（预防兽医学专业论文）火鸡疱疹病毒细菌人工染色体及重组火鸡疱疹病毒rHVTHA的构建.pdf

摘要 火鸡疱疹病毒( h v t ) 为一种0 【疱疹病毒，冈其与马立克氏病病毒( m d v ) 抗原相关性而被 j 泛川作预防马立克氏病( m d ) 的活疫卣。本研究的目的首先是构建h v t 全基冈组感染性细凶 人l ：染色体( b a c ) 。方法是利川e c o g p t ( 黄嘌呤呜嘌呤磷酸核糖转移酶) 基1 人i 和细菌人一i ：染色体 ( b a c ) 载体p b e l o b a c ll 的基本功能序列，构建，畦组病毒转移载体p g a b g p t b a c ll 。通过将 p g a b g p t b a c ll - t - j h v t , j 盛染细胞总d n a 共转染原代鸡胚成纤维细胞( c e f ) ，待出现病毒噬斑后， 利h j 霉酚酸( m p a ) 阻断了野生病毒的嘌呤代谢途径，而重组病毒表达黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基 转移酶( x g p r t ，g p t ) ，该酶利川外源提供的黄i 嘌呤完成鸟嘌呤的外源补救合成途径，补救了重 组病毒d n a ( 1 , j 复制，从而有利丁重组病毒的筛选、富集和纯化，经过筛选获得纯化的重组病毒命 名为p u r i f i e d r h v t 。提取p u r i f i e d r h v t 感染细胞总d n a 电转化人肠杆菌d h1 0 b 电转化感受态细胞， 在氯霉素抗性平板上筛选刚性克隆，提取质粒d n a ，经过凝胶电泳鉴定为人分子d n a 的克隆，进 一步州酶切年i t p c r 方法对其进行鉴定。随机选取其中的6 个b a c 克隆，中量提取井纯化b a cd n a 磷酸钙法转染次t 匕c e f ，以完成h v t 重组病毒的拯救。结果，经过6 轮霉酚酸。黄嘌呤次黄喋呤加 压筛选培养基上筛选后，获得纯化的重组病毒，j h j p u r i f i e d r h v t 感染细胞总d n a l 乜转化d h l o b1 5 接 受态细胞筛选剑2 5 个b a c 分子克隆化病毒。其中b a c 6 、b a c 8 币i i b a c l 0 转染次 - 七c e f 后成功启动 病毒感染，产生与野生型h v t i 出染c e f 相似的病毒噬斑形态，说明已经获得振救山的h v t 重组病 毒，分别命名为b a c 6 一d e r i v e dr h v t 、b a c 8 d e r i v e dr h v t 季i i b a c l 0 d e r i v e dr h v t 。进一步对野生 型h v t 、p u r i f i e d r h v t 币i i b a c d e r i v e dr h v t 体外生k 特性进行了比较。结果表明p u r i f i e d r h v t 与 野生型h v t 在c e f 上的增殖曲线相似，但是b a c d e r i v e dr h v t 在c e f 上的增殖曲线与前二者不同， b a c d e r i v e dr h v t 彳 t ! c e f 上的增殖较慢。本研究构建了h v t 全基冈组感染性细菌人= 染色体，建 立了h v t 反向遗传操作技术平台。为方便利j j 现代r e d e t 和c r e l o x p 重组修饰系统对病毒进行反 向遗传操作提供了技术平台，从而为h v t 基冈功能的研究和h v t 活载体基闪：i ：程疫曲的开发奠定 了基础。另外，对m d v - 1 耻病毒严格的细胞结合特性、致瘤机制和满伏感染机制的研究也将起到 重人促进作川。 高致病性禽流感( h p a l ) 是一种由a 型流感病毒引起的禽类高度致夕匕性传染病。血凝素蛋白 ( h a ) 是禽流感病毒( a i v ) 囊膜纤突的一种主要糖蛋白，是流感病毒表面诱导保护性中和抗体 的主要抗原。目前国际上构建的流感基因工程疫苗大多足利用h a 基冈作为目的基冈。本研究以 h v tb a c 为平台，利h j r e d e t 同源重组技术，通过选择反选抒基冈，经过两步法重组：第一步， p c r 扩增两侧带有5 0b p 的左、以同源臂a 矛l l b 的选择标记基因r p s l - n e o 表达盒，【u 转化到含有h v t b a c 的大肠杆菌d h l 0 8 中，在r e c e ； i l r e c t 酶的作川下，发生同源重组，选择标记基冈r p s l n e o 替 换h v tb a c 的u s 2 区；第二步，用带有5 0b p 左、以同源臂a 矛l l b 的h a 基冈表达盒替换选择标记基冈 r p s l n e o 表达盒。在含有氯霉素和链霉素舣抗性的平板上筛选同i 性克隆，提取b a cd n a ，进一步 通过p c r 扩增h a 基冈鉴定，鉴定止确的克隆提取并纯化b a cd n a ，经过酶切分析，与软件分析 结果一致。