（分析化学专业论文）蛋白质与光谱探针的作用及其分析应用研究.pdf

摘要 蛋白质光谱探针是2 0 世纪5 0 年代发展起来的测定蛋白质的分析方法。借助于蛋白质 光谱探针可以测定微量的蛋白质，并可以研究蛋白质结构与功能的关系，研究蛋白质与小 分子配体的作用机理。它的主要特点是：操作方法较为简便；灵敏度高；线性范围宽；干 扰物质少；应用范围广等，具有广阔的发展前景。基于蛋白质定量分析的研究现状及本实 验室的研究基础，本文做了以下几个方面的工作： 1 概述了蛋白质化学基础，综述了蛋白质定量分析的一些主要方法及其在生物化学、药 学、食品和临床医学等方面的应用，引用文献1 2 6 篇。 2 寻找新的性能优良的光谱探针 ( 1 ) 染料探针：研究发现，变色酸2 c 在p h 3 8 2 的b r i t t o n - r 0 b i i l s o n ( b r ) 缓冲介质中， 能与血清蛋白质形成有色复合物， 。为5 6 0 r l i l l ，比试剂本身红移约5 1 i m ，表观摩尔吸 光系数为3 0 5 1 0 5l m o l c m ( b s a ) ，线性范围为2 0 一8 0 m g l ：偶氮胂羧在p h l 5 的 c l a r k l u b s ( c l ) 缓冲介质中，能与多种蛋白质在室温下能迅速结合生成蓝色复合物，。 为6 1 2 i l i n 。线性范围( h s a ) 为0 1 0 0 m g l ，表观摩尔吸光系数为2 6 7 1 0 5 l r n o l c m 。而 且这两种方法简单，稳定，线性范围宽，对比度大，灵敏度高，能应用于人血清中总蛋白 质的测定，因此，建立了以变色酸2 c 和偶氮胂羧为光谱探针光度法测定人血清蛋白质的 新方法。 ( 2 ) 金属络合物光谱探针：研究表明，在p h 2 o 2 4 的酸性介质中，c u ( i i ) a ai 络合 物与蛋白质发生作用，生成三元分子复合物。线性范围为o 一1 2 0 m 叽，表观摩尔吸光系数 。6 3 5 = 3 8 9 1 0 5 l m o l c m ；在p h l 8 也2 的酸性介质中，铜( ) 一硝基磺酚s 络台物与蛋白 质发生作用，导致络合物溶液褪色，线性范围为o 8 0 r r 吼，表观摩尔吸光系数e 6 1 7 = 4 8 1 1 0 5 l m o l c m - 1 ；在p h 3 8 0 q 2 0 的c l a r k l u b s 缓冲介质中，c u ( i i ) a r s 络合物 与蛋白质作用，其吸收光谱发生大幅度变化，生成的深红色三元复合物，k 。为5 3 8 n m ， 比试剂本身红移“8 衄，比络合物k 。红移3 0 锄。线性范围为啦3 0 0 m g l ，表观摩尔吸 光系数85 3 8 = 2 3 7 1 0 5 l m o l 一啪d ( 人血清白蛋白) 。这些方法的灵敏度较大数直接以染料 为光谱探针的光度法高，且生物体内常见无机离子及有机物质基本不干扰测定，直接应用 于人血清中蛋白质总量的测定，结果满意，因此建立了以络合物为光谱探针分光光度法测 定蛋白质含量的新方法。 3 深入开展蛋白质与染料探针( 小分子有机配体) 相互作用理论研究 研究了铀试剂i i i 与人血清白蛋白反应前后的吸收光谱，并对其反应机理和结合平衡进 行了深入探讨。深入开展蛋白质与染料探针( 小分子有机配体) 相互作用的理论研究不仅 对于改进蛋白质分析方法有实际意义，而且有助于阐明生物大分子与小分子配体相互作用 的化学本质。因而在生命科学中有重要意义。 关键词：蛋白质，光谱探针，吸收光谱，分光光度法，染料探针，金属络合物光谱探针 “ a b s t r a c t p r o t e i ns p e c t r a lp r o b ew a sp r o p o s e di n1 9 5 0 sa san e wa n a i y s i sm 甜】o df o rd e 协h n i n “o no f p r o t e i n s m i n i mp r o t e i nw a sd e t e m i n e db yd i t l to fs p e c t r a lp m b e ，、v em i g h ts e a r c ht h er e l a t i o n b e t v e ns t r u c t u r ea n dm n c t i o n ，a n dc o u l ds e a r c ht l cr e a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e nd r o t e i na n d s m a l lm 0 1 a rl i g a l l d t h em e m o dh a sb e e nc o n s i d e m b l yr e c o g n i z e db e c a u s ei ti ss i m p l e ，f a