（神经病学专业论文）增强绿色荧光蛋白真核表达载体pegfpn1rapsynmusk的构建.pdf

i i i i ii1i iieiii ii ie iu i y 17 4 5 3 9 8 材料与方法9 结果2 0 分析与讨论3 4 结论3 6 参考文献”3 7 附勇乏4 0 致谢”4 l 综述及参考文献”4 2 独创性声明4 8 中文 n s f r a p s y n 重症肌无力 神经一肌肉接头 乙酰胆碱受体 肌肉特异性受体酪氨酸激 酶 酪氨酸激酶 n e t h y l m a l e i m i d es e n s i t i v en 一乙基马来酰亚胺敏感因 f a c t o r r e c e p t o r a s s o c i a t e dp r o t e i n 子 突触受体相关蛋白 2 收后用限制性内切酶双酶切法将目的基因连接至真核表达载体p e g f p - n 1 ，并转 化x l l 一b l u e 感受态细胞。然后用n h e i 和x h o i 双酶切筛选阳性单克隆重组子， 获得预期结果后进行序列测定、序列比对。 2 、通过高保真p c r 法，以p c d n a - m u s k 为模板获得m u s k 目的基因，凝胶回收后 用限制性内切酶双酶切法将目的基因连接至真核表达载体p e g f p - n 1 ，并转化 x l l - b l u e 感受态细胞。然后用x h o i 和e c o r l 双酶切筛选阳性单克隆重组子，获 得预期结果后进行序列测定、序列比对。 3 、用n h e i 和x h 0 1 分别双酶切测序正确的p e g f p n 1 r a p s y n 和p e g f p - n 1 m u s k ， 凝胶回收r a p s y n 基因片段和线性p e g f p n 1 m u s k 并连接，转化x l l - b l u e 感受态 细胞后，用n h e i 和e c o r i 双酶切筛选阳性单克隆重组子，获得预期结果后进行 序列测定、序列比对。 结果： l 、通过高保真p c r 法以p c d n a r a p s y n 为模板扩增出了1 2 5 2 b p 的d n h 片段，构 建筛选的阳性重组质粒经双酶切得到在m a r k1 2 0 0 b p 附近的d n a 片段，大小与预 期结果相符，测序结果与目的基因r a p s y n 序列( 已测序并b l a s t ) 通过v e c t o rn t i s u i t e8 软件比对后一致。 2 、通过高保真p c r 法以p c d n h - m u s k 为模板扩增出了2 6 5 7 b p 的d n a 片段，构建 筛选的阳性重组质粒经双酶切得到在m a r k2 0 0 0 b p 和3 0 0 0 b p 之间的d n a 片段， 大小与预期结果相符，测序结果与目的基因m u s k 序列( 已测序并b l a s t ) 通过 v e c t o rn t is u i t e8 软件比对后一致。 3 、构建筛选的阳性重组质粒“p e g f p n l r a p s y n m u s k 经限制性内切酶双酶切 得到在m a r k3 0 0 0 b p 和4 0 0 0 b p 之间的片段，大小与预期结果相符( r a p s y n m u s k 4 r a p s y n m u s k 序列通过v e c t o r 绿色荧光蛋白真核表达载体 氨酸激酶；增强绿色荧光蛋 x l l - b l u ec o m p e t e n tc e l l s , r e c o m b i n a n t sw e r es c r e e e n e dt h r o u g he n z y m ed i g e s t i o n a n a l y s i sb yn h e l ，x h o lr e s t r i c t e de n z y m ea n dd n aa g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s a f t e r o b t a i n i n gt h et h e o r e t i c a lr e s u l t ，w ei d e n t i f i e dp o s i t i v er e c o m b i n a n t sb ys e q u e n c i n g a n ds e q u e n c ea l i g n m e n t 2 m u s kg e n ew a sa m p l i f i e df r o mp c d n a - m u s kb yh i g hf i d e l i t yp c r a f t e rg e l e x t r a c t i o na n dd i g e s t i o n ，p c rp r o d u c t i o nw a sc o n n e c t e di n t oe u k a r y o t i c f l u o r e n s c e