提取并纯化b a cd n a ，使川脂质体包裹转染原代鸡胚成纤维细胞，结果在转染后第4 天，出现病毒噬斑，形态人小以及病毒生长曲线与野毒相似，表明拯救出重组病毒，命名为 r h v t - h a ，进一步经过间接免疫荧光检测表明，重组病毒r h v t - h a 住c e f 中能止确表达h a 基| 大| ， 具有生物学活性。有望成为一种新型的重组病毒活载体疫苗，实现一次免疫同时预防m d 平i i a i 发 生的目的，其免疫效果止在通过动物实验进ij ：验证。 关键词：火鸡疱疹病毒，细菌人i ：染色体，禽流感病毒h a 基冈，r e d e t 克隆修饰系统，重组病 毒 a b s t r a c t h e r p e s v i r u so ft u r k e y ( h v t ) i sa na l p h e r p e s v i r u st h a ti sw i d e l yu s e da s al i v ev a c c i n ea g a i n s t m a r e k sd i s e a s e ( m d lb e c a u s eo fi t sa n t i g e n i cr e l a t i o n s h i pw i t hm a r e k sd i s e a s ev i r u s ( m d v ) t h ea i m o ft h i ss t u d yw a st oc o n s t r u c th e r p e s v i r u so ft u r k e yf c l 2 6s t r a i na sa ni n f e c t i o u sb a c t e r i a la r t i f i c i a l c h r o m o s o m e ( b a c ) u s i n gt h e s e l e c t i o nm a r k e re c o - g p t ( x a n t h i n e g u a n i n ep h o s p h o r b o s y l t r a n s f e r a s e ) ( i 3k b ) w h i c hw a sd e s i g n e db yo u r s e l v e sa n db a cv e c t o rp b e l o b a c il ( 7 4k b ) ，w e c o n s t r u c t e dt h et r a n s f e rp l a s m i dp g a b g p t b a ci1 t h e n t h et r a n s f e rp l a s m i da n dh v t - i n f e c t e dc e l l s t o t a ld n aw e r ec o t r a n s f e c t e di n t op r i m a r yc h i c k e ne m b r y of i b r o b l a s t s ( c e f s ) a f t e rs i xr o u n d so f s e l e c t i o ni nm e d i u mc o n t a i n i n gm y c o p h e n o l i ca c i d ，x a n t h i n ea n dh y p o x a n t h i n e w eo b t a i n e dp u r i f i e d r e c o m b i n a n tv i r u s e s g e n o m i cd n aw a se x t r a c t e da n de l e c t r o p o r a t e di n t oe s c h e r i c h i ac o l id h 1o b c o m p e t e n tc e l l s c h l o r a m p h e n i c o l r e s i s t a n t c o l o n i e sc o n t a i n i n gh i g hm o l e c p l a rm a s sd n a ( b a c c l o n e s ) w e r ei d e n t i f i e db yr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n dp c ra n a l y s i s ，a n dt h e nt e s t e df o ri n f e c t i v i t y a f t e rt r a n s f e c t i o ni n t oc e f su s i n gc a l c i u mp h o s p h a t e w eo b t a i n e dt w e n t y - f i v eb a cc l o n e s ，a n dt h r e e r e c o m b i n a n tv i r u s e sw e r er e c o n s t i t u t e db yt r a n s