，用无菌水洗净放入无菌 4 水中去奶4 小时( 加入的无菌水量以刚好浸过幼虫虫体为宜) ，用7 5 的酒 精洗3 遍，再用无菌d d h 2 0 洗3 遍，按每1 0 0 条2 m l 加入d d h 2 0 放入2 5 过夜，加入无菌d d h 2 05 南1 洗蛆体，而后用加样枪吸出分泌物放入无菌瓶中。 于4 ，1 2 0 0 0 + g 离心1 0 分钟，用o 2 2 u m 滤菌膜滤菌，滤液放入7 0 冰箱冻 存，将冻存的分泌物进行冷冻干燥，得到的冷冻干燥粉米，加入无菌d d h 2 0 调到蛋白浓度为2 m g m l ，放入4 保存备用。 1 1 5 2 细菌的准备过程 金黄色葡萄球菌在3 7 下培养1 8 小时。取新培养好的金葡菌放入 2 0 m l t s b 液体培养基中3 7 。c ，9 0 转分钟，培养1 7 小时。取培养物1 0 0 u l ， 放入t s b 培养基中3 7 。c ，9 0 转分钟，培养4 小时，用新鲜的t s b 培养基调 到菌的浓度约5 1 05 m l 。 1 1 5 3 浊度法测活性 取分泌物样品2 0 0 u l ，加入2 2 u l1 0 无菌胰蛋白冻，混匀，阴性对照用1 的无菌胰蛋白冻，在混合液中取15 0 u l 加入到9 6 孔板的孔中，再分别加 入上述制备好的菌悬液3 0 u l ，测定其在零时刻时的光密度值。而后放入 3 7 。c 温箱孵育，分别测量其0 ，3 ，6 ，9 ，1 2 ，15 ，1 8 ，2 1 ，2 4 小时后的o d 值， 扣除零时刻的空白，以时间为横坐标，o d 值为纵坐标绘制o d t 曲线。 l ，1 5 4 不同的菌类对于浊度法检测的敏感度 分别取金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌作为检测菌，以浊度 法检测分泌物抑菌效果，方法同上。 i 1 5 5 诱导对与抑菌效果的影响【”】 取丝光绿蝇幼虫放放入4 冰箱中麻醉l 小时，再将其放入有少量 无菌水的培养皿中，用3 号昆虫针刺伤虫体，每针条，后放入培养瓶 中继续培养2 4 小时，收集分泌物。取诱导过的分泌物与未经诱导的分泌 物用1 1 5 4 方法检测其活性。 1 1 5 6 浓度对活性的影响 按照1 1 5 1 方法准备分泌物样品，调至蛋白含量0 8 m g m l ，对其进 行倍比稀释成0 4 m g m l 、o 2 m g m l 、0 ，1 m g m l 用浊度法测其抑菌效果。 2 琼脂平板法测活性2 1 6 1 8 j 1 ，2 1 幼虫 丝光绿蝇三龄幼虫由大连大学附属医院中心实验室提供。 1 2 2 菌种 金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌由大连医科大学微生物教研 室惠赠。 1 2 3 主要试剂 l b 培养基( 美国i n v i t r o g e n g i b c o 公司) ； 水解酪蛋白琼脂培养基( 杭州微生物试剂厂t ) ； 考马斯亮蓝g2 5 0 ( 上海试剂供应站分装) ： 牛血清白蛋白( 华美生物工程公司) ； p m s f ( 上海生工生物工程有限公司) ； 其它试剂为分析纯。 1 2 4 方法 1 2 4 1 样品的准备 1 2 4 1 1 组织匀浆液样品 取丝光绿蝇幼虫7 5 条放入手动匀浆器中按体积比1o o ：l 加入p m s f 推拉匀浆1 0 2 0 次，按体积比1 ：4 加入p h 7 0 的p b s 缓冲液匀浆。取上 层悬浊液分装于离心管中，4 ，1 2 0 0 * g 离心5 分钟，取出一样品管放 入4 冰箱备用，其余1 0 0 煮3 5 分钟，再于4 ，1 2 0 0 转离心5 分钟 取上清，放入4 冰箱备用。 1 2 4 1 2 血淋巴收集 取丝光绿蝇幼虫5 0 0 条用4 冷水反复冲洗8 1 0 次，再用无菌双蒸 水冲洗3 次，滤纸吸干虫体表面水分，剪去头部收集血淋巴于1 5 m l 离 心管中。6 0 0 0 + g 离心2 0 分钟，取上清夜备用。置于一2 0 冰箱保存备用。 