n te x p r e s s i o nv e c t o rp e g f p - n 1 f o l l o w i n gb yt r a n s f o r m e dt ot h eh o s t x l l 一b l u ec o m p e t e n tc e l l s , r e c o m b i n a n t sw e r es c r e e e n e dt h r o u g he n z y m ed i g e s t i o n a n a l y s i sb yx h o l ，e c o r ir e s t r i c t e de n z y m ea n dd n aa g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s a f t e r o b t a i n i n gt h et h e o r e t i c a lr e s u l t ，w ei d e n t i f i e dp o s i t i v er e c o m b i n a n t sb ys e q u e n c i n g a n ds e qu e n c ea l i g n m e n t 3 p e g f p n 1 r a p s y na n dp e g f p n 1 m u s kt h a th a v et h ec o r r e c ts e q u e n c ew e r e d i g e s t e db yn h e la n dx h 0 1 a f t e ro b t a i n i n gr a p s y ng e n ea n dl i n e a rp e g f p n 1 m u s k ， c o n n e c t e dt h e mu s i n gd n al i g a s e f o l l o w i n gb yt r a n s f o r m e dt ot h eh o s tx l l - b l u e c o m p e t e n tc e l l s , r e c o m b i n a n t sw e r es c r e e e n e dt h r o u g he n z y m ed i g e s t i o na n a l y s i s b yn h e l ，e c o r ir e s t r i c t e de n z y m ea n dd n aa g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s a f t e r 5 温州医学院硕士学位论文 o b t a i n i n gt h et h e o r e t i c a lr e s u l t ，w ei d e n t i f i e dp o s i t i v er e c o m b i n a n t sb ys e q u e n c i n g a n ds e q u e n c ea l i g n m e n t r e s u l t s ： 1 d n af r a g m e n t sa b o u t1 2 3 5 b pw e r eo b t a i n e df r o mp c d n a r a p s y nb yh i g hf i d e l i t y p c r t h r o u g he n z y m ed i g e s t i o na n a l y s i s , s e q u e n c i n ga n dv e c t o rn t is u i t ea n y l y s i s , t h er e s ul tw a sc o r r e c t 2 d n af r a g m e n t sa b o u t2 6 3 3 b pw e r eo b t a i n e df r o mp c d n a - m u s kb yh i g hf i d e l i t y p c r t h r o u g he n z y m ed i g e s t i o na n a l y s i s , s e q u e n c i n ga n dv e c t o rn t is u i t ea n y l y s i s ， t h er e s u l tw a sc o r r e c t 3 t h r o u g he n z y m ed i g e s t i o na n a l y s i s ，s e q u e n c i n ga n dv e c t o rn t is u i t ea n y l y s i s , t h e s e q u e n eo fp e g f p - n 1 r a p s y n m u s kw a s c o r r e c t c o n c l u s i o n ：t h er e c o m b i n a n tf l u o r