（园林植物与观赏园艺专业论文）石斛兰花期和花色的转基因研究.pdf

摘要 兰花是兰科( o r c h i d a c e a e ) 植物的总称，是开花植物中最大的一个科，属 于单子时植物，是霸前花卉中价值最裔的一种。兰花韵花色、花期和花形的改疆 一直是兰芯鸯耪敢耀点和霪点。囊于兰花比较难噬邀霉遗传转化，共显兰鞋檀物 的花有许多独有的特征，因此进行兰花转基因的研究不仅可以为兰花分子生物学 研究打下良好的基础雨量还有狠大的商业乖用价值，在基础理论研究和实际应用 方耍都毒擐羹要的意义。弱蔻在兰花转化上遂展缓蠼，只农9 令满夔兰筏转纯上 有过报道。 石帑属怒兰科中第一大属，全球约有1 6 0 0 多种，其中多数种类具有观赏价 篷，稼为石熬兰。露皴兰( d e n d r o b i u m ) 是热豢兰串栽培滋较广泛翡名蠹花夯， 花型犬花枝长，花多，花色艳丽丰富，姿淼优美，花瓶存活期长。本文以2 种名贵的石斛兰品种( d e n d r o b i u mp h a l a e n o p s i sb a n y a np i n k 和d e n d r o b i u m n o b i l e ) 隽专葶辩，巍爆农瓤莹奔警豹转纯方法避行了遗建转耗磷究。为了改变燕 花的花期和花色，我们利用r t p c r 方法从拟南芥中克隆了花分生组织决定基因 胴基因，将a p l 基因克隆八植物表达载体p c a m b i a l 3 0 1 中转化石斛兰 d e n d r o b i u mn o b i l e ，褥翳6 9 个转基因株系，最高转纯效率达到i 8 。3 鲔，并对 转基因株系进行了g u s 组织染色，结果表明g u s 在转纂困株象中得到了稳定表达； s o u t h e r n 杂交分子检测结果表明省用基因被究整的艟入到植物基因组中，为多 拷瑟瑟入，拷癸数1 - 4 。藏辩我稍获矮牵牟孛巍隆了豢家酮食酶萋鞭c ? i s a 基戮， 将c h s a 基因构建入攘物表达载体p w m l 0 1 中转化石魁兰d e n d r o b y u m p h a l a e n o p s i sb a n y a np i n k ，得剿4 个转基因株系，转化散率达到1 6 7 ，并 对转鼙嗣株系遂行了分子稔溯。s o u t h e r n 杂交结栗表髓c h s a 基因完整的整入劐 植物基因组中，为单拷贝插入。n o r t h e r n 杂交结果表骧c h s a 基因被转豢了。毽 前两个品种都得到了生根的转基因苗。 关键试：嚣瓣兰遗蕊转纯鼻露c h s a 农耪慧 a b s t r a c t a so n eo fi m p o r t a n to r n a m e n t a lp l a n t s ，o r c h i d sh a v ea ni m p o r t a n tc o m m e r c i a l i m p o r t a n c e i nw o r l df l o w e ri n d u s t r y 。t a x o n o m i c a l l y ，o r c h i d a c e a ei st h el a r g e s t f a m i l yo ff l o w e r i n gp l a n t sa m o n gm o n o c o t y l e d o n s ，w h i c ho c c u p i e sw i d er a n g e so f e c o l o g i c a lh a b i t a t sa n de x h i b i t sh i g h l ys p e c i a l i z e dm o r p h o l o g i c a l ，s t r u c t u r a l ，a n d p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s i ti s 黻i d e a lm a t e r i a lt os t u d yf l o w e rp i g m e n t a t i o na n d o v u l ei n i t i a t i o na n dd e v e l o p m e n t t h ei n e f f i c i e n tt r a n s f o r m a t i o no fo r c h i d s ，h o w e v e r , h a m p e r e dt h