（植物学专业论文）eatp在拟南芥抗逆过程中的作用.pdf

摘要 近年来研究表明，植物细胞外存在着游离的a t p 分子，它们参与细胞正常生长发育 的调控和植物对逆境适应性的形成过程。为了探索e a t p 影响拟南芥主根生长的作用机 理以及它在拟南芥逆境生理反应过程中是否发挥作用，本实验采用常规植物生理学实验 方法，初步探讨了e a t p 影响拟南芥主根生长的作用机理以及逆境胁迫条件下拟南芥种 子萌发率、幼苗存活率以及幼苗生长状况的影响。 实验结果显示，a t p 和a d p 可以抑制拟南芥主根的生长，而a m p 则对拟南芥主根 生长过程没有影响；a t p n a 2 盐、a t p k 2 盐、a t p t r i s 盐可以抑制拟南芥主根的生长， 并且其抑制程度之间没有明显差异，说明a t p 能够抑制拟南芥主根生长的作用与a t p 所含的阳离子无关；a t p 对异三聚体g 蛋白的两种缺失突变体g p a l j 、g p a l - 2 主根生 长的抑制程度低于野生型，而对两种超表达株系w g a 、c g a 主根生长的抑制程度高于野 生型，说明异三聚体g 蛋白在e a t p 抑制拟南芥主根伸长过程中发挥介导作用，异三聚 体g 蛋白的表达量越多，外源a t p 对拟南芥主根生长的抑制作用就越明显；a t p 对拟 南芥c o l 以及n a d p h 氧化酶基因缺失突变体r h d - 2 主根生长的抑制程度之间没有明显 差异，说明r o s 在e a t p 介导的抑制拟南芥主根生长过程中不起作用。 经干旱胁迫和盐胁迫处理，a t p 处理后拟南芥的种子萌发率与对照之间没有明显差 异，说明a t p 对于干旱胁迫和盐胁迫造成的拟南芥种子萌发率的抑制无缓解作用。经热、 冷、冻胁迫处理，a t p 处理后拟南芥的幼苗存活率与对照之间没有明显差异，说明a t p 对于热、冷、冻胁迫胁迫造成的拟南芥幼苗存活率的抑制无缓解作用。经干旱、盐、热、 冷、冻胁迫处理，拟南芥的主根生长状况与对照相比之间没有明显差异，说明a t p 对于 逆境胁迫造成的拟南芥主根生长的抑制无缓解作用。 本实验证实了e a t p 对拟南芥主根生长的抑制作用，异三聚体g 蛋白在a t p 抑制拟 南芥主根生长过程中发挥作用，e a t p 可能对拟南芥的种子萌发和幼苗生长耐受逆境( 干 旱、盐、热、冷、冻) 胁迫的过程没有促进作用。 关键词：e a t p 拟南芥异三聚体g 蛋白逆境胁迫 i i i a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，e a t ph a db e e nf o u n de x i s t i n gi ne x t r a c e l l u l a rs p a c eo f p l a n tc e l l s e a t p i si n v o l v e di nm o d u l a t i n gg r o w t h , d e v e l o p m e n ta n ds t r e s st o l e r a n c eo fp l a n tc e l l s i no r d e rt o e x p l o r et h em e c h a n i s mo fe a t pr e g u l a t e dm a i nr o o tg r o w t ha n dt h ee f f e c to fe a t po ns e e d g e r m i n a t i o na n ds e e d l i n gg r o w t ho fa r a b i d o p s i st h a l i a n au n d e rv a r i o u ss t r e s s ( d r o u g h t ，s a l t ， c h i l l i n g , f r e e z i n ga n dh i 曲t e m p e r a t u r e ) c o n v e n t i o n a lm e t h o d so fp l a n tp h y s i o l o g yw a s a p p l i e dt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fa t po nm a i nr o o tg r o w t hr a t ea n dt h es e e dg e r m i n a l p e r c e n t a g e ，s e e d l i n gl i v a b i l i t ya n dd e v e l o p m e n to fs e e d l i n g t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o la t pa n da d pi n h i b i t e dg r o w t ho fm a i nr o o t so f a r a b i d o p s i st h a l i a n a , w h i l ea m pd i dn o ta f f e c tt h