e s c e n t e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o r p e g f p - n l i r a p s y n m u s kw a s c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l yb yg e n ef u s i o nt e c h n o l o g y k e yw o r d s ：r e c e p t o r a s s o c i a t e dp r o t e i no ft h es y n ap s e ；mu s c l e s p e c i f i cr e c e p t o r t y r o s i n ek i n a s e ；f l u o r e s c e n te u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r ；g e n ef u s i o nt e c h n o l o g y ； p e g f p - n 1 6 m u s k 的构建 重症肌无力( a c q u i r e da u t o i m m u n em y a s t h e n i ag r a v i s ，m g ) 是一种神 经一肌肉接头( n e u r o m u s c u l a rj u n c t i o n ，n m j ) 传递功能障碍的获得性自 身免疫性疾病。主要由于n m j 突触后膜乙酰胆碱受体( a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r ，a c h r ) 受损引起。临床特征主要表现为骨骼肌无力、易疲劳， 活动后症状加重、休息后症状减轻u 曙1 。中国发病率为8 - 2 0 1 0 万，患病率 为5 0 1 0 万，南方发病率较高，女性多于男性l 4 j 。1 6 7 2 年英国学者t h o m a s w i l l i s 首先报道m g 至今，已有三百年的历史l ：5 - j然而具体病因及发病机 制仍未明确，这就导致在治疗学方面主要是对症治疗，主要包括以下几个 方面：胸腺治疗、胆碱酯酶抑制剂、选择性胆碱酯酶抑制剂、肾上腺皮质 激素、免疫抑制剂、血浆置换、大剂量静脉注射免疫球蛋白、特异性血浆 置换、非致病性抗a c h r 抗体、免疫调节、补体抑制疗法、磷酸二酯酶抑制 剂、钙离子阻滞剂、干细胞移植、中医临床辩治。p 驯 肌肉特异性受体酪氨酸激酶( m u s c l e s p e c i f i cr e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e ， m u s k ) 是神经一肌肉接头突触后膜的一种跨膜蛋白，不同于其它的酪氨酸激酶 ( r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e s ，r ! ，r k s ) ，主要表达在电器官和骨骼肌上m q l 。其 胞外区由4 个i 蜘样区域和1 个半胱氨酸聚集区构成，胞内区由1 个近膜区、1 个激 酶区和羧基末端尾部组成。主要作用有：在n m j 分化形成过程中以及聚集a c h r 方 面中起重要作用，调节突触相关基因转录。l 2 5 - 3 3 1 突触受体相关蛋白( r e c e p t o r a s s o c i a t e dp r o t e i no ft h es y n a p s e ，r a p s y n ) 是神经一肌肉接头突触后膜的一种膜周边蛋白，分子量为4 30 0 0 d ，在a c h r 定位、 聚集、稳定中起重要作用。主要表现在以下几个方面：与a c h r 直接作用；与a c t i n 、 1 3 - d y s t r o g l y c a n 、b - c a t e n i n 相互作用；通过羟基末端功能域促进c d k 5 的磷酸 化，抑制下调a c h r 聚集的蛋白激酶c d k 5 的活化；小鼠中r a p s y n 的减少、基因突变 引起a c h r 减少和肌无力。5 卜删 重症肌无力治疗学研究国内外主要集中在免疫抑制治疗，或和胸腺切除， 相应保护a c h r 的措施没有取得实质性进展。有研究显示增力h m u s k 的表达能够增 2 口a c h r 的转录，另一研究显示，真核表达载体p c d n a r a p s y n 对e a m g 模型的a c h r 7 温州医学院硕i j 学位论文 有保护作用，这为m g 的a c h r 保护治疗及其基因治疗提供了初步实验依据。在成 年人，m g 的治疗可以尝试通过基因治疗增加n m j 处m u s k 和r a p s y n 的表达达到治疗 效果。 