（植物学专业论文）硫化氢脱氢酶的分离纯化及性质研究.pdf

中文摘要 从来源于烟气生物脱硫系统的好氧产硫磁性稳态流化床反应器 ( a m s f b ) 中取磁性多孔珠固定化生物膜，采用排硫硫杆菌培养基在好氧 条件下，经富集培养、反复分离纯化获得纯分离物。对分离物进行形态、 生理生化分析，结果如下：呈短杆状，大小为0 3 0 5 1 1 1 51 1m ， 最适生长温度为2 8 ，最适p h 为7 0 ；革兰氏染色阴性，端生鞭毛；在 硫代硫酸盐琼脂上的菌落为圆形，表面隆起，边缘完整，直径l m m - 2 n n 左 右；菌落开始透明，随后因硫沉淀而呈白色，进一步菌落中心变为褐色； 液体长期培养p h 值会下降，且有单质硫产生；液体静置培养时形成粘膜， 粘膜具有下垂的纤丝；严格自养，通过氧化硫代硫酸盐、硫化物、连四 硫酸盐获取能量，积累硫粒，缓慢氧化元素硫，以硝酸盐、铵盐作为氮 源。对应伯杰氏细菌鉴定手册，初步鉴定该分离物为硫杆菌属 ( t h i o b a c i l l u s ) 的排硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o p a r u s ) 。 将反复纯化分离得到的排硫硫杆菌细胞经超声破碎后，采用四步工 艺分离纯化出一种新型的膜结合型的硫化氢脱氢酶。光谱分析表明该酶 含有1 分子的血红素c 和一分子的f a d ；s d s - - p a g e 表明该酶由分子量 4 2 6 k d a 和5 1 3k d a 的两个亚基构成；该酶属于氧还蛋白家族，其最适 p h 为8 5 ，最大反应速度为4 9 + 0 1 州c y t c ( m g 蛋白) 1 m i n 一，对马 心细胞色素c 和硫化物的表观l ( m 分别为2 1 0 3 州和6 1 0 8p m ； 电子转移化学计量关系表明该酶的氧化产物为元素硫。 关键词：分离鉴定，生长曲线，硫化氢脱氢酶，排硫硫杆菌，硫化物氧化 a b s t r a c t i s o l a t i o no ft h eb a c t e r i aw a sp e r f o r m e df r o ma e r o b i cm a g n e t i cs t a b i l i z e d f l u i d i z e db e dr e a c t o ro ff l u eg a sb i o d e s u l f u r i z a t i o ns y s t e m t h ei m m o b i l i z e d b i o f i l ms a m p l e sw e r ec u r u r e do nt h i o b a c i l l u se n r i c h m e n tm e d i au n d e r a e r o f i ec o n d i t i o n s t h ei s o l a t e dc u l t u r e sw e r eo b t a i n e dt h r o u g hr e p e a t e d s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n t h ei s o l a t e db a c t e r i aw a si d e n t i f l e dt of i n do u t t h a t ：t h em o r p h o l o g yo ft h eb a c t e r i aw a sr o d - s h a p e d ；t h ea v e r a g es i z eo ft h e b a c t e r i aw a s0 3 0 5x1 1 1 5um ：t h eo p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r ew a s 2 8 0 c ：t h eo p t i m u mp hw a s7 0 t h er e s u l t so fg r a ms t a i n i n gf o rt h eb a c t e r i a i n d i c a t e d t h a tt h eb a c t e r i aw e r en e g a t i v ew i t hf l a g e l l ao ni t ss i d e t h ec o l o n i e s o nt h i o s u l p h a t ea g a rm e d i aw e r er o u n d s h a p e dw i t hb u m p s u r f a c e ，i n t e g r a t e d f r i n g e a n dt h ed i a m e t e ro ft h e mi sa b o u tl m m - 2 m m t h ec o l o n yw a s t r a n s p a r e n tf i r s t ，t h e ni tb e c a m ew h i t ef o rt h es u