（发育生物学专业论文）粘细菌外膜蛋白发育相关基因的筛选及功能研究.pdf

中文摘要 粘细菌外膜蛋白发育相关基因的筛选及功能研究 研究生金晶指导老师毛晓华教授 东南大学基础医学院遗传与发育生物学系 发育与疾病相关基因教育部重点实验室 中文摘要 目的： 粘细菌属于最简单的具有多细胞发育结构的生物体之一，其发育过程与真核生物存 在相似性。粘细菌属原核生物，生活周期具社会性行为，是研究多细胞结构形态发生机 制的良好模型。作为细胞与外界环境问的界面，细胞膜几乎与发育中各种生物活动密切 相关，然而迄今为止所克隆的与粘细菌发育相关的膜蛋白基因数量非常有限，一些重要 的应定位于细胞膜的蛋白因子一直未能找到。本论文拟找出在粘细菌发育阶段表达量上 调的膜蛋白基因，并对这些新蛋白因子进行基因敲除实验，以明确其生物学功能。 方法： 本实验最初使用双向电泳技术对粘细菌发育与非发育阶段细胞膜蛋白的表达进行 了研究。随后利用六种外膜蛋白预测软件对粘细菌基因组读码框编码产物进行结构预 测，将六种软件均预测为外膜蛋白的基因筛选出来，分别构建转录融合载体，即将其上 游的调控区域与报告基因l a e z 相连，经电穿孔分别导入粘细菌野生株d k l 6 2 2 ，通过测定 重组菌株1 3 一半乳糖苷酶活性寻找出粘细菌发育阶段表达的基因。对筛选到的基因进行 基因敲除，观察该敲除菌株的表型变化以初步明确其生物学功能。 结果： 1 在双向电泳实验中，比较几次实验所得到粘细菌在营养性生长和发育1 2 h 的2 d 图谱，发现每次实验均存在一些发育阶段蛋白量明显增加的点，但是不同次实验的重复 性较差，我们从中挑选了5 个在两次以上实验中蛋白量均有明显增加的斑点进行了质谱 分析，但质谱分析结果均没有得到粘细菌膜蛋白。 2 利用生物信息学软件分析，在粘细菌基因组中筛选出了1 2 个编码外膜蛋白的基 因。报告基因检测结果提示其中2 个基因( m x 3 1 0 6 ，m x 3 8 8 3 ) 在发育起始阶段表达量 上升，通过氨基酸序列比较，基因m x 3 1 0 6 所编码的蛋白与粘细菌中对型菌毛的形成 以及s 运动至关重要的p i l q 同源。m x 3 8 8 3 与革兰氏阴性菌分子伴 8 弓1 领蛋白通路中 的引领蛋白同源，其所在操纵子与粘细菌孢子外壳蛋白的分泌有关。其余十个基因均与 物质跨膜运输有关，在发育阶段表达量均下降或未表达。其中m x l 3 1 6 ，m x 4 5 5 9 ， m x 6 0 4 4 ，m x 6 5 7 9 ，m x 6 9 11 为t o n b 依赖的外膜蛋白受体，主要在大分子跨膜物质运输 中起重要作用。 3 通过同源重组获得m x 3 1 0 6 和m x 3 8 8 3 基因敲除菌株。这两种敲除菌株在营养丰 富的固体平板表面运动无异常，在饥饿平板能正常聚集发育为子实体，在现有实验条件 下对孢子的形成也无影响。 东南大学硕士学位论文 结论：l 1 利用生物信息软件分析粘细菌基因组读码框，预测出1 2 个可能编码外膜蛋白的 基因。基因m x 3 1 0 6 和m x 3 8 8 3 在发育时期表达上调，其余1 0 个基因在发育时期几乎 不表达或表达下降，这1 0 个基因均与物质跨膜转运有关。 2 m x 3 1 0 6 与和型菌毛组装有关的p i l q 同源，单独敲除m x 3 1 0 6 不影响粘细菌 s 运动及发育阶段的细胞聚集。 3 生物信息学分析提示m x 3 8 8 3 作为革兰氏阴性菌分子伴侣引领蛋白通路成员参 与发育后期一种孢子外壳蛋白的分泌，虽然本论文实验条件下敲除m x 3 8 8 3 对孢子数目 没有明显影响，但仍不能排除m x 3 8 8 3 参与发育后期孢子的分化成熟。 关键词：粘细菌，外膜蛋白，发育，表达 i i i d e n t i f i c a t i o no ft h eo u t e rm e m b r a n e p r o t e i n sf o rt h e d e v e l o p m e n to fm y x o c o c c u s x a n t h u s b y j i n gj 玎呵 s u p e r v i s e db y p r o f e s s o rm a ox i a o - h u a d e p a r t m e n to fg e n e t i c sa n dd e v e l o p m e n t a lb i o l o g y , s o u t h e a s tu n i v e r s i t ym e d i c a ls c h o o l k e yl a b o r a t o r yo fd e v e l o p m e n t a lg e n e sa n dh u m a nd i s e a s e ，m i n i s t r yo fe d u c a t i o n a b s t r a c t o b j e e t i v e ： m y x o c o c c u sx a n t h u s ，w h i c hh a st h es o c i a lb e h a v i o ra m