（分析化学专业论文）荧光光度法测定辅酶类、伯胺类化合物.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其 他需要将别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何荧献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： 言 蒲 导师签字： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂蕉有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权盐可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适 用本授权书) 位论文作者签名： 韧讳 导师签字： 签字日期：2 0 0 7 年芗月 。日签字只期：2 0 0 7 年乡月j 珀 山东师范大学硕士研究生毕业论文 荧光光度法测定辅酶类、伯胺类化合物 ( 中文摘要) 辅酶a 是含泛酸的复合核苷酸，广泛存在于一切动植物和微生物的活细胞中，分 子中所含有的毓基可与酰基形成硫酯，其重要的生理功能是在代谢过程中作为酰基的载 体接受和传递酰基，是参与生物体内乙酰化反应的辅酶。对糖、酯类和蛋白质代谢起着 非常重要的作用，对厌食、乏力等症状有明显的改善效果。在临床上用于白细胞减少症、 原发性血小板减少性紫癜及功能性低热等。 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( 简称辅酶i i ，n a d p ) 一种自然存在于所有生物体内 的辅酶，可参与葡萄糖酵解、丙酮酸盐代谢、戊糖的生物合成和脂肪、氨基酸、蛋白质 及嘌呤的代谢等。由于含有尼克酰胺的毗啶环，可通过它可逆的进行氧化还原，在代谢 中起递氢作用。当它损耗异常时会出现a t p 的生成功能紊乱等，导致细胞抗氧化功能 的破坏或丧失，最终会导致细胞的死亡。 组胺( h i s t a m i n eh a ) 是8 0 年代才被确定的神经递质，具有较强的生物活性，在组织 的肥大细胞中含量很高，能引起平滑肌收缩、扩张毛细血管和刺激胃酸分泌。脑组织中 也含有组胺，参与多种脑功能的调节，起着神经递质或调质的作用。组胺在调节神经、 呼吸、心血管、消化、免疫、内分泌等系统中具有重要作用。尿中组胺含量的变化与机 体的多种生理、病理现象( 如支气管哮喘，过敏性疾病，肿瘤等) 有密切的关系，因此 分析测定尿中组胺的含量是一项重要的临床指标。 5 羟色胺( 5 h t ) 又叫血清素( s e r o t o n i n ) 是重要的神经递质，广泛存在于自然界动植物 中。5 羟色胺能促进血管平滑肌细胞的收缩、增生、迁移，活化血小板，诱导血小板的 聚集，刺激有丝分裂的发生，活化t 、b 、n k 和吞噬细胞，参与血压的调节和中枢神经 山东师范大学硕士研究生毕业论文 系统的神经传递。在良性肿瘤、偏头痛和精神分裂症病人的体液中发现5 一羟色胺的含量 增加，因此测定尿液中的5 - 羟色胺含量可为多种疾病的诊治及精神疾病的机理研究提供 依据。 本文以分子光谱( 荧光、紫外) 作为研究手段，分别对药物一稀土离子络合物与辅 酶类化合物相互作用及甲醛一乙酰丙酮与伯胺类化合物相互作用的分析应用进行了研 究，共分为四章。 第一章，综述了论文的情况，及目前国内外的研究现状。 第二章，用荧光光度法研究了药物一稀土金属离子络合物与辅酶a 的相互作用及 分析测定。在一定的酸度和高碘酸存在的条件下，辅酶a 能使药物一稀土金属离子络 合物的特征荧光显著增强且增强的荧光强度与辅酶a 的含量成正比。根据这一性质， 建立了测定辅酶a 的新方法，该方法能成功地应用于实际样品的测定。 第三章，以铕离子一四环素作为荧光探针，研究了与辅酶i i 的相互作用及其分析应 用。含8 一二酮结构的四环素是稀土金属离子铕的理想配体，能与铕发生分子能量转移， 发射出铕位于6 1 2 r i m 处的特征荧光。在一定酸度条件下，辅酶1 i 能显著增强四环素一铕 络合物其位于6 1 2 n m 处的特征荧光强度且增强的荧光强度与辅酶i i 的含量成正比。本文 利用荧光光度法和紫外吸收分光光度法研究了辅酶1 i 对四环索一铕体系的荧光增强效 应及其影响因素，探讨了作用机理，成功应用于合成水样的测定。 第四章，根据h a n t z s c h 反应，伯胺类物质能与乙酰丙酮和甲醛通过环化、缩合反 应，生成n 取代基- - 2 ，6 _ - q j 基3 ，5 - 二乙酰基一l ，4 二氢吡啶，该物质能发射出黄 绿色荧光。根据这一反应，对组胺和5 一羟色胺进行了研究，并成功的测定了人尿和血 清中组胺和5 一羟色胺的含量。 