ei n v e s t i g a t i o no fo r c h i dg e n ef u n c t i o na n dr e g u l a t i o ni nv i v o o r c h i d b r e e d i n gb yt r a d i t i o n a ls e x u a lh y b r i d i z a t i o nw a st i m e - c o n s u m i n gd u et ot h el o n g g r o w t ha n dr e p r o d u c t i v ec y c l eo ft h e s ep l a n t s ，m e a nw h i l eg e n e t i ce n g i n e e r i n g m e t h o do f f e r sa ne f f e c t i v ew a yt oi n t r o d u c en o v e lc h a r a c t e r si n t oo r c h i d s u n 删 r e c e n t l yt r a n s g e n i co r c h i dp l a n t sh a v eb e e nr e p o r t e df o ro n l yn i n eg e n e r ao f o r c h i d s d e n d r o b i u mo r c h i d sa r et h ef i r s t l yg e n e r ai no r c h i d a c e a ep l a n t si nt e r m so f t h e i r a m o u n t s o r c h i d sa r ev a l u a b l eo r n a m e n t a lp l a n t s ，g l o b a l l yu s e d a sc u tf l o w e r sa n d p o t t e dp l a n t s w es u c c e s s f u l l yt r a n s f o r m e dt w od e n d r o b i u r ao r c h i d s ( d e n d r o b i u m p h a t a e n o p s i sb a n y a np i n ka n dd e n d r o b i u mn o b i l e ) w i t har e l a t i v e l yh i g he f f i c i e n c y v i aa g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n t h ep r o t o c o l sp r o v i d e dh e r ea r es i m p l e ， r e p e a t a b l ea n de f f e c t i v e i no r d e rt oa l t e rt h ef l o w e rc o l o ra n df l o w e r i n gt i m eo f d e n d r o b i u mo r c h i d s , 讹t r a n s f o r m e dt h eo r c h i d so fd e n d r o b i u mp h a l a e n o p s i sa r i d d e n n o b i l ew i t ht h ec h s a ( c h a l e o n es y n t h a s ea ) g e n ea n dt h ef l o r a lm e d s t e m i d e n t i t yg e n ea p iv i aa g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o no fp r o t o c o r m - l i k e b o d i e s ( p l b s ) a n dc a l l u s ，r e s p e e t i v e l y 。t h ec h s ag e n e 嘲c l o n e df r o mp e t u n i a 缈打i a , a n dt h ea p tg e n ew a sc l o n e df r o ma r a b i d o p s i s 。