o n gp r o k a r y o t e s ，p r o v i d e sa l l e x c e l l e n tm o d e lo r g a n i s mf o rs t u d y i n gt h em e c h a n i s mo fm u l t i c e l l u l a rm o r p h o g e n e s i s a s i n t e r f a c e st ot h ee x t e m a le n v i r o n m e n ta n da si n t e r f a c e sb e t w e e nc e l l s c d lm e m b r a n e sf u l l 6 l n v i t a lr o l e sd u r i n gd e v e l o p m e n t h o w e v e r , s of a ro n l yas m a l ln u m b e ro fm y x o c o c c u sx a n t h u 8 m e m b r a n ep r o t e i n sw h i c ha r ei m p o r t a n tf o rd e v e l o p m e n th a v eb e e nc l o n e da n ds o m ep r o t e i n s w h i c hs h o u l db el o c a t e di nt h em e m b r a n eh a v en o tb e e nf o u n dy e t i nt h i ss t u d y , w ea t t e m p t t oi d e n t i f ym e m b r a n ep r o t e i n sw h i c ha r es p e c i f i c a l l yi n d u c e dd u r i n gd e v e l o p m e n ta n d e x a m i n et h ef u n c t i o n so ft h e s ep r o t e i n s m e t h o d ： w ea t t e m p t e d 一 (2-d)to e s t a b l i s ho p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt w od i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s o fm e m b r a n ep r o t e i n sf r o mm ，x a n t h u sa n di d e n t i 白p r o t e i n ss p e c i f i c a l l yi n d u c e dd u r i n g d e v e l o p m e n t h o w e v e rn om 。x a n t h u sm e m b r a n ep r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e db yt h i st e c h n o l o g y t h a n k st ot h er e c e n ta d v e n to f 肱x a n t h u sg e n o m es e q u e n c e b i o i n f o r m a t i cs o f f w a r e sw e r e u s e dt op r e d i c to u t e rm e m b r a n ep r o t e i n s ( o m p s ) f r o mt h et r a n s l a t e do r f so f 必：r a n t h u s t h e s e0 m p sw e r ec l o n e di n t ot h et r a n s c r i p t i o n a lv e c t o rw i t h 肠以a st h e i rr e p o r t e rg e n ea n d s e p a r a t e l y i n t r o d u c e di n t o 朋：x a n t h u sw i l d t y p e s t r a i nd k l6 2 2b yi n t e g r a t i o na t c h r o m o s o m a la t t bs i t e t h el a c ze x p r e s s i o nw a se x a m i n e db ym e a s u r i n gt h es p e c i f i ca c t i v i t y o f1 3 - g a l a c t o s i d a s ed u r i n gd e v e l o p m e n t g e n e sw h i c hg o th i g h e rl e v