s t ，t h e 谢d el i n e a rr a l l g e ，h i 曲s e n s i t i v i t ya 1 1 dt o l e 舢tt om a i l yf l o r e i g ns u b s t a n c e s ，锄dp o s s e s s e sw i d e a p p l i c a t i o np r o s p e c t b a s e do nt h er e s e a r c hs t a t u sq u of i o rt l l eq u a l l t i t a t i v ea n a l y s i so fp m t e i na 1 1 d o l l rl a b o r a t o r y7 si r l 、他s t i g a t i o nw o r k ，s e v e r a la s p c c t so f t l l ew o r kw e r ed o n ci nt h ep a p e l 1 i nm e p a p e r p r o t e i nc h e m i s t r yb a s ew a ss 啪m a r i z e d ，雠ds o m em 旬o rq u a i l t i t a t i v ca i l a l y s i s m e t l l o d so f p r o t e i na n dt h e i r 印p l i c a t i o ni nt h ef i e l d so f b i o c b 啪i s t 啦m 酣i c i n e ，f o o da 1 1 dc l i n i c a l m e d i c i n ew e r cr e v i e 、e di nd 咖i l s 1 2 6r e f e r c n c e sw e r ec i t e d 证t l l i sc h a p t e r 2 s e a 玎c h f o rm e n c ws p e c t r a l p r o b c ( 1 ) d y ep r o _ b e ： c 1 1 r o m o t r o p e2 cc o u l db 砌w 砒ls e n m lp r o t e i n st of o m lac o l o rc o m p l e x i nb r i t t o n r o b i n s o nb u 舵rm c d i u mp h 3 8 2 ，州c hp r e s e m sam a x i m 啪a b s o i p t i o na t5 6 0 啪 谢t l l5 l 衄o fr e ds l l i f tc o m p a r e dt oc h r o m o 咖p c2 ci t s e l f am o l a ra b s 0 删v i t yo f3 0 5 l0 6 u m o l c m ( b s a ) 姐dl 妇a r yr a n g eo f 2 0 一8 0 l n g lf o rp r o t e i nw e r ed e 蜘血n e d + i nc l a r k l u b s b u 彘ra tp h l 5 ，c a r b o x y a r s e n a z 0c 趾b i n dm p 础yw i n l i n a n yk i n d so fp r o t 咖a tm o m t e l n p e 删= u r ef o n i n gab l u ec o m p l e x ，w l l i c hh 够am a 试h 岫a b s o r p t i o nw a v e l e n g t l la t6 1 2 呦 b e e r sl a wi so b e y e di nam g e 舶mot o1 0 0i i 虮( h s a ) t h em o l a ra b s o 州v i t yo f r e a c t i o ni s 2 6 7 1 0 3 m l c m a n dm em 烈h o d sw e r es i m p l e ，g t a b l e ，也ew i d el i n e a rr a n g e ，g o o d s c l e c t i v i 够a l l dl l i g hs e n s i t i v i 何t h e s 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，a i l dc a u sa b s o r b a n c ed e c r e a s ea t6 l7 哪o ft h ec u ( i i ) 州i 由r o s u l f o p h e n o ls c o m p l e x t h cl m e a rm g e f o rc a j i b r