（微生物学专业论文）p27kip1在小鼠卵巢发育中的控制作用.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 眭美丞1 日 期：丝望z 三f 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复 制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 导师签名： 日期： 丝2 = ! ：2 山东大学硕士学位论文 中文摘要 为了揭示哺乳动物卵巢滤泡形成和活化的分子机制，我们利用 基因修饰小鼠模型对此进行了深入细致的研究，获得了一些有力的 证据，表明周期蛋白依赖性激酶( c d k ) 韵抑制因子p 2 7 “p 1 ( p 2 7 ) 是通过抑制原始滤泡的形成和活化、促进原始滤泡死亡来控制卵巢 发育的 为了研究p 2 7 的功能，我们利用p 2 7 缺失( p 2 t i ) 小鼠来研究 p 2 7 在小鼠卵巢滤泡形成、活化以及闭锁退化中的作用。通过提取小 鼠尾巴的染色体组d n a 测定小鼠的基因型；通过形态学染色和免疫 组织化学染色确定小鼠卵巢中卵母细胞和各个发育阶段滤泡的数 量：通过免疫印迹法测定小鼠卵巢中以及磷酯酰肌醇一3 激酶途径中 相关蛋白质的表达水平和磷酸化水平；用组蛋白h 1 傲为底物测定小 鼠卵巢中相关激酶的活性。 通过对p 2 7 缺失小鼠和野生型小鼠出生后第1 天卵巢进行免疫 组织化学染色结果显示。p 2 7 缺失小鼠出生后，形成原始滤泡的数量 是野生型小鼠的两倍。p 2 7 缺失小鼠卵巢中原始滤泡数量的增加，表 明p 2 7 具有抑制小鼠原始滤泡形成的作用。用组蛋白h l 做为底物对 p 2 7 缺失小鼠卵巢中周期蛋白依赖性激酶的活性进行测定显示，p 2 7 缺失小鼠中c d k 2 的活性与野生型小鼠相比显著上升。表明p 2 7 缺失 两抑制作用解除时c d k 2 的活性上升，由此促进和加强了原始滤泡的 形成。利用p 2 7 与c d k 2 共同缺失的小鼠模型试验结果表明，小鼠卵 巢中不能形成原始滤泡。因此c d k 2 的活性存在与否直接影响着卵巢 中能否形成原始滤泡以上结果说明p 2 7 是通过抑制c d k 2 的活性来 阻止小鼠卵巢中原始滤泡形成的。 山东大学硕士学位论文 通过对p 2 7 缺失小鼠和野生型小鼠出生后第2 天、第4 天、第8 天、第1 3 天和第3 5 天的卵巢进行形态学染色和免疫组织化学染色 观察以及对小鼠出生后第8 天、第1 8 天、第2 3 天和第3 5 天卵巢中 原始滤泡和活性滤泡的数量以及两者的百分率进行统计，结果表明 p 2 7 缺失小鼠卵巢中原始滤泡被过早活化了，说明p 2 7 可以有效地阻 止小鼠卵巢中原始滤泡向活性滤泡的转化。通过免疫印迹法测定p 2 7 缺失小鼠卵巢提取物中磷酯酰肌醇一3 激酶途径的关键分子蛋白激 酶b 、磷酸化的蛋白激酶b 、f o x 0 3 a 和磷酸化的f o x 0 3 a ，p 2 7 缺失 小鼠与野生型小鼠的表达水平基本一致，表明磷酯酰肌醇一3 激酶途 径在p 2 7 缺失小鼠卵巢原始滤泡活化过程中能正常发挥调控作用， 促进原始滤泡的活化。 另外，在小鼠发育成熟早期( 例如，在1 2 周的小鼠卵巢中) ，p 2 7 缺失小鼠卵巢中滤泡的数量急剧下降，大量被活化的滤泡耗尽之后 引起了卵巢功能早衰( p o f ) ，这和人类卵巢功能早衰现象是一致的。 表明p 2 7 缺失可以导致卵巢滤泡发育缺陷，引起卵巢功能失调和多 种病理变化。 通过对p 2 7 缺失小鼠和野生型小鼠卵巢中原始滤泡和活性滤泡 数量的分析表明野生型小鼠在性成熟前( 出生后第3 5 天) 原始滤泡 池中没有被活化的大量原始滤泡消失了，而p 2 7 缺失小鼠性成熟前 没有被活化的原始滤泡大部分消失的现象被抑制了说明p 2 7 是造 成小鼠卵巢中性成熟前原始滤泡闭锁退化的关键分子用组蛋白h i 做为底物测定p 2 7 缺失小鼠卵巢中c d k 2 c d c 2 一c y c l i n a b 1 激酶的 活性，与野生型小鼠相比明显上升，表明由于p 2 7 缺失导致的激酶活 性升高在一定程度上抑制了原始滤泡的死亡说明p 2 7 是通过抑制 相关激酶的活性来导致小鼠卵巢中性成熟前原始滤泡闭锁退化的。 总之，p 2 7 是决定哺乳动物卵巢发育的关键分子之一p 2 7 是卵 2 山东大学颈士学位论文 巢原始滤泡形成和活化的抑制因子，是原始滤泡闭锁退化的促进因 子，是黄体分化的重要因子。我们提出小鼠卵巢中p 2 7 缺失可以导 致滤泡发育缺陷，从而引起卵巢功能失调和多种病理变化。这项研 究中的发现为人类由于卵巢遗传畸变而导致滤泡发育缺陷的疾病提 供了有力的理论依据，使我们能够深入了解人类卵巢功能早衰等导 致不孕的疾病。 关键词：p 2 7 。