（运动人体科学专业论文）力竭运动恢复期大鼠海马5ht、da含量及其代谢的动态变化.pdf

南京体育学院硕士学位论文 摘要 目的：观察大鼠力竭运动后不同时段海马脑区5 一羟色胺( 5 - h t ) 、 多巴胺( d a ) 含量及其代谢的动态变化，分析运动恢复期中枢单胺类 抑制性和兴奋性神经递质的变化特点与相互关系，为探寻运动性中枢 疲劳和恢复的机理提供实验依据。 方法：大鼠进行一次性游泳运动直至力竭，并分别在安静状态下、 运动后即刻、运动后l h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 断头处死，在冰面上快速分 离海马脑区，分成三份并称重。其中一份用2 5 高氯酸进行匀浆， 离心后取上清液，采用高效液相色谱一荧光法测定d a 、5 - h t 、色氨酸 ( t r p ) 、5 一羟吲哚乙酸( 5 一h i 从) 含量；另外两份分别加入蔗糖和磷 酸盐缓冲液、生理盐水匀浆并离心，取上清液。运用紫外比色法分别 测定单胺氧化酶a ( m a o a ) 、单胺氧化酶b ( m a o b ) 的活性。 结果： 力竭运动后大鼠海马t r p 、5 - h t 、5 一h i a a 、m a 0 一a 的变化均呈 现先上升后下降的趋势。t r p ( p o 0 1 ) 、5 - h t ( p o 0 5 ) 在运动后1 小时显著上升，运动后1 2 小时t r p 水平与运动后1 小时相比显著下 降( p o 0 1 ) ，5 一h t 则在1 2 小时达到峰值。5 一h i a a 含量、m a 0 一a 活 性在运动后1 2 小时显著升高( p 0 0 5 ) 。各指标在运动后4 8 小时均 恢复到运动前水平。 力竭运动后大鼠海马d a 、i t a o b 的变化均呈现先下降后上升的 趋势。力竭运动即刻d a 含量下降，恢复1 小时下降至最低。而后随 着时间的延长，呈上升趋势，恢复2 4 小时d a 含量到达峰值并超过安 静水平( p o 0 1 ) ，运动后4 8 小时恢复至安静水平。运动恢复期大鼠 海马m a o - b 活性变化并不显著。 力竭运动即刻d a 5 一h t 下降但不显著，恢复1 小时下降至最低 ( p ( o 0 1 ) 。而后随着恢复时间的延长，呈上升趋势，运动后4 8 小时 恢复至安静水平。 结论： 力竭运动后单胺类神经递质的变化趋势为：5 - h t 含量先上升 后下降，d a 则是先下降后上升，总体恢复需要2 4 - 4 8 小时。提示： 大鼠海马脑区单胺类神经递质的恢复存在一定的延迟性。恢复的初 南京体育学院硕士学位论文 期，抑制性神经递质发挥主导作用；随着时间的延长，兴奋性神经递 质的作用逐渐恢复，达到新的动态平衡。 大鼠力竭运动后1 小时海马d a 5 一h t 比值最小，且此时t r p 达 峰值，促进5 一h t 的合成加快，中枢神经抑制过程明显，是运动性中 枢疲劳产生的重要原因之一。 力竭运动后1 小时大鼠海马5 一h t 前体t r p 达到最高值， 而5 - h t 在1 2 小时达到波峰状态。提示：力竭运动后5 一h t 合成代谢 有一定的时间过程。 大鼠海马中参与5 - h t 分解代谢的酶m a o - a 活性在力竭运动后 1 2 小时显著增加，催化5 - h t 代谢产物5 一h i 从含量增加。表明： 力竭运动后5 - h t 分解代谢具有一定的滞后性。 力竭运动恢复期大鼠海马m a o - b 活性均低于安静状态，d a 在 运动后2 4 小时达到峰值，而此时d a 5 一h t 比安静组稍低，但已无显 著性差异。提示：运动恢复期中d a 分解代谢受到抑制。 关键词：力竭运动恢复期；海马；5 一羟色胺：多巴胺：代谢变化 南京体育学院硕士学位论文 t h ed y n a m icc h a n g eso f5 一h t ，d ac o n t e n ta n dt h ei r m e t a b o lis mi nr a tb r a i nh i p p o c a m p u sd u r i n g ，1 o r e c o v e r yp e r l o da 士t e re x n a u s t l v ee x e r c l s e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oo b s e r v et h ed ) r n a m i cc h a n g e so fo nt h eh i p p o c a m p u ss e r o t o n i n ( 5 - h t ) ， d o p a m i n e ( d a ) a n dt h e i rm e t a b o l i s ma f t e rt h ee x h a u s t i v ee x e r c i s e ；t oa n a l y z et h e r e c o v e rm e t a b o l i s ma n di n t e r r e l a t i o no fi n h i b i t o r ya n de x c i t a t o r ym o n