关键词：荧光光度法，辅酶a ，辅酶i i ，组胺，5 一羟色胺 2 生至堕蔓盔兰堕主鲤塞生兰些丝塞一 t h es p e c t r o p h o t o f l u o r i m e t r yf o r t h ed e t e r m i n a t i o no ft h ec o e n z y m ea n d p r i m a r ya m i n e sc o m p o u n d ( ab s t r a c t ) c o ai sam u l t i p l en u c l e o t i d et h a tc o n t a i n sp a n t o t h e n i ca c i d i ti sn a t u r a lc o e n z y m e sp r e s e n t i n a l la n i m a la n dp l a n to r g a n i s m s i ti so n eo ft h em o s ta c t i v em e m b o l i cc o m p o u n d s ，a n di s i n v o l v e di na c t i v a t i o na n da c y l g r o u pt r a n s f e r si nm a n ye n z y m a t i cr e a c t i o n s c o ap l a y sa n i m p o r t a n tr o l ei nt h em e t a b o l i s mo fc a r b o h y d r a t e s ，l i p i d sa n dp r o t e i n s i to b v i o u s l yi m p r o v e s t h es y m p t o m so fa n o r e x i aa n ds p i r i t l e s s n e s s ，a n di n c l i n i c ai ti su s u a l l yu s e dt ot r e a t l e u c o c y t o p e n i ap r i m a r y , t h r o m b o c y t o p e n i cp u r p u r a , f u n c t i o n a ll o w f e v e r , a n ds oo n n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e ( c o z e n m yi i ) i san a t u r a lc o e n z y m ep r e s e n t i na l la n i m a la n dp l a n to r g a n i s m s i ti se s s e n t i a lt ot h ef u n c t i o no fm a n y c a t a b o l i ca n d b i o s y n t h e t i cp a t h w a y sf o u n dw i t h i nl i v i n go r g a n i s m s i th a sap y r i d i n ec i r c l eo f n i c o t i n a m i d e ， a n du s i n gi to x y g e n a t i o na n dd e o x i d i z a t i o nc a l lo c c u rr e v e r s i b l y , i tc a nb eu s e df o rt h et r a n s f e r o fh y d r o g e ni nt h em e t a b o l i z a b i l i t y d y s f u n c t i o no fa t pp r o d u c t i o na c c o m p a n i e db ya l o s so f c o z e n m yi id e p l e t i o nc a nb eo b s e r v e d ，l e a d i n gt ot h ei m p a i r m e n t o fa n t i o x i d a n tm e c h a n i s m s ， l o s so f f u n c f i o n ，a n df i n a l l yt oc e l ld e a t h h i s t a m i n ei so n eo ft h en e u r o t r a n s m i t t e r w h i c hw a sc o n f i r m e di n8 0 t i m e s ， t h ec o n t e n to ft h eh i s t a m i n ei sh i g hi nt h eh y p e r t r o p h yc e l l sa n d i t sp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e ss u c h a sc o n t m c t i o no fs m o o t hm u s c l e s ，e x t e n s i o no fc a p i l l a r i e sa n dg a s t r i ca c i ds e c r e t i o n sh a v eb e e n i n v e s t i g a t e d i ti so n e o ft h ec h e m i c