l p h u rs e d i m e n ta n da tl a s tt h e c e n t r eo ft h ec o l o n yt u r n e d b r o w n a f t e rt h el o n g - t e r mc u l t u r e ，t h em e d i ap h d r o p p e da n dt h ee l e m e n t a ls u l p h u rw a sy i e l d e d t h ef i l mw i t hs a gf i b e r sw a s f o r m e dw h e nt h es a m p l e sw e r ec u l t u r e ds t a b l yi i lt h el i q u i d t h eb a c t e r i aw e r e s t r i c t l ya u t o t r o p h i ca n dt h e yd e r i v e de n e r g yf o rg r o w t hf r o mt h eo x i d a t i o no f t h i o s u l p h a t e ，s u l p h i d e ，n a 2 5 4 0 6w i t hn i t r a t ea n da m m o n i u ma sn i t r o g e n s o u r c et oa c c u m u l a t ee l e m e n t a ls u l p h u rp a r t i c l e s t h e ne l e m e n t a ls u l p h u r p a r t i c l e sm a yb e o x i d a t e dc o n t i n u a l l y a c c o r d i n gt ob e r g e y sm a n u a lo f d e t e r m i n a t i v e b a c t e r i o l o g y , t h e c u l t u r ew a s c l e m e n t l y i d e n t i f i e da s t h i o b a c i l l u st h i o p a r u so ft h i o b a c i l l u sg e n u s an o v e lm e m b r a n e - b o u n ds u l f i d ed e h y d r o g e n a s ee n z y m ew a sp u r i f i e d f r o mt h e n e u t r o p h i l i c ，o b l i g a t e l yc h e m o l i t h o a u t o t r o p h i c t h i o b a c i l l u s t h i o p a r u sb ym e a n so faf o u r - s t e pp r o c e d u r e s p e c t r a la n a l y s i sr e v e a l e dt h a t t h ee n z y m ec o n t a i n sh a e mca n df l a v i n s d s p a g es h o w e dt h ep r e s e n c eo f t w ot y p e so fs u b u n i tw i t hm o l e c u l a rm a s s e s o f4 2 6a n d5 1 3k d a a c o m b i n a t i o no fs p e c t r a la n a l y s i sa n dt h ep y r i d i n eh a e m o c h r o m et e s ti n d i c a t e d t h a tt h es u l f i d ed e h y d r o g e n a s eh e t e r o d i m e rc o n t a i n so n em o l e c u l a ro fh a e mc a n do n em o l e c u l a ro ff l a v i n i ta p p e a r e dt h a tt h es u l f d ed e h y d r o g e n a s ei sa m e m b e ro fas m a l lc l a s so fr e d o xp r o t e i n s t h ep ho p t i m u mo ft h ee n z y m ei s 8 5 t h ev m a xw a s4 9 ：印1p m o lc y t o c h r o m ec ( m gp r o t e i n r a i n ) a n dt h e k mv a l u e sf o rc y t o c h r o m e sa n ds u l f i d