o a m i n e n e u r o t r a n s m i t t e r s ；t op r o v i d ee x p e r i m e n t a lb a s i st ot h er e s e a r c hf o rc e n t r a lf a t i g u ea n d r e c o v e r ym e c h a n i s m ， m e t h o d s ：a l lr a t sw e r ed e c a p i t a t e da f t e rao n e - t i m es w i m m i n gu n t i le x h a u s t i o n b r a i n sw e r eo b t a i n e di nt h ef o l l o w i n gs t a g e s ：c o n t r o lg r o u p ( as t a t eo fq u i e t ) ； i m m e d i a t e l ya f t e re x e r c i s e ，l ha f t e re x e r c i s e ，1 2h r sa f t e re x e r c i s e ，2 4h r sa f t e r e x e r c i s e ，a n d4 8h r sa f t e re x e r c i s e h i g he f f i c i e n c yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e t h o dw a su s e di nt h ed e t e r m i n a t i o no ft h ec o n t e n to fh i p p o c a m p u sd a ，5 一h t t r y p t o p h a n ( t i p ) a n d5 - h i a a ( 5 一h i a a ) u l t r a v i o l e tc o l o r i m e t r ym e t h o d w a su s e dt o d e t e r m i n et h ea c t i v i t yo fm o n o a m i n eo x i d a s e a ( m a o a ) a n dm o n o a m i n eo x i d a s e - b ( m a o b ) r e s u l t s ： t h ec o n t e n to fh i p p o c a m p a lt r p ，5 - h t , 5 - h l ，m a o - ac h a n g e ds t a t i s t i c a l l y n o n s i g n i f i c a n ta f t e re x h a u s t i v ee x e r c i s e ，b u tt h ed i f f e r e n c ew a s n o ts i g n i f i c a n t ，t h e y s h o w e de a r l ya s c e n d i n ga n dl a t e rd e s c e n d i n gt r e n d si nt h er e c o v e r yp h a s e c o m p a r e d t ot h ec o n t r o lg r o u p ，t h ec o n t e n to fh i p p o c a m p a l5 - h t , t r ps i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d a f t e r1h o u rr e c o v e r ys t a g e ( p o 0 5 ) 5 - h tr e a c h e dp e a kv a l u ea tt h es t a g eo f12h r s a f t e re x e r c i s e o n eh o u ra f t e rt h ee x e r c i s e ，t h ea m o u n to ft r ph i p p o c a m p u sr e a c h e d t h eh i 曲e s tp o i n t ( p o 01 ) ，t h e ns i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p 0 o1 ) t h ec o n t e n to f h i p p o c a m p a l5 - h i a a a n dt h ea c t i v i t yo fh i p p o c a m p a lm a o - as i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d a f t e r12h r sr e c o v e r ys t a g e ( p 0 0 5 ) t h ec h a n g eo fd a ，m a o - bs h o w e de a r l yd e s c e n d i n ga n dl a t e ra s c e n d i n gt r e n d si n t h er e c o v e r yp h a s e t h ec o n t e n to fh i p p o c a m p a ld a s l i 曲t l yd e c r e a s e di m m e d i a t e l y a f t e re x h a u s t i v ee x e r c i s e ，a n dr e a c h e dl e a s tv a l u ea tt h es t a g eo fo n eh o u ra f t e r e x e r c i s e t h e nt h ed ac o n t e n tg r a d u a l l yi n c r e a s e da st i m ew e n tb y , a n ds h o w e dn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea tt h es t a g eo f 4 8h r sa f t e re x e r c i s ec o m p a r e dt ot h ec o n t r o l i i i 南京体育学院硕士学位论文 g r o u p c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p ，t h ec o n t e n to f h i p p o c a m p a ld as i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e da f t e r2 4h r sr e c o v e r ys t a g e ( p o 01 ) a n dr e a c h e dp e a kv a l u e t h ea c t i v i t yo f h i p p o c a r n p a lm a o bd i d n tc h a n g es i g n i f i c a n t l yi nt h er e c o v e r yp h a s e t h er a t eo fd a 5 一h ts l i g h t l yd e c r e a s e d ，r e a c h e dl e a s tv a l u ea tt h es t a g eo fo n e h o u ra f t e re x e r c i s e ( p 0 0 1 ) t h er a t eg r a d u a l l yi n c l i n e da st i m ew e n tb y , a tt h es t a g e o f 4 8h o u r sa f t e re x e r c i s e ，i ts h o w e dr i os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dt ot h ec o n t r o l g r o u p c o n c l u s i o n ： t h ec h a n g e so fm o n o a m i n en e u r o t r a n s m i t t e r sa f t e rt h ee x h a u s t i v ee x e r c i s e ：5 - h t s h o w e de a r l ya s c e n d i n ga n dl a t e rd e s c e n d i n gt r e n d sw h i l ed a r e v e r s e d ，t h e ya l ln e e d 2 4 - 4 8h r st or e c o v e r y i ti sc o n c l u d e dt h a tt h eh i p p o c a m p a lm o n o a m i n e n e u r o t r a n s m i t t e r sh a v ea d e l a yi ne x e r c i s ei r r i t a b i l i t y i n h i b i t o r ym o n o a m i n e n e u r o t r a n s m i t t e r sp l a yal e a d i n gr o l eo ni n i t i a ls t a g e ；e x c i t a t o r ym o n o a m i n e n e u r o t r a n s m i t t e r sr e s t o r eg r a d u a l l ya st i m eg o e sb y , r e a c h i n gan e w d y n a m i c m e t a b o l i cb a l a n c e a tt h es t a g eo fo n