a t i o ng r a p ho fh _ i n a l ls e 九珊a l b u l l l i ni su pt o8 0 m l ，a n d t 1 1 e a p p a r e n t m 0 1 a r a b s o r p t i v i t y o f b i n d i n g r e a c d o na t 6 1 7 n mi s i l i 4 8 1 1 0 5 l m o l c m c o p p e “i i ) 一a l i z a r i nr e ds c o m p l e xc o u l dc o m b i n e 州t 1 1 p r o t e i n t o f o n l la d e e pr c dt e m a r yc o m p o u n ds u b s t a n c ei nc l a r k l u b sa tp h 3 8 0 2 ，w h i c hp o s s e s s e dm a ) 【i m m a b s 唧t i o na t5 3 8 n i n 谢t h3 ( ) n m 趾d118 m o fr e ds h i f tc o m p a r e dt ot h ec o p p e r ( i i ) a l i z a r i nr e d sc o m p l e xa n dd y ei t s e l r e s p e c t i v e l y n l el i n e a rr a i l g ei s0 3 0 0 m g l ，鲫dt l l e 印p a r c n tm o l a r a b s 唧t i v 蚵i s2 3 7 1 0 5 l - m o l - c m - i 1 1 1 es e n s i t i v 时o ft h i sm e m o di sh i 曲e rt h a nm o s to ft l l e s p e c 仃o p h o t o m e m cm e m o d sw h i c hm ed y e sa r ed i r e c t l yu s e da ss p e c t r a lp r o b e m a n yi i l 0 1 苫a n i c i o n sa i l do 唱a i l i cm a t e r i a l sd on o ti n t e r f e r ew i t l ld e t e 埘n i n a t i o n t h em e m o dh a sb e e na p p l i e dt o m ed e t e 咖i n a t i o no ft o t a l 锄o l t so fp m t e i n si nm eh u m a ns e m ms a l l l p l e sa n ds a t i s f a c t o r y r e s u l t sa r eo b 诅i n e d o nt h eg m u n d ，也e s em e t l l o d sf o rt l l ed e t c 衄i n a t i o no f p r o t e i n sb yu s i n gt h c m e t a lc o m p l e xa ss p e c t m lp r o b e s 、e r ee s t a _ b l i s h e d 3 f 删h c rd e v e l o pf o rt l l ei i l t e r a c t i o nt 1 1 e o r yb e t w e e np r o t e i na n dd y cp r o b e ( s m l lm o l a r o 罾u l i cl i g a l l d ) t h ea b s o 删o ns p e 咖肌o fa r s e n a z o ia i l dh u m a l ls e m ma l b u m i nb e f o r ea n da f t e rt h e i r r e a c t i o nw e r es t u d i e db ys p e c 廿0 p h o t o m e t 啦t h er e a s o no fe q m c o l o l l rp o i n t 、张s 锄_ a l y z c d ，a n da p r e l i m i n a r yd i s c u s s i o no nt h er e t i o nm e c h a n i s mw a sa l s og i v e n nw 鹊v e r yi m p o r t a n tn o to n l y f o ri m p r o v i n g 血ea n a l y s i sm e t l l o do f p r o t e i n s ，b u ta l