p i 、p 2 7 缺失小鼠、滤泡形成、滤泡活化、滤泡退化 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h em o l e c u l a rm e c h a n i s m su n d e r l y i n gm a m m a l i a no v a r i a nf o l l i c l e f o r m a t i o na n da c t i v a t i o na r ep o o r l yu n d e r s t o o d i nt h i st h e s i s ，w e p r o v i d es e v e r a l l i n e so fg e n e t i ce v i d e n c e s h o w i n gt h a tt h ec y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e ( c d k ) i n h i b i t i o rp 2 7 。p 1 ( p 2 7 ) c o n t r o l s o v r i a n d e v e l o p m e n ti nm i c e ，b ys u p p r e s s i n gf o l l i c l ef o r m a t i o na n da c t i v a t i o n ， a n db yp r o m o t i n gf o l l i c l ed e a t h i no r d e rt os t u d yt h ef u n c t i o no fp 2 7 ，w eu s e dp 2 7 - d e f i c i e n tm i c e q 27 。一) w e e x t r a c t e dt h eg e n o m i cd n af r o m m i c et a i l t i p s t o d e t e r m i n et h eg e n o t y p e s t oq u a n t i f yt h et o t a ln u m b e r so fo v a r i a n f o l l i c l e sa tv a r i o u sd e v e l o p m e n ts t a g e s ，w ec o u n t e da l ls e c t i o n so fa n o v a r yt h a ts t a i n e dw i t hh e m a t o x y l i nf o rm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y f o rd e t e c t i o no f o o c y t e s w e s t e r n b l o tw e r e p e r f o r m e dt om e a s u r ep r o t e i nl e v e l si nm i c eo v a r ya n dt h ee x p r e s s i o n p h o s p h o r y l a t i o nl e v e l so fc o m p o n e n t so fp h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3k i n a s e ( p 1 3 k ) p a t h w a yi no o c y t e s k i n a s ea s s a y su s i n gh i s t o n eh 1a sa s u b s t r a t ew e r ep e r f o r m e dt od e t e r m i n ek i n a s ea c t i v i t i e s w ef i r s tq u a n t i f i e dt h eo o c y t en u m b e r sa tp d1 ( p o s t n a t a ld a y ) a n d f o l l i c l en u m b e r sa tp d 8b yc o u n t i n go o c y t e si ns e r i a ls e c t i o n so fw h o l e o v a r i e sf r o mp 2 7 。a n dp 2 7 hm i c e i np 2 7 - d e f i c i e n tm i c e ( p 2 7 、 p o s t n a t a lf o l l i c l ea s s e m b l yw a sa c c e l e r a t e d ，a n dt h en u m b e ro fe n d o w e d f o l l i c l e sw a sd o u b l e da sc o m p a r e dt ow i l dt y p em i c eb 2 7 1 + ) i t i n d i c a t e st h a tp 2 7c a ns u p p r e s sp r i m o r d i a lf o l l i c l ee n d o w m e n t i n p 2 7 一d e f i c i e n tm i c e ，t h ea c t i v i t i e so fc d k 2w e r ee l e v a t e