eh o u ra f t e re x e r c i s e ，t h er a t eo fd a 5 h tr e a c h e sl e a s tv a l u e w h i l et h ec o n t e n to ft r pr e a c h e sp e a kv a l u e i ta c c e l e r a t e st h es y n t h e s i sp r o c e s so f 5 - h t c e n t r a ln e r v o u ss y s t e mi si n h i b i t e d ，i ti st h ei m p o r t a n tr e a s o no f e x e r c i s e i n d u c e dc e n t r a lf a t i g u e t h ec o n t e n to ft r pr e a c h e d sp e a kv a l u ea f t e r1h o u r r e c o v e r ys t a g e ，5 一h tr e a c h e d p e a kv a l u ea tt h es t a g eo f12h r sa f t e re x e r c i s e i ti sc o n c l u d e dt h a tt r ps y n t h e s i z et o 5 一h tn e e d sac e r t a i na m o u n to f t i m et or e s u m et h e p r o c e s s t h es p e e do f5 一h t a n a b o l i cm e t a b o l i s mi ss l o w t h ec o n t e n to fh i p p o c a m p a l5 一h i a aa n dt h ea c t i v i t yo fh i p p o c a m p a lm a o a s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s ea f t e r12h r sr e c o v e r ys t a g e s h o w st h a t ：t h ec a t a b o l i c m e t a b o l i s mo f5 一h th a sac e r t a i nl a ga f t e rt h ee x h a u s t i v ee x e r c i s e t h ea c t i v i t yo fh i p p o c a m p a lm a o - bi sl o w e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p s ，t h ed a c o n t e n ti n c r e a s e ss i g n i f i c a n t l y i ti sc o n c l u d e dt h a tt h ec a t a b o l i cm e t a b o l i s mo f d a i s i n h i b i t e da tt h es t a g eo f r e c o v e r ya f t e re x e r c i s e 。 k e yw o r d s ：e x h a u s t i v ee x e r c i s e ；r e c o v e r y p e r i o d ；h i p p o c a m p u s ；5 - h t ；d a ； m e t a b o l i s m i v 南京体育学院硕士学位论文 英文缩写词表 t r pt r y p t o p h a n 色氨酸 t p h t r y p t o p h a nh y d r o x y l a s e 色氨酸羟化酶 5 h t 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ( s e r o t o n i n ) 5 羟色胺 m a om o n e a m i n eo x i d a s e单胺氧化酶 5 h i a a 5 - h y d r o x y i n d o l e a c e t i ca c i d 5 羟吲哚乙酸 5 h t p d c 5 一h y d r o x y t r y p t o p h a nd e c a r b o x y l a s e 5 一羟色氨酸脱羧酶 5 h t o l 5 - h y d r o x y t r y p t o p h o l 5 一羟吲哚乙醇 c n sc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m中枢神经系统 f - t r p f r e et r y p t o p h a n游离色基酸 b c a ab r a n c h e dc h a i na m i n oa c i d支链氨基酸 d a