s ob e i n gp r o p i t i o l l st oi i l l l l i l i m t ec h e m i s 仃y e s s e n c eo fm ei m e m c t i o nb c 栅e e nb i gm l e c u l eb i o l o g ya r l ds m a l lm o l e c l l l el i g 卸dt od e v e l o p d e e p l yt h ei n t 釉c t i o nt l l e o r yb e 咐e e np r o t e i na 1 1 dd y ep r o b e ( 蛐a l lm o l e c l i 王eo r g a i l i cl i g 趴d ) s o i tw 硒v e r yi m p o r t a n tf o rt h el i f cs c i c n c e k e ) w o r d s ：p r o t e i n ；s p c c t r a lp r o b e ；a b s o 珏m o ns p c c t n 吼；印e 咖p h o t o m e 时；d y ep r o b e ；m e t a l c o m p l e xp r o b e 第一章绪论 第一章蛋白质化学基础及其定量分析技术的发展 1 1 蛋白质化学基础 蛋白质是生命最重要的物质基础之一，生物的遗传性状都是通过生物自身合成的各种 不同的蛋白质互相作用表现出来的。生物体的代谢活动和各种生理现象都是种种功能不同 的球蛋白参与作用的过程。例如：酶的催化作用；蛋白质激素调节代谢的作用；运载蛋白 质输导作用，等等。因此，蛋白质与生命息息相关，没有蛋白质就没有生命活动【l i 。 1 1 。l 氨基酸、多肽与蛋白质 蛋白质元素分析表明，组成蛋白质的元素有：碳( 5 0 ) 、氢( 7 ) 、氧( 2 3 ) 、氮( 1 6 ) 和硫( 0 呦。有些蛋白质还含有其他一些元素，如磷、铁、铜、碘、锌和钼等。蛋白质的 平均含氮量为1 6 ，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏( k j e d a l l l ) 定氮法测定蛋白 质含量的计算基础：蛋白质含量= 蛋白氮o 1 6 。 1 1 1 1 氨基酸 蛋白质就其化学结构来说，是由2 0 种l 型- 氨基酸通过肽键组成的长链分子。从各 种生物体中发现的氨基酸已有1 8 0 多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸只有2 0 种，这 些氨基酸称为蛋白质氨基酸。除脯氨基酸外，这2 0 种氨基酸在结构上的共同点是与羧基 相邻的a 碳原子上都有一个氨基，因而称为氨基酸。各种舡氨基酸的区别在于侧链r 基的不同。按r 基的化学结构，2 0 种氨基酸可以分为脂肪族、芳香族和杂环族三类，其中 以脂肪族氨基酸为最多( 1 5 种) 。但从光学性质来看，以芳香族的苯丙氨酸p h e 、酪氨酸 1 w 和杂环族的色氨酸t r p 最为重要，这三种氨基酸在紫外区有吸收而且能发射荧光。 按r 基的极性性质，2 0 种氨基酸可以分成四组：1 非极性r 基氨基酸；2 不带电荷的 极性r 基氨基酸；3 带正电荷的r 基氨基酸；4 滞负电荷的r 基氨基酸( 指在p h 7 左右) 。 在这种分类方法中，带正电荷的r 基氨基酸值得注意。这类氨基酸包括赖氨酸l y s 、精氨 酸衄g 和组氨酸h i s 三种碱性氨基酸。赖氨酸脂肪链的位上有一个氨基；精氨酸含有一 个带正电荷的胍基；组氨酸有一个弱碱性的咪唑基。在p h 低于7 的酸性溶液中，这三种 氨基酸的r 基质子化，从而使蛋白质带净正电荷。当某些染料分子( 酸碱指示剂) 与带正 电荷的蛋白质靠近时，可发生质子离解作用而使染料的颜色发生变化，从而起到蛋白质光 第一章绪论 谱探针的作用。 1 1 1 2 多肽 一个氨基酸的氨基同另个氨基酸的羧基相连接可以使氨基酸相互反应形成肽。在这 种反应中，来自一个氨基酸的氨基( n h 2 ) 中的h 与另一个氨基酸的羧基( 一c o o 聊中的o h 结合生成h 2 0 ，然后两个氨基酸残基通过肽键连接。最简单的肽由两个氨基酸组成，称为 二肽，其中包含个肽键。含有三个、四个、五个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽、五肽 等。肽链中的氨基酸由于参与肽键的形成已经不是原来完整的分子，因此称为氨基酸残基。 氨基酸( 6 3 0 个残基) 通过肽键连接形成的短链称为多肽。当氨基酸连接在一起的数 目达4 0 个或更多( 分子量5 0 0 0 以上) 时，其肽链就具有蛋白质的性质。但是，在分子量 方面，多肽与蛋白质并无绝对的分界线。一般认为，多肽和蛋白质的根本区别在于蛋白质 一般含有廿螺旋结构，这种结构的主要功能是稳定蛋白质的总的构象：多肽一般没有洳 螺旋，其构象有很大的可变性和可塑性。