（果树学专业论文）苹果属山定子Mbnramp1基因克隆及其功能的初步研究.pdf

苹果属山定子m b n r a m p l 基因克隆及其功能的初步研究 肖海华 ( 中国农业大学园艺植物研究所，北京1 0 0 0 9 4 ) 摘要 n r a m p ( n a t u r a lr e s i s t a n c e - a s s o c i a t e dm a c r o p h a g ep r o t e i n ) 是一个膜整合蛋白家族，该家族 基因成员在金属离子的转运，尤其是在铁离子的代谢中起着重要的调控作用。本文以苹果属抗寒 砧术山定子( m a l u s b a c c a t a ( l ) b o r k h ) 为试材，根据植物中n r a m p l 基因的保守区域设计简并引 物，采用r t - p c r 与r a c e 法相结合，从苹果属山定子中克隆n r a m p l 基因，并在真核模式生物 酵母中对该基因功能进行了初步研究。主要结果如下： 1 率先从苹果属山定子中克隆到一条长为2 0 9 0b p 的c d n a 序列，该基因含有长为1 6 5 6b p 的开放阅读框，编码5 3 1 个氨基酸。将所得序列在g e n b a n k 中进行同源性比较，结果表明该基因 属于n r a m p 基因家族，而且与番茄中的n r a m p l 基因具有极高的同源性，将该基因命名为 m b n r a m p l ，基因登录号为a y 7 2 4 4 1 3 。与植物中的同源基因进行序列比对，结果表明m b n r a m p l 与l e n r a m p l 具有很高的同源性，同源性为6 6 ，相似性为8 0 ；与o s n r a m p l 的同源性为 6 3 ，相似性为6 8 ；与a t n r a m p l 同源性为5 5 ，相似性5 8 。m b n r a m p l 蛋白含有推断 的n 一端相连的糖基化位点，1 2 个推断的跨膜域f r i s ) 和在第八和九个跨膜域之间第四个胞内环中 有一个一致的转运基序。 2 山定子中该基因为单拷贝。正常供铁条件下，m b n r a m p l 基因在根中转录水平极低，在叶 片中几乎不表达。缺铁条件下，m b n r a m p l 基因在根中转录水平迅速提高，直到缺铁1 5 天时转 录仍处于较高水平。然而，直到缺铁1 5 时时叶片中表达仍然很微弱。 3 m b n r a m p l 基因转化酵母突变株d e y l 4 5 3 生长状况明显好于空载体转化后的突变株。培 养基中b p d s 增加到1 5um 时，转化了m b n r a m p l 的酵母细胞生长状况与野生型相差无几。在 3 0 pm b p d s 时，m b n r a m p l 转化的细胞与低浓度b p d s 相比生长延缓，但是明显优于空载体转 化的d e y l 4 5 3 突变株。与较低浓度b p d s 相比，野生型酵母( d y l 4 5 7 ) 的生长量也减少了。初 步证明m n r a m p l 编码具有功能的铁转运蛋白，转运蛋白m b n r a m p l 能够使酵母吸收铁的突 变株恢复突变。进一步在酵母细胞中对m b n r a m p l 进行亚细胞定位研究，结果表明该蛋白主要 位丁二细胞膜内侧的内吞泡膜上还有- - d , 部分位于多聚小泡上。 初步提出植物中存在第三种铁吸收机制内吞机制，构建了内吞机制模型。 关键词：苹果属山定子：m b n r a m p l 酵母突变株d e y l 4 5 3 i 亚细胞定位 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fm b n r a m p lg e n e i nm a l u sb a c c a t a ( l ) b o r k h x i a oh a i h u a ( i n s t i t u t ef o rh o r t i c u l t i r a lp l a n t s ，c h i n a a g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y ，b e i j i n g1 0 0 0 9 4 ，c h i n a ) a b s t r a c t g e n em e m b e r so ft h en r a m pf a m i l ye n c o d i n go fi n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i n s ，a x ei n v o l v e di nm e t a l i o n t r a n s p o r t i o n ，e s p e c i a l l y r e g u l a t i o no fi r o nm e t a b o l i s m i no r d e rt o i s o l a t et h en r a m p l g e n e ( n a t u r a l r e s i s t a n c e a s s o c i a t e dm a c r o p h a g ep