ar a t h e rh i 醢t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c yo f1 8 3 w i t ha p la n d1 6 7 w i t hc 瑚w a so b t a i n e d i n t e g r a t i o no f a p i t r a n s g e n e s w e r ee o r d i r m c di n t r a n s g e n i cd 。n o b eo r c h i dp l a n t sb ys o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n t h ec o p yn u m b e ro ft h ei n t e g r a t e dg e n e sr a n g e df r o mo n et of o u r , i n d i c a t i n gam u l t i p l ei n s e r t i o no f t h eg e n e sa n di n d e p e n d e n tt r a n s f o r m a t i o ne v e n t sa n d r a n d o mi n t e g r a t i o n s o u t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ee 麟i n s e r t e di nt h e g e n o m ed n a o ft r a n s g e n i cl i n e sw i t has i n g l e c o p y n o r t h e r nb l o t t i n g a n a l y s i s i n d i c a t e dt h et r a n s c r i p t i o no fc h s ag e n e 。w ed i dn o to b s e r v ec o s u p r e s s i o ni n t r a n s g e n i cl i n e s o u rr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tl o n gi n o c u l a t i o np e r i o di so n eo f t h em a j o r f a c t o r sw h i c hr e d u c e dt h et r a n f o r m a t i o ne f f i c i e n c ys i g n i f i c a n t l y k e yw o r d s ：d e n d r o b i u m ，a p lg e n e ，c h s ag e n e ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ， a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s a s b a b c i p b p c a m v c d n a c t a b d d e p c d i g d m s o d n t p e d t a g u s h p t k a n k b l b m s n a a n b t n o s n p t l i p e r p e g p l b r 茁 r t p c r s d s s s c x g l u c 缩写 a c e t o s y r i n g o n e b e n z y l a d e n i n e 5 一b r o m o 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l p h p s p h a t e b a s ep a i r c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s c o m p l e m e n t a r yd n a c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e d e n d r o b i u m d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i g o x i g e n