ep r o c e s s t h ee a t p i n d u c e di n h i b i t i o no f r o o tg r o w t hw a s s u p r e s s e di nh e t e r o t r i m e r i cgp r o t e i nn u l lm u t a n ta n dp r o m o t e di ngp r o t e i n o v e r - e x p r e s s i o ns t r a i n s ，i n d i c a t i n g t h a th e t e r o t r i m e r i cgp r o t e i np a r t i c i p a t e si ns i g n a l t r a n s d u c t i o no fe a t pi n d u c e dr o o tg r o w t h t h e r ei sn o td i f f e r e n c ei nr o o tg r o w t hr a t eb e t w e e n w i l dt y p ea n dn u l lm u t a n to fn a d p h o x i d a s e ，i n d i c a t i n gt h a tr o sm a y b en o tp a r t i c i p a t i n gi n e a t pi n d u c e dr o o tg r o w t hi n h i b i t i o n u n d e rv a r i o u ss t r e s sc o n d i t i o n ，t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei ns e e dg e r m i n a t i o n r a t e ， s e e d l i n gl i v i b i l i t y a n dd e v e l o p m e n to fs e e d l i n gb e f o r ea n da f t e ra t pt r e a t m e n t i n d i c a t i n gt h a te a t pc a n n o tp r o m o t et h et o l e r e n c eo f a r a b i d o p s i st ot h e s es t r e s s e s o u rr e s u l t sc o n f i r m st h a te a t pi n h i b i tm a i nr o o tg r o w t ho fa r a b i d o p s i s t h a l i a n a ，g p r o t e i np a r t i c i p a t e si nt h i sp r o c e s s a t pc a nu n l i k e l yp r o m o t es t r e s st o l e r a n c eo fa r a b i d o p s i s t od r o u g h t ，s a l t ，c h i l l i n g ，f r e e z i n ga n dh e a ts t r e s s k e yw o r d s ： e a t p a r a b i d o p s i st h a l i a n a h e t e r o tr i m e r i cg p r o t e i n s t r e s st o l e r a n c e i v e a t p ：e x t r a c e l l u l a ra t p e a d p ：e x t r a c e u u l a ra d p e a m p ：e x t r a c e l l u l a ra m p 缩写表 c b d ：c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n r o s ：r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s d p i ：d i p h e n y l e n e i o d o n i u m g p c r ：g p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r e d r f ：e n d o t h e l i u m - d e r i v e dr e l a x i n gf a c t o r e g t a ：e t h y l e n eg l y c o lt e t r a a c e t i ca c i d m s ：m u r a s h i g ea n ds k o o g sm e d i u m f b l ：f u m o n i s i nb 1 d e x ：d e x a m e t h a s o n e v 