ew e r e2 t 士0 3 肛ma n d6 1 i - 0 8p m ， r e s p e c t i v e l y o nt h eb a s i so fe l e c t r o nt r a n s f e rs t o i c h i o m e t r y , i ts e e m sl i k e l y t h a ts u l f u ri st h eo x i d a t i o np r o d u c t k e yw o r d s ：s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n ，g r o w t hc u r v e ，s u l f i d e d e h y d r o g e n a s ，t h i o b a c i l l u st h i o p a r u s ，s u l f i d eo x i d a t i o n 内蒙古师范大学硕士学位论文 1 前言 1 1 硫氧化细菌研究概况 自然界中的硫循环如下图卜l ，其中硫的生物循环1 1 1 是硫素循环中最为重要的环 节。硫的生物循环包括以下几个部分：( 1 ) 在厌氧环境条件下，硫酸盐经硫酸盐还 原菌作用，被还原为硫化物的过程，这个过程称为异化还原过程( 图1 - 1 中) ；( 2 ) 硫化物在好氧硫杆菌的作用下被氧化为单质硫和硫酸盐的过程，这个过程称为生物氧 化过程( 见图卜1 中) ；( 3 ) 硫酸盐在细菌的作用下被转化为有机硫的过程， 这个过程被称为硫的同化还原过程( 见图卜l 中) 。这些硫的生物循环过程与物化 过程( 见图1 1 中1 1 、1 2 ) 紧密结合，共同构成了硫的自然循环【2 l 。硫的自然循环主 要是通过硫的生物循环来实现的p 。 图1 - 1 自然界中的硫循环过程 f i g 1 lt h ec i r c l eo f s u l f u ri nn a t i i i e 自然界的硫素循环是通过不同生物体及化学过程协同完成的，包括动物、植物和 微生物，其中硫氧化菌和硫还原菌在硫循环中起着很重要的作用。根据自然界硫素循 环机理，利用硫酸盐还原菌( s r b ) 将s o , 还原为异化还原产物h 2 s 及同化还原产物有 硗化氢脱氧酶的分离纯化及性质研究 机硫，产生的h 2 s 废气采用碱液或用微生物水溶液或悬浮乳液吸收，然后利用微生物 脱除液相中溶解的硫化物，由此产生的硫化物二次污染物( 包括h 2 s 、s 2 和h s 一) 可 通过某些氧化菌将其氧化为单质硫。该法不仅可避免硫化物的毒性、腐蚀性、恶臭和 高耗氧量等问题对水体环境所造成的污染，又可解决其深度氧化为s q 惭产生的污 染m l 。因此，解决s 旷和硫化物污染的关键是分离和研究能氧化硫化物的微生物。 有文献表明自然界的硫化物可通过以下三种方式被微生物氧化【”1 ：由硫氧化光 合菌进行的厌氧氧化； 由反硝化细菌进行的氧化； 由无色硫细菌进行的氧化。 自然界中能氧化硫化物的细菌种类很多，大部分属于化能自养型，主要可分为3 大类： 丝状硫细菌，光合硫细菌，无色硫细菌【1 2 l 。 丝状硫细菌主要包括2 个属，即贝氏硫细菌属( b e g g i a t o a ) 和发硫菌属 ( t h i o t h r i x ) 它们生活在含硫化物的水中，能在有氧环境中把水中的硫化氢氧化为 单质硫，并从中获得生长和活动所需的能量，生成的单质硫则以硫粒的形式沉积在细 胞体内( 习惯称硫磺细菌) ，当环境中缺少硫化氢时菌还可将单质硫进一步氧化为硫 酸盐。 光合硫细菌是一类光能营养细菌叶“i ，可以从光中获得能量，依靠体内特殊光合 色素，同化c 0 2 进行光合作用。表1 1 列出了光合硫细菌的分类及特征。 表1 - 1 光合硫细苗的分类及特征” ， t a b l ei - ic l a s s i f i c a t i o na n dc l l a r a c t e r i s t i co f s y n t h e t i cs u l f u r b a c t e r i a 科 代谢特性电子供体 胞外捧硫，严格厌氧 绿丝菌科 着色菌科 红螺菌科 兼性光能营养型，兼性自养， 胞外捧硫，高温型 光能营养型，兼性自养， 胞内捧硫，兼性好氧 兼性光能营养型，兼性自养， 胞外捧硫 s 2 - , 有机酸 s 2 i ，s 2 0 3 i s 0 。h 2 ，有机酸 有机酸 该类菌主要包括：严格光能自养型，着色菌科( c h r o m a t i a c e a e ) 的着色菌属和绿菌 2 内蒙古师范大学硕士学位论文 科( c h l o r o b i a c e a e ) 的绿菌属；另一类是兼性光能自养型，它们能以有机物( 简单的 有机酸和醇类) 作为电子供体和碳源，主要包括红螺菌科rr h o d o s p ir i l l a c e a e ) 的红螺 菌属、红假单胞菌属、红微菌属及绿丝菌科( c h l o r o f l e x a c e a e ) 。光合硫细菌在自然界 硫的转化过程中起着重要的作用，是自然界中单质硫沉积的主要作用者，但只有紫色 硫细菌和绿色硫细菌的一些种能代谢硫化物，到目前为止光合硫细菌应用于生物脱硫 工艺的例子不多。