a lm e d i a t o r so fa l l e r g ya n dan e u r o t r a n s m i t t e ri nm a m m a l i a n b r a i n , a n di tp l a y sa ni m p r o t a n tr o l ei nt h es y s t e m so fn e r v e ，b r e a t h ，c o r d i sb l o o dv e s s e l ，d i g e s t ， i m m u n i t y ，i n t e r n a ls e c r e t i o n m e a s u r e m e n to f h i s t a m i n ei nh u m a nu r i n ei sa ni m p o r t a n tc l i n i c a l 3 山东师范大学硕士研究生毕业论文 p a r a m e t e ri nv a r i o u sd i s e a s e ss u c ha sb r o n c h i a la s t h m aa n da t o p i cd e r m a t i t i s ，t h r o u g hi m m e d i a t e a l l e r g i cr e a c t i o n sa n dc a n c e r 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ( 5 - h t ) i sw e l lk n o w na san e u r o t r a u s m i t t e r , p r e s e n ti n m o s t a n i m a la n d p l a n to r g a n i s m s i t c a r li m p r o v et h ec o n s t r i n g e n cy ，h y p e r p l a s i aa n dm i g r a t i o no ft h e b l o o dv e s s e ls m o o t hm u s c l ec e l l ，a c t i v a t eb l o o dp l a t e l e t s ，i n d u c et h eg a t h e r i n go fb l o o d p l a t e l e t s ，s t i m u l a t em i t o t i co c c u r r e n c e ，a c t i v a t et ，b ，n ka n dp h a g o c y t i ch e m o c y t e ，p a r t i c i p a t e i n r e g u l a t i n gt h eb l o o dp r e s s u r ea n dd e l i v e r i n gn e r v eo ft h e c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m t h e i n c r e a s e dc o n t e n to f5 - h ti nh u m a np l a y s i o l o g i c a lf l u i d sh a v eb e e nr e c o g n i z e di nt h ep a t i e n t s w i t hc a r e i n o i ds y n d r o m e ，m i g r a i n ea n ds c h i z o p h r e n i a ，s om e a s u r e m e n tt h ec o n t e n to f5 - h ti n h m n a nu r i n ei sa ni m p o r t a n tc l i n i c a lp a r a m e t e ri nv a r i o u sd i s e a s e sa n di sa ni m p o r t a n tb a s i si n t h er e s e a r c h o f m e c h a n i s m o f s p i r i t p a r o x y s m i nt h i sp a p e r , u s i n gm o l e c u l es p e c t r o s c o p y ( f l u o r e s c e n c ea n du vs p e c t r o s c o p y ) a s r e s e a r c hi n s t r u m e n t ，w e s t u d yt h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nd r u g - m e t a li o nc o m p l e xa n d b i o m o l e c u l ea n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na c e t y l a