（植物学专业论文）植物细胞类红膜肽与类力蛋白的分布及相关.pdf

植物细胞类红膜肽与类力蛋白的分布及相关 摘要 f 膜骨架源于动物血红细胞的研究，后来人们发现动物非血红细胞内也存在 膜骨架蛋白，并证明膜骨架与细胞内很多生理功能相关。近来的研究进一步发 现高尔基体上也存在膜骨架，它们可能在调控高尔基体囊泡分泌及运输方面起 一定的作用。但有关高尔基体膜骨架与细胞质力蛋白的连接，尚缺乏明确的证 据。而植物细胞膜骨架的研究也仅有少量报导。、“ 通过s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹发现，抗人红膜肽抗体可以与 玉米根尖中分子量$ 0 k d 的蛋白进行反应；抗鼠的力蛋白中间链抗体可以与玉 米根尖中分子量7 4 k d 的蛋白进行反应，该蛋白的分子量与动物细胞质力蛋白 中间链的分子量类似。在烟草花粉中进行s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印 迹发现，红膜肽抗体可以与分子量2 2 0 k d 的蛋白进行反应，而力蛋白中间链 抗体可以与分子量7 4 k d 的蛋白进行反应。 经免疫荧光标记及共焦激光扫描显微镜观察发现，烟草花粉和花粉管内以 及玉米根尖中，类红膜肽和类力蛋白存在于颗粒状细胞器上，经荧光双标发现 二者共分布在同一细胞器上。在玉米根尖中，对类红膜肽和类力蛋白进行免疫 金标，在电子显微镜下观察发现它们主要位于高尔基体附近的囊泡膜上。对类 红膜肽和类力蛋白进行双金标，在电子显微镜下观察发现，在高尔基体附近的 囊泡膜上它们存在共分布。 关键词：红膜肽；力蛋白；根尖；花粉管；玉米；烟草；植物细胞 y 一 始 、。最 里壅些盔堂堡主堂垡丝塞 d i s t r i b u t i o na n dc o r r e l a t i o no fs p e c t r i n l i k ea n d c y t o p l a s m i cd y n c i n - l i k e i np l a n tc e l l a b s t r a c t m e m b r a n es k e l e t o nw a ss t u d i e di ne r t h y r o i da tf i r s t t h e yw e r ef o u n di nn o n - e r t h y r o i d o fa n i m a ll a t e ra n dp r o v e dt h a tm e m b r a n es k e l e t o na r ei n v o l v e di nm a n yp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s r e c e n t l y , i tw a sf o u n dt h a tt h e r ea r em e m b r a n es k e l e t o ni ng o l g ia p p a r a t u so f a n i m a lc e l l i tm a ym e d i a t es e c r e t i o na n dt r a n s p o r to fg o l g in e t w o r k b u tt h ee v i d e n c eo f l i n k i n gg o l g is p e c t r i n t oc y t o p l a s m i cd y n e i ni sl a c k t h es t i l d ya l s or e m a i n st om a k e p r o g r e s s a b o u tm e m b r a n es k e l e t o ni np l a n tc e l l s a sm e a s u r e db yi m m u n o - w e s t e mb l o t t i n g ，w ef o u n dt h a tt h e r ew a st h eh o m o l o g yo f s p e c t f i ni nr o o t - t i pc e l l so f m a i z e ，i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s 9 0 - 1 0 0k d a w ea l s of o u n dt h a t t h e r ew a sh o m o l o g yo fc y t o p l a s m i cd y n e i ni nr o o t - t i pc e l l so fm a i z e ，i t sm o l e c u l a rw e i g h t w a s7 4 k d a ，s i m i l a rt ot h em o l e c u l a rw e i g h ti na n i m a lc e l l s t h es i m i l a rr e s u l tw a so b t a i n e d i nn i c o t i