主要原因首先是光舍硫细菌生长和活动需要光照，工艺控制复杂， 使运行成本增加，而且有些菌也在体内贮存硫；其次光合硫细菌氧化硫化物的过程与 c o z 的还原和细胞物质的生长相藕联，其氧化速率和能力受到细菌细胞物质的生长速 率和总量的限制1 1 7 1 。 无色硫细菌( c o l o u r l e s ss u l f u rb a c t e r i a ) 是一个生理学惯用词降1 6 , 1 $ - 2 0 l ，不是分类 学名词。实际上，有些无色硫细菌的纯培养菌苔呈粉红色或棕色，说明其体内含有细 胞色素i l q 。无色硫细菌的种类繁多，且各自具有不同的生理学、形态学和生态学特征， 不同类型的无色硫细菌对环境条件的要求也有差异，如表1 - 2 所示。 表1 2 几种无色硫细菌的培养条件 t a b l e1 - 2c u l t u r ec o n d i t i o n sf o rc o l o r l e s ss u l f u rb a c t e r i a 硫杆菌属( t h i o b a c y l l u s ) 是土壤和自然水体中最常见的种无色硫细菌1 1 9 1 ，一 般是无芽孢的短杆菌，革兰氏阴性，端生鞭毛，能将硫化物氧化成单质硫或硫酸盐，或 将硫代硫酸盐氧化为硫酸盐。大多数无色硫细菌都在p h 中性、中温条件下生活。但 硫化氢脱氢酶的分离纯化及性质研究 也有研究表明，无色硫细菌可生活的环境范围很广，在p h2 0 l o 0 、温度4 9 5 的 条件下都有无色硫细菌生长和活动；对d o 的要求很宽松，在高至饱和浓度低至完全无 氧状态下，都有无色硫细菌生存。研究还发现，环境条件的改变会引起某些无色硫细菌 营养方式的改变，如a c i d j a n u s 在好氧条件下氧化硫化物生成单质硫，而在厌氧条件 下则以h 2 作为电子供体，将单质硫还原为硫化物，即这种细菌随着环境条件的改变，会 由硫氧化菌转变为硫还原菌【1 2 1 。 无色硫细菌的共同特征是能氧化还原态硫化物并从中获取生长和活动所需的能 量，其主要氧化反应为： h 2 s + 2 0 2 - h 2 s 0 4 ， 2 h 2 s + 0 2 2 s ”+ 2 h 2 0 ， 2 s ”+ 0 2 + 2 h 2 0 2 h 2 s 0 4 ， n a 2 s 2 0 3 + 2 0 2 + h 2 0 一n a 2 s 0 4 + h 2 s 0 4 4 n a 2 s 2 0 3 + 0 2 + 2 h 2 0 - 2 n a 2 s 4 0 6 + 4 n a o h 2 n a 2 s 4 0 6 + 7 0 2 + 6 h 2 0 2 n a 2 s 0 4 + 6h 2 s 0 4 2 k s c n + 4 0 2 + 4 h 2 0 ( n 0 4 ) 2 s 0 4 + i ( 2 8 0 4 + 2 c 0 2 ， 5 h 2 s + 8 k n 0 3 ，4 k 2 s 0 4 + h 2 s 0 4 + 4 n 2 + 4 h 2 0 ， 5 s u + 6 k n 0 3 + 2 h 2 0 3 k 2 s 0 4 + 2 h 2 s 0 4 + 3 n 2 对无色硫细菌代谢途径的研究表明，碳的代谢途径较为简单和统一，即多数无色 硫细菌都通过c a l v i n 循环进行二氧化碳的固定，但不同种类的无色硫细菌对硫的代谢 途径不同，电子传递系统与参与代谢的酶也有所差异，反应所发生的部位也可能有所 变化【l s l 。大多数无色硫细菌以0 2 作为电子受体，因而多数无色硫细菌是好氧菌。但某 些无色硫细菌可在厌氧条件下以n 0 3 或n 0 2 作为电子受体，将其还原为n 2 ，如 7 ：d e n t r i f i c a n s 。研究表明，很多严格好氧的无色硫细菌也可在厌氧状态中存活或生 长。多数无色硫细菌是体外排硫的。所以氧化速率和能力不像光合硫细菌那样受细胞 生长的限制1 1 4 , 1 j , i s 。 无色硫细菌能够氧化硫化氢、元素硫、硫代硫酸盐和四硫酸熊等形成硫酸【2 l 】。常 见的化能自养无色硫细菌有氧化硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 、排硫硫杆菌 ( t h i o b a c i l l u st h i o p a r u s ) 、氧化亚铁硫杆菌( t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ) 及脱氮硫杆菌 ( t h i o b a c i l l u sd e n i t r i f i c a n s ) 。不是每一种硫杆菌都能氧化所有的无机硫化物，其中 4 内蒙古师范大学硕士学位论文 $ 2 0 3 2 是他们都可以氧化的，仅氧化过程有差异田】。k u e n e n 等人1 研究发现，无色硫 细菌在营养物质受限制而有足够硫化物时，可在几乎无明显生长的情况下，高效地将 硫化物甚至胞外的单质硫氧化。