c e t o n e f o r m a l d e h y d ea n dt h e i ra p p l i c a t i o n t h e r ea r ef o u rc h a p t e r s f i r s t ，is u m m a r i z e dm yt h e s i sa n di n t r o d u c e dt h ei n v e s t i g a t i o n a c t u a l i t yo ff r e m d n e s s a n dh o m e l a n d s e c o n d ，w ep r o v i d e dam e t h o dt od e t e r m i n ec o au s i n gd r u g m e t a li o na sf l u o r e s c e n c e p r o b e sa n di t sa p p l i c a t i o n i nt h eo p t i m u mb u f f e rs o l u t i o n ，c o ac o u l dr e m a r k a b l ye n h a n c e t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h ed r u g m e t a li o nc o m p l e xa f t e ra d d i n gh 5 1 0 6a n dt h ee n h a n c e d f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fc o a t h i sm e t h o dc a nb e s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e r m i n a t i o no fc o a i ni n j e c t i o n , h u m a ns e r u ma n dp i gl i v e r s 4 山东师范大学硕士研究生毕业论文 s a m p l e s t h i r d ，u s i n gt e t r a c y c l i n e ( t c ) e u r o p i u mi o n ( e u 3 + ) c o m p l e x a saf l u o r e s c e n tp r o b e ，w e s t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ec o m p l e xa n dn i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e ( n a d p ) a n di t sa p p l i c a t i o n t cc o n t a i n i n g 1 3 d i k e t o n a t ec o n f i g u r a t i o ni sag o o dl i g a n df o r e j + a n dc a nt r a n s f e re n e r g yb e t w e e nt ca n de u 3 + a n dt h et c e u 3 + b i n a z yc o m p l e xc a ne m i t t h ec h a r a c t e r i s t i cf l u o r e s c e n c eo fe u 3 + a t6 1 2m u i nt h eo p t i m u mb u f f e rs o l u t i o n ，n a d p c o u l dr e m a r k a b l ye n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h et c e u 3 + b i n a r yc o m p l e xa f t e r a n dt h ee n h a n c e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no f n a d ei nt h i s p a r t ，u s i n gm o l e c u l es p e c t r o s c o p y ( f l u o r e s c e n c ea n du vs p e c t r o s c o p y ) a sr e s e a r c hi n s t r u m e n t , w es t u d i e dt h ef l u o r e s c e n c e i n c r e a s e de f f e c to fn a d po nt h ec o m p l e xs y s t e m ，e x p l a i n e dt h e i n t e r a c t i o nm e c h a n i s m t h ed e v e l o p e dm e t h o dh a db