f e c t i o no fh v t - b a c 6d n a ，h v t - b a c 8d n aa n d h v t - b a c l 0d n ai n t oc e f sr e s p e c t i v e l y i nt h i ss t u d y , w ec l o n e dt h ec o m p l e t eg e n o m eo fh v t f c l 2 6 s t r a i na sa l li n f e c t i o u sb a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ，w i t ht h e s ec l o n e dg e n o m e si nh a n d ，w ew i l lu t i l i z e t h er e d e to rc r e i o x pr e c o m b i n a t i o ns y s t e m t o m o d i f yt h eh v tb a c s ，w h i c ha c c l e r a t e t h e u n d e r s t a n d i n go fh v tg e n ef u n c t i o n sa n dp r o m o t et h eu s i n go fh v ta sav e c t o rf o re x p r e s s i n gf o r e i g n g e n e s i na d d i t i o n ，i tm a yb ep o s s i b l et og e n e r a t en o v e lh v t l i v ev e c t o rv a c c i n e sb a s e do nt h eb a c s u t i l i z i n gt h er e d e tr e c o m b i n a t i o ns y s t e mw h i c hi s an e ws e l e c t i o na n dc o u n t e r - s e l e c t i o ns y s t e m b a s e do nt h er p s lg e n e ( r p s l - n e o ) a n ds t r e p t o m y c i ns e l e c t i o n ，w ea r et r y i n gt od e v e l o pab i o l o g i c a l l y s a f el i v ev a c c i n eb a s e do nt h eh v tb a c s u s i n gt h i st w os t e pr e d m e d i a t e dm u t a g e n e s i ss y s t e mi n e c d l i f i r s t l yt h ed h 10 bc o m p e t e n tc e l l sc a r r y i n gt h eh v tb a c sw e r et r a n s f o r m e dw i t ht h ee x p r e s s i o n p l a s m i dp r e d e t t h e ni n d u c e db yt h ea d d i t i o no fl a r a b i n o s ea n dat e m p e r a t u r es h i f tf r o m3 0 t o3 7 a f t e ri n d u c t i o n t h ec e l l sw e r ep r e p a r e df o re l e c t r o p o r a t i o n a n dt h el i n e a r r p s l 。n e o c o u n t e 卜s e l e c t i o n s e l e c t i o nc a s s e t t ef l a n k e db yt h e5 0b pl o n gh o m o l o g ya r m sw a se l e c t r o p o r a t e di n t ot h e c e l l s r e c ea n dr e c tc a t a l y z et h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nr e a c t i o n ，t h e f u n c t i o n a lc a s s e t t ew a s i n s e r t e di n t ot h eu s 2l o c u st ob em o d i f i e do fh v t o n l yc o l o n i e sc a r r y i n gt h em o d i f i e db a cw o u n d s u i v i v ek a n a m y c i ns e l e c t