d o p a m i n e 多巴胺 t h t y r o s i n eh y d r o x y l a s e 酪氨酸羟化酶 d o p ad i h y d r o x u p h e n y l - a l a n i n e ， 多巴 d d c d o p ad e c a r b o x y l a s e 多巴脱羧酶 c o m t c a t e c h o l o - m e t h y l t r a n s f e r a s e 儿茶酚氧位甲基转移酶 第3 6 页 硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交易竭洲朝戈鼠牺坼阳铝黼穗 人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完 全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：导师签名： 硕士学位论文版权使用授权书 冻蔫刁u 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校对本人递交的 学位论文翩鹄鞫乒糸奶坼删销海断酒幻砌渤保留并向国家有关部门或 机构送交论文的复印件和电子版，允许在校内和与学校有协议的部门公布论文并 被查阅和借阅。 本人授权南京体育学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：移如新签名：瓶蓐划 签字日期：加7 年乡月7 日 签字日期：力吵年否月e l 南京体育学院硕士学位论文 1 前言 运动性中枢疲劳是指由运动引起的、发生在从大脑到脊髓运动神经元的神经 系统的疲劳，是大脑皮层保护性作用的结果。尤其是长时间中等强度的运动产生 的疲劳，主要因素为中枢神经系统出现保护性抑制，中枢神经系统中的神经递质 参与了这种疲劳的产生。 神经递质是神经元之间或神经元与效应器之间进行信息传递的化学活性物 质，在神经元内合成，储存在突触前末梢，在信息传递过程中释放，作用于突触 后受体，引起突触后电位变化。每一种递质参与多种生理功能的调节，而每一种 生理功能又是由多种递质来调节的，各种递质之间维持着一种动态平衡，一旦某 种递质的合成、释放或代谢发生改变，这种动态平衡就会被打破，正常的生理功 能就难以维持，出现病理症状和体征。 中枢兴奋与抑制的转换影响运动能力，与神经递质的变化直接相关，其中单 胺类神经递质起着重要的作用。5 一羟色胺( 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ，5 - h t ) 、多巴 胺( d o p a m i n e ，d a ) 是中枢重要的单胺类神经递质。 5 一h t 又叫血清素( s e r o t o n i n ) ，是一种广泛分布的生物性吲哚胺。机体内 约有9 0 存在于消化道内，8 在血小板中，存在于中枢神经系统的5 一h t 只占1 一2 。由于血脑屏障的存在，中枢神经系统和外周的5 - h t 分属两个独立的系 统，但5 一h t 的生物合成途径在中枢和外周是完全相同的。因为5 一h t 能神经元只 存在于中枢神经系统，所以目前认为5 - h t 主要作为一种中枢神经递质发挥作用。 在中枢神经系统中，5 一h t 作为一种广泛存在的抑制性神经递质，参与情绪、 食欲、睡眠、体温等神经活动的调节，与焦虑症、强迫症、孤独症、情感性精神 障碍、精神分裂症以及酒、药依赖等都有一定关系。n e w s h o l m e 等( 1 9 8 7 ) 根据 中枢5 一h t 作用与变化首次提出了“中枢疲劳 的假设，大脑5 一h t 被认为是中枢 疲劳的可能性介质。 色氨酸羟化酶( t p h )5 一羟色氨酸脱羧酶( 5 一h t p d c ) 色氨酸( t r p ) 5 一羟色氨酸( 5 - h t p ) 5 一h t i 单胺氧化酶 上( m a o ) 5 一羟吲哚乙酸( 5 一h i 从) + 一5 一羟吲哚乙醛 土 5 一羟吲哚乙醇( 5 - h t o l ) 图1 脑5 一h t 代谢通路 5 一h t 来源于t r p 的代谢，t r p 先经酶色氨酸羟化酶( t p h ) 的催化作用生成 5 - h t p ，然后再经脱羧酶的作用生成5 一h t 。生成的5 - h t 在单胺氧化酶( m o n o a m i n e 第l 页 南京体育学院硕士学位论文 o x i d a s e ，m a 0 ) 催化下可转化为5 一羟吲哚乙酸( 5 一h i 从) 。 d a 是哺乳动物大脑中主要的儿茶酚胺类神经递质，占所有脑内儿茶酚胺类 神经递质含量的8 0 ，它控制着运动、认知、情感、正性强化、摄食、内分泌调 节等许多功能。多巴胺系统是近几年研究的焦点之一，许多疾病如精神分裂症， 帕金森病都与多巴胺递质传递障碍有关瞪1 。 从瑞典神经药理学家c a r l s s o n 于1 9 5 8 年首次提出脑内d a 是独立的神经递 质后，其重要性得到进一步证实。d a 参与精神情绪活动，脑内多巴胺缺少时， 人的情绪会变得压抑，产生抑郁症。相反，多巴胺过盛时，则产生幻想、狂燥， 甚至诱发精神分裂口1 。 