学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文e a t p 在拟南芥抗逆过程中的作用，是在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人 和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者( 签名) ：访需玑 坷年j 月坯日 指导教师确认( 签名) ：尚痉才车 抄了年r 月甜日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在年解密后适用本授权书) 论文作者( 签名) ： 够矽年r 月谬日 西容糸 艚撕c ：尚畸 沙歹年，月) 了日 1 1 l j 一 刖吾 a t p 作为细胞内一种重要的能源物质参与多种生理生化反应，在细胞内的物质和能 量代谢中发挥重要作用。近年来研究表明，植物细胞外存在着游离的a t p 分子，其作为 一种细胞外重要的信使分子在动物体的神经调节、细胞凋亡以及植物体的花粉管萌发、 主根生长等各种生理过程中起着十分重要的作用。 研究表明外加a t p 可以抑制根的向重力生长特性，使本该垂直向下生长的根发生了 弯曲，进一步增加a t p 的浓度甚至导致了根的卷曲生长。异三聚体g 蛋白在植物细胞 的生长发育及胞外信号跨膜转导中发挥着非常重要的作用( t a n g 等，2 0 0 3 ) 。p a n d e y s 和a s s m a n n ( 2 0 0 4 ) 研究发现，a b a 可以抑制拟南芥的主根生长过程，异三聚体g 蛋 白g p a l ，a g b l ，g c r l 的单突变体、双突变体、三突变体的主根延伸对a b a 引起的抑制 比野生型敏感，说明异三聚体g 蛋白参与a b a 抑制拟南芥主根生长的一系列信号转导 过程发挥作用。动物细胞中已经证实了g 蛋白偶联受体( p 2 y 受体) 的存在，而植物细 胞中并未鉴定出g 蛋白偶联受体，但动物细胞p 2 y 受体拮抗剂p p a d s 同样在植物中发 挥作用，这暗示了其同样可能存在于植物细胞中，这就让我们把异三聚体g 蛋白与e a t p 的作用联系起来。 植物细胞如何感受逆境胁迫信号并调控相关基因表达以及相应的生理反应来适应 逆境胁迫已经成为近些年来的研究热点。近些年来的研究表明，模拟病原刺激能够促进 a t p 分泌，这些分泌到细胞外的a t p 在植物细胞耐受病原刺激反应的过程中发挥重要 作用。这就使我们联想到e a t p 在拟南芥耐受干旱、盐、热、冷、冻胁迫过程中发挥作 用的可能性。 本实验采用常规植物生理学实验方法，初步探讨了e a t p 对拟南芥主根生长的作用 机理以及逆境胁迫条件下拟南芥种子萌发率、幼苗存活率以及幼苗生长状况的影响。试 图研究异三聚体g 蛋白以及r o s 是否在e a t p 抑制拟南芥主根生长过程中发挥介导作 用，a t p 是否对拟南芥的种子萌发和幼苗生长耐受逆境( 干旱、盐、热、冷、冻) 胁迫 的过程能够起到促进作用。 文献综述 1e a t p 植物细胞外重要的信使分子 a t p 是生物体细胞中普遍存在的高能化合物，其作为细胞内一种重要的能源物质广 泛分布于线粒体、叶绿体等细胞器以及高等生物的细胞质中，参与多种生理生化反应， 在细胞内的物质和能量代谢中发挥重要作用。近些年来的研究表明，e a t p 作为一种细 胞外重要的信使分子在动物体的神经调节、细胞凋亡以及植物体的花粉管萌发、主根生 长等各种生理过程中起着十分重要的作用。 1 1动物细胞e a t p 研究进展 1 1 1e a t p 的存在和生理功能 a t p 作为一种细胞外重要的信使分子这一作用，首先是在动物细胞的研究中发现的。 f i s k e 和s u b a r r o w ( 1 9 2 9 ) 研究发现在动物细胞间基质中存在游离的a t p 分子。h o l t o n 等 ( 1 9 5 9 ) 报道活细胞可以向细胞外分泌a t p ，证实细胞外的a t p 来自于正常的细胞分泌 过程，而不是细胞死亡后质膜破裂渗漏到细胞外的。b u m s t o c k 等( 1 9 9 2 ) 在研究中发现 嘌呤神经元末梢含有a t p 的不透明小泡，并且发现a t p 和去甲肾上腺素俏e ) 以及a t p 和乙酰胆碱( a c h ) 在中枢共存，并且具有协同释放的现象。对于a t p 信号转导的研究不 断取得突破，逐渐形成了胞外a t p ( e x t r a c e l l u l a r a t p ，e a l 下) 信使的概念。 b e a n 等( 1 9 9 0 ) 利用电压钳技术发现a t p 可使神经元膜电导增加，并且发现a t p 激 活神经元的电流直接由配体结合引起而不是通过第二信使系统。z a n o v e l l o 等( 1 9 9 0 ) 首 先证明了胞外a t p 诱导淋巴细胞株细胞凋亡，进一步研究利用大鼠淋巴为实验材料确证 了这种现象，并发现a t p 还能诱导一些肿瘤细胞株凋亡。