i o no nt h ea g a rp l a t e s t h es u c c e s s f u li n t e g r a t i o no ft h er p s l n e oc a s s e t t ew a s m o n i o t o r e db yp c ra n ds t r e p t o m y c i ns e l e c t i o n ，f o rt h ei n s e r t i o no fr p s l - n e oc a s s e t t ec e l l sw i l lb e c o m e s t r e p t o m y c i ns e n s i t i v e s e c o n d l y , i n t h es a m ew a y , t h er p s l - n e oc a s s e t t ew a sr e p l a c e db y t h e n o n s e l e c t a b l et a r g e td n a - - h e m a g g l u t i n i n ( h a ) g e n eo ft h eh i g h l yp a t h o g e n i c a v i a ni n f l u e n z a v i r u s ( h p a i v ) a g o o s e g u a n g d o n g 1 9 6 ( h 5 ni ) f l a n k e db y t h es a m eh o m o l o g ya r m s o n l yc o l o n i e s w h i c hl o s tt h er p s l n e oc a s s e t t ew i l lg r o wo ns t r e p t o m y c i nc o n t a i n i n gp l a t e s f i n a l l y , w eo b t a i n e dm a n y b a cc o l o n i e so fw h i c ht h eh ag e n eo ft h ea i vw a si n s e r t e di n t ot h eu s 2l o c u st ob em o d i f i e do fh v t , a n do n er e c o m b i n a n tv i r u sw a sr e c o n s t i t u t e db yt r a n s f e c t i o no fo n eo ft h e s eb a cc l o n e sd n ai n t o c e f s t h er e s c u e dv i r u sw a sd e s i g n a t e da sr h v t - h a t h eh 5h ag e n ee x p r e s s i o ni nt h i sr e c o m b i n a n t v i r u sr h v t h aw a sc o n f i r m e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y k e yw o r d ：h e r p e s v i r u so ft u r k e y , b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ，h ag e n eo fa v a i ni n f l u e n z av i r u s r e d e tc l o n i n gs y s t e m ，r e c o m b i n a t i o nv i r u s 英文缩写 a i a l v b a c d n a c e f c p e d s d n a g p t h a h c m v h p a l h s v 二l h v t i r e i r s m d m d v m d v 二1 m p a o d o r f p c r p f u s p f t r l t r s u l u s v z v v m d v v v m d v v v + m d v w t h v t 英文缩略表 英文全称 a v i a ni n f l u e n z a a v i a ni n f l u e n z av i r u s d n ao fb a c t e r i a ia r t i f i c i a lc h r o m o s o m e c h i c k e ne m b 拶of i b r o b l a s t s c y t o p a t h o g e n i ce f f e c t d o u b l e s t r a n dd n a x a n t h i n e - g u a n i n ep h o s p h o r i b o s y it r a n s f e r a s h e m a g g l u t i n i