e lo f a c ze x p r e s s i o n d u r i n gd e v e l o p m e n tw e r ek n o c k e do u tf r o mm x a n t h u sc h r o m o s o m et oe x a m i n et h ef u n c t i o n o ft h e s eg e n e s r e s u l t s ： 1 b yv i s u a lc o m p a r i s o n ，s e v e r a ls p o t sw e r ec o n s i s t e n t l ys e e nt ob ee n r i c h e di nc e l l sa t 12 ha f t e rt h eo n s e to fd e v e l o p m e n ti ns i l v e r - s t a i n e d2 一dg e l s f i v eo ft h e s ec o n s i s t e n t l y e n r i c h e ds p o t sw e r es u b j e c t e dt op e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n g h o w e v e rr i om y x o c o c c u s x a n t h u sp r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e dp r o b a b l yd u et ol i m i t e dq u a n t i t yo rc o n t a m i n a t i o n 2 i nt h e 肱x a n t h u sg e n o m e t w e l v eh y p o t h e t i c a l0 r f sw e r ep r e d i c t e dt ob eo u t e r m e m b r a n ep r o t e i n sb yu s i n gs i xp r o g r a m s t h o s eg e n e sw e r ec l o n e di n t ot h et r a n s c r i p t i o n a l i i i 东南大学硕士学位论文 v e c t o rw i t h a c za sr e p o r t e ra n dt h e 瓣i f i ea c t i v i t i e so fp - g a l a c t o s i d a s ew o r ee x a m i n e d t w oo ft h e mg o th i g h e r a c ze x p r e s s i o nd u r i n gd e v e l o p m e n t m x 310 6s h a r e sas c q u e n o e h o m o l o g yw i t hp i l qw h i c hb e l o n g st oal a r g ef a m i l yo fi n t e g r a lo u t e rm c l l l b r a n es e c r e t i n p r o t e i n sa n di se s s e n t i a lf o rb o t hp i l u sb i o g e n e s i sa n ds - m o t i l i t yi n 必x a n t h u s m x 38 8 3 b e l o n g st ot h ec h a p e r o n e u s h e ra s s e m b l yp a t h w a y i n 膨x a n t h 淞t h i so p e r o np r o b a b l y e n c o d e sas p o r ec o a tp r o t e i np r o d u c e da tt h el a t es t a g eo fd e v e l o p m e n to f 肱x a n t h u s p r o d u c t so fo t h e rg e n e sw e r ea l lr e l a t e dt ot r a n s p o r to fm o l e c u l e sa c r o s st h eo u t e rm e m b r a n e 3 t 0t e s tw h e t h e rm x 3l0 6 38 8 3p l a yar o l ei nf r u i t i n gb o d yd e v e l o p m e n t ，p l a s m i d sf o r k n o c k o u to fm x 3l0 6 38 8 3w e r ec o n s t r u c t e d m e nt h ec o n s t r u c t e dp l a s m