r o t e i n l ) f r o mm a l u sb a c c a t a ( l ) b o r k h ，r t - p c ru s i n g d e g e n e r a t ep r i m e r sc o r r e s p o n d i n gt oc o n s e r v e dm o t i f so fn r a m p li np l a n t ，a n dc o m b i n e dw i t hr a c e a n da f t e rt h a tf u r t h e rs t u d yo nf u n c t i o na n ds u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o nw a sd e v e l o p e di nm o d e l e u k a r y o n 。 n em a i nr e s u l t sa x ea sf o l l o w s ： 1 a2 0 9 0b pe d n af r a g m e n tw a sc l o n e d ，w h i c hc o n t a i n saf u l l - l e n g t ho p e nr e a d i n gf l a m eo f n r a m p lg e n ei nm a l u sb a c c a t a ( l ) b o r l d a i te n c o d e sap r e d i c t e dp o l y p e p t i d eo f5 5 1a m i n oa c i d sw i t h am o l e c u l a rw e i g h to fa b o u t5 9 仉【d a b e c a u s et h i sg e n es h a r e dh i g hh o m o l o g yo fl e n r a m p l i ti s n o m i n a t e da sm b n r a m p l i t sa c c e s s i o nn u m b e ri sa y 7 2 4 4 1 3 a l i g n m e n ta n a l y s i ss h o w e dt h a t m b n r a m p lh a sh i g h e rs i m i l a r i t y 州t hl c n r a m p l ( 6 6 i d e n t i t ya n d8 0 s i m i l i t y ) t h a n 埘t h o s n r a m p i ( 6 3 i d e n t i t ya n d6 8 s i m i l a r i t y ) a n da t n r a m p lf 5 5 i d e n t i t ya n d5 8 s i m i l a r i t y ) t h em b n r a m p lp r o t e i nc o n t a i n sa l lc o n s e r v e dd o m a i n so fn r a m p s n c ha sp u t a t i v en - l i n k e d g l y c o s y l a t i o ns i t e s ，1 2t r a n s m e m b r a n ed o m a i n sf f m s ) a n dac o n s e n s u st r a n s p o r t e rm o t i f ( c t m ) i nt h e f o u r t hi n t r a c e l l u l a r1 0 0 db e t w e e nt m s a n d 2 n r a m p lh a so n es i n g l ec o p yi ng e n o m eo f m a l u sb a c c a t a ( l ) b o r k h e x p r e s s i o no f m b n r a m p l u n d e rn u t r i e n t - s u f f i c i e n tc o n d i t i o n si sv e r yl o wi nr o o t sa n dn o td e t e c t a b l ei ns h o o t s t h ee x p r e s s i o n l e v e lo fm b n r a m p lu n d e rf e - d e f i c i e n c yc o n d i t i o ni n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l yi n r o o t s i ns h o o t st h e e x p r e s s i o ni sd e t e c t a b l ea f t e r1 5 d a y s f e - d e f i c i e n c yt r e a t m e n t s 3 m b n r a m p lw a se x p r e s s e di ny e a s tm u t a n td e y l 4 5 3 ，w h i c hr e v e r s e dt h eg r o w t hd e f e c to n i r o n 。