n h u m a nc y t o m e g a l o v i r u s e s h i g h l yp a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z a h e r p e ss i m p l e xv i r u st y p el h e r p e s v i r u so ft u r k e y i n t e r n a lr e p e a to ft h eu n i q u el o n gr e g i o n i n t e r n a lr e p e a to ft h eu n i q u es h o r tr e g i o n m a r e k sd i s e a s e m a r e k sd i s e a s ev i r u s m a r e k sd i s e a s ev i r u ss e r o t y p e1 m y c o p h e n o l i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p l a q u ef o r m a t i o nu n i t s p e c i f i c - p a t h o g e nf r e e t e r m i n a lr e p e a to ft h eu n i q u el o n gr e g i o n t e r m i n a lr e p e a to ft h eu n i q u es h o r tr e g i o n u n i q u el o n gr e g i o n u n i q u es h o r tr e g i o n v a r i c e l l a z o s t e rh e r p e s v i r u s v i r p l e n tm a r e k sd i s e a s ev i r u s v e 呵v i b t l e n tm a r e k sd i s e a s ev i r u s v e 哆v i r p l e n tp l u sm a r e k sd i s e a s ev i r u s w i l dt y p eh e r p e s v i r u so ft u r k e y 中文名称 禽流感 禽流感病毒 细卤人一i j 染色体d n a 鸡胚成纤维细胞 细胞病变 双链d n a 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶 血凝素 人细胞巨化病毒 高致病力禽流感 单纯疱疹病毒l 型 火鸡疱疹病毒 长末端内部重复序列 短末端内部重复序列 马立克氏病 马立克氏病病毒 血清l 型马立克氏病病毒 霉酚酸 光密度 开放阅渎框 聚合酶链式反应 蚀斑形成单位 无特定病原体 k 末端重复序列 短末端重复序列 i j = = 独特区 短独特区 水痘带状疱疹病毒 强毒马立克氏病病毒 超强毒马立克氏病病毒 特超强毒马立克氏病病毒 野生型火鸡疱疹病毒 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文巾特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：互铸如 时间：州8 年 厂月j7 同 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 e i j 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签 导师签名： 时间：嘏年歹月7 7 同 时间：占，岔年6 月f7 日 中阍农q k 科学院硕l 。学化论文= 筇一市绪论 第一章绪论 火鸡疱疹病毒( h v t ) ( 或m e l e a g r i d 疱疹病毒1 ) 是一种无致病性的f t 疱疹病毒，最初- j - 2 0 1 t | = 纪6 0 年代末期从火鸡体内分离得剑( k a w a m u r ae la l ，1 9 6 9 ；w i t t e re ta 1 , 1 9 7 0 ) 。h v t 被划分为m d v - 3 型，h v t 的基冈组为线性、义股d n a 分子，人小约为1 6 0k b ( a f o n s oe ta l , 2 0 0 1 ) 。h v t 与鸡的高 度传染性、致瘤性疾病马立克氏病( m d ) 的病原马立克氏病病毒( m d v ) 在遗传学利血清学上 具有相关性( w i t t e re ta l , 1 9 7 0 ；p u r c h a s ee la l , 1 9 7 l ：b a i g e n te ta l , 2 0 0 6 ；g i b b se la 1 1 9 8 4 ) 。m d 由致 病性的m d v - i 型病毒感染所引起，它是一种以商晶鸡的t 细胞淋巴瘤和严重的免疫抑制为特征的 恶性传染病，每年给养禽业造成至少1 0 亿美元的经济损失，因此m d 被各国视为养禽业最重要的疾 病之- - ( n a i r , 2 0 0 5 ) 。