蛋白质和多肽是构象、性质和功能都不同的两类 物质。蛋白质是生物体的功能大分子，负责完成生物体所需的各种功能，如氧的运输、生 化反应的催化和肌肉收缩等；而生物体内的活性多肽则属于体内的化学信息传递物质，如 生长、发育、生殖以及兴奋等生命想象，都需要多肽激素( 信息分子) 发挥作用。 1 1 1 3 蛋白质 蛋白质分子没有严格的定义，一般地说，它是具有完整生物功能的蛋白质的最小单位。 蛋白质分子具有一条或数条多肽链。多肽链不是条直线，也不是任意的线团，而是在三 维空间有特定的走向与排布。生物界蛋白质的种类在1 0 1 0 1 0 1 2 数量级。造成种类如此众多 的原因重要是2 0 种氨基酸在肽链中的排列顺序不同，这种顺序异构现象是蛋白质生物功 能多样性和种属特异性的基础。 1 1 2 蛋白质的结构 蛋白质的性质与功能决定于蛋白质的结构。深入了解蛋白质的结构对于生物化学和分 析化学都是十分必要的。因为对于生物化学家来说，不了解蛋白质的结构，就不能阐明蛋 白质分析方法的机理，也就不能对于蛋白质分析方法的改进与创新予以理论上的指导。 蛋白质分子有不同的结构层次：一级结构：二级结构；超二级结构：结构域；三级结 构；四级结构。有些蛋白质分子只有一、二、三级结构，没有四级结构，如：肌红蛋白、 溶菌酶等。有些较大的蛋白质分子有四级结构，如：血红蛋白、乳酸脱氧酶等。 1 1 3 蛋白质变性 2 第一章绪论 鸡蛋清能够溶于水，但经过煮沸之后就凝固。这是众所周知的蛋白质变性现象。蛋白 质变性之后，其物理性质( 如溶解度、结晶能力、旋光值和荧光光谱) 、化学性质( 如水 解速度与某些试剂反应的能力等) 以及生物性质( 如酶的催化活性和激素的生理调剂能力 等) 都会发生变化。因此，蛋白质变性对于生物化学和分析化学都是一个重要的问题。 能够引起蛋白质变性的因素是很多的。这里讨论如下几个因素： 1 温度：蛋白质在5 0 6 0 的溶液中，经过一定时间，往往发生变性。热变性有可逆 和不可你之分，但多数是发生凝聚和沉淀的不可逆变性。温度升高使分子内的振动增强， 从而破坏了维系空间结构的次级键，使蛋白质变性。 2 酸、碱：大多数蛋白质在p h 4 1 0 之间是稳定的，超过这个范围，就发生变性。酸 碱能引起蛋白质变性的原因是在蛋白质肽链上连接着酸性氨基酸残基( a s p 和g l u ) 和碱 性氨基酸残基( h i s 、l y s 和a r g ) ，因而在多肽链的不同部位的侧链基团之间存在着静电吸 引或排斥作用。静电吸引有助于维持蛋白质的构象，静电排斥不利于蛋白质构象的稳定， 导致结构松散。由于蛋白质的结构不同，其电荷基团的分布不同，因而不同蛋白质对酸碱 的稳定性不同。 3 表面活性剂：表面活性剂( 如十二烷基硫酸钠s d s ) 很容易与蛋白质结合。原因是 s d s 分子有一个非极性的脂肪族长链，还有一个带负电荷的硫酸根。s d s 的脂肪族长链可 与蛋白质内部的非极性基团相互作用，而带负电荷的硫酸根可溶于水中，在s d s 的作用下， 蛋白质分子的构象发生变化：寡聚体离解成亚基，亚基由球状变成杆状。杆状的s d s 蛋白 质复合物，其表面上分布着大量的s d s 负电荷基团，因而易溶于水；阳离子表面活性剂( 如 溴化十六烷基三甲铵( c t m a b ) 和非离子表面活性剂( 如t r i t o n x l o o ) 对于蛋白质也有变 性作用。 4 有机溶剂：乙醇、甲醇等有机溶剂可以使蛋白质变性。一般认为，有机溶剂可以影 响蛋白质分予中的静电力、氢键和疏水作用力，从而导致蛋白质构象的变化，这种变化主 要表现为螺旋度的增加。 5 盐：盐对蛋白质构象的影响也是一个值得注意的问题，因为在蛋白质的分离提纯、 结构与功能研究以及蛋白质的分析中，广泛地使用了各种盐以维持一定的离子强度。不同 的盐对蛋白质的构象有不同的影响。盐对蛋白质构象的影响机制有两种考虑：一是离子对 于蛋白质内部的极性基团有直接的作用，例如阴离子可以结合在带正电荷的氨基酸残基 上，从而影响蛋白质的构象；二是离子可以改变溶剂水的结构，从而影响水分子与蛋白质 极性基团的相互作用，间接地影响蛋白质地构象。 第一章绪论 1 2 蛋白质定量分析技术的发展 蛋白质是人体中重要的一类生物大分子，它不仅对于维持生命是十分重要和必不可少 的，同时，它对于生命遗传密码的翻译、信息的转录、d 咐a 的复制等都有密切关系。此外， 蛋白质在现实生活中也有许多应用，如：i 临床分析、食品分析、利用酶制剂的工业生产、 日常生活等。因此，蛋白质的研究对生命科学、生物化学、临床医学等都有十分重要的意 义。通过对蛋白质的定性分析，可以了解其结构与功能之间的关系，提示生命现象的奥秘。 而蛋白质定量是生化、药物、食品及临床分析最常涉及的内容，也是临床检验中诊断疾病 及检查疾病治疗康复情况的重要指标，又是许多生化药物分离提纯和质量检验中最常用的 手段，某些生命物质乳酶、多肽、蛋白质及蛋白激素的分离纯化更是离不开蛋白质的定量 测定。