a n at a b a c u m , b u tt h em o l e c u l a r w e i g h to f t h eh o m o l o g yo f s p e c t r i nw a s 2 2 0k d ai n n i c o t i a n a t a b a c u m b yi m m u n o f l o r e c e n c el a b e l i n ga n dc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y o b s e r v a t i o n ，w ef o u n dt h a tt h es p e c t r i n l i k ea n dc y t o p l a s m i cd y n e i n l i k ep r o t e i n sd i s c r e t e d i s t r i b u t e di np o l l e na n dp o l l e nt u b e so f n i c o t i a n at a b a c u ma n d r o o t - t i pc e l l so f m a i z e b yi m m u n o f l o r e s e n c ed o u b l el a b e l i n g ，w ef o u n dt h a tt h es p e c t r i n - l i k ep r o t e i nw e r e c o l o c a l i z a t i o nw i t hc y t o p l a s m i cd y n e i n - l i k e p r o t e i ni np o l l e na n dp o l l e nt u b e so f n i c o t i a n a t a b a c u ma n dr o o t - t i pc e l l so fm a i z e i nm a i z er o o t - t i pc e l l s ，w ef o u n dt h a ts p e c 喇n 1 i k e p r o t e i na n dc y t o p l a s m i cd y n e i n - l i k ep r o t e i ne x i s tm a i n l yi nm e m b r a n e so fg o l g is e c r e t o r y v e s i c l e sb yi m m u n e g o l dl a b e l i n ga n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p eo b s e r v a t i o n w h e n d o u b l el a b e l e d ，w ef o u n ds p e c t r i n l i k ep r o t e i nw a sc o l o c a l i z a t i o np a r t l yw i t hc y t o p l a s m i c d y n e i n - l i k ep r o t e i ni ng o l g is e c r e t o r yv e s i c l e s k e yw o r d s ：s p e c t r i nd y n e i n r o o t - t i pp o l l e n m a i z en i c o t i a n at a b a c u m p l a n t e e l 2 ，；，；t。 ptl 垫塑塑堕茎塾壁然皇茎查堡皇堕坌塑墨塑羞一 p i p e s f i t c p b s b m m b s a p a g e s d s t r i t c n c t r i s e b c i p 缩写表 p i p e r a z i n e - n ，n 一b i s ( 2 - m o r p h o l i n o ) f l u o r e s e e i ni s o t h i o e y a n a t e p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n b u t y l m e t h y l - m e t h a e r y l a t e b o v i n es e r u ma l b u m i n p o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s s o d i u md o d e y ls u l f a t e c r y s t a l l i n et e t r a m e t h y l r h l d a m i n ei s o t h i o c y a n a t e n i t r o c e i l u l o s e t r i h y d r o x y m e t h y la m i n om e t h a n e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 一3 - i n k o l y lp h o s p h a t e 3 ；，溆魏 “，。