1 2 4 1 3 分泌物的收集 取3 龄幼虫放入牛奶中脱色5 小时，取出幼虫，用无菌水洗净放入无菌 水中去奶4 小时( 加入的无菌水量以刚过幼虫虫体为宜) ，用7 5 的酒精洗 3 遍，再用无菌d d h z o 洗3 遍，按每1 0 0 条加入2 m id d h 2 0 ，放入2 5 过夜， 加入5 m l 无菌d d h 2 0 洗蛆体，而后用加样枪吸出分泌物放入无菌瓶中，于 4 ，1 0 0 0 0 * g 离心1 0 分钟取上清，备用。 1 2 4 2 纸片琼脂法抑菌实验 取出冻存于7 0 金黄色葡萄球菌，复苏传代于固体l b 琼脂培养基 上，分出单个菌落。用无菌棉签蘸取2 、3 个菌落在无菌生理盐水中调制 o 5 个麦氏浊度。用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于水解酪蛋白琼脂培养基 表面，将直径7 m m 的无菌纸片帖于培养基表面，取样品加到无菌纸片上 置3 7 培养18 2 4 小时，观察抑菌圈。 1 2 4 3 测定不同取样部位抑菌活性 取组织匀浆液，血淋巴样品按照2 4 2 方法做抑菌实验，其中各样品 含量均为7 u l ，观察抑菌环。 1 2 4 4 不同取样部位浊度法抑菌效果 取组织匀浆、分泌物、血淋巴样品分别做浊度法抑菌效果曲线。 1 2 4 5 培养基对抑菌环形成的影响 分别用l b 琼脂培养基及水解酪蛋白琼脂培养做抑菌实验培养基。 取蛋白含量为2 o m g m l 组织匀浆样品，按2 4 2 方法做抑菌实验，每个 平板贴四张滤纸片，观察抑菌圈大小。 1 2 4 6 考马斯亮蓝测蛋白质含量 取样品液o 5 m l ，加入2 5 m l 考马斯亮蓝染色液，静止5 分钟，经分 光光度计测定5 9 5 n m 处吸光度。将上样量等倍减小，经酶标仪测定5 9 5 n m 处吸光度。以牛血清白蛋白为标准制作标准曲线，计算样品液中的蛋白 含量。 1 1 浊度法活性效果曲线 结果 f i 9 1 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a sd e t e r m i n e du s i n gt h et ba s s a ya g a i n s tsaureu$ 由f i 9 1 可见，分泌物对于金葡菌产生了明显的抑制作用。 1 2 不同取样部位抑菌效果 0 8 0 6 譬0 4 蓦0 2 0 0 2 不同取样部位抑菌效果 时自j ( h r ) ；+ 对照 i 一血淋巴 i 一分泌物 。l ，t 氮织玺浆 3 0 f i 9 2 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fd i f f e r e n ts a m p l i n gp o s i t i o n w a sd e t e r m i n e du s i n gt h et ba s s a ya g a i n s ts a u r e u s 7 由f i g 2 可知血淋巴与分泌物均有明显的抑菌活性，而组织匀浆液抑 菌效果不明显。 1 3 不同菌对于浊度法检测的影响 f i 9 3 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d u s i n gt h et ba s s a ya g a i n s ts a u r e u s 大肠杆菌抑菌教果曲线 枯草杆菌抑葡效果曲线 一对照 | 一分泌物 f i 9 4 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d u s i n gt h et ba s s a ya g a i n s t 口s u b t i l i s f i 9 5 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d u s i n gt h et ba s s a ya g a i n s te c o l i 由f i g ，3 、f i g 4 、f i g 5 可见，分泌物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 最佳，对枯草杆菌次之，对大肠杆菌最差。 