与光合硫细菌每增长1 9 细菌细胞能产生1 2 9 硫单 质相比，无色硫细菌的氧化能力更强，每增长l g 细菌细胞至少可产生2 0 9 单质硫。 因此可见，无色硫细菌在脱硫方面的能力远高于其它脱硫菌。 1 2 硫氧化细菌作用机理 丝状硫细菌是一类化能自养型无色硫细菌，能从氧化硫化氢和元素硫的过程中取 得能量。有的菌专一性不强也能进行腐生生活，硫化氢氧化后生成的硫磺粒可贮存菌 体内。当环境中缺少h 2 s 时，则将体内的硫磺迸一步氧化成硫酸。主要代表有贝氏硫 菌属( b e g g i a t o a ) 、辨硫菌属( t h i o p l o c a ) 、发硫菌属( t h i o t h r i x ) o ”。 、 光合细菌在厌氧光照条件下以h 2 s 为氢供体，还原c 0 2 合成菌体细胞，而h 2 s 被氧化成单质硫或进一步氧化成硫酸，光合硫细菌的脱硫反应表示如下i 2 印q ： 2 h 2 s + c 0 2 + h v - 2 s + 1 2 0 ， 2 s + 3 c 0 2 + 5 h 2 0 + h v 一3 ( c h z 0 ) + 2 h 2 s 0 4 ， n a 2 s 2 0 j + 2 c 0 2 + 3 h 2 0 + h v 一2 ( c h 劫+ 冬, , ! a 2 s 0 4 + h 2 s 0 4 。 紫色硫细菌在进行h 2 s s 氧化的同时也进行s - s 0 4 2 一的氧化反应，而后者反应 很慢。而绿色硫细菌在h 2 s 存在的情况下，只能进行h 2 s s 反应，生成的硫粒附着在 细胞外口7 捌。 一 无色硫细菌包括严格化能自养菌及化能异养菌，也有一些过渡类型。土壤与水中 最重要的化能自养无色硫细菌是多种硫杆菌，能够氧化硫化氢、元素硫、硫代硫酸盐 和连四硫酸盐等形成硫酸，并从中获取能量，反应可表示如下： 2 1 - 1 2 s + 0 2 2 h 2 0 + 2 s + 能量， 5 n a 2 s 2 0 3 + h 2 0 + 4 0 2 5 n a 2 s 0 4 + h 2 s 0 4 + 4 s + 能量， 2 s + 3 0 2 + 2 h 2 0 一2 h 2 s 0 4 + 能量， c 0 2 + h 2 0 + 能量一( c h 2 0 ) + 0 2 常见的化能自养无色硫细菌营养需求简单，生长过程无需有机物，是当前生物脱 硫研究最为广泛的微生物。其中氧化硫硫杆菌、脱氮硫杆菌、排硫硫杆菌、氧化亚铁 硫杆菌尤为突出。但不是每一种硫杆菌都能氧化所有的无机硫化物，其中s 2 0 3 2 。是它 硫化氢脱氢酶的分离纯化及性质研究 们都可以氧化的，仅氧化过程有差异。只有少数种能氧化h 2 s t ，在硫杆菌中，无机 硫化合物的氧化途经最可能如下 2 9 , 3 0 1 ： h s 。一膜附着硫 s 0 】一s o ， 膜附着硫【s o 】一s 0 3 ”一s 仉 硫化物氧化成硫酸分两步进行，第一步快，硫化物失去两个电子，膜附着聚合硫 形成；第二步慢，单质硫进一步被氧化为亚硫酸、硫酸。但不同种类的无色硫细菌对 硫的代谢途径却差异很大，不仅代谢所涉及的酶和电子传递系统大不一样，而且反应 所发生的部位也不相同。 无机硫化合物广泛分布于自然界，微生物与硫素循环密切相关，很多细菌与古细 菌负责无机硫化合物的氧化，但是很难将细菌催化的化学反应与活泼性硫化合物进行 的纯化学反应分开，微生物催化的硫素转化与硫的化学转化过程类似，遵循s 2 。一s o s 0 3 2 - - - s 0 4 2 - 的氧化，而且硫氧化过程中的某些中间物彼此间相互作用，使氧化途 径变得更复杂 3 1 - 3 2 】，s o s 0 3 2 _ 氧化抑制剂和s 0 3 2 _ 一s 0 4 2 - 氧化抑制剂的使用对于反应 化学计量学和氧化途径的阐明具有重要的作用，尤其是硫代硫酸盐和联四硫酸盐的氧 化更为有用1 3 2 1 。 t h i o s u l f a t eo 妇i 曲t i o n s 2 0 3 + 2 0 2 + h 2 0 _ 2 s 0 4 2 + 2 l 重+ ) p a t h w a y a l ” s s 0 3 a - + 2 h z o s + t b s 0 34 - 2 0 h 1 2 1 s + 0 24 - 蝇p h 2 s o ， 3 】2 h 2 s 0 3 4 - 0 2 2 s 0 4 4 - 4 料 h q n o ： f n 0 3 2 + 0 24 - 3 h 2 0 一2 h 2 s o j + 2 0 r n e m ：s 2 0 ，“4 - ，簸) 2 一s 4 - s o , 2 - p a t h w a yb 4 12 s 2 0 ，4 - 0 24 - 2 i f s ) 6 + h 2 0 【5 】$ 4 0 6 2 4 - h ：o 一$ 2 0 3 4 - s + s o 4 4 - 2 h * 1 2 1 s + o + h 2 0 一h 2 s 0 3 【3 】x 坛h 疆o ，4 - ，- 0 2 一s 0 4 2 4 - 2 1 - i * h q n o ： s 2 0 ，2 - 4 - l ；z j 0 2 + h 2 0 h 2 s o ，+ s 0 4 1 - n i 丑垤：s 型d ，加4 - ，鲁0 2 _ s + s o p 图1 - 2 硫代硫酸盐氧化的可能途径 f i g 1 - 2p o s s i b l et h i o s u l f a t eo x i d a t i o np a t h w a y sa n dr e a c t i o n si n v o l v e d 正如图1 - 2 所示，硫代硫酸盐可以通过途径a 氧化为s o 产，也可以通过途径b 氧化 6 内羹古师范大学硕士学位论文 为s 0 4 2 _ ，2 庚基- 4 羟基奎琳氮氧化物( h q n 0 ) 可以抑制s 0 3 2 - 的氧化，n 乙基马来酰 胺可以抑制硫的氧化，使用这些抑制剂结合好氧率和s 0 3 2 - 、s 0 4 2 积累的化学计量关 系可以为微生物催化的硫氧化途径的阐明提供重要的信息1 3 2 1 。 氧化硫硫杆菌是嗜酸化能自养菌f 3 3 】，可利用无机硫化合物作为能源，以硫作为能 源生长的细菌，研究发现硫氧化途径可能为：s 一s o s 0 3 2 - 一s 0 4 2 - 。近期研究例i 表明，氧化硫硫杆菌在p h5 条件下可以在硫代硫酸盐培养基中生长，但在p h2 3 条 件下不能生长，并对上述条件下的氧化机制进行了研究，采用化学计量学和抑制剂对 这两种p h 条件下的氧化机理进行了研究，营硫代硫酸盐生长的细菌较营s o 生长的细 菌含有更多的细胞色素c ，更适合于电子传递链的研究，尤其是亚硫酸盐的氧化，该 反应是一重要的产能反应，嗜酸菌的亚硫酸盐氧化除细胞色素c 、a 、d 外还涉及了 膜结合型细胞色素b 。h q n o 抑制位点口1 及膜结合型亚硫酸盐还原酶【3 6 1 ，与嗜中性的 zn o v e l l a s1 3 7 1 不同，嗜中性的zn o v e l l a s 氧化机制o ”9 】较简单：s 0 3 2 - 一亚硫酸氧化 目g ( s 0 3 2 - ：c y tc 氧化还原酶) 一c y tc c y ta 3 氧化酶一0 2 。因此，为了研究清 楚电子传递及能量代谢的过程，进行有关细胞色素、氧化硫硫杆菌、各种提取物的研 究非常必要。 1 3 硫氧化菌酶学研究简介 硫能以不同形式的离子或分子形式存在，其种类可达3 0 多种，其中仅有5 种在室 温和一个大气压下在溶液中具有稳定性，它们是s o 、h s o , 。、s o 、h 2 s 、h s 。其它形 式的硫例如硫代硫酸盐、多硫化合物和连多硫酸盐也可在自然环境中发现，但它们是 不稳定的。自然界硫循环可以完全由微生物完成，也就是说可以在没有其它高等生物 的参与下完成。换言之，如果使用适当的微生物和相应的环境条件，各种含硫化合物 ， 在微生物作用下相互转化是可能的【柚l 。利用硫酸盐还原菌( s r b ) 将亚硫酸盐、硫酸盐 还原成硫化物，然后再利用光合细菌或无色硫细菌氧化硫化物为单质硫，从而将硫从 系统中去除。微生物脱硫充分利用了生物硫循环机理。 近年来从酶学和遗传学角度研究生物脱硫过程的分子机理也取得了一定的进展。 已证明在菌株中存在特定的催化硫转化的酶基因，它们已被克隆和测序，并获得了纯 化的表达产物【4 1 1 。何正国等对氧化亚铁硫杆菌的铁和硫氧化系统及其分子遗传学进行 了综述h “。 7 硫化氢脱氢酶的分离纯化及性质研究 参与s 2 一s o s 0 3 一s 嘎”反应的一些关键酶及其复合物被分离出来。一种特殊的 硫氧化酶首次被i s a m us u z u k i 研究团队证实h 埔1 存在于几个硫杆菌中，此酶催反应 需依赖还原型谷胱甘肽的存在，它催化以下反应：s 。+ 8 0 。+ h 。0 8 蹈0 3 。k l e t z i n 在1 9 8 9 年首次在彳a r a b v a e n s 中发现了硫氧化还原酶m ，该酶可氧化s o 为亚硫酸盐和硫代 硫酸盐，同时能将s o 还原成硫化氢。 。 2 s u l f i t e s u l f a a p si 屯d u c t a 量e 2e 一勺 a p s p p j ps u l f u r y l a s e 龋p 。 图1 - 3 亚硫酸盐的直接和间接氧化途径 f 适1 - 3t h ed i r e c ta n di n d i r e c tp a t h w a y so f s u l f i t eo x i d a t i o n 亚硫酸盐的进一步氧化过程如图卜3 所示，其氧化为硫酸盐的过程可分为直接氧 化和间接氧化。参与直接氧化的是含钼元素的亚硫酸盐氧化还原酶( s o r ；e c 1 8 2 1 ) 。间接氧化是a m p 依赖氧化过程，经过中间物腺苷酰硫酸( a p s ) ，在a p s 还原酶( e c l 8 9 9 2 ) 的作用下将a m p 与亚硫酸盐转变为a p s ，然后a p s 在a t p 硫 酸化酶( e c2 7 7 4 ) 的作用下转变为硫酸盐【4 7 1 。 硫化物是自然界中的一种重要物质，无机硫和其化合物在自然界中分布范围很 广，研究认为从硫化物到零价硫单质的氧化过程主要包括两个酶系：黄素细胞色素c 硫化氢脱氢酶( f s d h ) 和硫化物醌还原酶( s o r ) 1 4 s - 5 0 。