，羹 ， # 鑫。_ ， 里奎些查堂堡主兰堡垒苎一一 第一章文献综述 高尔基体是连续的膜流动系统，是极化的囊堆结构，有特定的形态和腔室 化，在真核细胞中对蛋白质的加工和分类起主要作用。高尔基体有两个不同的 面：形成面，多与内质网相连；成熟面，形成高尔基体的反面。蛋白质分类发 生在高尔基体上，新形成的蛋白质进入形成面，在那里或者被分类循环返回内 质网，或通过高尔基体到成熟面，在成熟面处蛋白质被分类进入溶酶体、分泌 囊泡或直接到细胞表面。这就要求高尔基体有一个利于不同的膜蛋白分类过程 的装置。 高尔基体与细胞骨架成分的连接，尤其是与微管的连接，是保持其特定空 间位置和有效传递蛋白质和脂类到不同细胞位点所必须的。近来的研究表明， 连接高尔基体和细胞骨架所包含的成分( 如锚蛋白和红膜肽) 有利于高尔基体 膜与马达蛋白如力蛋白、动蛋白和肌动蛋白的连接，理解这种连接是如何调控 以及在高尔基体运输和动态中的作用是非常重要的。 一、膜骨架研究进展 1 膜骨架概述 动物细胞膜骨架最早发现于人的血红细胞内，当用非离子去垢剂处理血红 细胞时，人们发现了质膜下这种由多种蛋白质组成的网状结构( y u 。1 9 7 3 ) 。 其主要组成成分是红膜肽( s p e c t r i n ) 、锚蛋白( a n k y r i n ) 、肌动蛋白( a c t i n ) 。 此外还包括带3 蛋白( b a n d 3 ) 、带4 1 蛋白( b a n d 4 1 ) 、带4 2 蛋白( b a n d 4 2 ) 等( b y e r s ，1 9 8 5 ；l i u ，1 9 8 7 ；s h e n ，1 9 8 6 ) 。以后，逐渐在其它动物的血红细胞以 及很多其它类型的细胞内也发现膜骨架的存在。研究表明，动物细胞内膜骨架 存在具有普遍性( g o o d m a n ，1 9 8 8 ；b e n n e t t ，1 9 9 0 ；m a n g e n t ，1 9 8 8 ；c o l e m a n ， 1 9 8 9 ) 。 红膜肽是长型具柔性的分子，它大约2 0 0 - - 2 6 0 n m 长，3 6 n m 宽，有a ( 分 4 强“籀豳i 黼j 撼 棼j 疆：瀵碱：，罐抽隧囊菠 堕塑塑堕娄塾堕然皇鲞垄丝皇丝坌查墨塑羞 子量是2 8 0 k d ) 和b ( 分子量是2 4 5 - - 4 6 0 k d ) 两个亚基，这两个亚基通过a 亚单位n 末端区域和b 亚单位的c 末端相连往往形成反平行的二聚体，这两 个亚基还通过以下相互作用方式形成四聚体：( a ) 沿着ab 亚单位长度反平行 方向有弱的结合；( b ) 在b 亚单位n 末端和a 亚单位的c - 末端区域有紧密的 连接：( c ) 两个异源二聚体头头相连。 图1 膜骨架模式图( l u n a ，1 9 9 2 ) 在哺乳动物中，有两种a 亚单位，由不同的基因表达：组织不变的a 亚 单位位于人的第9 条染色体上，除了血红细胞，存在于所有组织中( l e t oe ta l 。 1 9 8 8 ) ；血红细胞a 亚单位位于人的第1 条染色体上( h u e b n e re ta l ，1 9 8 5 ) 鸟类及其它脊椎动物由一个基因同时编码血红细胞和其它组织的a 亚单位。 红膜肽和其它蛋白的结合位点大部分位于b 亚基上，这些蛋白包括锚蛋 白( a n k y r i n ，c a l v e r te ta l ，1 9 8 0 ；k e n n e d ye ta l ，1 9 9 1 ：d a v i s b e n n e t t ，1 9 8 4 ) 、 带4 1 ( c o l e m a ne ta l ，1 9 8 7 ) 、肌动蛋白( a c t i n ，k a r i n c he ta l ，1 9 9 0 ；f r a p p i e t e ta l ，1 9 9 2 ) 以及直接与膜相连的锚蛋白( s t e i n e re ta l ，1 9 8 9 ) 结合位点。现 在已经发现，红膜肽有以下一些蛋白质结合位点：( 1 ) ，红膜肽的b 亚基的n 。 末端具有肌动蛋白结合位点，从而可以使红膜肽与肌动蛋白相连( k a r i n c h ， 1 9 9 0 ：f r a p p i e r ，1 9 9 2 ) ；( b ) ，大多数红膜肽a 亚基的中间存在钙调蛋白结合 位点( h a r r i s ，1 9 8 8 ；l e t o ，1 9 8 9 ) ，但哺乳动物血红细胞的红膜肽上缺乏钙调蛋 白结合位点，而果蝇的红膜肽上的钙调蛋自结合位点的位置与脊椎动物的不同 ( d u b r e u i l ，1 9 8 9 ) ；( c ) ，锚蛋白结合位点位于红膜肽b 亚基的中部。此外，红 膜肽的中部包含多个由1 0 6 个氨基酸残基组成的重复片段，据研究，这些重复 5 羟瓢 里查些查兰堡主堂堡丝苎一一 片段主要由a 螺旋组成( 时i e r ，1 9 7 9 ：d a v i s ，1 9 8 4 ；k e n n e d y ，1 9 9 1 ) 。 