e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no f n a d pi nt h es y n t h e t i cw a t e rs a m p l e s f o u r t h ， a c c o r d i n g h a n t z s c h r e a c t i o n ，p r i m a r y a m i n ec a nr e a c tw i t h a c e t y l a c e t o n e f o r m a l d e h y d e t of o r man e wt e r n a r y c o m p l e xt h r o u g hc y c l i z a t i o na n d c o n d e n s a t i o nr e a c t i o n ，t h eo f f s p r i n gw h i c hi sn s u b s t i t u e n t 2 ，6 一d i m e t h y l 一3 ，5 一d e h y d r o a c e t i c a c i d 一1 ，4 一d i h y d r op y r i d i n ec a ne m i tt h eg r e e n i s hy e l l o wf l u o r e s c e n c e t h em e t h o dh a sb e e n s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o nt h ec o n t e n to fh i s t a m i n ea n d5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e i nh u m a nu r i n ea n ds e r u ms a m p l e s k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t r y , t o z e n m ya ，n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e ( n a d p ) ，h i s t a m i n e ，5 - b y d r o x y t r y p t a m i n e 5 坐查堕丝盔兰堡主堑塑圭兰些笙苎 英文缩写 e u t c e n x c o a n a d p h a 5 h t 6 中英文对照 英文全文 e u r o p i u m t e r t i u m t e t r a c y c l i n e e n o x a c i n e c o z e n m ya 中文全文 铕 铽 四环素 依诺沙星 辅酶a n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o f i d ep h o s p h a t e辅酶i i h i s t a m i n e 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e 5 羟色胺 山东师范大学硕- d ：研究生毕业论文 第一章前言 生命科学更深层次的研究是2 l 世纪的重点，而化学是生命科学的最基本语言。生命 化学分析是分析化学中最活跃的研究领域，它主要研究生物大分子、生物药物、生物活 性物质，以及生理元素在生物组织层、单细胞甚至细胞膜和人体蛋白质碎片内的微分布 及其结合形式，这些都得依靠分析试剂与仪器的结合来进行。分析化学在研究生命过程 化学、生物工程、生物医学中，在揭示生命起源、生命过程、疾病及遗传奥秘等方面具 有重要意义。目前在生物分析及生命科学中应用最多的分析方法主要有色谱、质谱、电 化学分析、荧光光谱、红外光谱等【1 1 。 一、镧系离子配合物荧光探针 随着人们对荧光化合物电子光谱及光物理行为的深入研究2 羽，使我们在利用荧光 化合物分子作为探针来监测各种不同物质的浓度、状态及其变化等方面都有了巨大的进 展1 6 - 7 。探针技术不仅在理论上更加健全，系统上更加完整，而且在应用方面更加广泛。 荧光探针方法的最基本特点是：方法的高度灵敏性和极宽的动态响应时间范围。 荧光探针按物质种类可分为有机荧光探针即分子荧光探针和离子荧光探针某些金 属离子具有荧光特性，由它们作为荧光探针置换生命金属离子后与生物分子配位体结 合，因配体的影响：探针离子的荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波 长荧光强度、蜂位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得生物大分子的有关 信息，目前用得最多的是稀土离子荧光探针，如e u ( i i i ) ，t b ( i i i ) ，g d ( i i i ) 。 稀土化合物具有许多引人注目的生物学和药理学性质，如发光强度高，单色性好， 其配合物能通过“天线效应”产生更高的能量转移效率而发出强荧光，而且一些药物配 体与稀土离子形成配合物后，对其生物学和药理学性质能产生“协同”或“增效”作用， 科研工作者对此进行了大量的研究【8 - l 们。