研究表明，d a 不足则会令人失去控制肌肉的能力，严重会令病人的手脚不 自主地震动或导致帕金森氏症。在运动调控中，中枢神经系统中d a 的作用是调 节肌紧张，使机体做好运动的准备，并在大脑皮质的信号触发下“启动某一动 作“】。 羟化酶t h ) l 多巴【l - d o p a ) l 羧酶 i 多巴胺ld a ) l 单睦氯化酶 氯位甲基转移酶 ( m a 0 ) ( c o m t ) 7 3 ，私二羟基乙酸ld o p a c )三甲氧酪氡 c 。m t a 。 高香草酸( h v aj 图2 脑d a 代谢通路 螽成 代谢 体内d a 是由酪氨酸合成，酪氨酸先经酪氨酸羟化酶( t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ， t h ) 催化生成多巴( d i h y d r o x u p h e n y l a l a n i n e ，d o p a ) ，再经多巴脱羧酶( d o p a d e c a r b o x y l a s e ，d d c ) 作用转化为d a ，并转运进入囊泡。单胺氧化酶( m a 0 ) 和儿 第2 页 、lill0、厂iij、iili厂ilj 南京体育学院硕士学位论文 茶酚氧位甲基转移酶( c a t e c h o l - o - m e t h y l t r a n s f e r a s e ，c o m t ) 催化d a 最终转化 为高香草酸( h v a ) 。m a o 是d a 主要降解酶之一，研究表明其活性的降低可使d a 代谢受阻。 d a 、5 - h t 均是体内重要的单胺类神经递质，其前体酪氨酸、色氨酸均属于 芳香族氨基酸，许多研究显示5 - h t 系统的功能与d a 系统的功能是密切相关的。 d a 5 一h t 比值是评定中枢神经系统疲劳的较敏感指标。d a 5 一h t 比值的变化可能 比单独的d a 或5 一h t 的变化更敏感。大脑d a 5 - h t 比率升高可通过增加激发作用、 促动作用和适当的肌肉协调性而使运动成绩提高：而d a 5 - h t 比率降低又会通过 减弱促动作用、嗜睡、运动神经的协调性丧失而降低成绩，并构成中枢疲劳。 海马作为大脑边缘系统的重要组成部分，与机体脏器调节、内分泌活动、情 绪反应、饮食、学习记忆、性活动等有关，一直受到国内外学者的重视。因此在 对海马的形态、细胞构筑、神经纤维联系、神经递质等方面做了大量的研究工作， 积累了丰富的资料。研究表明，运动导致5 - h i a a 升高主要表现在中脑、海马、 纹状体以及下丘脑等部位怔1 。孙久荣等1 观察了大鼠冷暴露( 5 2 c ，2 1 d ) 过程中 下丘脑、海马、桥一延脑和血清中单胺类递质及主要代谢物质含量的变化，发现 只有海马和桥一延脑中5 一h t 和5 - h i a a 的含量明显减少，且一直呈低水平状态。 这可能与脑干中存在大量5 一h t 能神经元和海马具有丰富的5 一h t 能神经元投射 有关。研究发现，运动期间中脑、海马、纹状体和下丘脑的d a 代谢增强口1 。而 参与d a 分解代谢的酶叫a o b ，只在视丘下部、海马和嗅球等几个特定脑区中 有m r n a 表达。 目前对中枢神经递质与运动性中枢疲劳的研究日益增多。但多数报道仅观察 运动对单胺类神经递质含量的影响，而动态的观察单胺类神经递质代谢变化，尤 其是恢复期的研究甚少。 本研究旨在通过观察大鼠力竭运动后不同时段海马脑区5 一羟色胺( 5 - h t ) 、 多巴胺( d a ) 含量及其代谢的动态变化，分析运动恢复期中枢单胺类抑制性和兴 奋性神经递质的变化特点与相互关系，为探寻运动性中枢疲劳和恢复的机理提供 实验依据。 2 研究对象与方法 2 1研究对象 2 1 1实验分组 6 0 只雄性s d 大鼠( 由上海斯莱克公司提供) 适应性喂养一周后随机分为6 组，每组1 0 只： 第3 页 南京体育学院硕士学位论文 ( 1 ) 安静组( a ) ：不施加运动。 ( 2 ) 力竭运动后即刻组( b 1 ) ：进行一次性力竭游泳运动。 ( 3 ) 力竭运动后恢复1 小时组( b 2 ) ：进行一次性力竭游泳运动后恢复l 小时。 ( 4 ) 力竭运动后恢复1 2 小时组( b 3 ) ：进行一次性力竭游泳运动后恢复1 2 小时。 ( 5 ) 力竭运动后恢复2 4 小时组( b 4 ) ：进行一次性力竭游泳运动后恢复2 4 小时。 ( 6 ) 力竭运动后恢复4 8 小时组( b 5 ) ：进行一次性力竭游泳运动后恢复4 8 小时。 饲养条件：室内，自然光照，通风条件良好。温度1 8 2 5 。c ，相对湿度4 1 一5 7 。 自由饮水，进食。 运动条件：游泳池1 2 0 x 6 0 x 8 0 c w ，水深6 0 c m ( 超过大鼠身长的2 倍) 。 2 1 2实验各组大鼠体重( 表1 ) 表1 实验各组大鼠体重( x s d ) 单位：g 经s p s s l 5 0 软件作单因素方差分析，各组间没有显著性差异。 