1 3 亚单位是多种红膜肽的主要原因，不同的b 亚基有不同的功能。现已经 发现，b 亚单位有五个异型体，由不同的基因编码，b 。在大部分脊椎组织中， 由人的第2 染色体编码( h ue ta l1 9 9 2 ) ；8 。首先在血红细胞中鉴定在脑和骨 骼肌中表达( w i n k e l m a n ne ta 1 1 9 9 0 ，1 9 9 1 ) ，位于人的1 4 q 2 3 q 2 4 2 ( f u k u s h i m a e t a l1 9 9 0 ) 和小鼠1 2 染色体上( l n u r i l ae ta l1 9 8 7 ) ；bt w ，在肠的上皮细胞顶 端区域与末端网络相连( g l e n n e ye ta l ，1 9 8 3 ) 的特异亚单位，在鸟类中存在， 但是在哺乳动物中没有发现；b 。，在神经肌肉节点上鉴定到的( b l o c h m o r r o w ，1 9 8 9 ) ，在神经肌肉节点上的1 3 亚单位不与a 亚单位相连( b l o c h m o r r o w ，1 9 8 9 ) ，尽管在其它组织上有与甄单位相连的位点( v y b i r a le ta l ， 1 9 9 2 ) ；bh 是4 3 0 k d 的多肽，最初是在果蝇上发现的( d u b r e u i le t ，1 9 9 0 ) ， 与a 亚单位形成2 6 0 n m 的四聚体。 b 红膜肽在离体实验中有不同的功能，并且表达和位置也是不同的 ( c o l e m a ne ta l ，1 9 8 9 ) 。1 3r 和bo 对锚蛋白( h o w ee ta l ，1 9 8 5 ；d a v i s b e n n e t t ，1 9 8 4 ) 以及独立的锚蛋白膜的结合位点( s t e i n e r & b e n n e t t ，1 9 8 8 ) 亲和是不同，而1 3t w 没有结合带4 1 和锚蛋白的位点( h o w ee ta l ，1 9 8 5 ；c o l e m a n e ta l ，1 9 8 7 ) 。b 红膜肽也有不同的表达条带。在脑发育过程中，b 。在出生前 表达，而口r 在出生后表达，在出生】0 天达到最大量( r i e d e r e re ta l ，1 9 8 7 ： h ue ta l ，1 9 9 2 ) ，在心肌细胞的不同时期也有特异的b 亚单位的表达( n e l s o n l a z a r i d e s ，1 9 8 3 ) 。 鸡脑( w a s e n i u s ，1 9 8 9 ) 、人血红细胞( s a h r ，1 9 9 0 ) 、人肺成纤维细胞( m o o n ， 1 9 9 0 ) 和果蝇细胞( d u b r e u k l ，1 9 8 9 ) 内的红膜肽a 亚基c d n a 序列已经被确 定，在脊椎动物中其c d n a 序列具有9 0 的一致性，而在果蝇与鸡的红膜肽 n 亚基c d n a 之间也存在6 3 的致，人的红细胞q 亚单位与一般人的d 亚 单位相比，有5 0 6 0 的一致，这些结果表明，红膜肽0 亚基在进化过程中具 有高度的保守性。 关于红膜肽b 亚基一级结构的研究资料是包括人b 。红膜肽( w i n k e l m a n ne t a li 9 9 0 ，1 9 9 1 ) 以及人( h ue ta l ，1 9 9 2 ) 和d r o s o p h i l a ( b y e r se ta l ，1 9 9 0 ) 的bo 红膜肽的2 4 6 - - 2 7 0 k d 的全序列和d r o s o p h i l a 的bh 红膜肽( d u b r e n i le ta l ， 1 9 9 0 ) 的部分序列。研究发现，b 。和b 。在全序列中是紧密相关的，有一致的 6 。露。 “2 鎏 苎塑塑堕鲞塾堕丛量鲞垄堡垒塑坌塑墨塑羞一 结构域组成，并且序列有6 0 的一致性，这表明，红膜肽的b 亚基在进化过 程中同样具有高度的保守性。 有一些肌动蛋白结合蛋白含有与红膜肽b 亚基类似的肌动蛋白结合位点， 这些蛋白与红膜肽一起被称为红膜肽超家族，它们包括a - a c t i n i n ，d y s t r o p h i n ， a b p 2 8 0 ，a b p ，1 2 0 和f i m b r i n ( d u r b r e u i l ，1 9 9 1 ) 。其中a - a c t i n i n 和d y s t r o p h i n 分子内还包含红膜肽n 亚基的c 末端和1 3 亚基的n - 末端，并且与红膜肽具有 类似的重复片段，因此人们推测它们可能与红膜肽具有共同的起源( b y e r s ， 1 9 8 9 ) 。 由于红膜肽在细胞内是动态的，这表明红膜肤结构的装配和去装配是可以 调控的。研究发现，钙离子能调节红膜肽的装配。亚微摩尔钙离子和钙谪素竞 争抑制红膜肽和锚蛋白在脑膜上的位点( s t e i n e re ta l ，1 9 8 9 ) ，微摩尔钙离子 激活钙蛋白酶i ，从而裂解红膜肽n 亚单位中间区域靠近钙调素的结合位点 ( h a r r i se ta l ，1 9 8 8 ) ，这样导致降低了和脑膜位点的亲和( h u b e n n e t t - 1 9 9 1 ) 以及与a c t i n 丝的结合( h a r r i s m o r r o w ，1 9 9 0 ) 。