这一切都引起了科学工作者的兴趣和广泛关注，同时随着科学技术的突飞猛进，不 断出现了用于定量测定蛋白质的一些新的分析技术。它促进了生命科学的不断发展。应用 蛋自质内源光谱性质的分析方法只有紫外光谱法和荧光光谱法，两种方法再检测灵敏度方 面常常不能满足要求，为此，人们发展了各种光谱探针分析法。所谓蛋白质光谱探针，就 是能与蛋白质结合后光谱性质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。借 助于蛋白质光谱探针可以测定微量的蛋白质，并可以研究蛋白质结构与功能的关系、研究 蛋白质与小分子配体的作用机理。 本文概括地介绍了蛋白质的定量测定方法如最早的浊度法、凯氏定氮法，和目前研究 最多、应用最广、操作较为简便的吸光光度法、荧光光度法，还有新进发展起来的共振瑞 利散射法、高效液相色谱法、毛细管电泳分析法。 1 2 1 浊度法1 2 l ( 比浊法) 利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度比较而定量测得未知蛋白浓 度的定量分析法。磺基水杨酸和三氯化铁是常用的蛋白质沉淀剂。3 0 9 甩磺基水杨酸作为 沉淀剂可沉淀白蛋白、球蛋白及血红蛋白，5 0 扎三氯乙酸蛋白作沉淀剂，可沉淀自蛋白 和球蛋白。磺基水杨酸法灵敏度与精确度高但干扰物质多。这两种浊度法都受温度的影响。 另外，两种方法所用试帮的浓度、滤光片的波长及反应浓度没有标准化，因此其结果的准 确及精确性较差，但由于操作简单、快速、试剂易购，因此，目前仍为临床常规检查所用。 1 2 2 凯氏定氮法( k j e l d a h l ) 1 3 i 该法是利用一般蛋白质含氮量平均在1 6 ，可将测定的含氮量折算成样品中蛋白质的 含量。其原理是：被测样品与浓硫酸共热时分解产生氨，氨和硫酸结合生成硫酸铵，在此 4 第一章绪论 过程中加入硫酸铜作为催化剂，加硫酸钾以提高沸点，硫酸铵在强碱作用下分解产生氨， 用水蒸气蒸馏法将氨收集于过量的硼酸中，然后用标准溶液滴定。根据所测得的含氮量， 计算样品的蛋白质含量。凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织、器官及 食品等组成复杂样品的测定，但操作比较复杂，含大量碱性氨基酸的蛋白质测定结构往往 偏高。 1 2 3 吸光光度法 测定蛋白质含量常用的吸光光度法包括经典的紫外光谱吸收法、金属探针法、染料探 针法和金属络合物探针法。 1 2 3 1 紫外光谱吸收法 蛋白质分子中所含的酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸残基的芳香结构对紫外光有吸收作 用，其最大吸收峰在2 8 0 砌附近。当蛋白质的质量浓度在0 1 1 o g l 之间时，其紫外吸光 值与浓度成正比，故可用作蛋白质含量的定量测定【4 】。本法操作简单、灵敏、快速、低浓 度的盐类不干扰测定。因此广泛用在蛋白质和酶的生化制各中，尤其适用于层析柱洗脱液 中蛋白质的快速测定。但是若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，则会出现较大 的干扰，而且不同种类蛋白质的上述氨基酸残基含量不同，其差异较大，这就决定了紫外 吸收光谱法的局限性。 1 2 3 2 金属探针 双缩脲法1 5 1 ( b i u r e ta s s a y ) 是一种测定蛋白质的经典方法。在强碱性溶液中，蛋白质与 c u s 0 。反应形成紫红色络合物，最大吸收峰位于5 4 0 姗处。本法主要优点在于不同种类蛋 白质的颜色类似，它是最常用的血请总蛋白的测定方法。其缺点是灵敏度低，检出限为 o 2 1 7 9 l ，干扰也比较大，且操作复杂。1 9 5 1 年，劳里( l o w r y ) 6 j 等将双缩脲试剂和 f o l i n - c i o c a l e t u 试剂( 磷钼酸盐磷钨酸盐) 一并加入到蛋白质溶液中，蛋白质发生双缩脲 反应之后再和f o l i n c i o c a l e t l l 试剂反应，反应生成的产物颜色更深，7 5 0 r 吼处有最大吸收， 在一定条件下，吸光度与蛋白质的浓度成正比。灵敏度比双缩脲法高1 0 0 倍。不足之处是 费时，干扰物质影响大。1 9 8 5 年，s i i l i m 【7 】等人对劳里法进行改良，用4 甲酸喹啉( b c a ) 代替f o l i n c i o c a l e t u 试剂。原理是，蛋白质与二价铜在碱性条件下反应生成一价铜【c u ( i ) 】， c “i ) 与b c a 反应形成紫色配合物，在5 6 5 n m 处测量吸光度。此法测定程序与劳里法相 近，但比劳里法的试剂稳定，干扰物质少，各种蛋白质之间显色差异小。此法逐渐被采用。 l 曲s t a l 等嘲人1 9 8 5 年发展了银染色法测定微量蛋白质的方法。蛋白质样品先用甘油醛 第一章绪论 处理，再与银氨溶液混合，1 0 m i n 后加入硫代硫酸钠终止反应，最大吸收波长为4 2 0 1 1 i n 。 