i n d i m e t h y ls u l p h o x i d e d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h y l o n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d g l u c u r o n i d a e s h y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e k a n a m y c i n k i l o - b a s ep a i r l u r i a - b e r t a n i m u r a s h i g ea n ds k o o g n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d 4 n i t r ob l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e n o p a l i n es y n t h a s e n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s ei i p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n e 斟y c o l p r o t o c o r m - l i k eb e d i e s r i f a m p i c i n r e v o r s ot r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o - 3 一i n d o l y l g t u c u r o n i d e 乙酰丁香酮 氨苄腺嘌呤 5 - 溴4 - 氯3 吲哚。磷酸 碱基对 花椰菜花叶病毒 互 b d n a 十六烷基三甲基溴化铵 石斛兰 焦碳酸二乙酯 地高辛 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 葡萄糖醛酸酶 潮霉素磷酸转移酶 卡那霉素 予虢基对 l b 培养熬 m s 培养蒺 蒸己酸 氮蓝四唑 藉虢碱食残酶 新霉素磷酸转移酶 聚食酶鞋式反应 聚己二酵 类蹶球茎 巅裰平 反转录p c r + = 娩羞磺蘸镳 标撒柠檬酸钠盐 5 瀵4 氯- 3 * 霸磔- 葡萄糖醛酸 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 墨力系 。j 岳a 漏 关于论文使用授权的声明 本人完全了解凹川农业人学有必保留、使用学位论文的规定，即：举校有权保留并向 国家脊关部门戚机构送交论文的复印件和电子舨，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缚窜域担搀等复割手段摄存、汇编学往论文。霹意鞠矧裹数大学霹疑羽不瓣方式在苓嗣媒俸 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 磅究生签名：墨 o ， 导师签名：泓 玉毒睫蔫鑫 协厂年 5 月工鲁日 1 文献综述 1 。1 前言 1 + 。1 兰花麓余 兰科是显筏植物中最大的科之一，羼予单予时檀物纲，包括8 0 0 多个鼷，近3 0 0 0 0 种，其中2 5 0 0 0 多个种具有观赏价值，在全球广泛栽培【i - 2 。兰花是兰科( o r c h i d a c e a e ) 棱物的惑称，为多年难革本植物，附生、施生或腐生。兰科植物大多数种类分布于南 美洲、溉洲和 e 渊的热带地区，只骞少数麟类糍适应寒冷帮舞由气娱。虫于其广泛分 布于各种生态环境，兰花表现出高度特异的生活习性、形态、结构謦生理特征，最具 独特豹愁它的假鳞茎，生殖系统和与真菌的共生关系。假鳞篓实质上就是肥大、缩短 的茎，既德藏水分与券分，又可进行光会作鼹。兰花懿生殖系统圭蘩是援芯羚糙会成 团，称为花粉团，花粉团与其下部的花粉团柄或粘盘柄以及花粉团柄末端粘附的盘状 或其它形捩的腺体都粘盘连含在起，形成一个复合器官，称为花粉块。花粉块是兰 辩植物独特的嚣富，在铸粉嚣重起罄惫妙熬捧用 3 1 。兰筏全部都是虫媒蕊，授粉过程疆 特，传粉机制复杂而衡妙，在自然条件下，绝大多数兰花的胚株不自受糖，很难形成 蒴果，箕子房发育需凝授粉后才能启动h 】。早在1 0 0 多年前达尔文就对兰花的复杂构 造及其瓣霆虫健粉豹奄妙遥瘦进学了深入豹磅究。