i d sp u f k - m x 3l0 6 a n dd u f k m x 3 8 8 3w e r ei n t r o d u c e x ti n t od k l6 2 2 ，t h er e s u l t i n gs t r a i n sd i s p l a y e dn o r m a l p h e n o t y p e so n 1 2 c t r ( o 5 a g a ra n d1 5 a g 哪a n de x h i b i t e dn o r m a lf r u i t i n gb o d y f o r m a t i o no nt p ma g a r s a l s o s p o r u l a t i o ne 蚯c i c n c yw a sa tw i l d - t y p el e v e l c o n c l u s i o n ： 1 w ea n a l y z e dt h emx a n t h u sg e n o m ef o rt h eg e n e se n c o d i n g0 口s t w e l v eo m p g e n e sw e r ep r e d i c t e dt ob eo u t e rm e m b r a n ep r o t e i n sb yu s i n gs i xp r o g r a m s o n l yt w oo ft h e m ( m x 3 10 6a n dm x 3 8 8 3 ) g o th i g l l e rl a c ze x p r e s s i o nd u r i n gd e v e l o p m e n t mo t h e rt e ng e n e s c o d ef o ro u t e rm e m b r a n et r a n s p o r t e r s 2 m x 310 6s h a r e sas e q u e n c oh o m o l o g yw i t hp i l qw h i c hi se s s e n t i a lf o rb e t hp i l u s b i o g e n e s i sa n ds m o t i l i t yi nmx a n t h u s t h em x 3 10 6 d e l e t e ds t r a i ne x h i b i t e dn o r m a l d e v e l o p m e n t a la g g r e g a t i o na n dsm o t i l i t yp h e n o t y p e 3 a sam e m b e ro fc h a p e r o n e u s h e r - d e p e n d e n tp a t h w a y , m x 3 8 8 3p r o b a b l yp l a y sar o l e i nt h es e c r e t i o no fs p o r ec o a tp r o t e i n a f t e rm x 38 8 3w a sd e l e t e d ，s p o r u l a t i o ne f f i c i e n c yw a s a tw i l d - t y p el e v e l sb yc u r r e n te x p e r i m e n t h o w e v e r , w es t i l lc a nn o te x c l u d et h ep o s s i b i l i t y t h a tm x 3 8 8 3m i g h tp a r t i c i p a t ei nt h ed i f f e r e n t i a t i o na n dm a t u r a t i o no fs p o r e s k e y w o r d s ：m v x o c o c c u sx a n t h u s , o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n ，d e v e l o p m e n t , e x p r e s s i o n w 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。 研究生签名： 企晶 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 爪 l j 研究生签名：二至：塑导师签名： 前言 静。士 日l f舌 黏细菌为革蓝氏阴性土壤菌，具有多细胞发育结构。在营养缺乏的环境下，粘细 菌表现为互相协作的复杂的形态发生过程：在固体表面上营养细胞通过滑行运动，向 一个中心有序聚集、堆积，形成子实体( f r u i t i n gb o d y ) ，子实体内部的细胞随发育进程 而渐渐变短，最终分化为休眠性的黏孢子( m y x o s p o r e ) ，若恢复营养的供给，孢子则重 新萌发开始营养性生长的过程。