据文献报道含氟喹诺酮类药物与稀土离子形成 山东师范大学硕上研究生毕业论文 配合物后其抗菌活性及抗肿瘤活性均显著提高【“】。另外，稀土离子配合物大多为强荧光 物质，有关稀土配合物特性的研究，对新型荧光材料的开发和应用有着非常重要的理论 指导意义。在稀土元素的研究中，以e u 3 + 和t b ”为中心的稀土有机配合物具有良好的发 光性能，所以对镧系离子有机配合物的研究日益受到了人们的重视【1 2 1 。 e u ( i i i ) 和t b ( i l i ) 作为研究生物大分子的探针时，作为中心离子e u ( i i i ) 和t b ( i i i ) 与生 物大分子配体配位时，有一定的结合部位可供选择，主要是具有带负电荷氧配位基团的 位置( 蛋白质分子中的羧酸根及羰基富集区，辅酶a 和辅酶1 1 分子中的磷酸根区) 。配位 原子与稀土离子配位能力大小顺序为o n s 。因为稀土离子为球形带电体，配位时无 明显方向性。生成的配合物立体化学基本由生物大分子的构象、参与配位的基团数、配 位基团大小及所带电荷、溶剂效应等决定。 探针的发光效率与配合物的结构密切相关，配合物共轭平面及其结构刚性越大，结 构的稳定性越高，发光过程的能量损失越小，镧系离子的发光效率也越高。配体取代基 对中心镧系离子的发光效率也有明显影响，其规律为：取代基的共轭程度越高，电子离 域性越大，给电子能力越强，因而分子内能量传递效率越剐1 3 1 。除了生物大分子之外， 许多药物分子也可以傲稀土离子的有效配体，如含有b 一二酮结构和a 一羰基羧酸等结 构的配体就是镧系离子发光非常有效的敏化体，有关这类配体的镧系离子配合物敏化发 光特性，光物理及光化学性质的研究一直是很活跃的领域i 1 4 - t s l 。 二、药物分子一四环素和依诺沙星 四环素( 结构见下图) 具有b 一二酮结构，是e u 3 + 的理想配体，所生成时二兀配合 物发射出e u 3 + 位于6 1 2 n m 的特征荧光，具有长的荧光寿命，大的s t o r k e s 位移，峰形变 窄及避免生物体的背景干扰等优点1 6 】，在荧光分析和荧光免疫分析中，广泛应用于研究 生物大分子的结构、性质和生物功能三者之间的关系。这些配合物体系可作为荧光探针 山东师范大学硕士研究生毕业论文 用于临床化学、分子生物学、药物、材料和环境科学的研究。 t c 的结构式 h n h 2 - h c 氟喹诺酮类( 第三代喹诺酮) 的发现和发展，创造了合成抗菌药的新时代。它们的抗 菌谱广，抗菌作用强，是一类可能与抗生素并驾齐驱的合成抗菌药。氟喹诺酮的临床应 用是2 0 世纪8 0 年代以来抗感染治疗的新突破。 依诺沙星( e n x ，结构见下图) 是具有a 一羰基羧酸结构的喹诺酮类药物，是铽离 子的理想配体，而且通过分子内能量转移可以敏化铽的特征荧光。依诺沙星可与t b 3 十 形成二元络合物，发射出的，r 妒+ 位于5 4 5 n m 处的特征荧光具有高的荧光量子产率、大 的s t o k e s 位移、窄的发射峰、以及长的荧光寿命。在荧光探针法检测生物分子中有着广 泛的应用价值。 h c 2 i - t 5 依诺沙星结构式 c o o h 9 llfij 山东师范丈学硕士研究生毕业论文 三、辅酶 生物体的基本特征之一是它不断地进行新陈代谢，新陈代谢是生命活动的基础，是 生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化， 都是在酶的催化下进行的。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动 都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。因此 从酶作用的分子水平上研究生命活动的本质及其规律无疑是十分重要的【 1 。 酶是由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质，在人体内所有的生物化学反应中，这 些高能量的蛋白质分子扮演着必不可少的角色。它们是消化食物、激活大脑、提供细胞 能量、修复所有的组织、器官和细胞所必需的。即使存在足够的维生素、矿物质、水和 其他的营养成分，但没有酶的活动，就不可能存在任何生命形式。每一种酶在体内都有 一种其他酶所不能替代的特殊作用。每一种酶的化学结构都是特定的，以至于只能在一 种或一组相关的化学物质中，引发一个反应，而在其他的物质中不行。酶作用的物质叫 做底物。因为每一种底物必须有一种特殊的酶，所以人体必须产生大量的不同的酶。从 化学组成来看酶可分为单纯蛋白质和缀合蛋白质两类。属于单纯蛋白质的酶类除了蛋白 质外，不含其他物质，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和核糖核酸酶等。属于缀合蛋 白质的酶类，除了蛋白质外，还要结合一些对热稳定的非蛋白质小分子物质或金属离子， 前者称为脱辅酶，后者称为辅因子，脱辅酶和辅因子结合后所形成的复合物称为全酶”， 酶的辅因子，包括金属离子及有机化合物，根据它们与脱辅酶结合的松紧程度不同，可 分为辅酶和辅基。通常辅酶是指与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物质，辅基是以共 价键和脱辅酶结合且结合比较紧密的有机化合物。