m u s k 矛l j r a p s y n 在n m j 形成过程中，通过a g r i n m u s k r a p s y n 信号通路在a c h r 聚集作用中起重要作用，由这个信号传导通路及相关研究可以得到启示，既然 m u s k 和r a p s y n 都对a c h r 聚集起作用，那么我们可以构建m u s k 和r a p s y n 融合基因的 真核表达载体，通过肌肉注射这一方便的给药途径，研究这一方案的可行性。相 信随着基因治疗的不断完善、重症肌无力分子机制的不断呈现，m g 的治疗将更加 乐观、有效。【4 1 _ 4 4 】 本研究旨在通过基凼融合技术，创造性的构建增强绿色荧光蛋白基因、突触 受体相关蛋白基因、肌肉特异性受体酪氨酸激酶基因的融合基因，为基因治疗 重症肌无力提供新的思路和实验基础。 p e g f p n 1 质粒图谱( 引自b v t e c hp l a s m i d ) 温州医学院硕士学位论文 材料和方法 一、材料 ( - - ) 、质粒与菌种 l 、p c d n a r a p s y n 、p c d n a - m u s k 质粒为本室保存。 2 、p e g f p - n 1 质粒、x l l - b l u e 菌株由温州医学院附属第一医院医科所蒋磊博士惠 赠。 ( - - ) 、主要试剂 p r i m e r ：s a n g o n 、i n v i t r o g e n b i o r e a d yp f up a c ：b i o f l u x g o l d v i e w t m 核酸染料：s o l a r b i o b i om a r k e ri i i ：b i o f l u x d n al a d d e r ：f e r m e nt a s a x y p r e p 质粒d n a 小量试剂盒：a x y g e n a x y p r e p d n a 凝胶回收试剂盒：a x y g e n n h e i 、x h o i 、e c o r i 限制性内切酶：n e b t 4d n a 连接酶：n e b 胰蛋白胨、酵母提取物：o x o i d 琼脂粉：o x o i d 琼脂糖：o x o i d 氨苄青霉素、卡那霉素 ( 三) 、主要仪器设备 j a 3 0 0 3 电子天平：上海恒平科学仪器有限公司 m i l l i - q 纯水仪：m i l l i p o r e 公司 立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂 烤箱：h e r a e u s 超净工作台：北京中化生物技术研究所 o r b i t a ls h a k e r 摇床：f o r m as c i e n t i f i c 公司 全套琼脂糖凝胶电泳装置：北京市六一仪器厂 凝胶图象分析系统i m a g em a s t e r v d s ：p h a r m a c i ab i o t e c h 公司 m yc y c l e r t m 梯度式p c r 扩增仪：b i o r a d 公司 m a s t e r c y c l e rp c r 仪：e p p e n d o r f 公司 h m t 2 0 0 恒温循环水浴箱：h e t o 公司 9 温州医学院硕士学位论文 细菌培养箱：g a ll e n k a m p 公司 电热水浴箱：n e s c a b 低温离心机：m i k r o2 2 r 高速离心机：e p p e n d o r f 普通冰箱：h a i e r 公司 - 8 0 冰箱：f o r m as c i e n t i f i c 公司 凝胶电泳仪：h m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司 微波炉：h a l e r 公司 自动制冰机：s c o t s m a n ( 四) 、主要溶液配制 l 、l b ( l u r i a b e r t a n i ) 液体培养基：称取胰蛋白胨l g ，酵母提取物o 5 9 ，n a c l l g ，加去离子水9 5 m l ，用5 m o l l n a o h 调p h 值至7 2 ，加去离子水定容至l o o m l ，高 压灭菌2 0 m i n ，4 c 保存。使用时根据质粒抗性加入浓度至l o o u g m l 氨苄青霉素或 5 0 u g m l 卡那霉素。 2 、l b 固体培养基：l o o m ll b 中加入琼脂粉1 5 9 ，高压灭菌，待培养基温度降至 5 5 。c 时，根据质粒抗性加入浓度至l o o u g m l 氨苄青霉素或5 0 u g m l 卡那霉素，摇 匀后铺板。 3 、5 0xt a e 电泳缓冲液贮存液： t r i sb a s e2 4 2 9 ，n a 2 e d t a 2 h 2 03 7 2 9 ，冰乙酸5 7 1 m l ，去离子水定容1 0 0 0 m l 。 二、方法 ( 一) 、p e g f p n 1 r a p s y n 的构建 1 、获得r a p s y np c r 纯化产物 ( 1 ) p c d n a - r a p s y n 质粒抽提( 按照a x y p r e p 质粒d n a d , 量试剂盒说明书操作) 取2 m ll b 培养过夜的p c d n a r a p s y n 菌液，1 2 0 0 0 9 离, 心l m i n ，弃尽上清。 