b u r n s o c k 等( 1 9 9 2 ) 通过研究 哺乳动物的神经元的突触发现a t p 可以快速地调节突触电位，研究还同时发现神经刺激 的效果可由外源的a t p 模仿，外源加入一定的a t p 可以通过降低静息钾离子的电导使膜 去极化、影响膜电位，从而降低中枢神经元的放电频率及胆碱能和肾上腺素能突触递质 的释放，研究还发现a t p 对脑的感觉区域和脊髓背角的外层同样也有其兴奋效果。由此 可见，a t p 在动物体细胞中的神经传递、细胞凋亡等生理过程中都起着十分重要的作用。 后来的研究表明，a t p 可以通过激发细胞的增殖、分化、死亡等过程促进创伤愈合， 并在高血压、肾血管损伤以及动脉粥样硬化中的血管平滑肌细胞生长和新内膜形成过程 2 中发挥着至关重要的作用( 罗海，2 0 0 6 ) 。目前的研究表明：a t p 能够起到抑制多种人 类肿瘤的生长的作用，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤疾病。 a t p 可以通过扩大血浆a t p 池，缓解罹患癌症时所引起的消瘦、食欲减退和激素失调， a t p 也能够减轻非恶性组织对化疗和放疗的抵抗性( 黄亿华等，1 9 9 8 ) 。由此可见，对 动物细胞外a t p 的研究，有可能开辟一条人类研究的肿瘤疾病的新途径，具有重大的现 实意义。 1 1 2a t p 受体 o c o n n o r 等( 1 9 9 1 ) 的在其研究中研究发现，在质膜上存在专一的a t p 受体或a t p 激活的离子通道。b u m s t o c k 等( 1 9 9 2 ) 利用药理学的方法把嘌呤受体分为两类：p 1 和p 2 ， a t p 在动物体不同组织上所产生的各种生理生化反应主要是由这两种受体类型介导的。 p l 受体主要由腺苷激活，其激动剂效价顺序依次为：腺苷 a m p 州山p a t p ；p 2 受体主 要由a t p 和a d p 激活，其激动剂效价顺序依次是a t p a d p 舢胛 腺苷。b u m s t o c k 等 ( 1 9 9 2 ) 利用a ，p m e a t p 和p ，丫m e a t p 等a t p 类似物，根据对a t p 及不同a t p 类似物在 动物体细胞中的各种生理过程中所表现出来的特性，又把嘌呤受体分成了两类，即配体 门控的离子通道( p 2 x ) 和异三聚体g 蛋白偶联受体( p 2 y ) 。p 2 x 亚型对a t p 类似物激 动剂的效价顺序是：0 【，p m e a t p i b ，丫m e a t p a t p = 2 - m e s a t p = a d p ，而对p 2 y 受体的激 动剂效价顺序为：2 - m e s a t p a t p ，p m e a t p = p ，丫- m e a t p 。p 2 x 嘌呤受体家族是一 类对k + 、n a + 和c a + 可通透的离子通道；p 2 y 受体构成了一个g 蛋白相偶联的受体，刺 激磷脂酶c 的活化及肌醇三磷酸的形成，其中第三跨膜片段同源区域内具有1 2 个连续的 氨基酸，被认为可能是p 2 y 受体的标志( 黄亿华等，1 9 9 8 ) 。至今为止，植物细胞中尚 未鉴定出有效的嘌呤受体。r o u x 和s t e i n e b r u n n e l ( 2 0 0 7 ) 对拟南芥和水稻基因组序列进 行分析后，都未发现与编码p 2 x 或者p 2 y 受体蛋白显著相似的基因。f o u n t a i n ( 2 0 0 8 ) 在 研究单细胞生物绿藻( o s t r e o c o c c u st a u r i ) 的过程中鉴定出了p 2 x 受体，但鉴定出的p 2 x 受体并不在细胞质膜起作用。 近些年以来，人们对p 2 受体的结构以及功能展开了深入的研究，许多种p 2 受体的亚 型通过分子生物学的手段被克隆出来。w e b b 等( 1 9 9 3 ) 在研究中首先克隆出了p 2 y 受体， l u s t i g 等( 1 9 9 3 ) 也克隆出了p 2 u ，p 2 u 也是一种p 2 受体亚型。这两种p 2 受体亚型( p 2 u 和p 2 y ) 都是与g 蛋白相偶联的受体，肽链的c 末端同样都位于胞内，n 末端伸出胞外， 同样都具有一个相同的结构域( 7 个跨膜的o r , 螺旋结构) 。有关p 2 嘌呤受体的总结如表1 所示。 表l 主要p 2 受体的分类( 黄亿华等，1 9 9 8 ) 1 1 3e a t p 的信号传导 e a t p 作为细胞外重要的信使分子，在动物体的各种生理过程中都起着十分重要的 作用。血管扩张的过程就是由动脉血管外的a t p 介导的一系列基因表达过程，对心血管 系统而言，a t p 作用于动脉血管壁内皮细胞上的p 2 y 受体，促使其释放一种被称为内皮衍 生松弛因子( e n d o t h e l i u m d e r i v e dr e l a x i n gf a c t o r ，e d r f ) 的物质，再由e d r f 引起血管扩张 ( 黄亿华，1 9 9 8 ) 。 动物细胞胞多 b a t p 通过嘌呤受体介导的细胞信号转导机制主要包括以下两类： ( 1 ) a t p 首先与嘌呤受体作用，然后作用于与g 蛋白相偶联的酶，进而引起下游一系列的 基因表达过程，( 2 ) a t p 直接激活配体门控的离子通道，使离子通道打开，从而引起跨 膜离子流动，引起下游一系列的基因表达过程( 罗海，2 0 0 6 ) 。 