da n dm a y e n h a n c ef o l l i c l ef o r m a t i o n t h ef o r m a t i o no fo v a r i a nf o l l i c l e si n p 2 7 d e f i c i e n tm i c ew a sc o m p l e t e l ye l i m i n a t e db ys i m u l t a n e o u sl o s so f c d k 2 ，i n d i c a t i n gt h a tc d k 2i sa ne s s e n t i a lm o l e c u l ef o ro o c y t es u r v i v a l a n df o l l i c u l a rf o r m a t i o ni nw i l d t y p ea n dp 2 7 一d e f i c i e n tm i c e p 2 7 4 山东大学硬士学位论文 s u p p r e s s e sf o l l i c l ef o r m a t i o ni nm i c et h r o u g hs u p r e s s i o nt h ea c t i v i t i o n o f c d k 2 b ys t a i n i n g w i t h h e m a t o x y l i n f o r m o r p h o l o g i c a la n a l y s i s a n d s t a i n i n gw i t hg c n a 1o rv a s af o ri m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n a l y s i s ，w e o b s e r v e dp 2 7 “j a n dp 2 7 “m i c eo v a r i e so fp d 2 ，p d 4 。p d 8 ，p d l 3a n d p d 35a n dq u a n t i f i e dt h en u m b e ro fp r i m o r d i a lf o l l i c l e sa n da c t i v a t e d f o l l i c l e so fp d g ，p d ig ，p d 2 3a n dp d 3 5 o u rd a t as u g g e s tt h a t p r i m o r d i a l f o l l i c l e sw e r ep r e m a t u r ea c t i v a t e di np 2 t - m i c eo v a r i e s p r o t e i np 2 7s u p r e s s e sp r i m o r d i a lf o l l i c l ea c t i v a t i o ni nm i c e w ea l s o d e t e c t e dp r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l so fc o m p o n e n to fp 1 3 kp a t h w a yi n p 2 7 - m i c eo v a r i e sb yw e s t e r nb l o t ，t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fa k t ，p - a k t ， f o x 0 3 aa n dp - f o x 0 3 ai np 2 t - o o c y t e sw e r es i m i l a rc o m p a r e dt ot h o s ei n p 2 7 + 一o o c y t e s 。t h a ti n d i c a t e dt h a tp 1 3 kp a t h w a y si np 2 7 一d e f i c i e n tm i c e o o c y t ec a nc o n t r o lp r i m o r d i a lf o l l i c l ea c t i v a t i o n h o w e v e r ，a te a r l ya d u l t h o o d ( i e i n 1 2 - w e e k - o l dm i c e ) ，t h e o v e r a c t i v a t e df o l l i c l e sw e r ed e p l e t e d ，c a u s i n gp r e m a t u r eo v a r i a nf a i l u r e w h i c hi sas y m p t o ms i m i l a rt ot h a to fp r e m a t u r eo v a r i a nf a i l u r ei n h u m a n s t h u s 。t h ep 2 7 。