用2 5 0 u l 己加入r n a s ea 的b u f f e rs 1 ( 4 贮存) 悬浮细菌沉淀，悬浮均匀， 不留有小的菌块。 加入2 5 0 u lb u f f e rs 2 ( 注意检查是否有沉淀) ，温和并充分地上下翻转 混合4 - 6 次均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。( 此步骤不宜超过5 m i n ) 加入3 5 0 u lb u f f e rs 3 ，温和并充分地上下翻转混合6 8 次，1 2 0 0 0 9 离心 l o m i n 。( 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组d n a 的污染) 吸取步骤中离心上清并转移到d n a $ o 备管( 置于2 m l 离心管中) ，1 2 0 0 0 9 离- o l m i n 。 将制备管置回2 m l 离心管，力h 5 0 0 u lb u f f e rw 1 ，1 2 0 0 0 9 离，心l m i n ，弃滤液。 将制备管置回2 m l 离心管，2 h 7 0 0 u lb u f f e rw 2 ( 已加入指定体积的无水乙 l o 温州医学院硕士学位论文 醇) ，1 2 0 0 0 9 离心l m i n ，弃滤液。 将制备管置回2 m l 离心管，力h 7 0 0 u lb u f f e rw 2 ，1 2 0 0 0 9 离，心l m i n ，弃滤液。 将制备管置回2 m l 离心管中，1 2 0 0 0 9 离一心l m i n 。 将制备管移入新的1 5 m l 离心管中，在d n a 制备膜正中央力h 6 0 u le l u e n t ( 6 5 ) ，室温静置l m i n ，1 2 0 0 0 9 离心l m i n 。 ( 2 ) p c r 弓 物设计：上下游引物5 端分别带有n h e i 和x h o i 酶切位点 上游引物：5 一c g g c t a g ca t gg g gc a gg a cc a ga c aa a gc a ac 一3 下游引物：5 一c g c t c g a gc a ca a ag c cc g gc t tc a tg g ag g ag c 一3 ( 3 ) p c r 反应体系及条件( 以b i o r e a d yp f up a c 说明书为标准) 反应体系 1 0 b u f f e r d n t pm ix t u r e s e n s ep r i m e r ( 1 0 u m ) a n t i s e n s ep r i m e r ( 1 0 u m ) p f ud n ap o l y m e r a s e p c d n a r a p s y n 质粒 d d h ：0 5 u 1 4 u 1 2 u l 2 u 1 0 3 u l 2 u 1 3 4 7 u 1 5 0 u l 反应条件：9 5 。c2 m i n ；9 5 4 5 s ，6 2 c1 5 m i n ，7 2 2 m i n ，3 0 个循环； 7 2 l o m i n ；1 0 保存。 ( 4 ) d n a 琼脂糖凝胶电泳 配$ i j 5 0 t a e 电泳缓冲液贮存液。 0 5 9 琼脂糖加入5 0 m l1 t a e 。 微波炉里加热至琼脂糖溶化后，加入l u lg o l d v i e w 核酸染料。 选择合适的梳子组装凝胶装置。 浇板，室温下完全冷却，即为1 琼脂糖凝胶。 向电泳槽内加入l t a e 缓冲液，将琼脂糖凝胶板置于电泳槽内。 ( z ) p c r 扩增产物和6 d n ab u f f e r 按5 ：1 混匀后上样，然后取6 u lm a r k 上样， 1 2 0 v 、8 0 m a 电泳4 0 - 5 0 分钟，于凝胶成象系统观察结果并照相。 ( 5 ) p c r 产物凝胶回收( 按照a x y p r e pd n a 凝胶回收试剂盒说明书操作) 称量1 5 m l 离心管重量并记录。 在紫外灯下切下含有r a p s y n 目的d n a 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面 液体并切碎，称量并计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积。 温州医学院硕士学位论文 加入3 个凝胶体积的b u f f e rd e - a ，混合均匀后于7 5 加热，间断混合( 每 2 - 3 m i n ) ，直至凝胶块完全熔化。 加o 5 1 b u f f e rd e - a 体积的b u f f e rd e - b ( 检查是否出现沉淀) ，混合均 匀。 吸取步骤中的混合液，转移j i d n a $ j 备管( 置于2m l 离心管中) ，1 2 0 0 0 9 离一t , l m i n ，弃滤液。 