该法的线性范围为1 5 也o o o n g ，灵敏度比考马斯亮蓝g 一2 5 0 ( c b b g - 2 5 0 ) 法高l o 倍，蛋 白质一银复合物形成快，显色稳定，碳水化合物、非离子表面活性剂等几乎不干扰测定。 在金属作为探针测定蛋白质的方法中除有以上几种方法外，还有胶体金【9 】( c 0 1 l o i d a l 譬o l d ) 、银【l 、钯染色法。其中金、钯等已被用于测定微量蛋白质。 1 2 3 3 染料探针 染料探针法是用于蛋白质的检测中最为广泛的分析方法之一，现已应用于临床医学及 生命科学的研究中。它是基于有机染料与蛋白质的结合作用所产生的显色或褪色反应，这 类方法不需要特别装置，而且简便、快速、准确、经济、污染小，应用已有五十多年。蛋 白质的基本化学结构单元为氨基酸，当溶液p h 小于蛋白质等电点时蛋白质肽链上的碱 性氨基酸上的氮原子因质子化而为阳离子，因而含有磺酸基等阴离子的染料就可以通过静 电引力和分子间范德华力与蛋白质结合1 1 1 孤，其中静电引力起着重要作用，这种结合改变 了染料的吸光度，为分光光度法测定蛋白质奠定了基础。目前采用分光光度法定量分析蛋 白质所用的染料主要有三苯甲烷类染料、偶氮类染料和卟咻类染料等。 三苯甲烷类染料溴甲酚绿( b c g ) 是使用最早、最广泛、性能优良的染料。在p h 4 2 时，黄色的b c g 与蛋白质反应，生成绿色的复合物，最大吸收波长从4 4 5 n m 移至6 2 8 n r n ， 在一定的范围内吸光度与蛋白质的浓度成正比【1 4 】。本法优点是操作简单、快速、经济、精 密度好、颜色对比度大。1 9 7 6 年，b r a d f b r d 提出了考马斯亮蓝g 2 5 0 分析蛋白质的方法， 考马斯亮蓝g 2 5 0 在酸性溶液中呈红棕色，与蛋白质结合变成蓝色，最大吸收波长从4 6 5 m 移至5 9 5 哪【l5 1 ，在一定条件下蛋白质的浓度与吸光度值成正比。该法的优点是灵敏度高( g 级) ，操作简便，显色稳定，反应5 m i n 内完成，干扰少。缺点是染料吸附比较严重，易沾 染器壁，线性范围窄，操作手续麻烦，反应特异性不好。继b r a d f o r d 后，许多人对这种方 法的各个方面进行了研究，使之应用更广”6 l ，更加完善1 8 】，但在克服缺点方面仍有待进 一步研究。此外，已见报道的还有曙红b ( e b ) 【1 9 1 、伊红y 【2 0 】、溴甲酚紫【2 1 】、百里酚蓝【2 2 j 、 酸性品红f 2 3 1 、铬天青l2 4 1 、埃铬掣2 5 1 、四磺荧光素2 6 1 、溴酚蓝【2 7 】、苯胺蓝f 2 研等。 偶氮类染料甲基橙【2 9 】是最早用于测定蛋白质的偶氮类染料，在p h 3 5 的缓冲溶液中， 甲基橙与蛋白质结合形成复合物，其最大吸收波长为5 5 0 r 蚰。此法在测定人血清白蛋白时 结果总是偏高。以后又相继报道了金莲橙g 【3 们、氨基黑l o b 【3 1 j2 1 、t - a z o - r p 3 1 等。但是，这 几种染料在测定的灵敏度及颜色对比度方面都不好。近年来，胡秋娈、李娜等人研究了许 多种对比度较大的偶氮类染料与蛋白质的作用( 如：硝基磺酚c 、变色酸2 r 、氯磺酚s 6 第一章绪论 等) ，灵敏度高，线性范围宽，可测定不同蛋白质，用于实际人血清样品中蛋白质总量的 测定，回收率和重现性都较好，基本无干扰，还避免了c b b 法盼试剂不稳定、易吸附于 器壁等弱点。张华山【3 4 】等人研究了十几种变色酸偶氮染料与蛋白质的作用及所引起的光谱 性能变化，详细探讨了实验条件、染料结构对其相互作用的影响。他认为含有水溶性较好 的酸性基团( 如一s 0 3 h ，一p 0 3 h 2 ，一a s 0 3 h 2 等) 越多，灵敏度越高，从而表明与蛋白质 等作用越强。李克安、童沈阳等口5 】人也研究了一系列有机染料与蛋白质等相互作用( 如： 酸性铬蓝k 、埃铬蓝s e 、偶氮磺i 等) ，取得了较好的成果。 某些常见的染料测定蛋白质的反应条件及分析特性见表。 表1 1 某些染料测定蛋白质的吸光光度法 卟啉类试剂 已发现的可以作为染料的卟啉类试剂有，p ，t ，6 一四( 对磺苯基) 卟啉 ( t p p s 4 ) 和a ，p ，y ，6 四( 对羧苯基) 卟啉( t c p p ) 。其中t p p s 4 性能优良，s a n d e l l 灵 第一章绪论 敏度( s ) 为0 0 0 8 7 “g c m 2 ，线性范围为l 一1 0m 叽，反应速度快。t p p s 4 与c b b g 一2 5 0 法 相比，有如下的优点：试舞h 稳定：显色酸度( p h 2 o ) 比c b b g 一2 5 0 ( p h o 9 8 ) 要低，使蛋 白质不易被沉淀和变性：水溶性好，不易吸附器壁；灵敏度高。 其它试剂近年来，近红外染料越来越引起人们的注意 5 2 】，因为它们的吸收及荧光光 谱均处于近红外区，而生物分子在这个波段无吸收，因而具有背景干扰小，灵敏度高等优 点。