更高浓度的钙离子能导致1 1 和p 亚单位裂解，失去与膜的结合能力并进一步降低与a c t i n 的相互作用。钙 调素、钙蛋白酶和钙能导致a c t i n 结合的完全失去，使红膜肽卸载成单体( h a r r i s & m o r r o w1 9 9 0 ) 。另一个调控因子是多磷酸肌醇，它能激活钙蛋白酶，使钙在 亚微摩尔水平的浓度上裂解红膜肽( s a i d oe ta l ，1 9 9 2 ) 。 2 动物细胞高尔基体膜骨架研究进展 自动物血红细胞内发现膜骨架以来，一直到9 0 年代初期，有关膜骨架的 研究主要集中在质膜上；至于细胞内其它细胞器尤其是内膜系统上是否存在膜 骨架，并没有明确的证据。1 9 9 4 年，b e c k 等人首次用免疫荧光标记、抗体显 微注射等方法，明确证明动物细胞高尔基体上存在类血红细胞红膜肽，并发现 高尔基体红膜肽与高尔基体的动态变化相关( b e c k ，1 9 9 4 ) 。因此。他们认为， 高尔基体上可能存在类似血红细胞质膜下膜骨架的结构，并推测高尔基体膜骨 架可能参与了蛋白质从高尔基体向其它地方分类及分泌转移的控制( b e c k ， 1 9 9 6 ) 1 9 9 6 年，d e v a r a j a n 等人进一步用分子生物学等方法证明动物细胞高尔 基体上不仅存在膜骨架蛋白红膜肽，而且还存在锚蛋白：并且在高尔基体上， 7 旦壅些盔堂堡圭兰垡望苎 红膜肽与锚蛋白是结合在一起的，这就进一步证实了膜骨架在高尔基体上的存 在( d e v a r a i a n ，1 9 9 6 ) 。以后，d e v a r a j a n 、b e c k 等人又进一步证明，多种动物 细胞高尔基体上存在膜骨架蛋白红膜肽和锚蛋白，并证明动物细胞高尔基体上 的红膜肽主要是类血红细胞膜骨架中的b 红膜肽( b s p e c t r i n ) ，而不是般 非血红细胞膜骨架中的红膜肽( f o d r i n ) ：分别用这两种红膜肽抗体处理动物细 胞发现，b 红膜肽( b s p e c t r i n ) 抗体只与高尔基体结合，而f o d r i n 抗体只与 质膜结合( d e v a r j a n ，1 9 9 7 ；b e c k ，1 9 9 7 ) 。但是动物细胞高尔基体上的锚蛋 白却存在两种不同的类型，一个分子量是1 9 5 k d ( b e c k ，1 9 9 7 ) ，另一种分子 量是1 1 9 k d ( d e v a r a j a n ，1 9 9 6 ) 。进而h o l l e r a n 等人发现细胞质力蛋白的结合 蛋白d y n a c t i n 与红膜肽共同分布于高尔基体上( h o l l e r a n ，1 9 9 6 ) 。由于细胞质 力蛋白( d y n e i n ) 参与高尔基体囊泡的运输，而细胞质力蛋白与高尔基体囊泡 不能直接结合，它与高尔基体囊泡的结合需要以d y n a c t i n 为桥梁；但人们发现 d y n a e t i n 也并不直接与囊泡相连，因而微管马达蛋白如何与囊泡相连成为个 谜( s h a f e r ，1 9 9 4 ) 。h o l l e r a n 等人根据d y n a c t i n 与红膜肽共同分布于高尔基体 上的事实，提出一个假设，认为力蛋白可能通过d y n a c t i n 与红膜肽相连而连接 在高尔基体囊泡上。他们认为，d y n a c t i n 通过其上的a r p l 与高尔基体上的红 膜肽相连，而红膜肽通过锚蛋自与高尔基体囊泡上的跨膜蛋白相连，从而把高 尔基体囊泡连接在细胞质力蛋白上，使之得以沿微管骨架运动( h o l l e r a n ， 1 9 9 6 ) 。f a t h 等人进一步用体外方法证明纽胞质力蛋白确实是与膜骨架蛋白一 起结合在高尔基体囊泡上( f a t h ，1 9 9 7 ) 。2 0 0 1 年。h o l l e r a n 等又进一步证明， d y n a e t i n 上的a r p l 可以和b 一红膜肽相连，从而进一步说明高尔基体膜骨架的 功能之一可能是通过与力蛋白连接参与高尔基体囊泡的运输( h o l l e r a n ，2 0 0 1 ) 。 i 司年，m u r e s a n ( 2 0 0 1 ) 等人用重组实验证明红膜肽是力蛋白推动反向轴丝运 输所必须的。 8 。鹌鲻随领b 、叫“凌 撼过砘； 堕塑塑堕篓堑堕堕兰耋垄望皂盟坌查垦塑茎一 图2 高尔基体膜骨架参与力蛋白推动囊泡运输模式图 ( l i p p i n c o t c s c h w a r t z ，19 9 8 ) 另一方面，l o r r a ( 1 9 9 9 ) 等人认为膜骨架蛋白红膜肽和肌动蛋白高尔基 体上装配成二维网络，由a c t i n s p e c t r i n 形成两个不同的结构，一个称为限制型， 一个称为接受型。