d e p l e t e dm e d i a i tg r e ws i g n i f i c a n t l yb e t t e rt h a nt h et r a n s g e n i cy e a s tw i t he m p t yv e c t o r g r o w t ho f m b n r a m p lt r a n s f o r m e dy e a s tc e l l sw a st h es a m ew i t hw i l dt y p ea t1 5pmb p d sa n dr e t a r d e da t3 0u mb p d sa st h ew i l dt y p ed i d a ta n yc o n c e n t r a t i o n so fb p d s ，g r o w t ho f m b n r a m p lt r a n s f o r m e dy e a s t c e l l sw a ss i g n i f i c a n t l yb e t t e rt h a nt h a to fd e y l 4 5 3m u t a n ts t r a i nt r a n s f o r m e dw i t he m p t yv e c t o r b e c a u s eb i b n r m p li sa b l et or e , s t o r et h eg r o w t ho fy e a s td e y l 4 5 3m u t a n t , i ti si n v o l v e di ni r o n u p t a k e 4 o b s e r v a t i o no ft h es u h e e l l u l a rl o c a l i z a t i o no ft h em b n r a m p lp r o t e i n ss h o w e dt h a t m b n r a m p lw a sm a i n l yl o c a l i z e di nt h ew h o l ee n d o c y t i cv a c u o l em e m b r a n ea n daf e wi nt h em u l t i p l e v e s i c l e s s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o np a t t e m so ft h em b n r a m p lp r o t e i ni ny e a s ti n d i c a t e dt h a t m b n r a m p lp r o t e i np m b a b l yt a k e sp a r ti nt h er e l e a s i n go f f ei nt h e s eo r g a n e l l e s t h ep l a n ti r o nu p t a k es t r a t e g yh i e n d o c y t i cm e c h a n i s mm o d e lw a se s t a b l i s h e d k e yw o r d s ：y e a s tm u t a n td e y l 4 5 3 ；m a l l sb a c c 啪( l jb o r k h ：m b n r a m p l ；s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n m c d n a e d t a f 1 盯3 f e t 4 l h g 1 r t m r n a n r a m p p c r r a c e i 汀 t r i s x g a l y s l z i p g f p b p d s 名词缩写 c o m p l e m e n t a r y d n a互补d n a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a u c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 f e ( 1 i ) - t r a n s p o r t e r 酵母高亲和系统f e ( i i ) 转运蛋白 f e ( 1 i ) t r a n s p o r t e r 酵母低亲和系统f e ( 1 j ) 转运蛋白 i s o p r o p y l - b - d - t h i o g a l a c t o s i d e 异丙基硫代- 1 3 - d - 、卜乳糖苷 i r o nr e g u l a t e dt r a n s p o r l e r 调节铁转运的蛋白 m e s s e n g e rr n a 信使r n a