2 2 研究方法 2 2 1 大鼠一次性力竭游泳负荷的确定 分别从各组大鼠中随机取1 只，以1 体重逐级增加负荷( 大鼠体重分别为： 2 4 1 9 ，2 3 7 9 ，2 0 6 9 ，2 6 5 9 ，2 1 8 9 ，2 3 0 9 ，2 5 5 9 ) ，各强度下游泳3 分钟并取血， 运动后即刻、3 分钟、6 分钟、9 分钟分别取血，观察逐级递增负荷运动时血乳 酸的变化( 表2 ，图3 ) ， 表2 递增负荷时血乳酸的变化( x - i - s d ) 取血时间运动 运动运动运动 运动运动恢复恢复 恢复 3 m i n 6 m i n9 r a i n1 2 m i n 1 5 m i n1 8 m i n3 m i n6 m i n 9 m i n 血乳酸值6 9 07 。8 7 8 5 29 。6 6i i 。4 0 1 4 0 51 5 1 61 1 8 3 1 0 2 9 1 竺竺竺! ：! !圭! ：6 4 o 4 21 1 2 o 6 8o 8 8 o 4 4o 7 2 o 9 1o 9 3 一 =： 以取血时间作横轴，血乳酸值为纵轴，拟合平滑曲线，以5 体重负荷时的 乳酸值为a ，过a 点作横轴平行线，与恢复期曲线交于b 点，自b 点向递增负荷 曲线作切线，切点为c ，自c 向横轴作垂线，所得切点为乳酸阈强度。 第4 页 南京体育学院硕士学位论文 图3 递增负荷运动时血乳酸的变化 根据以上图表数据分析，确定乳酸阈强度为2 9 2 体重的负荷。本实验采用 2 9 2 体重的负重进行力竭性游泳运动，故为有氧运动。 2 2 2 一次性力竭游泳运动方案 各组大鼠于实验前适应性游泳5 次，每次1 5 分钟。 大鼠采用游泳方式进行力竭性运动，尾部负重力2 9 2 体重。游泳水温控制 在3 0 1 ，水深6 0 c m ，每平方米水面5 6 只。力竭标准为游泳动作明显失调， 不能再坚持，沉入水底1 0 秒不能回到水面呻】【9 】。 2 2 3 取样及样本制备 大鼠分别在安静状态下、力竭后即刻和恢复期l h 、1 2 h 、2 4 h 和4 8 h 断头处 死，将头置于冰面上，取出全脑，迅速用冰冷的生理盐水洗净血液，滤纸吸干， 立即在冰面上分离海马脑区，分成三份称重后置液氮中冻存备用。 d a 、5 一h t 、t r p 、5 一h i 从的预处理：用1 0 倍预冷的2 5 高氯酸匀浆，4 下 1 0 0 0 0 r p m m i n 离心1 5 分钟，取上清液放入- 8 0 c 冰箱保存，待测。 m a o a ：用5 0 倍体积p h 7 4 的0 3 2 m o l l 蔗糖和0 0 1 m o l l 磷酸盐缓冲液进 行匀浆，4 c 下2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，取上清液4 下1 4 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟。 取沉淀加入1 m l p h 7 40 3 2 m o l l 蔗糖，0 0 1 m o l l 磷酸盐缓冲液。 m a 0 一b ：加1 8 倍生理盐水匀浆，常温状态下2 0 0 0 r p m m i n ，离心1 0 分钟， 取上清待测。 第5 页 南京体育学院硕士学位论文 2 3 观察方法 2 3 1 测试指标 测试海马脑区d a 、5 一h t 、t r p 、5 - h i a a 含量及m a o a 、) 4 a o - b 的活性。 2 3 2 测试方法 高效液相色谱一荧光法检测海马脑区d a 、5 - h t 、t r p 、5 - h i a a 含量。 紫外比色法检测m a 0 - a 、m a o - b 的活性。 2 3 2 1d a 、5 一h t 、t r p 、5 - h i a a 含量的检测： 仪器：a g li e n tt e c h n o l o g i e s1 2 0 0s e r i e s 液相色谱仪。 测试原理：液相色谱分离系统由固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可 以是吸附剂、化学键合( 或在惰性载体表面涂上一层液膜) 、离子交换树脂或多 孔性凝胶：流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根 据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大 小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子与溶剂( 即流动相或洗脱液) 以 及固定相分子间的作用，作用力的大小决定色谱过程的保留行为。 试剂：色氨酸、5 一羟吲哚乙酸标准品( 惠普公司出品) 、多巴胺、5 一羟色胺 标准品( s i g m a 公司出品) ，0 0 5 m m o l lk h ：p o 。缓冲液( 天津市化学试剂三厂) 荧光检测柱：w a t e r sc 1 81 5 0 4 6 m m5 u m 卡套柱( 大连依立特科学仪器有 限公司) 流动相a ：0 0 5 m m o l l k h ：p 0 。 流动相b ：c h 。