m d 也是目前唯一可以通过疫苗控制的肿瘤性疾病，因此m d 作为研究病毒性 肿瘤的理想模型而得剑了病毒学界、医学界、兽医界的广泛重视。 h v tf c 1 2 6 株作为原型m d 疫苗白1 9 7 0 年以来一直使用，该疫苗无致瘤性，保护效果良好， 可以冻干，使用方便，尤其对于一些交通运输和贮存条件较差的地区使川更是具有重要的价值， 另夕 - h v t 与其它疫苗株联合使川时表现出明显协同保护效果( 如h v t + s b 1 ，h v t + c v l 9 8 8 ) ，使得 其在控s t j m d 上仍然具有十分重要的价值( w i t t e re ta l , 2 0 0 4 ：s c h a t ，2 0 0 5 ：b a i g e n te ta l 。2 0 0 6 ) 。h v t 疫苗在全球范同内的广泛使川，极人地降低了m d 带来的经济损失。因而从根本上弄清h v t 基 的功能和决定其表现独特性质的分子基础，将有助丁提高由h v t 诱导的免疫应答。 另外，h v t f l - 为病毒载体携带外源保护性抗原基冈方面，与其它病毒载体相比具有许多优势： 其对鸡及其它动物均无致病性，使用安全；接种鸡体后病毒在鸡体内形成长达数周的病毒i f i i 症， 且终生潜伏感染，可刺激机体产生较高的抗体水平并维持终生，接种一次即可获得终生免疫；h v t 疫苗不仅生产成本低，而且可以冻干，易于贮存利运输。目前，国外已成功地利4 j h v t 作为载体 表达了多种禽病原保护性抗原基冈( b u b l o t & s h a r m a ，2 0 0 6 ；b a i g e n te ta l ，2 0 0 6 ) ，新城疫病毒( n o v ) 、 血清l 型m d v 、传染性法氏囊病病毒( i b d v ) 、传染性喉气管炎病毒( 1 l t v ) 、禽白血病病毒( a l v ) 以及艾美尔球虫病( e i m e r i a ) 的保护性抗原都已在h v t 载体中获得表达，而且能抵抗致夕e 剂量病 原的感染，免疫保护效果良好，冈而以h v t 为载体的基因工程疫苗的研究具有j 阔的应用前景。 但是h v t 基冈组庞大，结构复杂，而且h v t 具有很强的细胞结合性，使 j 在真核细胞中的重 组操作技术对其进行操作羽i 研究，显得困难重重，而且费时费力。近年来，细菌人一i ：染色体( b a c ) 技术在疱疹病毒上的应h j 解决了这一难题( b r u n ee t a l , 2 0 0 0 ) 。通过构建h v t 全基冈组细菌人i ：染 色体，就可以方便地禾u ) t j r e d e t 、c r e i o x p 等现代基冈重组系统等病毒进行反向遗传操作，其住 火肠杆菌中就可以完成对h v t 基闪组的遗传修饰。与在真核细胞中相比，在人肠杆菌中操作的重 组技术具有更快速、有效而且可靠的优点( s c h u m a c h e re ta l ，2 0 0 0 ；b a i g e n te ta l ，2 0 0 6 ；卢建红等， 2 0 0 6 ) 。 禽流感( a v i a ni n f l u e n z a ，a i ) 是由a 型流感病毒引起的一种禽类( 家禽和野禽) 感染的疾病综合 症。是目前危害养禽业最严重的疫瘸之一。1 9 9 7 年香港及随后东南弧多个国家包括中国人陆在内的 h 5 n l 弧型禽流感病毒的暴发，井在越南、泰国、柬埔寨、印尼和中国引起人的感染和死亡，提示 人们禽流感的防控具有公共甲生意义( m a l i kp e i r i se la l ，2 0 0 7 ) 。禽流感自首次发现至今已有l o o 多年 的历史，给世界上许多国家的养禽业造成了极人的经济损失。其中由部分h 5 及h 7 弧型病毒所引起 巾罔农q k 科学院硕i 学付论史第一章绪论 的高致病性禽流感( h p a l ) 可以导致感染鸡群的全部夕e 亡，已被国际兽疫局列为a 类烈性传染病。 对h p a i 的控制最初是采取隔离幕l 于h 杀相结合的方法，如今越来越多的国家倾向于应刚疫苗进i 丁免 疫预防，实践证明全病毒灭活疫苗具有良好的免疫效果，但此类疫苗不能有效诱导细胞免疫利黏 膜免疫应答，而且使j j 过程中受母源抗体的干扰较人，其最人的不足是疫曲接种诱导机体产生的 抗体会导致免疫鸡与 j 然感染鸡难以区分，从而影响疫病的流行病学普查( v e i t se la l ，2 0 0 6 ) 。新 型的基冈1 ：程重组疫苗仅利j l f j a i v 的某一种( 或两种) 保护性抗原基冈来研制，可以很人程度上 弥补上述不足。其中以活病毒为载体表达a i v 的保护性抗原基冈，不仅可以弥补灭活苗的不足， 而且可以同时预防多种疾病，人人降低生产成本，还能产生潜伏感染，引起终生免疫，进而更好 地满足生产：的需要。 禽流感病毒( a i v ) 的表面糖蛋白山凝素( h e m a g g l u t i n i n ，h a ) 和神经氨酸酶( n e u r a m i n i d a s e ， n a ) 是病毒的两种主要保护性抗原，h a 是a i v 表面与毒力以及细胞受体结合密切相关的蛋向， 在决定宿主特异性和致病力方面起着关键的作川。