n a t u r a lr e s i s t a n c ea s s o c i a t e dm a c r o p h a g ep r o t e i n与自然抗性有关的巨噬细胞蛋白 p o l y m e r e a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s快速e d n a 末端扩增 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n 逆转录 t r i s ( h y d m x y m e t h y l ) m e t h y l a m i n o 三羟甲基氨基甲烷 5 - b r o m o 4 - c h l o r o - 3 - i n d o | y l - b - d - g a l a c t o s i d e 5 - 溴4 氯- 3 - 吲哚- b - d 半乳糖苷 y e l l o ws 仃i p e l 玉米f e ( 1 i d 铁载体吸收转运体的缺失突变体 z r t f i r tp r o t e i n7 m f e 转运相关蛋白 g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 绿色荧光蛋白 b a t h o p h e n a n t h r o l i n ed i s u l p h o n i ca c i dd i s o d i n ms a l t f 乎+ 鳌合剂 i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果a 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 疴渤茅 蹄间：埽f 年g 其db 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 肖汤华 时间： 加町年月) 日 刷磁轹弗彦镌 时间：埘“月夕r 中国农业丈学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 铁是植物光台作用、呼吸作用及蛋白质与核酸等物质代谢过程中多种氧化还原酶的重要组成 部分。缺铁可使叶绿素的合成受阻，导致叶片黄化，影响光合作用，最终导致作物的产量和品质 的下降。随着近几年分子生物学技术的飞跃发展，植物铁素营养的机理有了长足的发展。植物缺 铁往往是由于f c ”溶解度低引起铁缺乏，尤其是在石灰性和碱性土壤上。从而植物应对铁缺乏的 策略是溶解f 矿+ ，以利于植物根吸收铁。 1 9 8 6 年r 6 m h e l d 和m a r s l m e r 提出植物主要以两种方式吸收铁营养，即机理i 与机理h 。机 理i 包括双子叶与非禾本科单子叶植物，靠h + - a t p a s e s 酸化质外体与根际，缺铁引起质子溢泌 ( h + ) ，分泌小的有机鳌合分子( 鳌合剂) 溶解r ”。f e ”被f r 0 2 还原为f e 2 + ( r o b i n s o n 等，1 9 9 9 ) ， 然后由根表皮中的f e ”转运蛋白转运吸收( e i d e 等，1 9 9 6 ；v e r t 等，2 0 0 2 ) ( f i g 1 1a ) 。除了根际 外，铁的代谢与吸收可能也发生在根的质外体。机理i i 是指禾本科植，s 腺营甲硫氨酸通过烟酰 胺合成酶、烟酰胺氨基转移酶和文献( m o i l ，1 9 9 9 ) 中概括的其它酶反应合成铁载体并分泌到根际 ( f i g 1 1b ) 。铁载体是f e ”有效鳌合荆。这些铁载体衍生于蛋氨酸的一种浓缩产物，非蛋白原三 肽类分子烟酰胺。r ”，铁载体复合物通过y s l ( y e l l o ws l r i p e1 ) 再运输到摄( c u r i e 等，2 0 0 1 ) 。 图1 1 缺铁时根与根毛获取铁的示意图 ( a ) 机理i ：双子叶植物与除禾本科以外的单于叶植物。 ( b ) 机理：i i 禾本科植物 f i g 】1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f i r o na e q u i s i t i o a i nr o o l s d tr o o t h a i r s u p o n i r o n d e f i c i e n c y ( a ) s t r a l e 窨y 1o f d l c o ta n d m o n o c o tp l a n t s 研r h t h e e x c e p l i o no f g r a s s e s s t r a t e g y i i o f g r a s s e s 1 1 机理i 植物的分子生物学机理研究 b p d s 或f e r r o z i n e 结合还原态f e 2 + 后变红或耪色，通过颜色反应可以显示铁还原酶活性。这 一颜色反应用于正向遗传筛选发现缺乏铁还原酶活性的拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 突变体和 三个等位基因突变体p a l 一、p a l l 一2 与f r a l - 3 ( 还原酶缺失突变体) ( v i 和g u e r i n o t ，2 0 0 0 ) 。