兰稀 壹戆耱果实一簸为蘩果，耱子 小而多，种子的胚没商子叶与胚乳，在自然环境下，兰科植物的一生或者莱个生命酚 段，需要依赖脊益真菌对根部的感染以获取营养【3 1 。虽然关予兰花的传粉机制以及与 传粉昆虫熬凌蠲进纯，甚至耱_ 予兹蘑发毫研究清楚，毽还有一骜更鬟要静兰花猿有豹 特征我们却了解的很少。例如兰花花粉粒的早期发育和成熟，花粉团的形成，胚珠在 授粉后的发育和成熟簿。在过去的十年中以拟南芥和水稻为材料进彳予了深入的分予生 戆学褥究，蘩臻了一些萋嚣辩疆浆获育静调控飘错，戈其是开花戆调控辊捌释莸病梳 剥。随着拟南芬姆水稻基匿缀序烈测定酶竞或巍爨宣质组学的嚣展，我嬲澍这些擞越 的研究将驻加深入。相比之下目前针对兰花的分子生物学研究却非常少p j o 1 1 2 兰花的经济价值 花卉业是一项新必的产蛾，特别是近几年来随着社会经济的发展壮大和人民生活 承乎翁挺商，裁痔已或为人类生活豹一类蘸要鬻稿。髫蓊，菡际市场花卉攮发震中分 迅猛，据资料报道，全世界花卉年贸易总额高达2 0 0 多亿美元1 6 。在我国大中城市， 鲡北京，上海，广州和经济较发达的中小城市如深圳、汕头、中山等花卉业的发展迅 速，花卉市场增长遽度很快，花卉的年销售额每年的增幅在4 0 以上。在农业生产 结构调整中，花卉业作为市场潜力巨大的一项新兴产业和新的经济增长点，征在必起 并迅速发展。据报道，花卉业已经成为我阔政府和企业十分关注的一项新兴的朝阳产 业，发展前景十分广阔。截歪2 0 0 3 年底，全阐花卉种植面积4 3 万公顷，销售额3 5 3 亿元人民币，进出阴额9 6 8 0 万美元共有花卉市场2 1 8 5 个，花卉企业6 万多家。尽 管如此，我国仍是兰花出口小国，出口兰花品种档次和技术含纛都很低；而多数鼎质 好、价格贵的花卉种类的种子、种苗等基本是靠进口来满足市场需要。 在全世界花卉业中，兰花是目前花卉中价值最高的一种。兰花花形多姿多态，花 色艳丽丰富，叶形优美，花期长( 切花寿命在半个月以上) ，具有重要的观赏价值和 商业价值，既可以做切栈又可以做盆栽花。兰花在国外早已商品化，年销售爨约占国 际花卉市场的1 0 以上。以热带兰为_ 燕。在我国兰花有国兰和洋兰之分，国兰是指花 小、素淡而清香的兰属( c y m b i d i u m ) 地生品种，主要为春兰、建兰、墨兰、慧兰、 寒兰等5 类，中园、朝鲜和日本等东方国家的人多枣欢此类品种。而洋兰则是指花形 奇特，大而艳丽的热带兰，如蝴蝶兰、石触兰、卡特兰、万代兰等，鹾方国家的人多 喜欢此类品种。洋兰已成为当今世界兰花栽培业的主流。兰花的研究、开发和生产不 但不产生任何环境污染，相反它恰恰是为了美化环境，属生态环保型产业。农发达匡 家和地区如荷兰、日本、新加坡、泰图和我国的台湾省及蛰港，兰芯是羹要的产业。 泰国有兰花公司和兰园2 0 0 0 多个，年创汇2 亿多美元。美国有3 0 0 余家兰花公司，年 产值l 亿美元以上。另外还从国外进口1 0 0 0 万美元以上的盆花| 觏切撼。爨本是亚测最 大的兰花消费国，国蠹兰花年产俊上亿美元，每零进口甥筏馀悠3 0 0 0 多万类型“”， 花卉市场蹲年的销售额达数十亿荚嚣，与麓花褒剃蓠茅嘲。棼整每年芯卉燃舜总额送 1 3 亿美嚣，箕中兰花鑫2 0 麓右掰。奁速骜主要鹣篓兹黧产鬻酾瀵爨嚣邑形藏一辩褥 豫救“兰掩正业”。我隰栽培兰撬鼓然瑟史悠久，资潦率宦，毽一誊延续馋缝菸家嶷 种梭方式，褥且长期以来以斟兰为妻体，慰予热豢兰螅生产则起疹较姨。囊予兰筏晶 种鼙一，产照纯、市臻他程度低，秀嬲上黛产耱嚣壤佳较强，艇产鼓术隶乎落惹，涂 台湾、海纛、云蘧等少数兰花将檀基地癸，至今嶷寒影戏大翡摸粪鼗德生产及鞲售侮 系【刖。 2 1 1 3 兰花的繁殖及育种 兰花酌繁殖分为羊孛予繁殖、分抹繁殖和组织培养。兰科植物种子缁，j 、焉多，一个 蒴果可产生1 0 十1 0 6 粒种子。在结构上兰科植物种子可分为两个主蒙类型：少数种类的 褥子胚初步分化，具有一个发育不全鹊子时，这类穗子比较套翳葫发；绝大多数穆类 兰花种子豹胚缀简单，不其备子咔和胚乳，无营养物质供发芽之用，常常需鼗菜种真 菌的帮助才能萌发，即b e r n a r e d 创嶷的共生萌发法1 9 d o 。因此在自然状态下兰科植 物辫子萌发搴极低，繁骥j 常困难，传统上兰花裁壤主要靠分橡繁建。分撩繁建是壹 兰花基部的假鳞茎或短蒸发出小芽长成新菌丽成，函此繁殖周期长，一般需簧2 3 年， 且繁殖率低，育种进程缓慢。另外由于长期无性繁藏，造成带瘸毒的植株日蓣增多， 使兰花的优良髭质下降 3 , i t l 。因j 鞋：兰筏豹组织培养楱终弓| 人注毽。 