它是a i v 诱导保护性免疫的最主要抗原，不但 可以诱导特异性中和抗体的产生，而且还可以刺激机体产生细胞毒性t 淋巴细胞反应，抗h a ( t c j 抗 体对病毒的感染具有中和作川，从而可以阻l 卜疾病的发生( w e b s t e re t a t , 1 9 9 2 s w a y n ee t a l ，2 0 0 0 ； q i a oe ta l ，2 0 0 6 ) 。冈此，目前对了- a i 的诊断和防制的研究多集中丁h a 蛋白，它含有主要的抗原表 位。 本文以h v tf c 1 2 6 株为病毒载体构建成病毒全基冈组感染性细菌人j i ：染色体( h v tb a c ) ， 然后以感染性的b a c 分子克隆化病毒为平台，利刚现代重组技术r e d e t 重坌f l 系统对h v t b a c 进行 反向遗传操作，通过两步法重组构建了表达h 5 n l 弧趔高致病性禽流感病毒a g o o s e g o n g d o n g 3 9 6 株i 缸凝素( h a ) 基j 人l 的重组火鸡疱疹病毒，所构建的重组病毒可成为多联苗的侯选毒株，h j 丁同 时对a 俑i m d 的预防和控制。此外，由丁h v t 的宿土仪限丁鸡和火鸡，人们不必担心重# h v t 疫 苗的使川而带来f l j a i v 基冈宝l 重排和变异，所以，它具有一定的生态学意义。 1 1h v t 研究概述 1 1 1h v t 与m d v 鸡马立克氏病病毒( m d v ) ，属疱疹病毒科，c 【- 疱疹病毒弧科舣链d n a 病毒( f a u q e te ta 1 2 0 0 5 ) 。 以前根据抗原性不同，即根据免疫琼脂扩散剐免疫荧光试验的结果，将马立克氏病病毒( m d v ) 分为3 种血清型，即血清l 型、衄清2 型和血清3 型。血清1 型包括所有致瘤的马立克氏病病毒，含分 离的强毒株及它们致弱的变异毒株；而血清2 型包括所有不致瘤的无毒力的但可产生小型蚀斑的马 立克氏病病毒；血清3 型包括火鸡疱疹病毒( h e r p e s v i r u so ft u r k e y ，h v t ) 及其所有的变异毒株 ( p a y n e 19 8 5 ；v a nr e g e n m o n e le ta l ，2 0 0 0 ；d a v i s o n ，2 0 0 2 ) 。 m d v 的生物学特性，尤其是其诱导t 细胞淋巴瘤形成的能力及其在细胞培养中生k 缓慢的特 性，发t 见m d v 与y 一疱疹病毒弧科中的艾博拉病毒( e b v ) 1 f 常类似，但是对m d v 基闪组进行电镜 观察研究得到m d v 具有q 疱疹病毒舣链d n a 中典型的重复结构特征( c e b r i a ne ta t , 1 9 8 2 ) ，通过 详细的酶切图谱分析、单个基冈序列测定及后来的全基冈组序列测定证实，m d v 在遗传学上与a 一 疱疹病毒中的单纯疱疹病毒( h s v ) 和水痘带状疱疹病毒( v z v ) 极为相似，同时根据血清2 型 h p r s 2 4 羽l 血清3 型f c l 2 6 毒株的基冈组序列，按照最新的分类方法( o s t e r r i e d e re la t , 2 0 0 6 ) 将3 2 巾l 硐农, l k 丰： 导：院硕f 学f 移论文 第一章绪论 个血清型pi 属。丁j 舡疱疹病毒弧科、类鸡马立克病病毒属的成员，其中血清l 型m d v 属禽疱疹病毒2 型( g a l l i dh e r p e s v i r u st y p e2 ，g a h v 2 ) ，为该病毒属的代表毒株；血清2 型m d v 属禽疱疹病毒3 型 ( g a l l i dh e r p e s v i r u st y p e3 ，g a h v 一3 ) ，血清3 型属火鸡疱疹病毒l 型( m e l e a g r i dh e r p e s v i r u st y p e1 m e h v i ) 。 h v t 对鸡不具有致病性，但是能够诱导病薄山症的产生，这与h v t 诱导产生对m d v - 1 型病毒 的保护性免疫反应有关。鸡感染h v t 后持续带毒= f 且能够维持k j 】免疫状态。与m d v - i 型致刺株 和m d v - 2 型毒株相比较，h v t 在皮肤细胞上的复制效率明显低得多，这可能与h v t 极少发生水平 传播有关。 1 1 2h v t 的基因组结构与病原学特征 m d v 的病毒颗粒具有典型的疱疹病毒的形态，病毒粒，散侄- 丁细胞核内，很少5 现丁细胞浆 或细胞外问隙。在感染细胞培养物超薄切片中，可见直径8 5 1 0 0n m 的人角形核农壳，以及直径 为1 5 0 1 6 0n m f l g 带囊t 1 莫f l , j 病毒颗粒。观察羽毛囊上皮细胞的超薄切片，可见角质化细胞浆中有人 量的有囊膜的疱疹病毒颗粒，直径为2 7 3 一4 0 0 n m ，表现为不定型结构( c a l n e ke la l1 9 7 0 ) 。