动物细胞# b a t p 与细胞表面的a t p 受体的相互作用，能够导致胞浆中c a 2 + 浓度的发 生变化，动物细胞外a t p 影响胞内c a 2 + 的机制如图1 i f i 示。 4 吲于体一胞气腑一眩彳体 辜，嵩 择3 流 ll j 争i + + 一1 + ， 胞未叶 胞浆c a 2 + f胞浆c a 2 + f 肥泵c a i 图l 动物细胞外a t p 对胞内c a 2 + 的影响( 黄亿华等，1 9 9 8 ) 1 2e a t p 作为一种细胞外重要的信使分子在植物细胞中的研究 1 2 1e a t p 的分泌 相比较人们对动物细胞外a r p 研究所取得的成果，人们对植物细胞外a t p 的研究开 展的较晚，所取得的成果也相对少一些。但近些年来，对植物细胞外的a t p 的研究逐渐 成为植物生理学和植物细胞生物学领域研究热点，关于植物细胞外a t p 深入的研究报道 也相应增多。 k i l n 等( 2 0 0 6 ) 构建了一个蛋白，这个蛋白是通过使纤维素连接的区域 ( c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 的肽链熔链松散，然后连接到荧光素酶( 一种依赖 a t p 的酶) 上，从而构建得到的融合蛋白c b d 荧光素酶，其中的c b d 可以铆钉到植物体 细胞壁上，从而保证被定位的a t p 位于细胞外。通过共聚焦显微镜或者c c d 照相就可以 检测活细胞或组织根部和根毛的荧光，从而确定e a t p 的定位和浓度。利用这种荧光显示 e a t p 的方法研究发现，根的顶端不同生长区和黄化胚轴都能够分泌e a t p ，并且e a t p 的 分泌水平是有区别的，这种区别对于不同种类的细胞也是不同的。一方面，由于细胞体 积的增加的方向是垂直于根的，所以黄化胚轴的表皮细胞和皮层细胞细胞壁的纵向上的 细胞体积增加的最快，研究发现这些部位也同时有最高的e a t p 水平。另一方面，在根 部分生组织的顶端，细胞体积的增加是最小的，研究表明这些部位e a t p 的水平也是最 5 低的。在相同根顶端的伸长组织中有较高e a t p 的水平，根部越成熟的区域其e a t p 的水 平越低。这些结果清楚地表明，e a t p 的分泌水平与细胞的年龄有直接的关系，正在生 长部位的e a t p 的水平较高，而成熟的区域的e a t p 的水平较低。 e a t p 分泌最显而易见的方式是细胞膜被破坏，从而使a t p 被释放到细胞外。s o n g 等( 2 0 0 6 ) 报道了植物体伤口处分泌的液体中含有大约4 0 # m o l l 浓度大小的a t p 。 y e g u t k i n ( 2 0 0 6 ) 和z i m m e r m a n n ( 2 0 0 0 ) 的研究发现，细胞质中瞬间释放出的a t p 浓度 可以达到毫摩尔水平，但是由于伤口处液体的稀释以及细胞外的磷酸酶、三磷酸腺苷双 磷酸酶等物质对a t p 的分解作用，使得测得伤口处的a t p 浓度只有微摩尔水平。 人们对动物细胞外的a t p 研究表明，动物细胞释放a t p 的一种形式以囊泡融合的形 式从细胞质膜释放出来。在植物细胞中，根毛极性生长的部分( 根毛顶端) 也有囊泡融 合现象的出现，所以研究人员推测植物细胞释放a t p 的一种形式是通过囊泡融合的形式 从细胞膜释放出来。b r e f e l d i na ( 布雷菲德菌素a ，一种特异性很强的小泡运输的抑制 剂) 处理导致e a t p 明显减少，从而证明了根毛e a t p 的分泌很可能是通过囊泡融合的形 式从细胞膜释放出来( k i m 等，2 0 0 6 ) 。 j e t e r 等( 2 0 0 4 ) 报道在伤害刺激、机械刺激和渗透胁迫条件下植物细胞外a r p 水平 会升高。k i m 等( 2 0 0 6 ) 也发现模拟病原刺激能够促进a t p 分泌，推测e a t p 可能在植物 细胞对病原刺激起反应的过程中发挥重要作用，a t p 的分泌很可能是各种( 生物和非生 物) 胁迫刺激下植物细胞信号转导链条中重要的一个环节。 可见，e a t p 主要通过细胞膜破坏、泡状融合、各种胁迫刺激的等过程分泌到细胞外。 几种主要的a t p 分泌方式如图2 所示 6 图2 植物e a t p 分泌的可能途径( r o u x ，2 0 0 7 ) 1 2 2e a t p 对植物细胞代谢的影响 2 0 世纪六七十年代人们开始关注植物细胞外a t p 的作用，近些年来取得了较多的研 究进展。近些年来的研究表明，细胞外a t p 在刺激植物的器官运动( j a f f e 等，1 9 7 3 ) 等 植物细胞中各种生理反应过程中起着十分重要的作用。 t a n g 等( 2 0 0 3 ) 研究发现j l - ；b la t p 可以抑制根的向重力生长，使本该垂直向下生 长的根发生了弯曲，加大a t p 的浓度则会导致了根的卷曲生长。在拟南芥和玉米等植物 材料中都发现j b na t p 能够抑制生长素的极性运输，由于生长素具有抑制植物体根生长 的作用，因此推测外加a t p 可以抑制生长素的极性运输，从而使根的向重力性生长受到 了抑制。