m i c em a yb eau s e f u lm o d e lf o rt h es t u d yo f o v a r i a nf a i l u r e 。w h e r ef o l l i c l e sa r ed e p l e t e dd u et oo v e r a c t i v a t i o n i nm i c e ，al a r g ep r o p o r t i o no ff o l l i c l e sd i s a p p e a rf r o mn o n - g r o w i n g f o l l i c l ep o o ld u r i n gt h ef i r s tw a v eo ff o l i c l ed e v e l o p m e n t h o w e v e r ，i n p 2 7 以o v a r i e st h i sr a p i df o l l i c l ed e a t hi sl a r g e l yp r e v e n t e d ，i n d i c a t i n g t h a tp 2 7i sak e ym o l e c u l ei nt h ep r o m o t i o no ff o l l i c l ea t r e s i ap r i o rt o s e x u a l m a t u r i t y b yp e r f o r m i n g k i n a s e a s s a y s ，w e s h o w e dt h a t c d k 2 c d c 2 c y c l i n a b1c o m p l e x e s - a s s o c i a t e d k i n a s ea c t i v i t i e s a r e e l e v a t e di np 27 小o v a r i e sa n ds u p p r e s s e df o l l i c l ea t r e s i ab e f o r es e x u a lm a t u r i t y p r o t e i np 2 7p r e v e n t sf o l l i c l ea t r e s i at h r o u g hs u p p r e s s i o nt h ea c t i v a t i o n o fc d k 2 1 c d c 2 - - c y c l i n a b 1c o m p l e x e s i nc o n c l u s i o n ，t h ep 27g e n ei st h ec r i t i c a lm o l e c u l ei nd e t e r m i n i n g m a m m a l i a no v a r i a nd e v e l o p m e n t w ep r o p o s et h a td e r e g u l a t i o no fp 2 7 些墨查兰堡主兰垒丝塞 m a yl e a dt od e f e c ti nf o l l i c l a rd e v e l o p m e n t ，w h i c hm a yc a u s ed i s t u r b e d o v a r i a nf u n c t i o na n dp a t h o l o g i c a lc h a n g e si no v a r y t h ef i n d i n g si nt h i s s t u d ym a yp r o v i d es o m eu s e f u lk n o w l e d g ei nt h es e a r c hf o rg e n e t i c a b e r r a t i o n so ft h eo v a r yt h a tl e a dt od e f e c t si nf o l l i c l ed e v e l o p m e n ti n h u m a nd i s e a s e s ，s u c ha sp r e m a t u r eo v a r i a nf a i l u r e k e y w o r d s ：p 2 7 州，p 2 7 一d e f i c i e n tm i c e ，f o l l i c l ef o r m a t i o n 。