脱辅酶与辅因子单独存在时，均无催 化活力。只有二者结合成完整的分子时，才具有活力。辅酶或辅基的作用是作为电子、 原予或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程。通常一种脱辅酶必须与某一特定 1 0 山东师范大学硕十研究生毕业论文 的辅酶结合，才能成为有活性的全酶。如果此辅酶为另种辅酶所替换，此时酶即不表 现活力。反之，一种辅酶常可与多种不同的脱辅酶结合，而组成具有不同专一性的全酶。 故辅酶在生命活动中具有十分重要的地位。 1 、辅酶a 辅酶a 是含泛酸的复合核苷酸在生物体内，辅酶a 是泛酸的主要活性形式，是由等 分子的泛酸、巯基乙胺、焦磷酸和3 - a m p 组成的，结构见下图。辅酶a 分子中所含 有的巯基可与酰基形成硫酯，其重要的生理功能是在代谢过程中作为酰基的载体接受和 传递酰基，是参与生物体内乙酰化反应的辅酶。由于携带酰基的部位在s h 基上，通常用 h s c o a 表示。在糖代谢中，丙酮酸经氧化脱羧后的乙酸必须形成c h 3 c o s c o a 才能进入 三羧酸循环；在酯类分解代谢中，脂肪酸氧化的第一步就是先酰化形成酯酰辅酶a ，然后 才进行8 氧化；在氨基酸代谢中有些氨基酸转化成相应的酮酸后，也必须在辅酶a 参 与下才能进一步的代谢，因此h s c o a 对糖、酯类和蛋白质代谢起着非常重要的作用博l 。 辅酶a 对厌食、乏力等症状有明显的改善效果。在临床上用于自细胞减少症、原发性血 小板减少性紫癜及功能性低热等，对人体糖、脂肪及蛋白质代谢起重要作用。与a t p 、 胰岛素一起用作能量合剂。因此建立准确、灵敏、简单的c o a 法在生物、生命和生理 过程研究方面有重要意义。 目前，测定辅酶a 较为常见的方法有毛细管电泳法【1 9 j ，高效液相色谱法【2 0 。2 4 1 ，高 效液相色谱质谱法 2 5 - 2 6 j ，反相高效液相色谱2 7 。2 羽，液相色谱，电喷雾离子化光谱测定法 ( l c e s i m s ) 2 9 - 3 0 1 ，同位素放射法【3 i j ，酶法f j 2 - 3 3 1 。由于酶法的高选择性被广泛应用于 针剂中c o a 效价的测定，但是酶法的试齐q 较为昂贵，实验条件较为复杂，步骤繁琐。 山东师范大学硕士研究生毕业论文 s h c h 2 c l h 阿 c o c h 2 c h n i l c o h c o h c h ，一c c h ) 盛；一。一o p o 一 0 h o c o a 的结构式 2 、辅酶 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( 简称辅酶i i ，n a d p , 结构见下图) 广泛存在于一切动 植物和微生物的活细胞中，是目前已知的3 0 0 多种脱氢酶的辅酶，可参与葡萄糖酵解、 丙酮酸盐代谢、戊糖的生物合成和脂肪、氨基酸、蛋白质及嘌呤的代谢等。许多脱氢酶 如异柠檬酸脱氢酶，葡糖一6 一磷酸脱氢酶，谷胱甘肽还原酶等作用的发挥都离不开 n a d p ，n a d p 的分子结构中含有尼克酰胺的呲啶环，可通过它可逆的进行氧化还原， 在代谢中起递氢作用。n a d p 在生物体的新陈代谢活动中特别是在能量传递和维持细胞 内的氧化还原平衡方面起着非常重要的作用，当它损耗异常时会出现a t p 的生成功能紊 乱等，导致细胞抗氧化功能的破坏或丧失，最终会导致细胞的死亡。因此建立准确、灵 敏、简单的n a d p 测定方法在生物、生命科学的研究方面有重要意义。 目前测定还原性辅酶i i 较为常见的方法有电化学法 3 5 - 4 1 1 ，h p l c 法【4 2 - 5 0 】，生物发光 法5 1 1 ，生物免疫法【5 2 】，分光光度法例，酶联免疫法【5 4 i ，毛细管电泳法【55 1 ，f i a - - c m e 法【5 6 - 5 7 1 等，但是至今尚未见到关于以t c - - e u 3 + 为探针测定n a d p 的报道。 山东师范大学硕士研究生毕业论文 四、组胺和5 一羟色胺 n a d p 的结构式 根据h a n t z s c h 反应，伯胺类化合物能与乙酰丙酮和甲醛通过环化、缩合反应，生成 n 取代基2 ，6 二二甲基，3 ，5 - - - 7 , 酰基一1 ，4 - 二氢吡啶，该物质发射黄绿色荧光。反应 过程如下： i r c “n ，又r ：i i 州：。 i 组胺和5 一羟色胺都是伯胺类化合物，因此可以根据h a n t z a e h 反应，以甲醛一乙酰丙 酮为荧光探针测定人尿和血清中组胺和5 一羟色胺的含量。 1 、组胺 组胺( h i s t a n l i n eh a 结构见下图) 是8 0 年代才被确定的神经递质，它具有较强的生物 活性，在组织的肥大细胞中含量很高，能引起平滑肌收缩、扩张毛细血管和刺激胃酸分 泌，脑组织中也含有组胺，且在灰质中的含量高于白质中的含量，参与多种脑功能的调 1 3 一 “ 一 一 一 f-一t一 。矗蒋 一 7 - 。二。酊瓢 一_立： 一 一 一 c 山东师范人学硕土研究生毕业论文 节，起着神经递质或调质的作用。