c h i v a s a 等( 2 0 0 5 ) 的研究以拟南芥、玉米、烟草和大豆细胞为实验材料，用 葡萄糖一己糖激酶和腺苷三磷酸双磷酸酶水解掉细胞外a t p 分子，导致了植物细胞的死 亡；而用d ，丫亚甲基腺苷5 三磷酸等一些a t p 类似物竞争性地抑制a t p 与细胞表面的 a t p 受体的结合同样可以导致了植物细胞的死亡。上述研究结果都表明e a t p 在维持细 胞活性方面发挥重要作用，细胞外a t p 的存在对于植物细胞存活是必需的，一旦细胞外 a t p 被清除或a t p 与细胞表面的a t p 受体的结合受到抑制，这些细胞内重要生理过程 也会相应停止，从而引起植物细胞的一系列不良反应的出现，甚至造成细胞的死亡。由 此可见，细胞外a t p 在调控植物细胞生命活动的某些基本的生理过程中发挥着重要的作 用。f b l 是一种真菌毒素，研究发现f b l 处理以后，植物细胞外a t p 的数量明显减少， 植物细胞的一些不良反应也相继出现，甚至引起了植物细胞的死亡。j l - j la t p 则会使植 物细胞的不良反应得到缓解。外源a t p 能够缓解f b i 造成的毒害作用，说明了a t p 在 细胞生存方面的发挥作用。由此可见，e a t p 在植物体细胞代谢调控的过程中发挥着十 分重要的作用。 1 2 3e a t p 的信号转导 动物细胞中的a t p 介导的一系列信号转导机制已经基本清楚，而植物细胞e a t p 介导 的一系列信号转导机制尚未弄清，但近些年来植物e a t p 介导的一系列信号转导机制的研 究也取得了一些进展。2 0 0 0 年左右，人们开始认识到植物细胞外确实存在着a t p 分子， 并且认识到细胞外a t p 在植物体细胞代谢调控的各种过程中发挥着着十分重要的作用， 于是对细胞外a t p 在植物细胞信号转导过程中的地位及其作用机制开展广泛的研究，近 几年取得的研究成果逐渐表明，a t p 植物细胞外一种重要的信使分子。 近些年来的研究也表i 碉r o s 的形成对e a t p 介导的植物细胞中一系列的信号传导过 7 程至管重要。s o n g 等( 2 0 0 6 ) 在他们的研究中证实了a t p 可以促进植物细胞a o s 的形 成。k i m ( 2 0 0 6 ) 等对r o s 分布的分析表明在植物体根毛顶端的活性生长区r o s 有很强 的活性。在没有加入a t p 的对照实验中，r o s 的活性在1 5 分钟内没有明显的变化，保持 在同一水平，而外加a t p 的实验中，r o s 的活性在1 5 分钟内明显上升，在1 5 分钟后r o s 的活性又恢复到原来的水平，外加腺苷、a m p 、a d p 都不能对r o s 的活性产生影响，外 加可以水解a t p 的三磷酸腺苷双磷酸酶则会造成r o s 的活性的下降。在大多数的a t p 处 理的实验中，发现a t p 和a d p 具有类似的刺激效果，a t p 彻底水解的产物a m p 、无机磷 酸不能a t p 刺激后所引起的生理反应，而不能被a t p 酶水解的a t p 类似物( 例女i 2 m e a t p 、 a 1 3 m e a t p 和p 丫m e a t p 等) 也都能够引起a t p 刺激后出现的生理反应，说明筒r p 刺激后所 出现的生理反应是a t p 直接引起的，而不是它水解之后的产物引起的生理效应。某些三 磷酸核苷( 如u ，r p 、g t p ) 虽然其作用效果明显比a t p 弱，但同样具有与a t p 类似的生 理活性，这表明具有相对完整的核苷三磷酸结构的分子对于植物细胞的生理功能也具有 调控作用。外加一种角素混合物( 是一种诱导植物防御反应的强诱导剂，用于模拟病原 刺激) 能够引起较高的r o s 活性，外加三磷酸腺苷双磷酸酶r o s 的活性下降，说明这种 角素混合物引起的r o s 活性的升高可以通过外加三磷酸腺苷双磷酸酶而逆转。k i m ( 2 0 0 6 ) 等研究发现a t p 和r o s 在根毛细胞中的共区域化，e a t p 量多的区域同样有较高 的r o s 活性，e a t p 量的多少直接影响r o s 量的变化。上述研究结果说明了a t p 可以显著 增强r o s 的活性，这暗示了可能存在一条e a t p 和r o s 参与的信号传导通路，e a t p 可能 是通过r o s 来影响根毛细胞的正常生长。、u 等( 2 0 0 8 a ) 在研究中发现外加1 0 1 0 0 1 t m a t p 到丹参毛壮根培养基中可以快速引起h 2 0 2 产生以及培养基p h 的升高，并对e a t p 具 有剂量依赖性，这一过程可以被动物细胞中的质膜嘌呤受体抑制剂r b 和c a 2 + 螯合剂 e g t a 有效抑制。他们还发现y e 诱导的a t p 的释放也依赖于c a 2 + 的内流，这些结果表明 c a 2 + 内流在e a t p 释放及其诱导h 2 0 2 产生及h + 内流过程中起到重要作用。