粘细菌按系统分类属于真细菌，但其发育过程与真核 生物存在相似性，如定向性细胞运动、多细胞形态发生、细胞分化、基因的有序表达 及真核样细胞信号传导级联系统等。正由于黏细菌具有这种多细胞的发育周期，它成 为研究原核生物发育的良好模型。 粘细菌的发育过程涉及一系列时空特异性基因，在生活周期不同时间点细胞蛋白 质的组成和表达有其特有的规律。用产生随机转录融合的启动子探针t n - 5 在全基因组 水平监测粘细菌发育时期的基因表达，表明该细菌的发育需要数百个发育特异基因的 参与。目前已经分离了一些发育相关基因，它们的编码产物包括信号蛋白、基因调节 因子以及参与细胞运动和物质代谢的蛋白或酶等。 我们关注粘细菌细胞膜蛋白表达谱随发育周期的变化，因为生物体内基因组中 3 0 编码基因产物定位于细胞膜，而且作为细胞与细胞、细胞与环境的界面，细胞膜几 乎与发育中的各种生命活动如细胞识别、信号转导、细胞运动、物质运输等密切相关， 例如粘细菌中研究比较深入的胞外信号c 因子就是一种位于细胞表面的膜结合蛋白。 但目前对膜蛋白发育相关基因的了解仍十分有限，一些应定位于膜上的发育相关因子 仍未找到，本实验室旨在找出定位于膜上的发育相关基因并对其进行功能研究，以增 进对粘细菌发育程序分子调节的认识。 本实验包括二部分，第一部分：找出粘细菌发育时期表达上调的膜蛋白基因；第 二部分：通过基因敲除对所筛选出基因的生物学功能进行初步分析。 东南大学硕士论文 文献综述 粘细菌运动机制的研究 细菌运动方式主要有二种：即在液体环境中表现为“泳动”( s w i m m i n gm o t i l i t y ) ，而 在固体表面表现为“爬动”( g l i d i n gm o t i l i t y ) 。“爬动”是指细菌沿细胞长轴的运动，粘细 菌爬行运动对粘细菌在营养性生长阶段的捕食以及发育阶段子实体的形成有着重要的 作用。通过对粘细菌多个运动缺陷菌株的研究发现，粘细菌的运动受两种不同的系统调 控：a ( a d v e n t u r o u s ) 型运动系统和s ( s o c i a l ) 型运动系统【l ，2 】。a 运动系统，调控单个细 胞运动；s 运动系统调节细胞群体运动。a 型运动引擎通过位于细胞表面的喷嘴( n o z z l e s ) 挤压出黏液状物质，推动细胞向前运动，s 型运动则是在细菌的前端伸出型菌毛，附 着于固体表面或其它细胞上，并通过菌毛的收缩拖动细胞向前运动。s 运动和a 运动都参 与营养性生长阶段细胞群体向外迁移以及发育阶段的细胞聚集，阻断s 基因或a 基因能 减弱但不能消除粘细菌的爬动，然而同时阻断s 基因或a 基因能消除粘细菌的爬动，因此 s 运动和a 运动相互独立。当粘细菌在干燥结实的固体表面运动，a 运动起主导作用，s 运动则在较软和潮湿的表面运动起主导作用【3 】。某些情况下，在干燥结实的培养基表 面，a 运动可以部分的替代s 运动。这两种运动均需要很多蛋白的参与以及它们之间的相 互作用，目前已确定了许多a 运动和s 运动相关的基因座。但是，从突变频率和基因的靶 位点来看，估计仅发现了约一半的a 运动相关基因，y o u d e r i a n 等估计至少有2 5 的s 运 动相关基因并没有确定 4 】。 s 运动的分子机制 s 型运动，主要在细胞聚集、子实体形成等过程中起作用。从基因和行为学的角度 来分析，可以看出s 型运动与铜绿假单胞菌p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 中的t w i t c h i n g 运动 非常相似，需要i v 型菌毛( t f p ) ，细胞外多聚糖( e p s ) ，f r z 系统成分之一f r z s 蛋白 和脂多糖o a n t i g e n ( l p s ) 5 , 6 】。s 运动依靠菌毛的收缩来进行，而e p s 则为菌毛 的附着提供了一个附着点。菌毛不仅仅是推动细胞前进的工具，并且可以感受相邻细胞 的靠近，从而导致更多e p s 的产生。f r z s 蛋白受到f r z 化学信号转导通路的调控，调 节细胞的极性转换。l p s 是一种外膜蛋白，但其对s 运动的功能仍不清楚。 1 1i v 型菌毛的组装 粘细菌i v 型菌毛相关的基因簇共由p i l a 、p i l q 等1 7 个基因组成，这些基因功能相关， 共同参与i v 型菌毛的合成及相关的功能。t f p 是由单一结构基因p i l a 的编码产物形成的 多聚体，但其组装及正常功能的发挥则需多个基因共同参与。p i l a 定位于运动细胞的 头端。它是一种胞质蛋白，通过由p i l q 组成的多聚体外膜蛋白通道分泌到胞外 7 】。p i l q 对菌毛的形成以及s 型运动至关重要。成熟的p i l q 蛋白包含了8 7 2 个氨基酸，是分泌素家 庭中最大的蛋白质。在粘细菌中，由多聚体亚基组成的p i l q 蛋白是由一种与p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 的p i l p 蛋白同源的脂蛋白所调控，该基因读码框位于p f 坦基因的上游。