1 4 诱导处理对浊度法抑菌效果的影响 浊度法显示，诱导后当蛋白质含量为0 8 1 m g m l 时与未诱导、蛋白质 含量为0 9 2 m g m l 时有相同的抑菌效果。 1 5 分泌物浓度对活性影响 分泌物浓度对活性影响曲线 0 4 名一塔黧l 1 吨2 1 02 03 0 卜0 tl m g m l 乏 ，0mv 一 ， 。 一 誉墨 由f i g 5 可以看出抑菌活性随着分泌物中蛋白含量的降低而降低，蛋 白质含量为o 8 m g m l 、o 4 m g m l 时的分泌物抑菌效果最明显。 1 6 纸片琼脂法抑菌圈分析 左图为不同样品纸片琼脂法所形的抑菌环 图中： l 阴性对照( p b s ) 2 分泌物 3 加热处理过的组织匀浆液 4 未经加热处理过的组织匀浆液 f i 9 7 z o n eo fi n h i b i t i o na s s a y s 从f i g 7 可观察到，样品2 、3 、4 均呈现抑菌环 1 7 培养基对抑菌环形成的影响 t a b l e1 t h ec o m p a r eo fa n t i b a c t e r i a lz o n eb e t w e e nt w oc u l t u r em e d i u m 讨论 从实验结果1 2 可知，在血淋巴和分泌物中均含有抑菌物质，由于血 淋巴本身对光吸收较大，因此测定时会产生较大的系统误差。另外，一些 色素在3 7 随时间会分解，会导致曲线向下凹陷，而非水平直线。实验结 果1 3 表明抑菌物质对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果，枯草杆菌次之， 而对葛兰氏阴性的大肠杆菌效果不明显，因此可用灵敏的金黄色葡萄球菌 作为检测活性的菌种。针刺机械诱导后的分泌物也表现出较高的抑菌活 性，只凭实验结果1 4 还不能判断诱导后的表达是否优于诱导前。由于诱 导的操作过程非常复杂，实验结果不稳定，因此可以省略诱导处理而通过 增加幼虫的数量来增加抑菌物质的总量。从实验结果1 5 可知，在图1 6 可看到明显的抑菌圈，不过在金葡菌受到抑制的同时，固体培养基表面有 杂菌生长，经检测发现，当蛆泌物总蛋白浓度低于0 4 m g m l 时抑菌效果 不明显，而且抑菌圈的出现并不稳定，所以这种方法不适合作为纯化过程 的检测手段。从结果1 7 可知水解酪蛋白培养基要比l b 培养基更容易出 现抑菌圈，其抑菌圈的半径要大于l b 培养基。水解酪蛋白培养扩散性能 好。事实上，医院抗生素敏感实验也是用的这种培养基。从结果中可以看 出，抑菌圈在两种培养基中的出现均不稳定，除与操作误差有关外，还因 为杂菌的分布与生长不均匀。 丝光绿蝇幼虫抗菌物质是一种未知的抑菌物质，其在组织匀浆液、血 淋巴、及分泌物中的含量不同，其所用的分离纯化手段不同，其纯化的着 重点也各异。分泌物中抗菌成分含量非常少，因此，寻找一种灵敏的活性 检测手段便成为纯化过程能否顺利进行的关键。为了确定最佳的活性检测 方法，需要将各种影响活性的因素改变到最佳的状态。纸片琼脂法具有操 作简单、样品用量少、可以测抑菌效价的优点：这种方法对于抗菌物质浓 度及纯度较高且活性在3 7 保存时间长的情况比较适合，但是抑菌物质在 总分泌物中含量很少，且其在3 7 c 时维持的活性的时间不长，所以，琼脂 平板法就暴露了其相对于不纯的生物活性物质的检测灵敏度不高的弱点。 浊度法具有灵敏度高、可动态监测、检测的样品数量多等优点，实验结果 表明是检测抗菌肽抑菌活性的理想方法。 抑菌活性的检测会受到很多因素的影响，需要在无菌的条件下操作， 因为对于灵敏的浊度法而言，少量对抑菌物不敏感的杂菌都可能导致活性 检测的失败，另外检测过程中要尽量减少抑菌物质的颜色。浊度法是以检 测光吸收变化为抑菌效果的衡量指标，抑菌物质的本底光吸收会增加系统 误差。寻求一种对于抑菌物质敏感的菌种，可以增加活性检测的敏感度。 另外，在分离纯化过程中保持低温操作，防止小分子量的抗菌肽被蛋白酶 水解都是我们应该非常注意的问题。 小结 1 采用浊度法作为检测抑菌活性的方法，可有效地检测出抑菌物质的 抑菌活性。 