w u 等( 2 0 0 8 b ) 还发现外加1 0 1 0 0 9 m a t p 到丹参毛壮根培养基中可以快速引起n o 产生，并对a t p 具有 剂量依赖性，但是外加1 0 0 2 0 0 9 m 甚至跟高浓度的a t p 时，n o 的水平随之降低，采用不 能水解的a t p 类似物a t 聊s ，得到了同样的结果。此诱导n o 产生的过程可被c a 2 + 螯合剂 所抑制，却不受蛋白激酶的抑制剂的影响，然而，外加a t p 诱导h 2 0 2 产生的过程依赖于 c a 2 + 内流、蛋白激酶还有n o 的生物合成。也就是说，a t p 诱导胞内c a 2 + 水平快速升高依 赖于n o 的生成而不是h 2 0 2 。这个实验结果表明，植物细胞中n o 的生成是a t p 诱导的生 理反应及信号转导过程中的一个环节。 s o n g 等( 2 0 0 6 ) 研究发现外加a t p 或者u r p 、g t p 等其他核昔三磷酸能够引起超 氧离子( 0 2 ) 积累，以n a d p h 氧化酶缺失突变体为实验材料，加入a t p 处理后，细 胞内0 2 - 的积累量很少，而在野生型植株中加入二亚苯基碘( d i p h e n y l e n e i o d o n i u m ，d p i ， n a d p h 氧化酶的抑制剂) 同样可以抑制a t p 诱导的r o s 活性的升高，说明在这一过 程中细胞膜上的n a d p h 氧化酶发挥了重要的作用。外加的伤害刺激促使受伤部位e a t p 大量积累，同时显著刺激活性氧合成。研究中还证实外加动物细胞p 2 受体的抑制剂 p p a d s 和r b 2 能够抑制e a t p 引起0 2 。的积累，说明明e a t p 可能是通过此受体结合进 而引起一系列的信号传递，从使细胞内0 2 的积累量增多。 加入钙离子螯合剂或者钙离子通道阻断剂能够抑制舒皿对活性氧积累的诱导作用， 说明在e a t p 和活性氧产生之间钙离子信号发挥着重要的介导作用细胞质中重要的作用。 s t e i n e b m 衄e r 等( 2 0 0 3 ) 报道了a t p 作为一种信号分子，增加a r p 的浓度可以使细胞内的 钙离子浓度上升。j e t e r 等( 2 0 0 4 ) 报道了a t p 诱导的细胞内钙离子水平的上升可能与下 游的一系列基因表达有联系，从而推测可能有一个细胞外a r p 诱导的完整的信号通路存 在。k i m 等( 2 0 0 6 ) 在研究中证实在根毛中存在一个顶端的钙离子浓度梯度，外加异博 定( 一种钙离子通道的阻断剂) 可以抑制根毛的顶端生长，但不影响根毛突起的形成。 j e t e r 等( 2 0 0 4 ) 发现无论是伤害、外源a t p 刺激还是渗透胁迫，都会导致细胞内的 m a p k 家族成员表达量的增加，暗示在e a t p 信号转导过程中，m a p k 家族很可能作为 信号转导过程中重要的部分，通过调节细胞内结构和功能蛋白的磷酸化状况而直接调控 细胞内的生理反应。研究中对伤害引起一系列的信号传导过程进行了总结，“伤害信号 一细胞内a t p 分泌一e a t p 含量增加_ 质膜钙通道开放_ 细胞内钙信号产生- - - ，m a p k 成 员增加_ 细胞内蛋白磷酸化_ 细胞内生理反应”这样一条信号转导途径是完全可能存在 的。研究中还发现e a t p 刺激胁迫相关基因的表达，包括乙烯合成的相关基因，推测乙 烯的产生及其诱导细胞内与抗性有关的基因表达也可能是e a t p 信号转导过程中的重要 环节之一。 结合近年来的相关实验结果，s o n g 等( 2 0 0 6 ) 提出了e a t p 信号转导的可能机制， 如图4 所示，在伤害刺激条件下，e a t p 水平升高，与质膜受体结合后激活钙通道，导 致细胞内钙离子水平升高，通过钙调素激活细胞膜上的n a d p h 氧化酶，刺激活性氧信 号产生，再由活性氧调控下游的基因表达。在信号转导完成后，腺苷三磷酸双磷酸酶分 9 解e a t p 使其恢复到正常水平，a t p 分解产生的腺苷分子也可以通过抑制活性氧的合成， 尽快切断信号传递，结束对生理反应的影响。 众多的研究结果表明：e a t p 是植物细胞的一种重要的细胞外信使分子，在植物细胞 的生长发育和防御反应和各种代谢过程中发挥着重要的作用。对于e a t p 受体、e a t p 跨 膜信号转导的作用机制以及下游一系列的基因表达的过程等方面进行深入的研究，将帮 助我们对植物生长发育和耐受胁迫的生理机制有更深入的理解。 俐澈耖斛 活p 乏秘小 ，体露c a m i 图3e 册可能的信号转导过程( s o 雄等2 0 0 6 ) 2 异三聚体g 蛋白 21 异三聚体g 蛋白的结构 活细胞内的g 蛋白根据其亚基组成及分子量大小一般被分为两大类。一类是由3 种不同亚基、b 、t 构成的异三聚体g 蛋白( h n 盱。幽甜c g - p r o t e i n s ) ，另一类是只含 有一个亚基的单聚体g 蛋白，故又被称为小g 蛋白( 锄d l g - p r o t e i n s l ，一般所说的g 蛋 白是指异三聚体g 蛋白。 异三聚体0 蛋白在植物细胞的生长发育及胞外信号跨膜转导中发挥着非常重要的 作用。人们利用多种实验方法在多种植物中检测到了异三聚体g 蛋白的存在，其中作为 模式植物的拟南芥的异三聚体g 蛋白研究尤为充分。