c n 检测器：荧光检测器：e x2 5 4 n me m3 3 8 n m 梯度：0 一一1 3 m i n ， b ：2 - - 2 1 ，p t m g a i n1 6 1 3 5 一一1 5 m i n ，b ：7 0 流速：0 7 m l m i n 柱温：2 5 计算方法： 含量( n g g ) = 测得值( n g ) 进样量( u 1 ) 样品总体积( u 1 ) 组织体重( g ) 第6 页 南京体育学院硕士学位论文 了沥倾飞耐秭珏研舻酾礴稃硼矿一 f 1 0 1 0 0 9 0 8 0 7 0 b ar 1 1 0 1 0 0 0 0 8 0 7 0 5 4 3 2 图4 空白过柱色谱图 f i 4 ) ta e 辨2 5 4 e n 恽3 3 8 ( t r p 0 6 0 7 w r p - 0 0 6 4 图5d a 标准品色谱图 图65 一h t 标准品色谱图 第7 页 箝 侣 竹 5 o f l d la 1 ； 一2 5 4 呈m 一3 3 8 ( t r p o 7 、t r p 司0 嗨d ) 图7t r p 标准品色谱图 图9 标准品色谱总图 2 3 2 2m a o _ a 的测定 空白管加入0 0 5 m l 水和3 m lc b b g 2 5 0 显色剂应用液，标准管重加入0 0 5 m l 的l m g m l 蛋白样品，混匀，静置l o m i n ，用紫外分光光度计在5 9 5 n m 下测定。 第8 页 鼢 竹 。 雠 m 倦 拍 竹 m 5 拍 o ”阳 o 南京体育学院硕士学位论文 m a o 的空管1 中加入0 8 m l0 o l m o l l 磷脂和p h 值7 4 的0 3 2 m o l l 蔗糖，空 白2 管中加入h 样0 2 m l ，0 8 m l o o l m o l l 磷脂和p h 值7 4 的0 3 2 m o l l 蔗糖 和0 2 m l l m o l lh c l ，测定管中先加入0 2 m l a 样，再加入0 6 m l0 o l m o l l 磷 脂和p h 值7 4 的0 3 2 m o l l 蔗糖。3 7 下水浴2 0 m i n ，加入2 0 0 u l0 0 2 m o l l5 一h t ， 3 7 下水浴3 h ，再加入0 2 m l l o m o l lh c l ，混匀，加入3 m l 环乙烷，振荡2 m i n 后，在2 4 2 n m 下比色。 2 3 2 3m a 0 - b 的测定 m a o - b 使用试剂盒检测( 由南京建成生物科技有限公司提供) 。原理：以苄 胺为底物，在m a o - b 作用下，生成苄醛，以环己烷提取，在2 4 2 n m 下测试吸光度。 测试组织中蛋白含量：取海马匀浆上清再用生理盐水稀释成l 组织匀浆， 待测。空白管中加入0 0 5 m l 蒸馏水，标准管中加入0 5 6 3 9 1 蛋白标准液0 0 5 m l ， 测定管加入0 0 5 m l 样品，再向各管中加入3 m l 考马斯亮兰显色剂，混匀并静置 1 0 分钟，5 9 5 n m 下比色，测出各管的o d 值。根据公式算出蛋白含量： 蛋白含量( g 1 ) = ( 测定管0 d 值一空白管o d 值) ( 标准管o d 值一空白管 o d 值) x 标准管浓度( g 1 ) 算出每个样的蛋白含量后，根据公式算出各样本m a o 的活力： m a o 活力( u m g p r o t ) ：测定管吸光度( 取样量x 蛋白含量) - - 0 0 3 2 4 数据处理 全部数据以平均数标准差表示( x + s d ) ，用s p s s l 5 0 软件作单因素方 差分析，q 为0 0 5 。 2 5 主要药品及试剂 试剂 5 一h t 标准品 d a 标准品 t r p 标准品 5 - h i a a 标准品 k h ：p 0 4 盐酸 高氯酸 c b b g 2 5 0 显色剂应用液 蔗糖 环乙烷 n a c l 生产厂家 s i g m a 公司 s i g m a 公司 惠普公司 惠普公司 天津市化学试剂三厂 南京化学试剂厂 南京化学试剂厂 南京建成生物技术公司 江苏强盛化工有限公司 南京化学试剂厂 南京化学试剂厂 第9 页 南京体育学院硕士学位论文 考马斯亮兰显色剂 o 5 6 3 9 1 蛋白标准液 单胺氧化酶试剂盒 2 6 主要仪器 仪器 y s i1 5 0 0 血乳酸测试仪 高速匀浆器a r t m ic c r od 一8 冷冻高速离心机 t d l 8 0 - 2 b 低速台式离心机 台式离心机 7 2 2 型可见光光栅分光光度计 s h z - 8 8 台式水浴恒温振荡器 1 】l h 一3 微型旋涡混合仪 a g l i e n tt e c h n o l o g i e s1 2 0 0s e r i e s 液 相色谱仪 移液器 1 5 m l e p 管 3结果 南京建成生物技术公司 南京建成生物技术公司 南京建成生物技术公司 生产厂家 美国黄石公司 德国m i c r r a - a r t 公司 美国贝克曼库尔特有限公司 上海安亭科学仪器厂 上海安亭科学仪器厂t g l - 1 6 8 上海第三分析仪器厂 江苏太仓市实验设备厂 上海沪西分析仪器厂 美国安捷伦公司 德国艾本德股份公司 南京建成生物技术有限公司 3 1 力竭运动恢复期大鼠海马d a 、5 -