兰兹鳃级壤莠熬辑突开始手2 0 邀鳃2 垂年我。l + k a n d s o n 予1 9 4 6 冬开裁t 兰花耱子 萌发的组织培养( 刘鬻林等，2 0 0 3 ) 。法国人( q m o r e l ) 于1 9 6 0 采用太花惠兰的茎尖， 在含有纲熬分裂豢约 壤券萋上进露壤菸，发壤蒸受转生缀绂澎大形成嶷瓣形瓣，l 、 球锩，这些枣球终与耱麟发旁成懿壤臻髂咎常搽酝，黢称必类疆球鍪( p r o t o c o r m - l i k e b o d i e s ，p l b s ) 。原球嫠增殖较快，并分化出根和时，篱次获褥麓花的无瘸辫檬株。 藤球茎爨兰辩撩骢鼹一黪霉囊方式，植物生懿攀溺粪( 1 9 9 4 颦) 孛将之悫义为攘撩 蒸舔峦毯滏寒努诧瓣游毽缨藏缝成瓣土溱有颈端燕故煮朝时潦萋，下添鸯援旁不定 根、初其球熬形态的球状体。而由外檬体如叶尖、蒸尖、花楼簿嫩避组织诱导壤券产 璺三类 娃予滕塔蘩翳齄撼缝缓，透露髂麓类源蘧墓竣攘骧球茎。w i m b e r ( 1 9 6 3 ) ) 靖m o r e l 蛉方法遴襻了殴进，袋耀滚体摄荡培养鹣方法，瓣浚了蒋l 球蒸增麓静速度，在瓶藕 内获得犬鬣的氍生植榇【垤l 。此后组织墙辨技术很快地被从事兰诧磺巍秘生产续罄卷应 震魏兰蕊黪菠耱匏捷速繁麓审去。疑遗诲雾臻究喾夔努杰，嚣嚣骞邋弼藩、数器耱兰 季尊植物可鞋躜缀织培莽静方法送行繁麓。这一方法猩许多重要的洋兰鲡虎头黧、卡特 兰、石斛兰、蝴蝶兰、文心兰、万代兰、米尔顿麓秘撼兰等生审褥裂应熙。嚣多 遂 避兰花懿缀织壤葵方法，爵戮薅瘾戆感染瓣鑫释避褥聪爨，遣霹淡袭培养瓣涎释中燕 入诱交裁，餐佼幼苗产生嶷辩，戳达鳓培育新爵种麓酱韵。 虽然兰犍远源杂交比较容易戏功，释闼甚至熙耀杂交并 # 雉攀。兰花耱挚麓发是 兰蓬杂交窍耱黪蓑霾舔磐，洋兰杂交耱予荔藐发，麓发螽形藏藤塔嫠，残嫠俊，篱拜 嚣肖戒了多个种杂交褥成瀚桑体杂稀。黼篓杂交种予荫发难，兰花杂交育种迸展缓慢， 3 种子萌发盾形成根状茎，成苗难j 杂种试管苗的嫩产效率低。由于共生萌发法需要先 势离整耱磨戆囊蓥，毳漤嶷杂，露蓠基缀少镬援。现在露矮辩楚姆转予撵释在培养基 上无菌萌发，即菲共生蕊靛。无菌萌缴简化了葫笈和育苗技术，有很大的实弼价值。 兰花种子萌发技术的进步、组培快繁披术的应用、新品种的不断宵出和栽培拽术的不 断握裹，掇大戆攘葫了兰藏鲢繁殖霸育种工箨的遴震1 曦| 3 l 。 1 1 4 离簿植物开诧的基因调控及以p ，基因 。 。毒；1 霉l 富 世界上品知的植物脊近3 0 万种，熟中9 0 以上怒开花植物i 删。高等植物税是最复 杂也是最其衡吸弓l 力的嚣容。花的形成是一个十分笈杂的发育过程，既受内在一系列 基透表运势键控，又受终器繇凌嚣豢瀚影薅。透2 蚤冬来，蘧着分予生臻学霸分子建黄 学的发展，人们开始从分予水平上来认识花发育的本质和机制。翻从1 9 9 0 年在拟南芥 菜( a z a b i a d o p s i st h a l i a , 豫) 祁金鱼擎( a n t i r r h i u m $ a j u s ) 中第一次分离至q 控制裢发 育瓣嚣嚣异爨萋嚣( h o m e o t i cg e n e ) 爨来，嚣在悉获褥了不多接镶花发謇酶突变蒋， 克隆到了许弗与花发育有关的基因，并初步构建了糙器官发育过糨的遗传模型。金鱼 革、拟南莽憋植物鲍花由圆种类型的凝器官缀成，即蕊萼( s e p a l ) 、花瓣( p e t a l ) 、雄 蕊( s t a m e n ) 稔心瘦( c a r p e l ) 藐嚣富捺别畿彝。玉豹瑟球形，蠡穆耱犍( w h o r l ) 。撩甥花 的成年器官鼹从分生组织发育而来的，髂养分生组织产生花序分歙组织，花序分生组 织产生花分篷媛缓，截分盘缍织产生穗器官愿基，嫩慝莛器官藤罄产生蕊器喾l 蛳， 1 1 4 2 链畿育调控基因 1 1 4 t2 1 糕序公生缱宝 l 决定基医 该凳基鞭惫摇整蠢芬t e r m i n if l o w e r t 巍鼹踉蕊鞭、藏鸯莽靛c l a t v a t a l ( c l p t a 拟南芥的“躐然因和会龅攀中的c e n t z o r a d i a i 内蟛w 基因。胞，姆洒馑因所编码的 爨盎覆与缨羧海蕊号抟警褰关蛋自璇嚣港类强 5 l ，蒸壤毽靛强焱这鬟? 瓣鼹糖戳蠖 瀚。蕊j 鞴溅镬嚣熬耋豢髓藐是保持藏序务皇缀缀褥链，两撵稍筏努生组织特异基 因的表达队5 剞。现已证实黜盯基因与营弊型分生组织向生殖型分擞组织发育过糨中的 讽节毒关 5 3 - 5 4 1 。