p a l - j 是从拟南芥中发现f e ”还原酶同系物，揭示出候选基因爿驴口2 与印“j 共分离僻o b i n s 等，1 9 9 9 ) 。 1 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 f r d 3 在根中特定表达，f r d 3 突变的植株表现出上调吸收铁和其它金属离子的表型( r o g e r s 和 g u e r i n o t ，2 0 0 2 ) 。a t f r 0 2 鉴定为机理i 中f e ”还原酶基因。根系缺铁供应受限时，a r f r 0 2 被诱导 ( r o b i n s o n 等，1 9 9 9 ) 。w a t e r 等( 2 0 0 2 ) 从豌豆( p s u ms a t i v u m ) 中鉴定出f c ”还原酶的同源基因 ( p s f r 0 1 ) ，在缺铁的根中与地上部以及感染和固氮区域的根瘤中表达，p s k o l 增加了酵母中f e 3 + 还原酶的活性。z i p ( z i p 代表z r p ，l i t 类蛋白，丝az i n c - r e g u l a t e d t r a n s p o r t e r 锌调节转运蛋 白r t ：i r o n r e g u l a t e dt r a n s p o r t e r 铁调节转运蛋白) 金属转运蛋白家族在真核生物和一些细菌中 参与了金属吸收f e n g 等，1 9 9 8 ；t h o m i n e 等，2 0 0 0 ：g u e r i n o t 和e i d e ，1 9 9 9 ) 。r t 具有高亲和 转运铁的功能吲d e 等，1 9 9 6 ；v e r t 等，2 0 0 2 ) ，定位于质膜上。在酵母功能互补试验中发现了植 物中第一个珈c d n a ( a t i r t l ) ，a t i r t l 底物范围广泛，包括铁( f e 2 + 优先于f e ”) ，锌，锰和镉( e i d e 等，1 9 9 6 ；k o r s h u n o v a 等，1 9 9 9 ：r o g e r s 等，2 0 0 0 ) 。a t i r t l 和其紧密相关的a t i r t 2 在根中受缺铁 诱导，在根毛区的根表皮中表达o “e r t 等，2 0 0 1 ；v e r t 等。2 0 0 2 ) 。低铁供应时，a t i r t l 功能失活导 致黄化和生长减( v e r t 等，2 0 0 2 ) 。a t i r t 2 不能够使拟南芥i r t l 一1 突变株恢复生长( w r t 等，2 0 0 2 ) 。 而且a r a b i d o p s i si r t 2 突变植株没有表现出任何缺铁表型( v a t o t t o 等，2 0 0 2 ) 。在番茄中，l e i r t l 编 码一个根特异的金属转运蛋白，在低铁供应条件下加强表达，在铁营养供应充足时表达处于最基 本水平( e c k h a r d t 等，2 0 0 1 ) 。在豌豆和水稻中也有报道推测的i r t l 在m r n a 水平诱导( b u g h i o 等， 2 0 0 2 ；c o y h e n 等，1 9 9 8 ) 。 1 2 机理i i 植物的分子生物学机理研究 c u r i e 等( 2 0 0 1 ) 从玉米( z e a m 口沈) 转座子突变粥f m f 突变株分离出了z m y s l ( z e a m a i z e y e l l o w s t r i p e l ) ，从而发现了一个新的转运蛋白家族。y s l 发生突变的植物叶片黄化，不能将铁载体复合 物吸收到根中f v o n 等，1 9 9 4 ) 。如果在生长培养基中供应f e 3 + 一铁载体复合物，y s l 能够与f e t 3 f e t 4 酵母突变株功能互补( c u r i e 等，2 0 0 1 ) 。缺铁条件下，z m y s l 在玉米根和叶片中被诱导和表达水 平增加，这表明z m y s l 在整个植物体中对铁的分配很重要。有趣的是，拟南芥基因组中含有八个 z m y s l 同源基因( 命名为爿舢f ：y s l - l i k e g e n e s ) ( c u r i e 等，2 0 0 1 ) 。既然机理i 植物不产生铁载体， 这也许表明y s l 类转运蛋白在高等植物中功能保守。或许y s l 蛋白在植物中运输金属烟酰胺复合 物。烟酰胺存在于检测的所有高等植物中，或许其在金属鳌合荆中起了重要的作用( s t e p h a n 和 s c h o 】z ，1 9 9 3 ) 。l e j e a n 等( 2 0 0 2 ) 报道a t y s l l 可能调节了地上部铁的分配。 1 3 编码参与烟酰胺和铁载体生成的酶的基因 烟酰胺是植物生长所必须的一种植物专一的复合物。番茄突变体c h l o r o n e r v a ( c h l n ) 是目前 报道的唯一一种没有烟酰胺的植物，产生严重的黄叶痛( s t e p h a l l 和s e h o l z ，1 9 9 3 ) 。