拟南芥基因组的基因序列信息表 明，拟南芥中可能有8 1 0 种不同的g d 、l 一2 种g 0 、1 种研、2 0 种左右的g 蛋白偶 联受体基囡( a r a b i d o p s i sg e n o m ei n i t i a t i v e ，2 0 0 0 ) 。目前对于基因克隆和功能的研究实 验表明，拟南芥细胞中存在着一种g a ( g p a l ) ，一种0 0 ( a g b l ) ，2 种g 丫( a g g l ， a g g 2 ) ，1 种g p c r ( g c r l ) 的基因。 m a ( 1 9 9 1 ) 等在研究中发现g a 亚基具有g t p g d p 核苷酸结合位点和g t p 水解酶 的活性，并且具有多个与异三聚体g 蛋白的生理功能关系极为密切的功能位点，如a d p 一 核糖基化位点、质膜受体识别与结台位点和胞内效应器结合位点等，因此g 是异三聚 体g 蛋白的功能亚基。异三聚体g 蛋白未被激活时，b 和y 亚基以非共价键紧密结合在 一起形成二聚体，g r 叶曾被认为是调节g a 活性的调节亚基，但越来越多的证据表明g 所 同样可以直接调节其胞内效应器( w e i s s 等，1 9 9 4 ) 。 22 异三聚体g 蛋白的活化机制 g 蛋白偶联受体( gp r o t e i n - c o u m e dr e c e p t o r ，g p c r ) 在异三聚体g 蛋白的活化过程 的起着十分重要的作用，异三聚体g 蛋白活化机制大体卜可以概括为：当细胞处于静息 状态时，g a 和g d p 结合，与g 叶共同构成二聚体形式；肖细胞质膜表面的受体g p c r 与 配基结合后，受体g p c r 被活化并催化g a 使其与g d p 解离，并在同位置结合g t p ，结 合t g t p 的印构象发生变化，使g 脚r t g a 解离，g a 被活化，被活化的g e t 调节胞内效应 器，进。步引起下游一系列的基因表达。此后o q 内源的g t p a s e 水解g t p ，形成g d p ， g d p 与g e t 的结合使g a 又恢复为非活化状态，此时g b t 再次与蕊结合成三集体的形式， 等待下一个配基的结合，从而进行下一次信号转导过程。异三聚体g 蛋白的活化机制如 图4 所示。 圈4 异三聚体g 蛋白的活化机制( 引白a s s m a n n ，2 0 0 2 ) 茹翩 驴嶂 l 譬 岛。 2 3 植物异三聚体g 蛋白的信号传导 对动物和简单真核生物细胞中异三聚体g 蛋白的研究已经取得了一定的进展，异三 聚体g 蛋白的结构、g 蛋白偶联受体及其与下游一系列的效应器之间的作用机制都已经 有了比较清楚的认识。而异三聚体g 蛋白在植物细胞中的研究开展的较晚，但也取得了 一定的进展。近些年来的研究表明植物细胞中异三聚体g 蛋白在植物体的种子萌发、光 反应( o k a m o t o 等，2 0 0 1 ；j o n e s 等，2 0 0 3 ) 以及细胞分化等各种细胞代谢过程发挥作 用。 a h a r o n 等( 1 9 9 8 ) 和p e r f u s b a r b c o c h ( 2 0 0 4 ) 的研究表明，作为细胞质膜上主要的 跨膜信号转导成分，异三聚体g 蛋白参与调控植物细胞内c a 2 + 信号产生的过程，而且 钙离子通道很可能就是异三聚体g 蛋白下游效应器。异三聚体g 蛋白不仅参与了调控 植物细胞内c a 2 + 信号产生的过程，而且在植物激素、光以及质外体钙调素信号传导过程 中发挥着重要的作用。 2 3 1 异三聚体g 蛋白与植物激素信号传导 异三聚体g 蛋白在植物激素信号转导过程中具有着十分重要的作用。u l l a h 等 ( 2 0 0 1 ) 研究发现，烟草野生型植株经生长素处理后，发现其细胞周期缩短，细胞分裂 频率增加，转基因培养系中g p a l 过量表达型的烟草植株也出现了相同的现象，而转基 因烟草培养系中g p a l 的缺失突变体( g p a l j 和g p a l - 2 ) 的叶和茎中，细胞周期g l 期 延长，有丝分裂频率降低，由此可见，异三聚体g 蛋白在植物生长素信号转导过程中起 作用。 w a n g 等( 2 0 0 1 ) 在研究中利用拟南芥野生型和g q 的缺失突变体g p a l 植株，证实 了g a 参与a b a 调节气孔开放过程，说明异三聚体g 蛋白可能在a b a 调节的气孔开放 过程中发挥作用。p a n d e y s 和a s s m a n n ( 2 0 0 4 ) 在研究中发现，a b a 处理能够抑制拟南 芥的主根伸长过程，研究中利用拟南芥野生型以及g p a l ，a g b l ，g c r l 的单突变体、双 突变体为实验材料，说明了异三聚体g 蛋白可能参与到了在a b a 抑制拟南芥主根伸长 的一系列信号转导过程中，调节拟南芥主根伸长的过程。由此可见，异三聚体g 蛋白在 植物生长素信号转导过程中起作用。 异三聚体g 蛋白也同样参与了赤霉素的信号转导过程。h o o l e y 等( 1 9 9 8 ) 的研究 证实异三聚体g 蛋白与赤霉素的信号转导过程有关。u l l a h 等( 2 0 0 2 ) 的研究