而另一 种与p i l q 发生相互作用的脂蛋白是t g l ，t g l 基因可促进p i l q 的装配，在t g l 基因缺陷株中， 2 文献综述 p f l q 不能装配成多聚体，因此没有菌毛的产生，细胞s 运动也不能实现。有趣的是，下画 基因缺陷株当与野生型的细胞发生接触时，可以促使p i l q j 噩道的形成，可以获得菌毛和 s 型引擎所介导的活动性。这结果表明，r g l 的受体和配体均位于外膜，可以通过细胞 与细胞之f 叫的接触来传递t g l 蛋白f 8 。t 西通常被认为是定位在运动细胞的前端，因为它 g p i i q 通道的形成以及p i l a 的分泌与装配至关重要【9 9 。相对而占p i i q 存在于运动细 胞的两极，它的定位是不依赖于t d 的。因此只有在前端才存在有装配好的p i l q 。据推测， p i l q 可能存在于一种由p i l q ，p i l c a t p 酶，p i l b 以及p i l t 组成的与菌毛装配与收缩 ( r e t r a c t i o n ) 有关的多种蛋白因子组成的超级结构体中。运动细胞的前端应该是包含所 有与s 运动有关的配体，而后端的超级结构体则缺乏p i l a ，t 西以及多聚体的p i l q 。 1 2 i v 型菌毛通过d i f 化学信号通路来正反馈调控e p s 的合成 细胞外周质( e c m ) 对粘细菌的s 型运动咀及子实体的形成非常重要。e c m 由大 约等量的e p s 和蛋白质组成，其中e p s 对s 型运动是至关重要的，f i b a 是镶嵌于e p s 中的主要蛋白质。据推测f i b a 和p i l a 作为存在于e c m 中接受发育相关信号的感受器 发挥作用f 1 0 1 。粘细菌e p s 的产生受d i f 化学信号调节通路的影响 1 1 ，在调节e p s 的 d i f 通路中，信号如何导八仍有待于发现。t f p 位于d i f 信号通路的上游，并起到正反 馈调控e p s 产生的作用，通过对多种t f p 以及d i f 突变株的胞外互补实验的研究，证 实了t f p 是作为一种感受器来调节d i f 信号通路中信号分子的传入的。根据已有的实 验结果提出一种新的模型( 如图1 ) 首先胞外信号通过t f p 被传入个由d i f a ( m c p i l k 曲，d i f c ( c h e w - l i k e ) 和d i r e 组成的信号复合体中，其中d i r e 则通过一种磷酸 化信赖的途径将信号传递到下游的一种未知组分d i f x ，d i f x 可咀促使e p s 的合成。d i l l ) 直接与d i l e 作用作为磷酸基的接受器下调d i r e 的生成。d i f g 则直接与d i m 发生相互 作用推测其作为磷酸化d i f d 的磷酸酶进一步加强d i d 对d i r e 的下调作用。d i d 和 d i 船均是通过调节d i f e 的龟来影响e p s 的生成 1 2 1 。 图le p s 在d i f l 言弓通路中受t f p 调甘示意图 b l a c ke t a l ，2 0 0 6 1 3 f r z s 调节细胞的极性转换 东南大学硕士论文 大约每隔七分钟，粘细菌细胞就会发生一次极性转换，并改变运动的的方向。改变 的频率以及方向的偏离程度均由f r z 化学信号转导通路来调控。粘细菌的极性转换对粘 细菌正常的运动非常重要，可以促使单个细胞的重新定位。当细胞不可以调节其极性转 换的频率时，腾动、s 运动以及子实体的形成都会受到影响。f r z 化学信号转导通路是 通过一系列发育阶段细胞聚集缺陷的突变株的研究发现f f j d 3 1 ，在营养缺陷平板上，这 些突变菌株的细胞聚集紊乱，形成旋涡状的卷曲的f r i z z y 状结构，通过对单个突变菌株 的研究发现，导致这一表型的原因是由于细胞运动过程中发生反向运动的频率受到影响 所造成 1 4 】。 f r z 系统成分之一f 亿s 蛋白在s 运动中起重要作用，f r z s 带有n 端假接受结构域 ( p s e u d o - r e c e i v e rd o m a i n ) 和c 端的卷曲螺旋结构域( c o i l e d - c o i ld o m a i n ) 。f r z s 多数聚 集在细胞的前端，但在后端也同样存在。在运动过程中，f r z s 在前端的量不断降低而在 后端的量则不断增加。这种f r z s 量的变化频率受到f f z 化学信号转导通路的调控，这条信 号通路与细胞运动是直接相关的。有趣的是，删除了f r z sn 端假接受结构域以后，f r z s 则 一开始定位于细胞的后端而非前端。在这些突变株中，当细胞发生反向运动时，f r z s 首 先出现于细胞的前端，但不会停留，继而在后端发生聚集。与此相反，c 端发生突变的 菌株中，f 眩s 则不能聚集在后端。当n 端和c 端均发生突变时，f r z s 则不会在细胞两端 发生聚集，而是停留在细胞内的一种纤丝状结构中。据推测，f r z s 是借助于卷曲螺旋结 构域沿着纤丝状结构运输，再通过c 端和n 端结构域的共同作用定位于细胞的两端。