将制备管置回2 m l 离心管，l j l 5 0 0 u lb u f f e rw 1 ，1 2 0 0 0 9 离心3 0 s ，弃滤液。 将制备管置回2 m l 离心管，j j l 7 0 0 u lb u f f e rw 2 ( 已加入制定体积的无水乙 醇) ，1 2 0 0 0 9 离, t 二, 3 0 s ，弃滤液。 将制备管置回2 m l 离心管，力1 7 0 0 u lb u f f e rw 2 ，1 2 0 0 0 9 离一l , l m i n ，弃滤 液。 将制备管置回2 m l 离心管中，1 2 0 0 0 9 离4 二, l m i n 。 将制备管置于洁净的1 5 m l 离心管中，在制备膜中央j j l 2 7 u le l u e n t ( 6 5 。c ) ， 室温静置l m i n ，1 2 0 0 0 9 离, t , l m i n 洗脱d n a 。 2 、感受态细胞的制备( c a c l 4 法) 吸取2 u lx l l - b l u e 菌接种于约2 m ll b 液体培养液，3 7 。c ，2 5 0 r m i n ，1 6 h 。 吸取过夜培养物l o o u l 涂板，3 7 。c ，1 6 h 。 挑取单克隆菌株接种于4 m ll b 液体培养液，3 7 。c ，2 5 0 r m i n ，1 6 h 。 吸取2 m l 过夜培养物加入含有l o o m ll b 培养液的三角烧瓶中，3 7 ， 2 5 0 r m i n ，2 h 。( o d 4 0 5 ) 在无菌条件下将细菌转移n 2 个无菌、预冷的5 0 m l 离心管中，冰浴l o m i n 。 4 ，3 0 0 0 r p m ，离, t 二, 7 m i n 。 用l o m l 预冷的0 1 m o l 1c a c l 4 温和地重悬菌体沉淀，4 。c ，3 4 0 0 r p m ，离心 5 m i n 。 用l o m l 预冷的0 1 m o l 1c a c l 4 温和地重悬菌体沉淀，冰浴3 0 m i n ，4 c ， 3 4 0 0 r p m ，离& , 5 m i n 。 每分菌体沉淀用4 m l 预冷的0 1 m o l 1c a c k 重悬，将感受态细胞分装成小 份，并加入1 5 甘油( 每份2 0 0 u 1 ) ，- - 7 0 保存。 3 、构建重组子 ( 1 ) p e g f p - n 1 质粒的转化和提取 转化 a 取l u lp e g f p - n 1 质粒加入2 0 0 u l 预冷的x l l - b l u e 感受态细胞，混匀，冰浴 3 0 m i n 。 b4 2 水浴9 0 s 后，迅速冰浴2 m i n 。 1 2 温州医学院硕士学位论文 c 加入预热的5 0 0 u ll b 液体培养基( 无抗生素) ，3 7 。c ，2 5 0 r m i n ，l h 。 d 吸取l o o u l 菌液涂板( k a n + 、预热) 。 e 菌液完全吸收后，倒置培养皿，3 7 过夜。 质粒抽提( 按照a x y p r e p 质粒d n a 小量试剂盒说明书操作) 。 ( 2 ) n h e i 、x h o l 双酶切r a p s y np c r 纯化产物齐n p e g f p n 1 质粒( 以n h e l 、x h o i 限 制性内切酶说明书为标准) 反应体系 h 2 0 5 u l1 5 u l 1 0x b u f f e r4 u l3 u l l o b s a4 u l3 u 1 n i l e ll u ll u l x h o il u ll u l p c rp r o d u c t2 5 u l p 】a s m j d 7 u 】 4 0 u l3 0 u l 反应条件：3 7 、3 h 。 ( 3 ) d n a 琼脂糖凝胶电泳 d o 5 9 琼脂糖加入5 0 m ll t a e 。 微波炉里加热至琼脂糖溶化后，加入l u l g o l d v i e w 核酸染料。 选择合适的梳子组装凝胶装置。 浇板，室温下完全冷却，即为1 的琼脂糖凝胶。 向电泳槽内加入1 t a e 缓冲液，将琼脂糖凝胶板置于电泳槽内。 取上述酶切产物按5 u l 加入l u l6 x d n ab u f f e r 配制上样，取l o u lm a r k 上 样，1 2 0 v 、8 0 m a 电泳4 0 - 5 0 分钟，于凝胶成象系统观察结果并照相。 ( 4 ) 双酶切产物凝胶回收( 按照a x y p r e pd n a 凝胶回收试剂盒说明书操作) ( 5 ) 连接 反应体系 h 2 0 1 0 b u f f e r p c rp r o d u c t p l a s m i d l i g a s e 6 u l 2 u l 8 u l 3 u l 1 u 1 2 0 u l 1 3 温州医学院硕士学位论文 反应条件：1 6 c 、过夜。 ( 6 ) 转化 取2 0 u l 连接产物加入2 0 0 u l 预冷的x l l - b l u e 感受态细胞，混匀，冰浴3 0 m i n 。 