在限制型，囊泡不能进入，因此不能和高尔基体膜融合：在 接受型，网络由于局部去装配和重新分布，使得囊泡和高尔基体膜融合。高尔 基体膜骨架从限制型到接受型局部变化不仅使囊泡在高尔基体形成面融合，也 是成熟面处囊泡形成机制，膜骨架通过限制高尔基体腔室的大小，对腔室产生 压力，当网络局部去装配或重新排列时，是膜出芽的推动力量。 9 滏螽通馘陵滤巍纛鑫。l i 女邀纛。i 纛，是幻； ：，0tljff； ! 曼查些盔兰堡主堂垡丝奎 一一 图3 网络假说模式图( l o r r a ，1 9 9 9 ) 3 植物细胞膜骨架研究概况 王育东、阎隆飞等人首次证明高等植物细胞内存在与动物细胞相类似的膜 骨架蛋白( 王育东、阎隆飞，1 9 8 6 ) ，并对蚕豆叶细胞内红膜肽进行了免疫鉴 定( 王育东、阎隆飞，1 9 9 0 ) 。以后，m i e h a u d 等人用免疫印迹方法证明，植 物细胞内的类红膜肽蛋白分子量也是2 2 0 k d ，类似于血红细胞1 3 一红膜肽的分 子量，进而，他们用免疫荧光定位方法发现植物叶肉细胞内类红膜肽是以颗粒 状分布在细胞质中的，但他们未能确定这些颗粒是什么细胞器( m i c h a u d ， 1 9 9 1 ) 。以后，f a r a d a y 等人用免疫印迹法证明根尖细胞内也存在类红膜肽蛋白 ( f a r a d a y ，1 9 9 3 ) ，d er u i j t e r 和e m o n s 等人用类似方法发现很多植物细胞内 存在类红膜肽蛋白，同时，他们利用免疫荧光定位法发现，多数植物细胞内类 红膜肽是以颗粒状分布在细胞质中的( d er u i j t e r ，1 9 9 3 ) 。以后，他们又发现 1 0 越k g q ，。；忿。，# i 建t i 植物细胞类红膜肚与类力蛋白的分布及相关 植物根毛细胞内也存在类红膜肽( d er j u t e r ，1 9 9 8 ) 。同时，r e u z e a u 等人用抗 体显微注射法发现，植物细胞中类红膜肽也是以颗粒状方式存在，并与内膜系 统共分布( r e n z e a n ，1 9 9 7 ) 。由此推测，植物细胞中有膜骨架蛋白红膜肽( m i c h a l l o r e n ze ta l ，1 9 9 5 ) 。 1 9 9 9 年，李岩等人首次用免疫印迹、免疫金标及电子显微镜和免疫荧光定 位，对川百合花粉及花粉管进行研究，首次明确证明类红膜肽位于花粉及花粉 管内高尔基体附近的囊泡膜上( 李岩等，1 9 9 9 ) ；同年，h o l z i n g e r 等人以低等 植物绿藻为材料，用免疫金标和电子显微镜也发现类红膜肽位于高尔基体附近 的囊泡膜上( h o l z i n g e r ，1 9 9 9 ) 。由此可见，在植物细胞的内膜系统上也有膜 骨架，可能主要位于高尔基体附近的囊泡膜上。但植物细胞膜骨架的功能尚不 清楚。2 0 0 0 年，d er u i j t e r 报道，在植物细胞核中也发现有类红膜肽。 二、力蛋白 1 力蛋白概述 力蛋白最初是在鞭毛轴丝中作为a t p a s e 鉴定出来的( g i b b o n s r o n e ， 1 9 6 5 ) ，直到2 0 年后，在1 9 8 7 年，p a s c h a l 和v a l l e e 才从脑组织中把细胞质 力蛋白分离出来，并确定细胞质力蛋白是马达分子，担负着沿着微管朝负极方 向的运输( p a s c h a l & v a l l e e ，1 9 8 7 ) 。以后在植物( m o s c a t e l l i ，1 9 9 5 ) 和酵母 ( d e s h e l ，l a e ta l ，1 9 9 3 ) 中均发现力蛋白的存在。力蛋白不仅在细胞内担 负细胞器沿微管朝负极端运输，而且在有丝分裂中也起重要作用。 力蛋白是目前已知的最大的最多的马达蛋白复合体。迄今对它的结构，传 统的生化对它的了解很有限。随着分子生物学的迅速发展，对力蛋白的亚单位 及功能上与力蛋白相关蛋白研究使人们对力蛋白分子如何装配和行使功能有新 的了解。现有研究过的生物进行的序列分析表明，细胞质力蛋白的重链是由单 基因编码的，它们在细胞内可以执行不同功能；而轴丝力蛋白则由多复合体基 因家族编码的，而且轴丝力蛋白多种重链的功能是并列的( c o o r d i n a t e d ) ，不 是执行不同的功能；细胞质力蛋白和轴丝力蛋白重链的结构是保守的，有4 个 墓搿隧浚自t 灏3 灞酴灞瓢j 。墓l 潼 里壅些查主堡主堂丝堕塞 一 保守的p - 环共有序列，对核苷酸的结合和水解是保守的，细胞质力蛋白的中间 链在细胞内起靶位点作用。通过p c r 分析揭示了广泛的力蛋白家族 力蛋白是结构相似功能不同的蛋白家族，已经鉴定出来三种力蛋白从位 置看，轴丝力蛋白分为外臂和内臂力蛋白。衣藻外臂力蛋白是由三个头的复合 体组成，现已确定，只有原生生物轴丝力蛋白有三个头，其它生物的力蛋白都 是两个头。 内臂力蛋白在组成和分布上变化很大，现已鉴定到七个不同内臂亚型 ( k a g a m i k m i y a l 9 9 2 ；p i p e r n o e ta l ，1 9 9 0 ) ，并且发现内臂力蛋白随着轴丝长 度的变化，成分有所变化( p i p e r n o & r a m a n i s ，1 9 9 1 ) 。 