烟酰胺作为 铁载体的前体行使了另外的功能( m o i l ，1 9 9 9 ) 。从缺铁的大麦根制各的蛋白中纯化出h v n a s ， 根据h v n a s 多肽序列设计的简并引物分离出相应的h v n a s c d n a 克隆。在缺铁的大麦根中，h v n a s 在m r n a 和蛋白水平诱导加强，但是铁供应充足时在根中几乎不表达，表明h v n a s 是机理专 一的烟酰胺合成酶( h e r b i k 等，1 9 9 9 ；h i g u c h i 等，1 9 9 9 ) 。l e c h l n 基因编码烟酰胺合成酶，分布在 2 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 整个植株( i j n g 等，1 9 9 9 ) 。通常。l , i a s 基因是多基因家族，大麦中至少有六个h a s 基因( h i g u c h i 等，1 9 9 9 ) ，数据库中搜索结果表明拟南芥中有明显的四个h a s 基因。但是用l e c h l n 做探针进行 基因组杂交检测发现番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 中仅有一条n a s 条带( i j n g 等，1 9 9 9 ) ，并且 在番茄e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) 数据库( h t t p ：a v w w t i g r o r g t d b t g i l 倒) 中仅发现了唯一一 个l e c h t n 。 铁载体产生过程中第二个关键酶是烟酰胺转移酶( n a a t ) ，催化烟酰胺转化为脱氧麦根酸。 从缺铁大麦( h o r d e u m 培口r e ) 根中纯化出h v n a a t 并获得了两个相应的c d n a ，h v n a a t 基因仅 在缺铁的根中表达( t a k a h a s h i 等，1 9 9 9 ) 。两个拟南芥氨基转移酶与大麦中h v n a a t 蛋白有很高 的序列同源性，很可能参与了拟南芥中烟酰胺的代谢。目前仍未见有关机理l 植物中烟酰胺产物 代谢的报道。 铁载体代谢步骤依赖于禾本科植物的遗传背景，铁缺乏与铁载体的释放最、时间和种类相关。 大麦产生多种铁载体，由脱氧麦根酸转换为麦根酸，麦根酸转换为表羟麦根酸的基因位点已经分 别定位到大麦染色体臂4 l 和7 l ( m a 等，1 9 9 9 ；m o r i 和n i s h i z a w a ，1 9 8 9 ；m o r i ，1 9 9 9 ) 。这些位 点分别与大麦根中缺铁诱导的两个双加氧酶编码的c d n a ，h v i d s 3 和h v i d s 2 图位一致，表明这两 个c d n a 可能编码铁载体生物合成酶( n a k a n i s h i 等，2 0 0 0 ) 。h v i d s 3 也许编码一个机理铁载体过 氧化物酶，与没有转化的水稻相比，含有h v i d s 3 的转基因水稻能够产生麦根酸( k o b a y a s h i 等， 2 0 0 1 ) 。 1 4 调控基因 番茄触突变体( 1 3 2 3 8 r e r ) 没有显示出铁还原酶活性和质子溢泌现象，并且难以从土壤中吸 收铁( b r o w n 等，1 9 7 1 ；b r o w n 和a m b l e r ，1 9 7 4 ) 。f e r 突变体植株表现出根形态变化表型( 如在 低铁条件f 没有根毛增生) 以及特定金属转运蛋白基因m r n a 表达量减少( u n g 等，2 0 0 2 ) 。l e f e r 基因在根中是必需的( b r o w n 等，1 9 7 1 ) 。与野生型相比，在低铁和铁充足条件下都检测到了向 突变体植物的表型，这表明l e f e r 可能参与了根的调控以适应供铁条件( u n g 等，2 0 0 2 ) 。采用图 位克隆的方法已经从番茄中克隆了l e f e r 基因，发现该基因编码一个b h l h 蛋白，推测该蛋白可 能是一个调节蛋白，可能作为一个d n a 结合蛋白在转录水平起作用。l e f e r 基因在根中表达而在 叶片中不表达，而且与供铁状况无关。在根尖中检测到了工咖r 转录。靠近根尖，工啦，在皮层和 表皮中表达，而在根毛区的表达局限于维管束的薄壁细胞( l i n g 等，2 0 0 2 ) 。因此l e f e r 可能是主 要的调节元件，通过整合铁状况信号来调控番茄根中铁的吸收。目前b a u e r 和b e r e c z k y ( 2 0 0 3 ) 正 在研究调节元件l e f e r 的效应，l e f e r 可能作为由供铁状况调控的直接或间接的靶基因。 由于在结构与功能基因组方法上的努力，新的调节基因的发现仅仅是时间的早晚。可以通过 酵母双杂交筛选，免疫共沉淀，沉淀试验或其他的已有生化方法发现调节原件的相互作用伙伴。 另外一个方法就是借助c d n a 芯片技术从拟南芥或其它物种中鉴定感应供铁状况的正或负调控 转录因子。