血清 2 型和缸清3 型毒株形态与血清l 型m d v 相似，但在超薄切片中，火鸡疱疹病毒的核农壳通常早现 独特的十字形外, ) i e ( n a z e r i a ne ta t , 1 9 7 0 ) 。 近年来，h v tf c l 2 6 株全基冈组序列测定1 ：作已经完成( a f o n s oe ta l ，2 0 0 l ；k i n g h a me la l ， 2 0 0 1 ) 。h v t 的基i 大l 组为舣链d n a ，基冈组人小1 5 9 ，1 6 0b p ，g + c 的含量为4 7 5 。h v t 的基冈纽 结构1 其它c 【疱疹病毒类似，由一个k 独特i 又：( u l ) 及其两侧的木端k 重复序列( t r l ) 内部重复 序列( i r l ) ，和一个短独特区( u s ) 及其两测的术端短重复序列( t r s ) 内部短重复序列( i r s ) 所组成( a f o n s oe l a l 2 0 0 1 ) ( 见例l - i ) 。h v t 基洲纽包含3 9 7 个开放阅读框( o r f ) ，其中的9 9 个基 i 灭l 被认为是功能基冈。h v t 的基洲编码产物与m d v - l 和i m d v - 2 的基冈编码产物在氨基酸水平上的 同源性分别为3 6 - - - 8 2 平1 1 3 4 8 4 。在一m 禽类疱疹病毒中，象疱疹病毒l 型和4 型与h v t f l c j 同 源性最高，基编码产物n ：氨基酸水平上的同源性为2 7 6 2 。h v t 与m d v - l 都包含7 6 个保守 的基冈同源物，其中( 1 3 9 2 何于u 1 和u s 区，仅有一个m d v - l 的基冈同源物何丁重复区内。h v t 包 含1 3 个独特的基，在m d v 1 中没有其同源物，另夕i - h v t 的1 6 个基i 闷在m d v - 2 中没有同源物。 最近研究证明m d v - l 型病毒基闪组还可以整合进宿土细胞d n a ，体外将m d v 0 禽自血病病毒 ( a l v ) 或网状内皮组织增生病病毒( r e v ) 共培养，反转录前病毒的k 末端重复序列( l t r ) 可白发插入到m d v 基冈组中，整合常发生在m d v 重复序列和独特区序列的边缘区域齐l l g d 基冈内 ( s f o ne la t , 1 9 9 2 ；j o n e se ta t , 1 9 9 3 ；s f o r te la t , 1 9 9 4 ) 。但逆转录病毒与m d v 之间以及它们与7 苦土细 胞之间的相互作川机制还不清楚，并且逆转录病毒与m d 的致病机理之间的关系也不清楚。而在 h v t 中则没有发现这种现象。另外，在h v t 基冈组的两端以及i r l 平i i i r s 的连接处各包含一个相同 的2 5 l b p 序歹l j ( a f o n s oe ta t , 2 0 0 1 ) ，此重复序列与a 疱疹病毒的o r , 型序列类t 以( k i s h ie ta t , 1 9 8 8 ) ，它包 含有1 7 个拷贝的“g g g t t a ”基元，而这种基元在m d v - l 型毒株中有6 4 个拷贝，在入的疱疹病毒6 型以及真核生物端粒中均存在( t u h n a ne l a l ，2 0 0 0 ；a f o n s oe t a t , 2 0 0 1 ) 。另外，一个2 6 6b p 的相同 的倒转重复序列分别位丁t r l 附近的5 9 1 0 - - 6 1 7 5 位点平i i i r l 附近的1 1 6 8 5 6 - - 一1 1 7 1 2 1 位点，一个5 6b p 的独特序列( 1 1 7 1 2 2 1 1 7 1 7 7 位点) 将另一个2 6 6b p 的重复序列从i r l 区隔开( a f o n s oe ta l ，2 0 0 1 ) 。 3 ，口“n w i + 二l i m 口* ：0 研宄袭叩，m d v - l 型毒f 袖0 多十基_ 1 】编竹蚩白1d m d v - 掣毒株帕毒力宿t 崤肚及致瘤肚 棚爻，如与细】m 转化剌l j _ | 】瘾形成相芙的码止兜氏1 临 。j 丘o r l0 ( m e o ) 坐，1 l 焉i 1 ：i 毒，j 利 讲tt u m 柑关的p 口2 4 ，p p 3 8 ，c x ( 幢化网子，i3 2b p 重复7 予列，s o r i - 2 j 1 i s o r f 4 等 一驯、i i v t 托 q 纽中均求发现同游物。啊时，包 b c l ：基冈 t l v n i i3 丛i ；4 扎i q 的i3 个琏冈扯m d v - 1 型毒棣， ，没 有同榨物f k i n g h a mp ，“2 0 0 1 ) 。通j l x , j j g _ g 。荐异进“分析和研宄，村促进m d v i 力_ l 刖“性 柏天茫冈n 研究具有晴要的愈义，同时对掣【月h vr 所见冉n 独特+ e 物学特州的分f 基础以技丌拉 更为有效i h v i