2 分泌物中蛋白质种类相对较少，选择分泌物作为纯化的目标样品可 以简化后续纯化的过程。 3 采用金葡菌作为检测菌，选择t s b 作为金葡菌的培养基。 4 诱导虽然可以增加蛋白的表达，但大幅度增加了工作量，使操作困 难。因此省略诱导过程而直接收集分泌物。 第二章丝光绿蝇分泌物抗菌肽的确定 及纯化方法的比较和选择 丝光绿蝇幼虫分泌物是混合成分，其物质成分复杂，可以利用它们之 间不同的物理和化学性质的不同来进行分离与纯化。资料显示，家蝇幼虫 含有肽类物质，但肽类物质是否为幼虫产生抗菌效果的唯一成分却没有定 论。同样，丝光绿蝇幼虫分泌物中的抗菌成分是否为肽类还不清楚。因此， 本课题在对于幼虫抗菌成分进行纯化之前，必须通过实验确定幼虫分泌物 表现出来的抑菌活性是由肽类物质产生的。如果证明有效成分为蛋白质或 多肽，可利用待分离蛋白质与混合物中其他蛋白质之间在性质上的差异， 设计出一组合理而有效的分步纯化步骤。和纯化有关的蛋白质的性质包 括：蛋白质的大小、形状、电荷、等电点、电荷分布、疏水性、溶解度、 密度、配体结合能力、金属结合能力、可逆性缔合、翻译后修饰、特异性 序列或结构、非寻常性质如不寻常的热稳定性和不寻常的抗蛋白酶解抗 性、基因工程构建的纯化标记等 j9 1 。 2 1 材料 同1 1 i 、1 1 2 2 2 主要试剂 磷酸氢二钠( 北京市红星化工厂) ； 磷酸二氢钠( 北京市红星化工厂) ； d e a e s e p h a r o s et mf a s tf l o w ( d e a e s e p h a r o s e ) ，购自a m e r s h a m p h a r m a c i ab i o t e c h ，s w e d e n 。 2 3 实验仪器 层析拄，大连竞迈生物科技有限公司： l b s 1 0 0 型自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂； j m 2 5 0 小型数显电泳仪，大连竞迈生物科技有限公司； m v i i 型垂直电泳槽，大连捷迈生物科技有限公司； h c t p 型架盘药物天平，北京医用天平厂； a e g 一1 2 0 电子分析天平，日本，岛津公司； 7 9 0 1 型磁力搅拌器，上海华光仪器仪表厂； 4 3 3 0 型p h 计，英国，j e n w a y 公司； g l 8 3 2 型旋涡混合器，江苏其林医用仪器厂。 2 4 方法 2 4 1 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量f 2 0 1 同1 2 4 6 所述。 2 4 2 产物制备 同1 ，1 5 1 所述。 2 4 3 浊度法测抑菌活性 同1 1 5 3 所述。 2 4 4d e a e 离子交换层析验证抑菌物为蛋白类物质【2 1 】 将1 0 m l 弱阴离子交换层析填料d e a e s e p h a r o s e 装于直径1 8 c m ，高 l8 1c m 的层析柱中，用1 0 m l1 m m o l l 的n a o h 洗至碱性。再用p h 8 0 磷酸盐品缓冲液平衡半个小时。将分泌物样品约3 m g 用2 倍体积的样品 将样品缓冲液平衡半个小时后将样品缓缓加入层析柱，收集淋洗液，后 再用n a c l1 5 m m o l l ，p h 8 0 的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，直至 洗脱液p h 8 0 。将洗脱滤与淋洗液分别透析除盐。将总分泌物，洗脱液， 淋洗液分别滤菌，冷冻干燥，将干粉用3 0 0 u ld d h 2 0 溶解，分别进行浊 度法抑菌活性测定及蛋白质含量测定。用电泳检测分泌物蛋白与离子交 换柱吸附效果。 2 4 5d e a e 离子交换层析初步纯化 将1 0 m l 弱阴离子交换层析填料d e a e s e p h a r o s e 装于直径1 8 c m ，高 18 1c m 的层析柱中，用1 0 m l 的l m m o l l 的n a o h 洗至碱性。再用p h 8 0 磷酸盐溶液平衡。