细胞质力蛋白是第三种结构类型，与轴丝力蛋白相比，在细胞内功能更广 泛，在结构上更保守。 在形态学上，轴丝力蛋白和细胞质力蛋白是相似的。由1 3 个重链多肽 组成，大小是4 7 1 5 4 0 k d a ，中间链的数量不定，( 5 7 1 4 0 k d a ) ，轻链是6 2 2 k d a ，多肽的大小与中间链有关。 力蛋白的头是球形的，每个头的形状有些不同( s a l ee ta l ，1 9 8 5 ) ，直径是 1 0 - 1 4 n m ，通过细长的杆与底部连接( j o h n s o n & w a l l ，1 9 8 3 ：g o o d e n o u g h & h e a s e r ，1 9 8 5 ：v a l l e ee ta l ，1 9 8 8 ) ，细胞质力蛋白的分子量是1 2 x1 0 6 d a ( v a l l e e e ta l ，1 9 8 8 ) ，轴丝力蛋白的分子量是1 2 1 9 1 0 6 d a ，其分子量与球形头的 数量有关( j o h ne ta l ，1 9 8 6 ) ；分子底部和每个头的大小相似( j o h n s o n w a l l ， 1 9 8 3 ：v a l l e ee ta l ，1 9 8 8 ) ，底部是由几个球形域组成( s a l ee ta l ，1 9 8 5 ) ，这些 球形域代表着单个力蛋白的附属亚单位，轴丝力蛋白和细胞质力蛋白的各种突 出物如丝状杆与头相连，这些突出物的作用是与微管连接( g o o d e n o u g h & h e u s e r ，1 9 8 2 ，1 9 8 4 ；a m o s ，1 9 8 9 ) 。在轴丝中，球形力蛋白的头与外臂微管 的双联体的1 3 - 管相连，底部结合到a 管上( j o h n s o n & w a l l ，1 9 8 3 ) ，而细胞 质力蛋白的底部起锚定作用，把力蛋白锚定到细胞器或着丝粒上。力蛋白的球 形头与微管相互作用( v a l l e ee ta l ，1 9 8 8 ) 。 2 力蛋白重链 2 1 力蛋白重链序列 ，矗、 堕塑塑望壅塾塞然兰壅垄里鱼鲤坌塑墨塑茎 通过分析细胞质力蛋白重链的全序列和部分序列，表明这些多肽有高度的 保守性。力蛋白重链中心的第三个序列最保守，其次是c 末端第三个序列，n 末端第三个序列差异最大。 力蛋白重链有多个p 环( w a l k e re ta l ，1 9 8 2 ) ，在海胆轴丝力蛋白b 一重链 上，看到有5 个p 环( g i b b o ne ta l ，1 9 9 1 ；o g a w a ，1 9 9 1 ) ，其中一个靠近n 末端的p 环，在其它重链中没有看到，其它四个p 环有规律的分布在多肽中 心区域，在当前已经确定的所有力蛋白中，四个p 环成分之间的基本序列和间 隔是保守，并且力蛋白有3 5 4 0 k d 的a t p a s e 或a t p 结合区域，a t p 水解主要 位点是在b 力蛋白重链的靠近头一个p 环处( g i b b o n se ta l ，1 9 9 1 ) ，进一步 支持头一个p 环作用的保守性是因为在所有的已知序列中第一个p 一环是完全 保守的。 在现有的力蛋白全序列中，p 环的2 ，3 ，4 也鉴定出来了，它们的序列差 异很大，在轴丝力蛋白中，p 环4 和p 环1 保守性相同，在细胞质力蛋白中， p 环3 是高度保守的，p 环2 变化最大。 轴丝力蛋白对a t p 水解有高度特异性( g i b b o n s ，1 9 9 6 ) ，而细胞质力蛋白 可以水解c t p ，t t p ，g t p ，u t p ，和a t p ( s h p e t n e re ta l ，1 9 8 8 ：c o l l i n v a l l e e ， 1 9 8 9 ) ，但是只有a t p 维持离体微管滑动( p a s c h a l v a l l e e ，1 9 8 7 ) ，对于核 苷酸酶活性在细胞质力蛋白中的作用还不清楚。 轴丝力蛋白和细胞质力蛋白的动态参数的不同与重链的一级结构有关，此 外在功能上两种力蛋白也是不同的。 在轴丝力蛋白和细胞质力蛋白重链中，氨基末端的第三个序列变异较大 ( m i k a m ie ta l ，1 9 9 3 ) ，在这个区域中，细胞质力蛋白的序列( m i k a m ie ta l ， 1 9 9 3 ) 和轴丝力蛋白序列是保守的( m i t c h e l l b r o w n1 9 9 4 ：w i l k e r s o ne ta l 1 9 9 4 ) 。力蛋白重链的头三个氨基酸序列说明了异型体的功能特异性，例如调 节重链和力蛋白其它复合体的连接；此外，在轴丝力蛋白内氨基末端区域参与 锚定力蛋白和连接力蛋白分子底部到轴丝外臂双联体的a 微管上。 细长的杆由多肽链主链延伸形成，球形头部可能由含有功能域的中心p 环 折叠而成。 