舅癸还肖磷突表饕，叛囊菸篷翻国旗嚣与蓬寒分裳缀绞是葱势垒缀缓 躺转交骞关，m a r t i n e z ( 1 9 9 2 ) 试为翻嵫麓表达禳溅鼹其与花阉滞箨型基嚣箍撬作用 4 的结果1 5 ”。 1 1 4 2 ，2 花分生组织决定基因( l f y f l o ，a p l s o u a ，o a l ) 花分生组织特征基因包括从拟南芥中克隆的l e a f y 亿f 矽、a p e t a l a 翻刚和倒弛 i f l o w e r 矧d 基因，金鱼草中的( p l o r i c a u l a ( p l o ) 和“蚴懒捌( 删基因1 5 0 , 5 6 - 5 7 】。 f l o 和脯b 属于转录因子，有7 0 的相似性。l f y 控制着花分生组织的形态特征，又与 花瓣和雄蕊的形成有关 5 8 - 5 9 1 ，该基因只在幼龄花原基上有较高的表达，l f y 突变体能 部分地引起花转变成花序茎。研究还发现l f y 突变体使花序分生组织向花分生组织的 转变部分受阻m 5 8 。5 9 。尼瑾因是最早利用转座子突变方法从金鱼草中分离出来的， 它的突变体使花完全转变成了花序茎，原位杂交显示尼码因仅在花发育的早期阶段 有短暂表达。另一类花分生组织决定基因是5 留删与爿用基因，s o u a 和彳丹的产物同属 m a d s b o x 的转录因子，它们有6 8 的相似性。印哪在花的早期发育和花器官形态特征构 建中起作用【5 “。爿用在册表达之后开始表达，在花分生组织的形成及轮1 和轮2 器官正 常发育中起作用。3 5 s a p l 的组成型表达使转基因植株开花提前，且侧花序分生组织 转变成单花，爿用缺失后，营养生长不能正常向生殖生长转变f 6 0 1 。 1 1 4 2 3 花器官决定基因 花艨分生缀织产生何秘裢器官是由鄹源异裂基因( h o m e o t i c g e n e ) 鼹攘巷4 的。所谓 同源异型基因，是指有一些耩因在决定税器官性质上具有同源的功能，而具有同源功 熊的墓嗣在结构上寄一定的保守傲，我们把这些基因称为同源异激基因”。c o e n 和 m e y e r o w i t z 予1 9 9 1 年提基了兹愿熬形残鲍“a b c ”模式缀说。瑕摄芯器富翁弱添雾蹙突 变，将同源异型基因分成三犬类a 、b 和c 类，花器官的性质便是由这三类同源异型基因 所决定嘲，“a b c ”模式假说现在融发展为“a b c d e ”模型 6 3 1 。目前在拟南芥和金鱼革 中发现5 对震源异型基因：a p i s o u a ，蠢掰d e f , 声z 晓酝蠢牙戌e n4 怒a p 2 o g d ， 它们都属于 i a d a b o x 基因。其中a p 、a p 2 属予a 类纂因，a p 3 、删8 类基因。 劣跌忍点满于c 类基因。每一裳同源异型熬园对邻近的两个轮起作用，每一轮又对应着 不同款鄹源异型綦医瓣缝会。叁终翻走熬四轮蕊器富麓萼、花瓣、壤蕊羁心疫孛，每 相邻两轮由一类基因调控，即a 类基因调控l 、2 轮税器官萼片、花瓣的发育，b 类 纂因调掇2 、3 轮花嚣官花瓣、雄蕊的发育，c 类基因调控3 、4 轮花器官雄蕊、心皮 懿发育。在野玺型藏串，霆漂异型基霆稷纛它嚣】越箨焉豹轮孛大量表这，这耱嚣竣特异 性表达主要通过同源异型基因之间的拮抗作用如a 、c 互相接抗或自身调控来实现 62 6 4 碉或是两个功能甄相重疆的脚彳硝早期基因起始激活的产物所导致的脚】。 1 1 4 2 4 开花时间决磁基因 在攮甥豹开芯过程审，霹照长发怒一个 鬻关键的嚣素，窀够调控拜筏豹起戆， 然而有一炎基因可以不受日照长度的影响，它们的袭达足够触发开花，这一巍基因被 称为开花时间决定基创6 7 1 。如：f v e , 6 1 1 、a d g - i 、c o , p p f - i ，b e t 2 、f c a 、f h a 、 f t , g a l 、f p f - i 、甜、毋、p g m p h y a 蒺霞促进羚藏，瑟e m f , c c a l 、c l 式e lf 3 、 l h y ，s p y , t f l 、w l c 、e s d 4 等起抑制作用郴】。 1 ，1 4 3 芯分生组织决定基因及a p t 的作用 在金徼革和拟南芥巾发现有一类影响花原基发育的突变体，即不能完成从花序分 生组织到花分生组织的转变，使在应该长花的位簧长成了不确定的茎，将影响这一转 交过程懿蘩霾髂终芯分嫩缀缓决定蒸瓣1 5 啦。花分黧缢织凌定纂戮惫摇l f y , f l o , a p i ， s o u a 和c a l 基因。 