4 2 水浴9 0 s 后，迅速冰浴2 m i n 。 加入预热的5 0 0 u ll b 液体培养基( 无抗生素) ，3 7 c ，2 5 0 r m i n ，l h 。 上述菌液4 0 0 0 r p m 离。心5 m i n ，弃上清液6 0 0 u l ，混匀余下约l o o u l 菌液，吸取 l o o u l 菌液涂板( k a n + 、预热) 。 菌液完全吸收后，倒置培养皿，3 7 c 过夜。 4 、筛选阳性单克隆菌株 ( 1 ) 单克隆菌落质粒抽提( 按照a x y p r e p 质粒d n a d , 量试剂盒说明书操作) 。 ( 2 ) n h e i 、x h o i 双酶切单克隆菌落质粒 反应体系： h 2 0 3 5 u l l o b u f f e r l u l 1 0 x b s a l u l n h e l0 2 5 u l x h 0 10 2 5 u l p e g f p n 1 r a p s y n 4u l 1 0 u l 反应条件：3 7 、l h 。 ( 3 ) d n a 琼脂糖凝胶电泳 ( d o 5 9 琼脂糖加入5 0 m ll t h e 。 微波炉里加热至琼脂糖溶化后，加入l u l g o l d v i e w 核酸染料。 选择合适的梳子组装凝胶装置。 浇板，室温下完全冷却，即为1 的琼脂糖凝胶。 向电泳槽内加入l x t h e 缓冲液，将琼脂糖凝胶板置于电泳槽内。 取上述酶切产物5 u 1 ) j t l 入l u l6 d n ab u f f e r 混匀上样，然后取6 u lm a r k 上样，1 2 0 v 、8 0 m h 电泳4 0 - 5 0 分钟，于凝胶成象系统观察结果并照相。 5 、d n a 序列测定：由上海英俊生物技术有限公司完成。 6 、序列比对：v e c t o rn t is u i t e8 软件。 ( 二) 、p e g f p - n 1 m u s k 的构建 1 、获得m u s kp e r 纯化产物 ( 1 ) p c d n a m u s k 质粒抽提( 按照a x y p r e p 质粒d n a 小量试剂盒说明书操作) 。 1 4 温州医学院硕士学位论文 ( 2 ) p c r 弓j 物设计：上下游引物5 端分别带有x h o i 和e c o r i 酶切位点 上游引物：5 一c g c t c g a ga t ga g ag a gc t cg t ca a ca t tc c ac 一3 下游引物：5 一c g g a a t t c ag a cg c ct a cc g tt c cc t ct g ct c tc 一3 ( 3 ) p c r 反应体系及条件( 以b i o r e a d yp f up a c 说明书为标准) 反应体系 1 0 b u f f e r d n t pm ix t u r e s e n s ep r i m e r ( 1 0 u m ) a n t i s e n s ep r i m e r ( 1 0 u m ) p f ud n ap o l y m e r a s e p c d n a - m u s k 质粒 d d h 。0 5 u l 4 u 1 2 u 1 2 u l 0 3 u l 2u l 3 4 7 u 1 5 0 u l 反应条件：9 5 c2 m i n ；9 5 。c4 5 s ，6 2 。c1 5 m i n ，7 2 。c3 5 m i n ，3 0 个循环； 7 2 l o m i n ；1 0 保存。 ( 4 ) d n a 琼脂糖凝胶电泳 配制5 0 t a e 电泳缓冲液贮存液。 o 5 9 琼脂糖加入5 0 m llx t a e 。 微波炉里加热至琼脂糖溶化后，加入l u lg o l d v i e w 核酸染料。 选择合适的梳子组装凝胶装置。 浇板，室温下完全冷却，即为1 琼脂糖凝胶。 向电泳槽内加入l t a e 缓冲液，将琼脂糖凝胶板置于电泳槽内。 p c r 扩增产物和6 d n ab u f f e r 按5 ：l 混匀后上样，然后取6 u lm a r k 上样， 1 2 0 v 、8 0 m a 电泳4 0 - 5 0 分钟，于凝胶成象系统观察结果并照相。 ( 5 ) p c r 产物凝胶回收( 按照a x y p r e pd n a 凝胶回收试剂盒说明书操作) 。 2 、构建重组子 ( 1 ) p e g f p n l 质粒抽提( 按照a x y p r e p 质粒d n a 小量试剂盒说明书操作) 。 ( 2 ) x h o i 、e c o r i 双酶切m u s kp c r 纯化产物茅n p e g f p n 1 质粒( 以x h o i 、e c o r i 限 制性内切酶说明书为标准) 反应体系 温州医学院硕士学位论文 4 0 u l3 0 u l 反应条件：3 7 、3 h 。 ( 3 ) d n a 琼脂糖凝胶电泳 o 5 9 琼脂糖加入5 0 m l1 t a e 。 微波炉里加热至琼脂糖溶化后，加入l u l g o l d v i e w 核酸染料。 选择合适的梳子组装凝胶装置。 