2 2 力蛋白重链的家族范围 现有的研究表明，在大鼠、小白鼠、网柄菌属、果蝇属以及酵母中发现细 胞质力蛋白重链基因是单个的，( k o o n c e e ta l ，1 9 9 2 ：m i k a m ie ta l ，1 9 9 3 ；x i a n g e ta i ，1 9 9 4 ：l ie ta l ，1 9 9 3 ；e s c h e le ta l ，1 9 9 3 ) ，而轴丝力蛋白有多种重链 基因。 g i b b o n se ta l ( 1 9 9 4 ) 在海胆上鉴定到1 4 个不同的c d n a 序列其中一个 与鞭毛b 重链对应，而其它的由于与网柄菌属以及大鼠序列有同源性，认为 是细胞质力蛋白序列，多数部分序列是编码不同轴丝力蛋白重链的异型体，其 中有一个是编码细胞质力蛋白序列。 在草履虫属中鉴定了8 个部分力蛋白c d n a ，其中有一个是对应于细胞质 力蛋白( a s a ie ta l ，1 9 9 4 ) ，在果蝇属鉴定到7 个部分序列，其中一个是编码细 胞质力蛋白序列( r a s m a s s o ne ta l ，1 9 9 4 ) 。 通过部分序列可以估计力蛋白重链基因家族范围，在海胆上发现至少有1 5 个不同的力蛋白重链基因( g i b b o n se ta l ，1 9 9 4 ) ，在草履虫属发现至少有1 2 个力蛋白重链基因( a s a ie ta l ，1 9 9 4 ) ，这些结果与生化分析各种轴丝力蛋白 异型体是一致的，其中有些异型体可能是内臂力蛋白( g i b b o n se ta l ，1 9 9 4 ： w i l k e r s o ne ta l ，1 9 9 4 ) 异型体，这些序列可以用于鉴定p 一环外的保守序列， 用这些p 环保守序列来鉴定是轴丝力蛋白还是细胞质力蛋白的( a s a ie t a l ， 1 9 9 4 ) ，在p 一环1 附近看到了两个高度保守的成分( g i b b o n se ta l ，1 9 9 4 ：w i l k e r s o n e ta l ，1 9 9 4 ) ，这些序列对力蛋白的结构和功能还不清楚。 ，目前许多力蛋白重链基因被确定为基因家族，不是超家族，通过分析力蛋 白重链的全序列和部分序列发现，轴丝力蛋白和细胞质力蛋白之间的差异是相 对进化的结果，不是功能的不同。 3 中间链 衣藻鞭毛外臂力蛋白有1 0 个附属多肽，由两个中间链( 7 8 k d a 和7 0 k d a ) 和8 个轻链( 1 9 6 7 8 k d a ) ( p f i s t e re ta l ，1 9 8 2 ) 组成，而海胆的外臂力蛋 白有三个多肽( 1 2 2 、9 0 和7 6 k d a ) 和一系列轻链( b e l le ta 1 ，1 9 7 9 ) ，公牛 精子中有1 1 个多肽( 8 5 、7 3 、6 5 、6 3 、5 7 、2 2 、1 9 、1 1 5 、9 、7 5 和6 k d a ) ， 1 4 。墓女_ 纛。一溢。 目巍q 垫塑塑望壅塾堕壁兰娄垄曼皂塑坌变墨塑羞 一 衣藻上三个内臂力蛋白都有不同附属多肤的补充物( g o o d e n o u g h h e a s e r ， 1 9 8 5 ；p i p e r n oe ta l ，1 9 9 0 ：k a g a m i k a m i y a ，1 9 9 2 ) 。而细胞质力蛋白有 一组7 4 k d a 的多肽和四个低分子量多肽，分子量变化范围是5 3 5 9 k d a ( p a s c h a le ta l ，1 9 8 7 b ：c o l l i n s & v a l l e e ，1 9 8 9 ) ，但是在细胞质力蛋白中没 有鉴定到轻链。在进化过程中。力蛋白附属亚单位在功能上是保守的，长度 是变化的。 3 1 力蛋白中间链的分子鉴定 大鼠和网柄菌属中间链总的序列同源性是3 9 ，比轴丝和细胞质之间的同 源性高，大鼠和小白鼠序列同源性是7 6 ( v a u g h n c ta l ，1 9 9 3 ) ，而c 一末端区 域同源性更高。 生化证据表明：中间链位于分子底部，相互连接并与微管蛋白连接，中间 链在力蛋白功能中起重要作用，在轴丝上，担负着把外臂力蛋白锚定到a 微 管上，在细胞内，细胞质力蛋白中间链是细胞质力蛋白复合体的靶位点( p a s c h a l e t a l ，1 9 9 2 ) ，把细胞质力蛋白连接到膜细胞器表面或着丝粒上。力蛋白中间 链和p 1 5 0 0 “的连接从而使力蛋白和d y n a c t i n 连接在一起，中间链与p 1 5 0 0 “ 连接的区域可能也是中间链自我结合的区域，在中间链内内执行不同的功能 ( v a u g h a n e ta l ，1 9 9 5 ) 。 由于中间链有序列保守条带，有理由推测，c 末端区域担负着中间链的普 遍功能，如与重链的结合( p a s c h a le ta l ，1 9 9 2 ) ，而n 末端的功能是特异性的， 在轴丝力蛋白外臂双联体的a 微管上，可能参与分裂外臂、内臂力蛋白到各 自连接位点，以及连接细胞质力蛋白到膜表面或着丝粒上。 3 2 低分子量附多肽的确定 对于力蛋白低分子量的多肽的功能和结构了解很少。生化分析表明，有一 些轻链与中间链相连，有的位于力蛋白分子底部，是否这个模式适用于所有轻 链还不清楚，现有资料提出一种可能：有些多肽调节轴丝力蛋白与a 一微管的