组胺在调节神经、呼吸、心血管、消化、免疫内分 泌等系统中具有重要作用，血中组胺含量的变化与机体的多种生理、病理现象( 如过敏 性疾病，缺氧、休克，肿瘤等) 有密切的关系 5 s - 5 9 。因此，建立快速、准确的测定方 法在生理和药理等研究领域测定组织或体液中组胺的含量具有十分重要的意义。 目前，测定组胺较为常见的方法育h p l c1 6 0 删，液相色谱6 5 - 6 7 ，毛细管电泳法f 6 ”o j ， 酶法1 7 t - 7 4 ，酶联免疫【7 5 】，光度法【7 6 - 7 8 。 2 、5 - - 羟色胺 5 - 羟色胺( 5 h t 结构见下图) 又叫血清素( s e r o t o n i n ) 是重要的神经递质，广泛存在于 自然界动植物中。水果、蔬菜、坚果等都含有5 一羟色胺，无脊椎动物和脊椎动物组织中 也发现了5 羟色胺。哺乳动物除骨骼肌、外周神经和肾上腺不含5 羟色胺外，几乎遍布 其他器官组织。人体内5 羟色胺主要存在于胃肠道粘膜的嗜铬细胞，约占总量的8 0 其 余的主要分布在血小板、松果体及脑部的5 羟色胺能神经元。5 羟色胺能促进血管平滑 肌细胞的收缩、增生、迁移，参与血压的调节，活化血小板，诱导血小板的聚集，刺激 有丝分裂的发生，活化t 、b 、n k 和吞噬细胞，参与中枢神经系统的神经传递，与其他 神经递质一起，参与行为活动、情绪、食欲、体温调节等。测定血液中的5 羟色胺含量 可为多种疾病的诊治及精神疾病的机理研究提供依据删。因此，建立快速、准确的测定 组织或体液中5 羟色胺含量的方法在生理和药理等研究领域中具有十分重要的意义。 目前，测定5 一羟色胺较为常见的方法有高效液相色谱法$ “鲫，液相色谱8 6 。俐，流动 注射法，毛细管电泳法 7 2 删，气相色谱1 9 4 9 5 1 ，电化学法【9 6 ，光度法 9 7 堋。 1 4 组胺的结构式 h 卿邶h 2 n h 2 5 一羟色胺的结构式 山东师范大学硕士研究生毕业论文 第二章光度法研究药物分子一稀土离子络合物与辅酶a 的相互作用 及其分析应用 第一节四环素一铕络合物与辅酶a 相互作用的研究及其应用 摘要本文以四环素( t c ) 铕( e u 3 + ) 作为荧光探针，提出了一种用荧光光度法测量辅 酶a ( c o a ) 的新方法。在p h = 6 8 的最佳酸度和高碘酸的存在条件下，辅酶a 能使四环 素铕位子6 1 2 r i m 处的特征荧光强度显著增强且增强的荧光强度与c o a 的含量成正比。 该方法测定c o a 的线性范围是6 0 8 1 0 。3 1 8 2 x l o - 5m o l l ，检测限为1 5 2 x 1 0 一m o l l ， 并成功应用于实际样品的测定。 关键词四环素铕辅酶a 荧光光度法 1 引言 辅酶a 是含泛酸的复合核苷酸。在生物体内，辅酶a 是泛酸的主要活性形式，是 由等分子的泛酸、巯基乙胺、焦磷酸和3 - a m p 组成的，结构见下图。辅酶a 分子中 所含有的巯基可与酰基形成硫酯，其重要的生理功能是在代谢过程中作为酰基的载体接 受和传递酰基，是参与生物体内乙酰化反应的辅酶。由于携带酰基的部位在s h 基上， 通常用h s c o a 表示。在糖代谢中，丙酮酸经氧化脱羧后的乙酸必须形成c h 3 c o - s c o a 才能进入三羧酸循环；在酯类分解代谢中，脂肪酸氧化的第一步就是先酰化形成酯酰辅 酶a ，然后才进行d 埠e 化；在氨基酸代谢中有些氨基酸转化成相应的酮酸后，也必须在 辅酶a 参与下才能进一步的代谢，因此h s c o a 对糖、酯类和蛋白质代谢起着非常重要 的作用u 9 l 。辅酶a 对厌食、乏力等症状有明显的改善效果。在临床上用于白细胞减少症、 原发性血小板减少性紫癜及功能性低热等，对人体糖、脂肪及蛋白质代谢起重要作用。 与a t p 、胰岛素一起用作能量合剂。因此建立准确、灵敏、简单的c o a 法在生物、生 山东师范大学硕士研究生毕业论文 命和生理过程研究方面有重要意义。 目前，测定辅酶a 较为常见的方法有毛细管电泳法【1 9 1 ，高效液相色谱、法【2 0 2 4 j ，高 效液相色谱质谱法 2 5 - 2 6 ，反相高效液相色谱 2 7 - 2 羽，液相色谱电喷雾离子化光谱测定法 ( l c e s i m s ) 2 9 - 3 0 1 ，同位素放射法【3 1 1 ，酶法1 3 2 - 3 3 1 。由于酶法的高选择性被广泛应用于 针剂中c o a 效价的测定，但是酶法的试剂较为昂贵，实验条件较为复杂，步骤繁琐。 四环素是具有b 二酮结构的一类四环素药物，是e u 3 + 的理想配体，所生成的二元配 合物发射, l p , e u 3 + 位于6 1 2 r i m 的特征荧光具有高的荧光量子产率、大的s t o k e s 位移、窄的发 射峰、以及长的荧光寿命，这一切避免了生物大分子对荧光发射峰的背景干扰 3 4 1 。本文 选择t o 作为铕离子的配体，研究了以c o a 作为共配位体，与t c 共同敏化铕离子特征荧 光的可能性。实验结果表明，e u 3 + t c 体系中铕离子位于6 1 2 r i m 处的特征荧光能够被 c o a 显著增强。荧光增强来自具有紧密结构的t c c o a e u 3 + 超分子体系，在大聚集体内三 元体系的分子内能量转移更易发生。荧光增强的程度与c o a 的量成正