浇板，室温下完全冷却，即为1 的琼脂糖凝胶。 向电泳槽内加入1 t a e 缓冲液，将琼脂糖凝胶板置于电泳槽内。 取上述酶切产物按5 u 1 2 1 入l u l6 x d n ab u f f e r 配制上样，取l o u lm a r k 上 样，1 2 0 v 、8 0 m a 电泳4 0 - 5 0 分钟，于凝胶成象系统观察结果并照相。 ( 4 ) 酶切产物凝胶回收( 按照a x y p r e pd n a 凝胶回收试剂盒说明书操作) 。 ( 5 ) 连接 反应体系 h 2 0 1 0 b u f f e r p c rp r o d u c t p l a s m i d l i g a s e 6 u l 2 u 1 8 u l 3 u 1 1 u l 2 0 u l 反应条件：1 6 、过夜。 ( 6 ) 转化 2 0 u l 连接产物加入2 0 0 u l 预冷的x l l 一b l u e 感受态细胞，混匀，冰浴3 0 m i n 。 4 2 水浴9 0 s 后，迅速冰浴2 m i n 。 加入预热的5 0 0 u ll b 液体培养基( 无抗生素) ，3 7 ，2 5 0 r m i n ，l h 。 述菌液4 0 0 0 r p m 离。险5 m i n ，弃上清液6 0 0 u l ，并混匀余下约1 0 0 u l 菌液，吸 取l o o u l 菌液涂板( k a n + 、预热) 。 1 6 温州医学院硕士学位论文 菌液完全吸收后，倒置培养皿，3 7 。c 过夜。 3 、筛选阳性单克隆重组子 ( 1 ) 单克隆菌落质粒抽提( 按照a x y p r e p 质粒d n a j , 量试剂盒说明书操作) 。 ( 2 ) x h o i 、e c o r i 双酶切单克隆菌落质粒 反应体系： h 2 0 1 0 b u f f e r 1 0 b s a x h o i e c o r i p e g f p 。n1 m u s k 3 5 u 1 l u l l u l 0 2 5 u 1 0 2 5 u 1 4u 1 1 0 u l 反应条件：3 7 。c 、l h 。 ( 3 ) d n a 琼脂糖凝胶电泳 0 5 9 琼脂糖加入5 0 m l1 t a e 。 微波炉里加热至琼脂糖溶化后，加入l u l g o l d v i e w 核酸染料。 选择合适的梳子组装凝胶装置。 浇板，室温下完全冷却，即为1 的琼脂糖凝胶。 向电泳槽内加入1 t a e 缓冲液，将琼脂糖凝胶板置于电泳槽内。 取上述酶切产物5 u l 加入l u l6xd n ab u f f e r 混匀上样，然后取6 u lm a r k 上样，1 2 0 v 、8 0 m a 电泳4 0 一5 0 分钟，于凝胶成象系统观察结果并照相。 4 、d n a 序列测定：由上海英俊生物技术有限公司完成。 5 、序列比对：v e c t o rn t is u it e8 软件。 ( 三) p e g f p n 1 r a p s y n m u s k 的构建 l 、构建重组子 ( 1 ) n h e i 、x h o i 双酶切测序正确的p e g f p n 1 r a p s y n 和p e g f p n 1 m u s k 反应体系 1 7 温州医学院硕士学位论文 h 2 0 1 0 b u f f e r l o b s a n h e i x h o i p e g f p n l r a p s y no rp e g f p 。n i m u s k 5 u 1 4 u l 4 u l 1 u 1 l u l 2 5 u 1 4 0 u l 反应条件：3 7 。c 、3 h 。 ( 2 ) d n a 琼脂糖凝胶电泳 0 5 9 琼脂糖加入5 0 m ll t a e 。 微波炉里加热至琼脂糖溶化后，加入l u l g o l d v i e w 核酸染料。 选择合适的梳子组装凝胶装置。 浇板，室温下完全冷却，即为1 的琼脂糖凝胶。 向电泳槽内加入l t a e 缓冲液，将琼脂糖凝胶板置于电泳槽内。 取上述酶切产物按5 u 1 2 h 入l u l6 x d n ab u f f e r 配制上样，取l o u lm a r k 上 样，1 2 0 v 、8 0 m a 电泳4 0 - 5 0 分钟，于凝胶成象系统观察结果并照相。 ( 3 ) 酶切产物凝胶回收( 按照a x y p r e pd n a 凝胶回收试剂盒说明书操作) ( 4 ) 连接 反应体系 h 2 0 6 u l l o b u f f e r2 u l r a s y n 8 u l p e g f p n1 m u s k 3 ul l i g a s e l u l 2 0 u l 反应条件：1 6 。c 、过夜。 ( 5 ) 转化 ( ! ) 2 0 u l 连接产物加入2 0 0 u l 预冷的x l l - b l u e 感受态细胞，混匀，冰浴3 0 m i n 。 4 2 水浴9 0 s 后，迅速冰浴2 m i n 。 加入预热的5 0 0 u ll b 液体培养基( 无抗生素) ，3 7 。c ，2 5 0 r m i n ，l