或许存在一个需要进一步上游调控原件获得铁在转录水平自身调节的转录因子基因， 该调节原件或诱导或抑制这一基因，或者影响其m r n a 的稳定性。插入突变，删切与r n a i 方法 为植物中分离相应突变体，鉴定基因，进一步研究新的调节基因的功能提供了可能。将来用已有 3 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 的突变株进行新的正向筛选和抑制子增强子的筛选可能会揭示更多的调节元件成分( b a u e r 和 b e r e c z k y ，2 0 0 3 ) 。 1 5 其他基因 其它已经报道的参与铁动态平衡的基因不直接参与机理l 或i l 。最近从蓖麻( r i c i n u ac o m m u n i s l ) 中发现了一个e a 基因，是晚期胚胎形成丰富的基因，编码一个铁转运蛋白，可能在来自子 叶中的铁在韧皮部的运输方面发挥作用( k r u g e r 等，2 0 0 2 ) 。铁蛋白作为铁的储藏蛋白在所有生物 体中发挥主要作用，具有差异表达基因成员的基因家族( 在拟南芥中有四个成员) 编码的植物铁 蛋白定位于质体( b r i a t 等，1 9 9 9 ：p e t i t 等，2 0 0 1 ) 。已经发现一些铁蛋白基因受低铁抑制( p e t i i 等， 2 0 0 1 a ，p e t i t 等，2 0 0 1 b ) 。而且，在转基因植株中铁蛋白含量的调节影响了铁的吸收过程，表明 铁蛋白参与了铁库的调节( v a n 等，1 9 9 9 ) 。 另外，差示e d n a 筛选方法和m r n a 阵列技术发现了一些调控铁的基囡。这些基因的功能 仍然不清楚( g i r i t e h 等，1 9 9 8 ：n a k a n i s h i 等，2 0 0 0 ；n e 面s h i 等，2 0 0 2 ) 。 1 6 参与铁吸收的调节机制 机理i 和机理玎植物受低铁诱导产生一些生理特征，重新充足供铁时，这些生理特点消失。 因此机理i 和机理i i 反应受供铁条件有效调节。铁调节的一个先决条件是在高铁或低铁供应时， 一定存在铁感应成分，而且这些铁感应成分具有不同的活性。最简单的方法是可以设想铁可能是 这些感应器组份的激活剂或抑制剂。例如，铁可能通过调节m r n a 稳定性，d n a 结合能力，蛋 白与蛋白表面相互作用或激活一个受体介导的信号传递链。另外一个可能是铁结合一个内部植物 信号组份，烟酰胺作为引发剂，最后，特定的生理组份或过程能够感知铁的有无，翻译为二级信 号，然后作用于信号转换级联，最终到达d n a 水平。例如，铁的易位可能发出一种信号，或者 当铁结合到功能组织中，如质体的光合器官，在植物组织中能够感知到铁的获得。在这些组织中 铁缺乏诱导一种胁迫信号，可能与植物荷尔蒙或信号肽有关。目前，有关确切调节机制纯属假设。 既然机理l 和n 调节发生在不同水平，推测其中有不同铁信号和不同的调节机制参与了这些过程 f b a u e r 和b e r e c z k y ，2 0 0 3 ) 。 首先，铁活化基因 如f r 0 2 , i r t l ，j n r a m p , n a s 和n a a t ) 表达受到诱导，表明这些基因受到d n a 结合的转录因子转录调节作用。目前番茄的正，r 基因是这样一些调节元件的唯一一个成员( m a 等，1 9 9 9 ) 。但是还不清楚番茄中的依赖于归基因的转运蛋白基因是否是砖r 的直接靶标或者更 多的调节元件充当中间媒介。还没有证明铁缺乏诱导的靶基因的启动子和调节蛋白与这些元件间 具体的相互作用。在低铁条件下已经发现了在铁蛋白基因在a t f e r l 和z m f e r l 的启动子中能够 结合蛋白的顺势调节元件( i d r s ：i r o n d e p e n d e n tr e g u l a t o r ys e q u e n c e ) ( p e t i t 等，2 0 0 1 。编码f e 2 + 转运蛋白( i r t l 一类) 和还原酶( f r o 类) 的铁活化基因受生长培养基中的供铁状况直接调节。 然而，直接由铁调节并不是唯一的调节方式。充分供铁条件下，在拟南芥，豌豆，和番茄的各种 铁吸收突变株中也诱导出铁代谢基因。在突变体中，能够模仿缺铁条件，或者由于根中铁吸收效 4 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 率低( v e r t 等，2 0 0 2 ；r o b i n s o n 等，1 9 9 9 ) ，或者由于叶片中铁的分配发生了改变( r o g e m 和g u e f i n o t ， 加0 2 ：k n e e n 等，1 9 9 0 ：w a t e r s 等，2 0 0 2 ；k n e e n 等，1 9 9 0 ；w a t e r s 等，2 0 0 2 ：r o g e r s 和g u e r i n o t ， 2 0 0 2 ) 。在缺铁条件下，a t f r 0 2 在矗j 3 突变体中的表达水平高于正常条件下( r o b i n s o n 等，1 9 9 9 ) ， 并且在r t l 一1 突变体植物中观察到a t i r t 2 和a t f r 0 2 的表达也存在类似现象( y e a 等，2 0 0 2 ) 。