f o l l i c l e a c t i v a t i o n ，f o l l i c l ea t r e s i a 6 山东大学项士学位论文 符号说明 a k t p k b p r o t e i nk i n a s eb 蛋白激酶b a p sa m m o n i u mp e r s u l f a t e 过硫酸铵 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 b m p 一1 5b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n 1 5 骨成形素蛋白一1 5 c x 3 7c o n n e x i n3 7 连接蛋白3 7 c x 4 3e o n n e x i n4 3 连接蛋白4 3 c l c o r p u sl u t e u m 黄体 c d k c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e周期蛋白依赖性激酶 c k i c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r 周期蛋白依赖性激酶抑制因子 d t td i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e g f e p i d e r m i sg r o w t hf a c t o r 表皮生长因子 e g t a 2 - a m i n o e t h y le t h e rt e t r a a c e t i ca c i d2 - - 氨基乙醚四乙酸 e be t h i d i u mb r o m i d e溴乙锭 4 e b p l4 eb i n d i n gp r o t e i n14 e 连接蛋白l f o x of o r k h e a db o xo t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s叉头转录因子 0 亚家族 f s hf o l l i c l es t i m u l a t i n gh o r m o n e 滤泡刺激素 g s k 3 g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e - 3 糖原合成酶激酶一3 g c n a l g e r mc e l ln u c l e a ra n t i g e nl生殖细胞核抗原i g d f 一9 g r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r - 9生长分化因子一9 i g f 1i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r - l 类胰岛素生长因子l k i tr e c e p t o rp r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e ( r p t k )受体蛋白酪氮酸激酶 k lk i tl i g a n dk i t 配体 7 山东大学硬士学位论文 m t o rm a m m a l i a nt a r g e to fr a p a m y c i n帕雷霉素受体 p m s f p h e n y l m e t h y ls u l f o n y l f l u o r i d e 苯基磺酰氟 p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲溶液 p g c s p r i m o r d i a lg e r mc e l l s 原始生殖细胞 p 1 3 k p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3k i n a s e磷酯酰肌醇一3 激酶 p t e n p h o s p h a t a s ea n dt e n s i o nh o m o l o gd e l e t e do nc h r o m o s o m et e n 磷脂酶和紧张同系物 p i p 3 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3 , 4 ，5 - t r i p h o s p h a t e 磷酯酰肌醇一3 ，4 ，5 三磷酸 p i p 2 p h o s p h a t i d y l i n o s r 0 1 - 4 ，5 一b i p h o s p h a t e 磷酯酰肌醇一4 ，5 二磷酸 p hp l e c k s t r i n - h o m o l o g yd o m a i n 血小板一白细胞c 激酶底物 p d k l 3 - p h o s p h o i n o s i t i d e - d e p e n d e n t k i n a s e - l 3 磷酸肌醇依赖性激酶一l p c n a p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n 增殖细胞核抗原 p o f p r e m a t u r eo v a r i a nf a i l u r e卵巢功能早衰 s d ss o d i u md o d e c y ls u l p h a t e 十二烷基硫酸钠 s c fs t e mc e l lf a c t o r 干细胞因子 t e m e d t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e四甲基乙二胺 t r i s t r i s h y d r o x