如 图2 所示，首先f r z s 通过其n 端假接受结构域而锚定于细胞的前端。细胞运动过程中，f r z s 利用其c o i l e d - c o i ld o m a i n 沿着一种位于细胞骨架中的丝状结构逐渐往细胞的后端转移， 当细胞发生反向运动时，所有的f r z s 则全部迅速转移至细胞的新的前端。如此循环往复 【1 5 】。 图2 f r z s 在细胞极性转换过程中位置迁移示意图 m i g n o tt e ta l2 0 0 7 】 二a 型运动必需的蛋白因子 a 运动，调控个体或小的群体细胞运动，a 型运动不牵涉到菌毛或其它一些肉眼可 见的外部结构，因此很难找出促使a 型运动的动力，迄今为止a 型引擎的产生机制仍不明 确。目前存在着对a 运动引擎两种不同的解释。第一种解释w o l g e m u t h 等人提出的粘液 推动模型( s l i m ep r o p u l s i o n m o d e l ) ，即位于细胞的后端的a 型运动引擎，通过分泌粘 4 t 号 文献综述 液不断推动细胞向前运动【1 6 】。这种模型所提出的运动方式与一种海洋席藻 ( p h o r m i d i u ms p ) 的爬行运动相类似，这种菌所分泌粘液的速度与细胞的运动快慢相一致 1 7 】。而m i g n o t 等人通过对a 型运动中的一种起关键作用的蛋白因子a 酉z 定位的研究对 该解释提出了不同的看法。a g l z 在结构上与f r z s 类似，均带有n 端假接受结构域和一个 c 端卷曲螺旋结构 1 8 ，1 9 】。为了确定a g l z 在细胞中的定位，将于a g l z 与p ( 黄色荧光 蛋白) 相连，发现a g l z 在细胞运动过程中分散于细胞不同的位置。因此，m i g n o t 燕j a 型 运动提出了另一种解释：a 型运动引擎并非位于细胞的两极，而是分散于细胞中，沿着 细胞轴分布，并且与细胞骨架及跨膜附着复合物( m e m b r a n es p a n n i n ga d h e s i o nc o m p l e x e s ) 相连，产生推力推动细胞运动 2 0 1 。这两种解释最大的不同点在于a 引擎的定位。 三a 型运动和s 型运动的协调 大约每隔七分钟，粘细菌细胞就会发生一次极性转换。f r z 信号通路的突变会导致 细菌反向运动频率的降低。一些运动相关的蛋白，例如f r z s 和a g l z ，在接到细胞反向 运动信号以后，每隔几秒就是发生位置迁移。 f r z s ，是与s 型运动相关的蛋白，a 酉z ，是与a 型运动相关的蛋白，这两种蛋白， 在接到反向运动信号以后，在细胞前端和后端之间就会发生位置迁移。这两种运动相关 蛋白的相互协调对于促使粘细菌向同一个方向运动是非常重要的。在细胞发生反向运动 时，这两种蛋白均往新的前端转移。这两种运动极性转换保持一致的机制是什么呢? a 运动与s 运动的协调，这种极性转换的频率和方向受到f r z 信号转导系统的影响， f r z 系统是目前在粘细菌中发现的四个趋化信号转导系统之一，该级联系统的成分与肠杆菌 的趋化系统有高度同源性。在f m 系统缺陷株中，f r z s 几乎不能从细胞一端往另一端运 动。而a g l z 则完全不能发生反向运动。因此这两种蛋白均受到f r z 信号通路的调节。 m g l a 是唯一的与s 型运动和a 型运动均相关的一种蛋白 2 1 。在结构上与r a s 家 族的g t p 酶具有相似性。阻断其功能，粘细菌不能形成a 运动和s 运动，也不能够发 育，但不影响其在营养阶段的细胞生长分裂 2 2 ，2 3 】。在真核细胞中，g t p 酶作为一种 调控蛋白，通常与卷曲螺旋结构域发生作用，通过招募一些蛋白因子发挥作用。由于 m 西a 突变株是不运动的，因此它一定能通过招募对两种运动系统中起重要作用的蛋白 因子起作用。研究发现，m g l a 对f r z s 和a 西z 的定位起至关重要的作用，在m 西a 突 变株中，f r z s 始终停留在细胞的一极，而a 烈z 分散于细胞质中，不再成簇出现。因此， m 西a 是一个将f r z 信号转导通路与a 型运动和s 型运动联系起来的切入点。 由于天然的粘细菌生长在土壤中，而土壤的潮湿以及软硬程度处于不断的改变的状 态。因此，同时利用两种不同的运动体系对于粘细菌适应不同的生长环境是非常有必要 的。a 型运动在干燥结实的固体表面起主导作用，s 型运动系统则在柔软潮湿的固体表 面起主导作用。两种运动系统相互独立受各自相关的蛋白因子所调控，例如在s 运动中 起重要作用的f r z s 和在a 运动中起重要作用的a 西z ，这些蛋白功能既相互独立，同 时又相互协调调节细菌的运动。了解这些蛋白在粘细菌运动过程中的定位以及它们之间 的相互作用对细菌运动机制的认识有重要的意义。 