郑洪等人1 5 3 】采用自行合成的水溶性近红外试剂七次甲基花菁作为染料，测定血清中蛋 白质，检出限为5 0 1 0 。9 9 m l 。 1 2 3 4 金属络合物探针 金属络合物探针是近几年兴起的一种新方法，1 9 8 3 年f 嘶i t a y 【5 4 j 等首次提出利用金属络 合物测定蛋白质。其机理为金属离子一般使用含电荷高、离子外层含有较多空余的瞬间杂 化轨道，这样，当其与含有一o h 或c = o 的有机染料相遇时，氧原予中的孤对电子可顺 利进入杂化轨道，形成稳定的配合体系，在酸性条件下，该体系遇到结构不对称的蛋白质 时互相极化产生静电作用而合成新的大分子团；另外，大分子内部易形成氢键作用，蛋白 质分子中的芳香氨基酸残基与有机染料分子中的芳香结构都具有疏水作用，从而改变了原 体系的光谱性能，进而能定量测定蛋白质的含量。 在这些金属离子的报道中，有关m o ( ) 、t i ( ) 、v ( ) 和c u ( 1 i ) 的报道较多。在这些 报道中为增大染料及蛋白质的溶解度，一般都加入表面活性剂或乳化剂，用于尿液或血样 中蛋白质的测定，有些报道对体系的测定条件，测定过程及测定结果都作了较科学的详细 报道。例如，我国南开大学沈含熙先生及有关学者长期从事这方面的研究，从理论和实践 上解决了许多实际问题。他们提出了水杨基荧光酮一m o ( ) 加乳化剂o p 与蛋白质形成有 色配合物，在九一= 5 7 5 n m 处定量测定蛋白质，线性范围为0 也5 肛g m l - 1 ，得到很好的效 果，而且体系稳定，待测时间长、准确度高f 5 5 1 。他们还发现三羟基荧光酮是一类优良的显 色剂和荧光试剂，其配合物是蛋白质的良好探针和定量试剂，并发现二溴羟基荧光酮即 2 ，6 ，7 三羟基9 ( 3 ，5 二溴4 羟基) 苯基荧光酮( d b h p f ) ，可以和m o ( ) 络合，在室温下 与蛋白质快速结合形成稳定的络合物，从而改变了原配合物的吸收光谱，这一体系线性范 围为0 2 0 p g m l 。( b s a ) 和1 7 5 肛g m l 。1 ( h s a ) ，稳定性可达2 4 h ，且选择性好，可用于尿 样和血样的分析，结果与考马斯亮蓝法相同。这一体系的开发为我国用金属离子一有机染 料法定量测定蛋白质开拓了一个新的途径。1 9 9 6 年z h uk ，“k a 和t o n g s y 在a n a l l c t t 发表了溴邻苯三酚红- z n ( h ) 体系用于蛋白质的测划5 6 】，w e i y j ，l i k a 和t 0 n gs y 在1 1 a l a l l t 上发表了创新的测定方法，并引起了人们的关注【5 刀。 r 第一章绪论 常见的测定蛋白质的染料一金属络台物测定蛋白质的吸光光度法见表1 2 。 表l - 2 某些染料一金属络合物测定蛋白质的吸光光度法 1 2 4 荧光法 荧光法是定量测定蛋白质的另一种常用方法，通常较光度法更灵敏。大多数蛋白质在 2 8 0 m 紫外光区有强烈的光吸收而导致荧光，但其本身的荧光强度较弱。目前常用外源荧 光法来测定蛋白质，外源荧光法就是当蛋臼质与具有荧光特性的染料结合时，能引起荧光 第一章绪论 强度的变化( 增强或猝灭) ，并且在一定的范围内与蛋白质的浓度成正比，据此可以测定 蛋白质。外源荧光法可使测定的灵敏度进一步提高。 荧光法测定蛋白质含量最大的优点是灵敏度高，但仅使用于具有荧光的体系，使方法 的使用范围受到限制。几种常见的测定蛋白质的荧光光度法见表1 3 。 表1 3 测定蛋白质的某些常见荧光法 1 2 5 共振光散射法 光散射是指一束光通过介质时，在入射光方向以外的各方向观察到的一种光辐射现象。 有机染料是常用的光散射试剂，由于蛋白质的多肽链上各部分的非极性侧链在酸性条件下 带正电荷，强烈吸引带负电荷的有机染料与之结合，因此，在蛋白质表面形成一个有机染料 1 0 第一章绪论 的覆盖层，这种以蛋白质为支撑核心的大的染料聚集体远远大于染料自身聚集体的体积。 因此二者结合后，光散射的强度急剧增加并与加入的蛋白质浓度成正比【8 8 】。此法用于蛋白 质的定量分析具有很高的灵敏度【8 吼9 0 1 。一般可比吸光度法和荧光法高一、二个数量级。这 一发现为生物化学和临床分析中痕量生物大分子的测定开辟了一条新的途径。 l i u 【9 l 】等报道了单偶氮染料( 如酸性铬黑烂、铬蓝s e 、偶氮氯膦i 、偶氮胂i 、铬变 素) 与蛋白质作用的共振光散射法。f a n 【9 2 】等人研究了双偶氮染料( 如偶氮胂m 、偶氮氯 膦i 、氯磺酚s ) 与蛋白质的作用，在p h 3 4 4 o 时，这些双偶氮染料能与蛋白质作用使 溶液的共振光散射得到增强，最大散射峰位于4 0 0 4 7 0 砌。f a n 【9 3 】等人报道了t h ( ) 双 偶氮染料( 如偶氮胂i i i 、偶氮胂m 、偶氮氯膦、氯磺酚s ) 络合物与蛋白质作用的共振 光