y m e t h y l - a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 t a et r i s a c e t i ca c i d e d t at r i s 乙酸- e d t a t b et r i s b o r i ca c i d e d t at r i s 硼酸- e d t a t g s t r i s g l y e i n e s d s t r i s 甘氨酸- s d s ww h i t es p o t t i n gl o c i 8 山东大学硕士学位论文 第一章晡乳动物卵巢发育的研究背景 一、晡乳动物的卵巢 1 卵巢的发育过程 卵巢的主要功能一是释放成熟的卵母细胞，使雌性个体受精， 从而达到延续种族的目的二是产生类固醇激素，促进雌性第二性 征发育和促使怀孕。哺乳动物的卵巢是一个非均质器官，包括不同 发育阶段的滤泡和黄体。每个滤泡由一个卵母细胞和围绕在卵母细 胞周围的粒层细胞以及外周的鞘细胞组成。滤泡从静止的原始滤泡 状态被激活，经过初级滤泡、次级滤泡等发育到窦腔滤泡阶段。到 窦腔滤泡阶段，大部分滤泡闭锁退化。只有一部分窦腔滤泡在进入 青春期以后，在周期性促性腺激素刺激下，进一步发育到排卵前期 滤泡阶段，释放成熟的卵母细胞，滤泡中剩余的粒层细胞经过黄体 化过程形成黄体。滤泡的激活、发育、排卵和黄体化过程是在许多 基因的共同作用下完成的。这些基因的功能是通过对基因修饰小鼠 模型的研究来确证的h 。“。1 。 2 卵母细胞和滤泡的分类0 9 根据啮齿类动物卵巢中卵母细胞的直径，把卵母细胞分为三类： 小卵母细胞：直径不超过2 0 m 。生长卵母细胞：直径2 0 l im 7 0l lm 。大卵母细胞：直径超过7 0nm 。 根据啮齿类动物卵巢滤泡中最大横切面上粒层细胞的数量把滤 泡分为三大类十个型，见图1 1 。第一大类是小滤泡，其中包括3 9 山东大学硕士学位论文 个分型：l 型：只有卵母细胞。2 型：卵母细胞周围有2 5 个分 开的粒层细胞( 又叫做原始滤泡) 。3 a 型：卵母细胞周围有一层环 状粒层细胞，粒层细胞数少于2 0 个( 又叫做初级滤泡) 。第二大类 是中等滤泡，其中也包括3 个分型：3 b 型：卵母细胞周围有一层 环状粒层细胞，粒层细胞数2 1 6 0 个( 又叫做初级滤泡) 。4 型：卵 母细胞周围有两层环状粒层细胞，粒层细胞数6 1 1 0 0 个( 又叫做 次级滤泡) 5 a 型：卵母细胞周围有三层环状粒层细胞，粒层细胞数 1 0 1 2 0 0 个。第三大类是大滤泡，其中包括了4 个分型：5 b 塑：卵母 细胞周围有多层环状粒层细胞，粒层细胞数2 0 1 4 0 0 个，没有滤泡 液。6 型：卵母细胞周围有多层环状粒层细胞，粒层细胞数4 0 1 6 0 0 个，粒层细胞被滤泡液分隔开。7 型：卵母细胞周围有多层环状粒层 细胞，粒层细胞数超过6 0 0 个，有一个充满滤泡液的窦腔和无颈卵丘 8 型：卵母细胞周围有多层环状粒层细胞，粒层细胞数超过6 0 0 个， 有一个充满滤泡液的窦腔和有颈卵丘，是排卵前期滤泡 山东大学硕士学位论文 图1 1 滤泡发育过程中的形态特征 ( 摘自；e l v i ne fa 1 ，1 9 9 8 r e v i e w so f r e p r o d u c t i o n 3 。1 8 3 1 9 5 ) 滤泡的发育过程：发育起始，卵母细胞的生长，粒层细胞的增殖，鞘细胞层的形 成，窦腔滤泡的发育，滤泡的闭锁退化，捧卵以及滤泡的黄体化。滤泡的分类是 按照p e d e r s e n 和p e t e r s 建立的标准进行的。 表示滤泡的形态没有显示 二、滤泡的活化和早期发育 1 原始滤泡的形成 卵母细胞来源于原始生殖细胞，最早出现在胚外中胚层中( 小 鼠胚胎第7 2 天) ，然后通过后肠和背侧肠系膜迁徙到生殖嵴上“”。 在迁徙过程中原始生殖细胞通过有丝分裂进行增殖，在小鼠胚胎第 1 3 天左右停止有丝分裂，所有的原始生殖细胞进入减数分裂前期i “。在哺乳动物围产期卵巢中，卵母细胞就停止在减数分裂前期i 的双线期，周围只有一层鳞片状的扁平粒层细胞围绕形成一个数量 有限的原始滤泡池n ”，没有形成原始滤泡的卵母细胞大量凋亡。不 同物种形成原始滤泡的时间不同，啮齿类动物出生后2 3 天开始形 成原始滤泡。处于静止状态的原始滤泡是各个发育阶段的滤泡和卵 母细胞的来源。原始滤泡池中的原始滤泡耗尽后，雌性动物的生育 能力就结束了。 2 原始滤泡的活化 原始滤泡的扁平粒层细胞变成立体粒层细胞，标志着原始滤泡 活化的开始。在原始滤泡活化和早期发育过程中，卵母细胞的极其 快速生长是一个值得注意的现象，见图1 2 。在小鼠滤泡活化和早 山东大学硕士学位论文 期发育过程中，例如，在2 3 周的生长阶段，卵母细胞的体积增长 了大约3 0 0 倍，r n a 也相应地增加了3 0 倍n “1 。这些事件揭示了在 细胞迅速生长阶段，伴随着旺盛的新陈代谢。尽管卵母细胞生长和 粒层细胞增殖在滤泡发育过程中是协同进行的，但是这两个过程并 不同时发生。卵母细胞生长的同时，粒层细胞从只有一层、几个扁 平的前期粒层细胞逐渐生长发育成为三层立体的粒层细胞。