c o h e n 等人在研究丝状硫细菌 ( o s c i l l a t o r i al i m n e t i c a ) 的类囊体中发现了s q r ( e c1 8 5 7 ) 酶活性1 并首次提出 了硫化物醌还原酶。后来s h a h a k 和f r i e d r i c h 等人在光合氧化细菌中发现了膜结合 硫化物氧化系统：硫化物醌还原酶。s h a h a k 和k l u g h a m m e r t ”1 分别在o s c i l l a t o r i a s 内蒙古师范大学硬士学位论文 l i m n e a c a 、o s c i l l a t o r i ac h l o r o b i a 及无硫代硫酸盐利用的硫氧化菌( r h o d o b a c t e r c a p s u l a t u s ) 的研究中证实硫化物醌还原酶能够氧化硫化物，同时硫化物醌还原酶参 与细胞色素c 复合体中电子由硫化物向细胞色素c 的传递过程 5 3 - 5 5 1 。最近硫化物醌还 原酶( s q r ) 被s u c h u t z 等从r b a c a p s u l a t u s 中纯化出来，其基因在大肠杆菌中得以 表达而且基因序列也被测出，序列分析显示从尼c a p s u a t u s 分离出的s q r 属于谷胱甘 肽还原酶蛋白家族【5 6 】。 、 最初报道两种黄素细胞色素c 具有硫化物氧化活性，这两种黄素细胞色素c 最初 作为一种功能不清的血红蛋白被分离出来：第一个来源于光能自养紫色硫细菌 ( c i l r o m a t y u mv i n o s u m ，) ，第二个来源于光能自养绿色硫细菌( c h l o r o b i u m t h i o s u l f a t o p h i l u m ) 。但是，直到1 9 7 3 年才认识到这些黄素细胞色素c 是氧化硫化 物的酶。这组酶由于他们的功能是硫化物脱氢，因此被命名为黄素细胞色素c 硫化氢 脱氢酶( f s d h ) 。b r u n e 发现在细菌体外有黄素细胞色素c 硫化氢脱氢酶活性，后来 迸一步研究发现：黄素细胞色素c 在细菌体内硫化物氧化的过程中有很重要的作用 【4 l l 。w o d a r a 等即1 研究发现，从只d e n i t r y f i c a n sg b l 7 里的s o x f 基因推出的部分氨 基酸序列与光合细菌c h r o m a t i u mv i n o s u m 中黄素细胞色素c 的黄素亚基序列十分相 似。但是黄素细胞色素c 硫化氢脱氢酶不是存在于各种硫氧化细菌中，而是限定于一 些有能力氧化硫代硫酸盐的硫氧化菌中。 1 4 课题的意义及内容 近年来，利用微生物除硫的技术正在积极发展。生物法脱硫的原理是利用微生物 选择性的氧化或还原有机或无机硫的特点，去除煤炭和含硫废水及烟气中的硫污染 物。对无机硫化合物氧化的研究已近一个世纪，尤其是关于在地球圈硫素循环中起重 要作用的化能营养微生物的研究更热嗍。大多数自养硫细菌属于硫杆菌属，散布于 p r o t e o b a c t e r i a 的8 亚类。该属的细菌生理特征多样，革兰氏阴性，棒状，从还原 性硫化物的氧化中获取能量嘲。有关硫杆菌属对还原性硫化物氧化的生理生化研究说 明不同菌种具有不同的代谢途径【6 i 】。尽管有很多硫化物氧化细菌被分离出来，经过实 验证明它能氧化硫化物，但这些菌氧化硫化物的代谢机理和酶学方面还很不清楚。 硫化物是自然界中的一种重要物质，但是有关硫化物氧化途径的研究却很少。虽 然硫化物可以和氧气自发的发生反应，其氧化产物为硫代硫酸根、元素硫、亚硫酸【6 2 l ， 9 硫化氢脱氢酶的分离纯化及性质研究 但是由于硫化物氧化菌与硫化物和氧气具有极高的亲和力，因而硫化物氧化菌的氧化 速率远远超过自发反应速率【6 3 i 。当硫化物浓度大于1 5 0 r a m ，对硫杆菌会产生毒性叫l 。 关于硫代硫酸根、连四硫酸根、硫化氢氧化的代谢途径的研究受到各国学者的广泛关 注，因此负责这些化合物转变的几种酶和酶复合物被分离出来，但未检测到任何中 间代谢物啷】。对于大多数硫化物氧化菌，在硫化物氧化过程中会产生大量的或少量的 元素硫，这说明零价的元素硫是硫化物氧化途径中的一种代谢中间物，这一点已被 下述事实所证明：氧化硫硫杆菌的膜部分在c y t e 存在下将硫化物氧化为膜结合型 的聚硫形式。但是，硫化物氧化途径研究的瓶颈是，到目前为止从化能自养型的硫杆 菌属中分离到的氧化硫化物的酶很少，从好氧脱硫反应器中分离到的氧化硫化物的酶 还未见报道。迄今为止，所研究过的所有硫杆菌都能完全氧化硫化物为硫酸根。在营 化能自养的t h i o b a c i l l u sv e r s u t u s 中，一般认为硫化物可被酶氧化，硫化物到硫单质 的氧化途径是无机硫氧化的第一步，硫化氢脱氢酶是无色硫细菌代谢途径中的第一 个酶，可能是硫氧化代谢途径中的限速酶，该酶负责氧化s 2 。为单质硫，因此硫化氢 脱氢酶的分离纯化及性质研究不仅对于阐明硫氧化菌代谢途径及硫氧化机制具有重 要的理论意义。