直至洗脱液酸碱度达到p h 8 ：0 。将分泌物样品约3 m g 与2 倍体积的样品缓冲液混合，平衡半个小时后，将样品缓缓加入层析 柱，用o 1 5 m m o l l 的n a c l 溶液6 0 m l 梯度洗脱，以每管1 0 0 滴收集， 分别进行透析、滤菌、冷冻干燥，用3 0 0 u ld d h z o 溶解，分别进行浊度 法抑菌活性测定及蛋白质含量测定。采用电泳检测蛋白质样品的纯度。 2 4 6 调整优化d e a e 梯度洗脱条件 将2 4 5 步骤调整为用0 1 5 m m o l l 的n a c i 溶液1 0 0 m l 每管6 5 滴收 集，分别进行透析、滤菌、冷冻干燥，用3 0 0 u ld d h 2 0 溶解，分别进行 浊度法抑菌测定及蛋白质含量测定。采用电泳检测蛋白质样品的纯度。 2 4 7 变性条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 【3 2 凝胶配方见表 表2 1s d s p a g e 凝胶配方 t a b l e2 c o m p o n e n to ft h es d s p a g eg e l 上样前将4 0 u l 蛋白质样品与1 0 u l 的上样缓冲液( 2 5 甘油( w v ) ， 1 4 4m m o l l 的巯基乙醇，6 0 m m o l l t r i s h c lp h 6 8 和少许溴酚蓝) 混合 后，沸水中加热5 1 0 分钟。3 5 4 0 m a 稳定电流电泳，直至最前端距低槽 1 0 c m 左右。 所用溶液配方如下： ( 1 ) 电泳缓冲液( p h 8 3 ) ：取1 4 4 9 9 甘氨酸，3 0 2 9t r i s ，加1 0 0 m l1 0 s d s ，加水至1 升，4 度保存。 ( 2 ) 4 分离胶缓冲液：7 5 m l2m o l lt r i s - h c l ( p h 8 8 ) ，4 m l1 0 s d s ， 4 6 m l 蒸馏水，4 保存。 ( 3 ) 4 堆积胶缓冲液：5 0 m l 的1 m o l lt r i s h c i ( p h 6 8 ) ，4 m l1 0 s d s 4 6 m l 蒸馏水，4 保存。 ( 4 ) 染色液：考马斯亮蓝r - 2 5 02 。5 9 ，甲醇5 0 0 m l ，7 0 m l 冰醋酸，溶 解后补足水至总体积1 0 0 0 m l 。 ( 5 ) 脱色液：甲醇3 0 0 m l ，冰醋酸7 0 m l ，补足水至1 0 0 0 m l 。 结果 2 1d e a e 离子交换柱验证抑菌物为蛋白类物质 洗脱液抑苗效果曲线 f i g 9 s d s p a g ea n a l y s i so fa d s o r b e d p r o t e i nb yd e a e s e p h a r o s e 由f i g 8 可知洗脱液成分有抑菌作用，f i g 9 中1 为分泌物，2 为洗 脱液，3 为淋洗液可见大部分蛋白被吸附到d e a e 离子交换树脂上，通 过这两个结果可初步确定抑菌成分为蛋白类物质。 2 2d e a e 离子交换树脂初步纯化 1 2 。“ m6 1 04 。 02 蛋白质含量与活性峰曲线罾 2 02 5 f i g 1 0 s e p a r a t i o n o fa n t i b a c t e r i a l p e p t i d e o nd e ae - sedha r ose i；0 l o o o o 0 0 0 暑 珏濉一 j i 二 。 