在滤泡 窦腔形成之前，卵母细胞的生长基本完成了n ”。粒层细胞生长过程 中，卵母细胞在直径和体积上的增加相对较少。在滤泡的活化和早 期发育过程中，卵母细胞的生长和粒层细胞的增殖是不依赖于滤泡 刺激素的( f o l l i c l es t i m u l a t i n gh o r m o n e ，f s h ) 。但是在卵母细胞停止 生长以后，大部分粒层细胞的增殖和分化则是依赖于滤泡刺激素完 成的“”。 d w m 蝴t o y 协mb ，g 嗍l - i g 棚 帅轴c o c e 钒, 州眦l 划妯 y n a r y 埘憾h i np m m 倒自o * 蜘 图l 一2 原始滤泡的活化和早期发育过程中卵母细胞的生长 ( 摘自：l i ue ta 1 。2 0 0 6 d e v b i 0 1 2 9 9 。1 1 1 ) a 在原始滤泡中，一个静止的卵母细胞被几个扁平的早期粒层细胞所包围。 b 和c 在滤泡的活化和早期发育阶段，卵母细胞和粒层细胞的生长是协同进 行的，但不是同时发生的卵母细胞生长的同时，粒层细胞从只有一层、几 个扁平的前期粒层细胞逐渐生长发育成为三层立体的粒层细胞。 1 2 3 滤泡的闭锁退化 山东大学硕士学位论文 卵巢中原始滤泡形成的同时伴随着卵母细胞的大量凋亡，卵巢 中只形成有限数量的原始滤泡，这些处于静止状态的原始滤泡组成 原始滤泡池原始滤泡在卵巢内在因予的作用下被活化，经过初级 滤泡阶段，次级滤泡阶段到达窦腔滤泡阶段，在性成熟之前 滤泡闭锁退化在性成熟之后，在周期性的促性腺激素的作 一小部分窦腔滤泡继续发育到排卵前期滤泡阶段并进一步释 的卵母细胞，其他的窦腔滤泡闭锁退化。原始滤泡形成后， 泡的活化就持续不断地进行。各个发育阶段的滤泡在闭锁退 ，大量 用下， 放成熟 原始滤 化的同 时，处于静止状态的原始滤泡也会发生闭锁死亡。当原始滤泡耗尽 后，雌性的生殖功能就结束了。 4 不同发育阶段滤泡的形成规律1 1 啮齿类动物的卵巢发育是非常规律的，见图1 3 。在胚 期，原始生殖细胞迁移到生殖脊后发育为卵原细胞大鼠 卵巢中只有卵原细胞：出生 天卵巢中出现次级滤泡；出 后2 3 天开始形成原始滤泡； 胎发育后 出生后， 出生后7 生后1 8 天早期窦腔滤泡出现后，卵巢中 开始出现细胞凋亡现象；第一次动情周期出现在出生后3 5 天左右； 规律性的动情周期可以持续到1 0 1 2 个月龄；1 2 1 5 个月龄后，动 情周期开始延长；随后就越来越不规律直到动情周期完全消失。 从原始滤泡发育为次级滤泡需要3 0 天以上；从次级滤泡发育为 窦腔滤泡需要2 8 天；从窦腔滤泡发育为排卵前期滤泡只需要2 3 天，啮齿类动物的动情周期为4 5 天；但是在大鼠出生后，卵巢滤 泡的第一轮发育时间大大缩短了，从出生到第一次动情周期大约只 需要3 5 天。 山东大学硕士学位论文 三、卵母细胞和粒层细胞之间的双向交流 在滤泡发育过程中，卵母细胞的生长过程和粒层细胞的增殖过 程虽然不是同时进行的。但是两个过程是协同发生的。在卵巢滤泡 发育过程中卵母细胞和粒层细胞之间存在着双向交流，这种双向交 流发挥了重要作用。卵母细胞的生长发育依赖于来自粒层细胞的调 节信号、生长因子和营养物质等。同时，卵母细胞产生的生长分化 因子一9 ( g r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r - 9 。o d f 一9 ) 、骨成形素蛋白 一1 5 ( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n 一1 5 ，b m p - 1 5 ) 等在粒层细胞的增殖 和分化方面起关键作用“。“2 ”卵母细胞和粒层细胞之间的双向交 流主要包括两种方式：一是闻隙连接；二是通过旁分泌相互交流， 例如受体蛋白酪氨酸激酶( r e c e p t o rp r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e ，k i t ) 和 a p n w j y c o “i a l ya i 删 f o l l l c l 描 f o l l i c l e sf o l l i c l e s b 盯n l c “l 们町 蓄r l 照 o v u l a t i o g ( 0 2 - o a 蛳) a t r e i l k 1 4 山东大学硕士学位论文 图1 3 不同发育阶段滤泡的形成规律 ( 摘自：m c g e ee ra 1 ，2 0 0 0 e h d o c r r p m 2 j 。2 0 0 2 1 4 ) a 从出生后到性成熟前卵巢滤泡的发育规律p m df o l l i c i e s = p r i m o r d i a l f o l l i c l e s ，原始滤泡b 性成熟后卵巢滤泡的发育规律 它唯一的配体( k i t l i g a n d ，k l ) 之间的调节信号 卵母细胞和粒层细胞之间可以通过间隙连接相互交流间隙连 接是细胞间的细胞膜通道，允许小分子的物质例如营养物质、离子、 第二信使等直接在相邻细胞的细胞质之间移动交流。