5 东南大学硕士论文 参考文献： 1 h o a # i nj k a i s e rd g e n e t i c so fg l i d i n gm o t i l i t yi nm y x o c o c c u sx a n t h u s ：g e n e s c o n t r o l l i n gm o v e m e n to fs i n g l ec e l l s m o lg e ng e n e t 19 7 9 ；17 1 ：16 7 17 6 2 s o d g 蛔j ，k a i s e rd g e n e t i c so fg l i d i n gm o t i l i t yi nm y x o c o c e u sx a n t h u s ：t w og e n e s y s t e m sc o n t r o lm o v e m e n t m o lg e ng e n e t 19 7 9 ；l7 1 ：17 7 - 19 1 3 s h iw yz u s m a nd r t h et w om o t i l i t ys y s t e m so f m y x o c o c e u sx a n t h u ss h o wd i f f e r e n t s e l e c t i v ea d v a n t a g e so nv a r i o u ss u r f a c e s ，p r o cn a t la e a ds e iu s a 1 9 9 3 ；9 0 ：3 3 7 8 3 3 8 2 4 y o u d e r i a n 只h a r t z e l lp l t r a n s p o s o ni n s e r t i o n so fm a g e l l a n - 4t h a ti m p a i rs o c i a lg l i d i n g m o t i l i t yi nm y x o c o c c u sx a n t h u s g e n e t i c s 2 0 0 6 ：1 7 2 ：1 3 9 7 - 1 4 1 0 5 “ys u nh ，m ax ，l ua ，l u xr ，z u s m a nd ，s h iw ：e x t r a c e l l u l a rp o l y s a c e h a r i d e sm e d i a t e p i l u sr e t r a c t i o nd u r i n gs o c i a lm o t i l i t yo fm y x o c o e e u sx a n t h u s p r o cn a t la c a ds c iusa 2 0 0 3 ；1 0 0 ：5 4 4 3 - 5 4 4 8 6 m i g n o tt m e r l i ej pj r , z u s r n a nd r r e g u l a t e dp o l e - t o - p o l eo s c i l l a t i o n so fab a c t e r i a l g l i d i n gm o t i l i t yp r o t e i n s c i e n c e 2 0 0 5 ；310 ：8 5 5 - 8 5 7 7 q ld ，k o l e n b r a n d e rp e ，k a i s e rd n 璩m y x o c o c c u sx a n t h u sp i l q ( s g t a ) g e n ee n c o d e sa s e c r e t i nh o m o l o gr e q u i r e df o rt y p ew p i l u sb i o g e n e s i s ，s o c i a lm o t i l i t y , a n dd e v e l o p m e n t j b a c t e r i 0 1 1 9 9 9 ；1 8 1 ：2 牛- 3 3 8 w 砒ld ，w us s ，k a i s e rd c o n t a c ts t i m u l a t i o no ft e la n dt y p e p i hi nm y x o c o e e 峭 x a n t h u s jb a c t e r i 0 1 19 9 8 ；18 0 ：7 5 9 - 7 61 9 n u d l e m a ne ，w 砒ld ，k a i s e rd c e l l t 0 一c e l lt r a n s f e ro fb a c t e r i a lo u t e rm e m b r a n e l i p o p r o t e i n s s c i e n c e 2 0 0 5 ；3 0 9 ：1 2 5 - 1 2 7 10 b o n n e rp j ，b l a c k 帆y a n gz ，s h i m k e t s1 j f i b aa n dp i l aa c tc o o p e r a t i v e l yd u r i n g f r u i t i n gb o d yf o r m a t i o no fm y x o e o c c u sx a