0 o o i o o 抑菌效粜曲线 时间( 1 r f i g 1 1 a n t i b a c e r t i a la c t i v i t yo f t u b e1 2 ，1 3 ，1 4 ，1 5a n d1 6 f i g 1 2 s d s - p a g ea n a l y s i so fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d ee l u t e db y d e a e sep har osec0 1u i n n ia n e l ：t u be8 1a n e 2 ：t u b e9 1a ne 3 ：t u b e l0 1a n e 4 ：t u be 1l 由图：f i g 1 0 可以看出活性峰与蛋白含量主要分布区域分开， f i g 1 1 为有活性管即1 2 15 管抑菌效果图， f i g 1 2 为主要蛋白分布区8 1 1 管及活性分布区13 1 6 管 s d s p a g e 电泳图，考马斯亮蓝染色可观察到活性管的蛋白质条 带已经很少。 以上三图可看出抗菌肽得到了初步纯化。 2 3 调整优化d e a e 梯度洗脱条件 1 5 童 1 粤05 蔫 。 一o 5 蛋白含量j j 活性分布图 管数 f i g l3s e p a r a t i o no fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d eo nd e a e - se p h a r oseco i u mn 1 5 0s 0 d ；03 蔫02 0t 24 管活性曲线 l 一对照i l 一2 1 管 时间( i l r ) f i g 1 5 s d s p a g ea n a l y s i so fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d e e l u t e db yd e a e - se p h ar oseco l u mn f i g 13 为优化纯化条件后的蛋白质含量与活性峰分布图，活性范围变窄。 f i g 1 4 为活性管即2 4 管抑菌效果曲线。 f i g 15 为活性管与总分泌物蛋白对比电泳图。纯化后蛋白条带减小至三 条。 以上三图结果证明调整条件后的d e a e 纯化效果得到改善。 讨论 蛋白质等生物大分子中都同时带有正负两种电荷，不同蛋白质由于 其p i 不同，在同一种p h 值介质中，由于电离状况不同，分子所带电荷 的种类和数量就不同，与离子交换剂的静电吸附能力也不同【22 1 。离子交 换层析就是利用蛋白质的这种性质，用固定相偶联的离子交换集团和流 动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行分离的方法 1 2 2 23 1 。纯化一种具有两性的生物大分子。其离子化的程度取决于它所在 1 6 溶液中的静电荷。蛋白质带电荷与否，或带什么样的电荷，主要取决于 溶液的p h 值。溶液的p h 值高于蛋白质等电点时，就带负电荷，解离成 负离子；低于蛋白质的等电点时，就带正电荷，解离成阳离子。它们所 带的净电荷的数量，取决于分子中带有正负电荷集团的数量及环境的p h 值。离子交换层析就是利用生物大分子与带电介质之间的可逆吸附，及 生物大分子之间所带净电荷的微小差异来达到分离目的的。最常用的弱 离子交换配基有二乙基氨基乙基( d i e t h y l a m i n o e t h l ，d e a e ) 和羧甲基集 团( c a r b o x y m e t h y l ，c m ) ，前者是阴离子交换剂，后者是阳离子交换剂。 强离子交换配基有阴离子交换配基四乙基铵基( q u a t e r n a r ya m i n i e t h y l q a e ) 和阳离子交换配基磺酸丙基( s u l f o p r o p y l ，s p ) 。本实验结果表明， 活性蛋白质以中性和酸性蛋白质为主。故我们选弱阴离子交换树脂 d e a e 。阳离子交换剂选择酸处理，阴离子交换剂则选择碱处理。 2 4 i d e a e 选择碱处理，使之变成带上正电荷并吸引相反离子o h 。本实验中采用 p h 8 0 磷酸盐缓冲液作为缓冲液使相当一部分蛋白质带上负电荷，与离 子交换剂所吸引的o h l 进行交换；用起始缓冲液充分洗脱使未吸附物质 洗出，再通过增加溶液中离予强度，使吸附到交换剂上的物质根据其静 电力的大小而不断竞争性的解脱下来。 通过分泌物与d e a e 离子交换柱吸附实验发现，在p h 8 0 的缓冲条 件下，分泌物中大部分蛋白成分均可以吸附在d e a e 离子交换柱上，且 抑菌活性成分出现在总分泌物及洗脱液中，可以初步证明抑菌成分为蛋 白类物质。