卵母细胞和粒 层细胞之间的间隙连接是连接蛋白3 7 ( c o n n e x i n3 7 ，c x 3 7 ) ，它只在 初级滤泡发育阶段之后的滤泡中表达，并且被严格限制在卵母细胞 和粒层细胞之间的接触面上n “2 “2 ”小鼠缺乏连接蛋白3 7 ，就会因 为缺少问隙连接而不能发育成有窦腔的滤泡n “。 但是卵母细胞和粒层细胞之间的交流大部分依赖于旁分泌，特 别是受体蛋白酪氨酸激酶和它唯一的配体之间的调节信号。在小鼠、 大鼠和人类出生后的卵巢中，在所有发育阶段滤泡卵母细胞的表面 都有受体蛋白酪氨酸激酶。但是只有粒层细胞产生配体( k l ) ，配体 被认为是干细胞因子( s t e mc e l lf a c t o r ，s c f ) 或者是青灰因子( s t e e l f a c t o r ) 。许多证据表明卵巢滤泡的生长在滤泡刺激素受体形成之前是依 赖受体蛋白酪氮酸激酶和配体信号的口“1 p a c k e r 等人“”( 1 9 9 4 ) 的体外研究表明，出生后第8 天的小鼠 滤泡( 包括生长卵母细胞) 添加配体进行体外培养时，发现卵母细 胞有了惊人的生长。如果用受体蛋白酪氨酸激酶的抗体a c k 2 封闭或 者占据了受体蛋白酪氨酸激酶上的配体结合位点，干扰了配体和受 体蛋白酪氨酸激酶的连接，就会严重影响和卵巢共同培养的胎儿和 新生儿卵母细胞的生长，但是几乎不影响直径5 1 - 5 9 9um 的已经完 成生长的卵母细胞。因此体外研究表明，配体和受体蛋白酪氨酸激 山东大学硕士学位论文 酶对于维持卵母细胞生长是必须的在出生后第4 天的大鼠卵巢体 外培养中也得到了相同的结论。在用配体培养的过程中导致了原始 滤泡的发育，却被受体蛋白酪氨酸激酶的抗体a c k 2 所完全抑制，表 明配体在诱导大鼠原始滤泡的发育上是必需的 y o s h i d a 等人让。1 ( 1 9 9 7 ) 进一步在小鼠体内进行研究，取得了令 人信服的结果。他们选择在出生后各个年龄阶段小鼠体内注入有活 性的受体蛋白酪氨酸激酶抗体 c k 2 。结果发现，被抗体a c k 2 抑制 的受体蛋白酪氨酸激酶干扰了原始滤泡的发育、初级滤泡的生长和 窦前滤泡滤泡液的形成但是a c k 2 没有影响原始滤泡的形成、排卵 和黄体化过程 以上结果表明卵母细胞与粒层细胞之间内在的配体一受体蛋白 酪氨酸激酶相互作用在小鼠卵巢中滤泡刺激素受体形成之前，对早 期滤泡的发育是非常重要的，这也暗示着卵母细胞的配体一受体蛋 白酪氨酸激酶信号途径能够支持滤泡在不依赖于激素的条件下进行 自主发育。 四、卵母细胞内在的信号途径 1 磷醋酰肌醇一3 激酶( p h o s p h a t i d y l i n 0 3 i t o l - 3k i n a s e ，p 1 3 k ) 在滤泡的活化和早期发育过程中卵母细胞的快速生长暗示着这 个过程需要一些基本的信号途径，而这个途径应该广泛存在于细胞 的增殖和存活之中，例如磷酯酰肌醇一3 激酶信号途径。该途径是一 个“经典的”信号途径用于调节细胞的增殖、存活、迁移和新陈代 谢，见图1 4 磷酯酰肌醇一3 激酶是一个脂溶性激酶，它的3 端 是磷酸化的肌醇环。根据蛋白质亚基的组成和磷酸化底物的种类， 磷酯酰肌醇一3 激酶分为三大类：i 型( 包括ia 型和ib 型) 、h 型 1 6 山东大学硕士学位论文 和型。我们主要研究ia 型的磷酯酰肌醇一3 激酶该激酶由p 8 5 和p 1 1 0 亚基组成异二聚体，其中p 8 5 是调节亚基，包括p 8 5a 、p 8 5 8 和p 5 5y 三个亚型，具有s t l 2 结构域，是受体蛋白酪氨酸激酶的 结合部位；1 3 1 1 0 是催化亚基，包括p 1 1 0 ，p 1 1 0 1 3 和p 1 1 06 三个 亚型。p 1 1 0 包括一个n 一末端结构域与调节亚基相连；一个r a s 连 接结构域与r a s g t p 相连；一个c 一末端激酶结构域，可以使磷酯 酰肌醇肌醇环上的第3 位磷酸化，使磷酯酰肌醇一4 ，5 二磷酸( p i p 2 ) 转变成磷酯酰肌醇一3 ，4 ，5 三磷酸( p i p 3 ) 2 磷酯酸肌醇一3 激酶的活化方式 目前主要有两中方式使ia 型磷酯酰肌醇一3 激酶活化，一是活 化的r a s 蛋白( r a s g t p ) 与p l l 0 的r a s 连接结构域相连，直接使 ia 型磷酯酰肌醇一3 激酶活化。二是通过受体蛋白酪氨酸激酶使i 8 型磷酯酰肌醇一3 激酶活化。一些生长因子如表皮生长因子 ( e p i d e r m i sg r o w t h f a c t o r ，e g f ) 、类胰岛素生长因子一1 ( i n s u l i n - l i k e g r o w t hf a c t o r 1 ，i g f 1 ) 和胰岛素等与其相应的受体结合后，活化受 体本身的蛋白酪氨酸激酶，激酶再磷酸化磷酯酰肌醇一3 激酶的酪氨 酸残基使其活化受体蛋白酪氨酸激酶的多肽链只跨膜一次，胞外 区与配体结合，胞内区是受体蛋白酪氨酸激酶的催化部位。 3 ia 型磷醋酰肌醇一3 激酶途径( p 1 3 k 途径) 生长因子与受体蛋白酪氨酸激酶结合后，受体蛋白的胞外部分 构象发生变化，使受体蛋白形成二聚体导致受体胞内区互相靠近并 互相磷酸化受体胞内区的酪氨酸残基，通过这种自磷