这一 效应可能表明蛋白的活性反馈到调节其自身基因的表达。另外，缺铁可能影响那些利用另外的调 节元件效应的其他金属的吸收，突变株过量积累铁、锌、锰，这些也许对a t f r d 3 的高表达解释 ( r o g e r s 和g a e r i n o t ，2 0 0 2 ) 。 烟酰胺合成酶基因是在缺铁火麦根中进行调控的，而水稻中的同源基因表现为另一种表达情 况，铁充足条件下在叶片中低表达( h i g u c h i 等，1 9 9 9 ) 。有趣的是大麦中的基囡一旦转到水稻中表 达方式与水稻中的基因相似，证明大麦基因的调节序列在水稻中能够被识别，或许大麦和水稻的 生长环境不同在某种程度上调节了铁载体的合成( h i g u c h i 等，2 0 0 1 ) 。 另一个调节元件的水平干扰了蛋白的稳定性。a f i r t l 仅在低铁供应的根中稳定，而在铁供应 充足时a t i r t l 检测不到，甚至在转基因植物中3 5 s 启动子后过表达的a t i n l 也检测不f l ( c o n n o l l y 等，2 0 0 2 ) 。这表明a t i r t l 与酵母中的锌转运蛋白z i p 蛋白中z r t l 相似，在铁供应量充足时会遍 在化和降解( c o n n o l l y 筹，2 0 0 2 ；z h a o 和e i d e ，1 9 9 6 ) 。z r t l 在玎l 和螺旋间的胞内环含有一 个富含组氨酸的基序，该基序可能参与了金属的结台和感知( z h a o 和e i d e ，1 9 9 6 ) 。而且，在这一 可变区域中赖氨酸残基是遍在化所必需的( g i t a n 和e i d e ，2 0 0 2 ) 。在a t l r t l 中具有富含组氨酸的 序列与赖氨酸残基这两个特点( c o n n o l l y 等，2 0 0 2 ；e n g 等，1 9 9 8 ) 。 1 7 植物中可能存在的机理i i i t f ( t r a n s f e r f i n s ) 是在动物细胞内普遍存在的铁载体蛋白，具有结合，活化以及运输f e ”离 子的功能( w e l c h ，1 9 9 2 ) 。动物体内典型的转铁蛋自由两个内部重复序列组成，分别形成一个叶 型铁结合域。血清转铁蛋白通过受体介导的内吞作用将f e ”离子( 吸收f e 3 + 优先于f e ”) 运进靶 细胞。吞噬体蛋白在膜上作为二价阳离子流出的泵，通过减少可聱j 用金属的量增强对胞内微生物 的抵抗力。在这一机制中，依附在质膜表面的铁蛋白被内吞机制收进鞘中。在内吞泡的内表面， 内吞泡周围的内质网分泌的蛋白酶消化这些蛋白居，铁从中分离出来，然后通过n r a m p 类铁转 运蛋白将自由态的f e ”吸收进细胞质( m o r i ，1 9 9 9 ) 。吞噬体质膜上有多种蛋白质，n r a m p l 就 是其中的一种。追溯在动物中n r a m p 的研究历史发现，1 9 9 3 年第一个n r a m p 的产物是在小鼠巨 噬细胞和单核细胞中得到的，被命名为n r a m p l ( n a t u l r e s i s t a n g c ea s s o c i a t e dm a c r o p h a g e p r o t e i n ) 。这是一个有1 2 个跨膜域的高度疏水的5 5 0 个氨基酸的膜蛋白。目前已经从哺乳动物中 克隆了一类新型的高亲和铁转运蛋白基因家族( g u n s h i n 等，1 9 9 7 ：a i s e n ，1 9 9 8 ) 。这些基因的产 物从微生物被吞入的部位吞噬体，将这些金属( f e ”或其他金属) 运出，防止内吞的微生物生物 合成有活性的防卫酶，f e ：+ 或其他金属作为这些防卫酶的辅酶。它可能是为s o d 活性中心转运 提供f e 、m n 、c u 等离子。1 9 9 7 年f i s h e r 等首次在光台系统生物。耐盐单细胞藻类( d u n a f i e l ks a l i n a ) 中发现转铁蛋白类蛋白t r i p l i c a t e d t r a n s f e r r i n f i t 0 ，该蛋白分子量为1 5 0 - k d a ( f i s h e r 等，1 9 9 7 ) 。 t f f 位于质膜上并且受高盐诱导的，在3 5 mn a c i 可使铁吸收量增加2 倍，并证明该基因以吞噬 5 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 方式吸收转运三价铁，当细胞中的p h 降低后，再释放出铁离子( f i s h e r 等，1 9 9 8 ) 。“关于耐盐 藻类吸收铁是由1 5 0 k d a 的质膜转铁蛋白调节”( f i s h e r 等，1 9 9 8 ) 的报道使得人们开始发现这一 类型的铁转运机制在光合系统生物中也确实存在。也许转铁蛋白掺入藻类细胞靠与动物细胞中同 样的吸铁机制( a t k i n s o n 等，1 9 9 8 ) 。事实上2 0 多年前m o r i 就报道了以血红素作为铁源和唯一 氮源的水培水稻根细胞具有许多内吞泡，这些内吞泡来自于质膜结合血红素