关于硫化氢脱氢酶国内还未见报道，国外也只有极少数种菌有过报道， 但对于我们分离到的排硫硫杆菌中硫化氢脱氢酶未见报道。本研究是从烟气生物脱硫 好氧反应器中经过反复纯化分离出具有高效脱硫特性的排硫硫杆菌，并采用形态、生 理生化等指标对其进行了初步鉴定。纯化后的分离菌经破碎、粗提、纯化，分离到一 种新的膜结合型的硫化氢脱氢酶，并研究了硫化氢脱氢酶的光谱性质、动力学性质等。 从而为a m s f b 反应器元素硫生成机制及条件奠定基础，为烟气s 0 2 脱硫系统的高效 优化运行提供理论和实践指导。 内蒙古师范大学硕士学位论文 2 1 材料、仪器与试剂 2 实验部分 2 1 1 实验材料 。 本论文所用研究材料取自本实验室烟气生物脱硫系统的好氧产硫磁性稳态流化 床反应器( a m s f b ) 中的磁性固定化生物膜。 2 1 2 主要仪器和设备 7 2 2 分光光度计：上海第三分析仪器厂。 w m z k 0 1 温度指示控制仪：上海医用仪表厂。 p b 1 0 型酸度计：s a r t o r i u s 制造。 j y d 1 a 型溶氧测定仪：江苏江分电化学分析仪器有限公司。 电子天平：上海精益科学仪器有限公司。 高速离心机：珠海黑马医学仪器有限公司。 c 0 2 夹层培养箱：美国n u a i r 公司。 超声波破碎仪：s o n i c s ，1 0 0 w 佗0 k h z ，美国产。 冷冻真空干燥仪：f t s ，美国n u a i r 公司。 0 l m 岫u s 生物学显微镜及拍照系统：日本。 s - 5 7 0 扫描电镜：日本日立公司。 凝胶成像系统：d i g id o e - i t , 美国。 超速离心机( 6 0 m ) ：b e c k m a n 公司，美国。 柱层析系统：l k b 公司 倒置显微镜：o l y m p u s ，日本。 大容量高速冷冻离心机：图门离心机厂 d n ag e n i u s ：瑞士t e e k e n 公司。 紫外厂司f 见分光光度计：m o d e lu v - 2 0 0 0 ，莱伯泰科( 北京) 有限公司 硫化氢脱氢酶的分离纯化及性质研究 2 1 3 主要试剂 其他常规试剂均为分析纯。 2 1 4 试剂和溶液 2 1 4 1 酶活力测定液 5 0 m o i l - 1 ，p h 9t r i s h c l 缓冲液( 含5 0 x 4 马心细胞色素c ) 。5 0 m m o l l - ， p h 9t r i s h c l 缓冲液( 含2 0 脚n a 2 s ) 。 2 1 4 2 蛋白含量测定液 0 0 1 ( w v ) 考马斯亮蓝6 - 2 5 0 试剂：考马斯亮蓝6 - 2 5 01 0 0 m g 溶于5 0 m l9 5 的 乙醇中，加入1 0 0 m i8 5 磷酸，用蒸馏水稀释至1 0 0 0 m i ，滤纸过滤。最终试剂中含 4 7 ( w v ) 乙醇，8 5 ( w v ) 磷酸 ， 0 1 5 t o o l l - n a c i 标准牛血清蛋白溶液i m g m l 一、0 i m g m l 一。 内蒙吉师范大学硕士学位论文 2 1 4 。3 酶提取液 5 0r a mt r i s h c i 缓冲液( p h7 5 ，含0 1 t r i t o nx - 1 0 0 ) ，5 0m mt r i s h c i 缓冲液 ( p h 7 5 ，含0 1 t r i t o n x - 1 0 0 和2 m k c i ) 。 2 1 4 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液 3 0 丙烯酰胺单体贮液：1 4 5 5 9 丙烯酰胺、0 4 5 9 甲叉双丙烯酰胺，先用3 5 m l 双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至5 0 m l 过滤。 浓缩胶缓冲液( o 5m o l l ”t r i s - h c l ，p h 6 8 ) ：1 8 1 6 9 t r i s 溶解在8 0 m l 双蒸 水中，用4 m o l l - h c l 调至p h 6 8 。再用双蒸水稀释至5 0 m l ，于4 u 保存备用。 分离胶缓冲液( 1 5m o l l - 1 t r i s - h c l ，p h 8 8 ) ；3 0 3 9 t r i s 溶解在4 0 m l 双蒸水 中，用4 m o l l - t i c l 调至p h 8 8 0 再用双蒸水稀释至1 0 0 m ，4 保存备用。 1 0 9 6 过硫酸铵；0 1 9 过硫酸铵溶于1 0 m l 双蒸水。使用前新鲜配制。 5 倍电极缓冲液( o 0 1 2 5 m o lt t r i s ，1m o l t l t r i s 甘氨酸，p h 8 3 ) ：1 5 1 4 9 t r i s 、 7 2 0 7 9 甘氨酸，用双蒸水稀释至i l ，于4 保存备用。 样品缓冲液( o 1m o l l - 1t r i s h c l ，p h 6 8 ) ：0 5m o l l - t r i s h c l ( p h 6 8 ) l m l ，0 8 m l 甘油，0 0