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细菌内毒素检测,。,目录,细菌内毒素简介,细菌内毒素检查法,需要注意的问题,1,2,3,细菌内毒素简介,主要内容来源特性与热源的关系在药检中应用,细菌内毒素简介,主要来源主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖，这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约在15纳米。细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为1至100EU/ml。,细菌内毒素简介,主要特性（实验器材处理方法）耐热性一般在100加热1小时无影响，120加热4小时能破坏98，180200干热2小时或250干热半小时才能完全破坏。故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。2.不耐酸碱性内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡,细菌内毒素简介,主要特性（实验器材处理方法）3.水溶性与不挥发性热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。故：不可用湿热灭菌法处理实验器具,细菌内毒素简介,主要特性（去除内毒素方法）4.滤过性原体积很小，约在15nm之间，故能通过除菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不能通过半透膜。5.吸附性能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。,细菌内毒素简介,热源=内毒素？热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。,细菌内毒素简介,热源检查方法简介中国药典热原检查方法是采用家兔升温法进行检查。将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。,细菌内毒素简介,与热源对比内毒素检查法优势方便、快捷、经济；重现性好、灵敏度高；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源法,细菌内毒素简介,在药检中的应用细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。成品检查药品安全性检查之一半成品（生产过程）检查事前质控手段，避免造成药品成批报废,细菌内毒素检查法,主要内容凝胶法原理名词及基本概念解释方法学建立与验证结果判定,细菌内毒素检查法,中国药典批准使用方法：供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。本节将着重介绍凝胶法法的操作与有关原理。,测定方法,凝胶法,光度测定法,浊度法,显色基质法,细菌内毒素检查法凝胶法,基本原理,细菌内毒素检查法,名词解释1鲎及鲎试剂鲎（hu）是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。将此物质进行提取，经低温冷冻干燥而成的生物试剂即为鲎试剂，专用于细菌内毒素检测。鲎试剂灵敏度（）：能检测出内毒素标准溶液或供品溶液中的最低内毒素浓度。,细菌内毒素检查法,名词解释2国家标准品及工作标准品国家标准品：（单位：EU/ml）自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价；工作标准品：经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照；,细菌内毒素检查法,名词解释3细菌内毒素检查用水凝胶法：内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；故：灭菌注射用水细菌内毒素检查用水光度法：内毒素含量应小于0.005EU/ml；,细菌内毒素检查法,基本概念1细菌内毒素限值（L）指人对药品中细菌内毒素所能耐受的不致引起热原反应的某定量限值（L）；计算公式：L=K/MK：每公斤体重每小时最大可接受内毒素剂量，注射剂K=5EU/(kg.h)M:每公斤体重每小时的最大供试品剂量；以胸腺素1计算限值为例：L=5EU/(kg.h)(1.6mg60kg)=185.19EU/mg,细菌内毒素检查法,基本概念2样品最大有效稀释倍数（MVD）指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测；计算公式：MVD=cL/L：供试品的细菌内毒素限值c：供试品溶液的浓度：鲎试剂灵敏度以胸腺素1计算最大稀释倍数为例：MVD=10EU/mg1.6mg/ml0.25EU/ml=64（倍）,细菌内毒素检查法凝胶法,方法学建立步骤计算样品的内毒素限值（L）选择合适的鲎试剂计算最大有效稀释倍数方法学验证实验（灵敏度、干扰试验）（详见后）供试品凝胶法检测,细菌内毒素检查法凝胶法,方法学验证鲎试剂灵敏度复核试验（新购）目的：对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。方法：将细菌内毒素工作标准品稀释至2、0.5、0.25浓度，加入到鲎试剂中，保温371h，然后观察结果。结果判定：内毒素标准溶液2、0.5管应均为阳性，最小浓度(0.25)应均为阴性，本批鲎试剂可用。,细菌内毒素检查法凝胶法,试验结果（阴、阳性）判定：,细菌内毒素检查法凝胶法,方法学验证供试品干扰试验目的：确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数；,方法学验证供试品干扰试验影响因素：新药检查方法建立；鲎试剂批号或来源的改变；检品生产工艺，配方，成分的改变；检品关键成分来源的改变；,细菌内毒素检查法凝胶法,方法学验证供试品干扰试验试验方法：须选择两家以上的鲎试剂进行试验,细菌内毒素检查法凝胶法,方法学验证供试品干扰试验结果判定：如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度（c）均在0.5-2.0范围内时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，否则需要对供试品做适当处理。干扰的排除：对供试品进行更大倍数的稀释；选择灵敏度更高的鲎试剂；其他适宜的方法如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。,细菌内毒素检查法凝胶法,供试品日常细菌内毒素凝胶法检测检测方法：结果判定阴性阳性阳性阴性,注：A无干扰浓度供试品溶液；B供试品阳性对照；C阳性对照；D阴性对照。,细菌内毒素检查法凝胶法,回顾,实验试剂、仪器及用具等的准备,确定药品的细菌内毒素限值L,选择鲎试剂的灵敏度,鲎试剂的灵敏度复核,计算供试品的最大有效稀释MVD,供试品的干扰试验的验证（正式干扰试验）,供试品日常的内毒素限量检查,注意事项,实验前应复合鲎试剂产品的灵敏度和自身凝集时间鲎试剂灵敏度的改变或质量不符合要求，会影响实验结果实验器具的洁净度符合要求一般用硫酸清洁液浸泡4小时，用自来水冲洗干净，再用新鲜蒸馏水冲洗三道，并干热（250）恒温1.5h即可。实验用的玻璃器具必须严格无菌无热原，建议不要使用一次性朔料制品。实验条件实验室要求洁净，无尘埃空气流通，