通过2 4 5 实验用d e a e 离子交换柱对抗菌肽进行了初步纯化 如图可知，蛋白质含量峰与活性分布的峰位置分开，而电泳结果显示已 经对抗菌肽进行了初步纯化，但是活性组分电泳图中除了主要条带外， 还存在一些弱带，因此根据情况对实验进行了调整。经过增大了上样量， 加大洗脱体积和减小了每管收集量，增加了分辨率。调整后如2 4 6 实验 结果，虽然活性蛋白质的量可能更加分散，但主要活性集中与2 4 管中， 其电泳条带为三条带在银染时未见其它弱带，蛋白质的纯度得到了很大 提高，根据此情况可继续通过s u p e r d e x 7 5 进一步纯化。 小结 1 通过d e a e 离子交换柱对活性成分的吸附可以判断其活性物质为 蛋白质类物质。 2 可以通过加大样品量，加大洗脱体积，减小每管收集体积来减少 弱带，提高分辨率，进而提高纯度。 3 。在适当的条件下通过d e a e 可以对抗菌肽进行初步纯化，欲得到 更少的蛋白条带，须考虑串联凝胶过滤层析进一步纯化。 第三章对丝光绿蝇幼虫抗菌肽的纯化 抗菌肽分离和纯化的实验条件确立后要解决的问题是如何用最少的 步骤分离和纯化到所需的纯度，即建立一个最有效的蛋白质纯化程序。 一般情况下应考虑下述几点：1 ) 利用蛋白质在分离纯化上最有利的特性； 2 ) 尽早使用一种选择好的方法；3 ) 选择吸附能力强的层析技术作为第 一步层析；4 ) 不要连续使用相同的纯化方法；5 ) 将各层析步骤连接起 来，并使前一步得到的样品液适用于下一步层析；6 ) 在造成酶被稀释的 步骤后面要用浓缩蛋白质的方法；7 ) 要使每一步骤的分辨能力呈递增的 趋势；8 ) 每一步纯化过程后，通过蛋白质活性和蛋白质浓度的测定，监 测纯化的进程；9 ) 用电泳检测蛋白质条带数目减少的变化。遵循上述原 则和根据第二章的实验结果，本实验设计了一套较为系统而合理的方案， 对丝光绿蝇抗菌肽进行了纯化。 3 1 材料 同1 1 1 、1 1 2 所述。 3 2 实验试剂 a c r y l a m i d e ，b i s a c r y l a m i d e 购于美国p r o m e g a 公司； t e m e d 购于美国s e r v a 公司： a m m o n i u mp e r s u l f a t e ( a p s ) 来自a m e r e s c o 由华美生物工程公司进口 分装； 考马斯亮蓝r 一2 5 0 购自s i g m a 公司； s u p e r d e x 7 5 ，购自a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h ，s w e d e n ； 余同2 2 所述。 3 3 实验仪器 同2 3 所述。 3 4 方法 3 4 1 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 同1 2 4 6 所述 3 4 2 用浊度法测抑菌活性 同1 1 5 3 所述。 3 4 3 产物制备 同1 1 5 1 所述 3 4 4 离子交换层析 将1 0 m l 弱阴离子交换层析填料d e a e s e p h a r o s e 装于直径1 8 c m ，高 i8 1 c m 的层析柱中，用1 0 m l 1 m m o l l 的n a o h 洗至碱性。再用p h 8 0 磷酸盐溶液平衡。直至洗脱液p h 8 0 。将分泌物样品约1 0 m g 与2 倍体积 的样品缓冲液混合，平衡半个小时后，将样品缓缓加入交换柱，用 0 - 1 5 m o l n a c l 溶液1 0 0 m l 每管6 5 滴收集。 3 4 5 透析 将蛋白质峰所有试管分别用m w c3 ，5 0 0 透析袋透析，置于缓冲液中 4 8 小时，期间更换5 到6 次透析液。 3 4 6 滤菌 将透析后的各管分别通过o 2 2 u r n 的滤菌膜滤菌，滤菌时注意无菌超 做，滤液滤置高压灭菌试管中，用灭菌滤菌膜封好，放置一2 0 冰箱冷冻 保存。 3 4 7 冷冻干燥浓缩 将透析滤菌后的样品真