花发育的第一步是从花序分生组织转变成花分生组织，在这一过程中，花分生组 绥决定萋囡超鬓了关蕤豹佟露，宅 f l 豁突变会遥褥藏势生缝织懿鼯或，使疲该藏菝魏 位置形成丫不确定的茎【5 0 l 。爿用就娥这样一个来源于拟南芥的糯分生组织决定基因 1 6 3 - 6 5 1 ，同时必是一个同源异型基因。a p l 的突变导数嚣一轮的花姆发育成叶状器官， 繁2 耱懿藐瓣缺美，蘩3 、连轮菱蔫炎燕常戆箍黎辩心麦，在第l 辘器富熬蔽舔鬻惫食 着第二轮穗，其原因可能是花序分生缀织未转变成为花分生组织。而它与i f y 的双突 变体可以觉彻底地使花转变成花序鍪哺”，这说孵照然鹏雕对拟南芥的獠分生组 鲠鹣凌定楚必需豹，毽京选哭受赛罄分鲢控裁途径，蠢重巍三髓鏊嚣囊控裂静途径是 可以互补的f 7 2 】。一用属q ：m a d s b o x 歙膝成员，编码一个转录激活因子脚】，同时它自 身的表达也受到开花对阍决定基因产洲6 1 】幕l 另一个芯分生组织决定基因产f 5 l 驰激活 魄爱蓬分垒缎缓决定萋因t e l l 熬静剃卿鼬 。a p i ；醚矗黼熬塞器缀努乏一，控裁萼 片和花瓣的彤成，在决嫩花分生组织性质上a p i 基因在l f y 基脚下游起作用，爿尸，基 因的表达受l f y 激活f 6 0 , ) 3 0 s ) 。在花发育零勰，彳刀基嚣起调节花联蒸特异性的撵耀，蛙 瓣茬整个藏辣萋孛表遮，在花茇弯魏麓爱蔽手在轮l 秘轻2 孛表达，这簿菝认为是藐器 官特异性基因。在转基因植物中删程两个时期中的任何一个阶段表达，说明这两 种功能是可以暂时分舞驰 4 9 , 7 6 1 。m a n d e l 科思c a m v3 5 s 痘魂予馊a p i 基因在羧寓芬孛 缝藏董表达，太多数转基嚣禳耪嚣嚣蕊辩溺都罩予野生鏊。躞戮鹣异链表这w 缩短 6 檎株营养生长时期。这说明一月基因编磷了一个控制筏发育的开关l 鲫。 1 4 4 花分擞组织决定基嗣的转基因槭物蕃舞究 花分生组织决定基因对决定分生组织的成花命运是必须的，但这些基因在功能上 互相重叠，互为调控，且在檬物生命周期的不同阶段和不同环境条件下表现出一窳程 度戆挺互蝥找，联鞋缓难确定每一个基嚣焱决定藏蓬会运孛兹其薅穆建f b 】。安羁凝等 将a p l 基因转入矮牵牛中，转基因植株在嫩根后1 5 d 左右便在组织培养容器内持续不 断地开花。而缀过同样处理的野生型和p c r 阴性植株却从未在组织培养容器内开花。 雯一个麸羧露癸串宠整数兹势生缀织决定蒸溺l f f 棱转入一静8 年骧土才能嚣蕊熬按 树( a s p e n ) ，转然因杨树仅7 个月就开花了，转基因杨树拄形态上也发生变化由乔术变 成了较矮的丛擞灌术1 7 引。从水稻中克隆出燃基因，并使其在烟草中表达，烟草花期 曼蓉提蔻。l e a n d r op e n a 麓缓蠢磁窝三国纂嚣在穰撬枣过囊表这，转蒸嚣檀椿i 每鼷豢 e 常开花结果，大大缩短了柑橘的童期。郡寒霜等从拟南芥中克隆到册基因，并将l f y 基因转入菊花，使菊花花期撼前6 0 d 一7 0 d 。另外花分生缀织决定基因爿朋和l f y 在葡萄、 荔棱疆及农终铭窳稻等孛夏蠢痘瘸，都袭襞为花赣懿挺蘩。这郡说明a p l 基因在壤耱 花的形成过程中具有很重要的作用。从对拟南芥、金鱼草等以上植物发育的研究中发 现花发育在进化上具有保守性。说明花分嫩组织决定基豳在不同种豹植物中是高度保 守懿，擎控截开藏鼍馥在不鬻缓魏秘孛转移，不曩骞辣瓣特异往。羧瓣阉滚吴蝥慕嚣 在不同植物中的表达可以用来改变植物花期，加快花发育进程。为我们利用基因转化 技术实现人工控制一些生长周期长的名贵花卉的开花时悯提供了可能【7 3 】。 1 1 5 观赏撩物的花色激o h s a 基因 1 1 5 1 花色i 勺产生 蓰夔是鼹爨疆懿藐戆一令爱薰要静将镊，嘏是生产串花寿菇潢瓣蓬要指标。穰貔 的筏色( f l o w e rc o l o r ) 狭义爨捂撼瓣的藏憋 广义上懿拢色还起毯黢藐接物妻每藏琴、 拣蕊、雌蕊甚懋撬片发育成撬瓣的颜色p7 1 。筏也是光线照射到花瓣点穿遴色素联时， 部分疆冁收，郝努棱海绵缓缓爱射掰露，褥壤遴蓬琶繁簇嚣避入我稍黢帘新产生的惫 瓣，毽裢色素超奎要馋用f 纠魁。惫素主要黪在予兹瓣魏上表痰，撵樾趱织逶誊苓客毡 豢。海缡层细腿超着反射光线的作用，使髓瓣颜色更擞鳞艳l 期。花饿色素燕要包撼三 大黉释：第一激楚粪黄醺粪悉豢，包括筏鬻蜚、黄蘸、黄酮簿、苯蒸笨乙烯舔，豁溶 7 于水。类黄酮( f l a v o n o i d s ) 存在于花瓣表皮细胞液泡中，类黄酮的积熏产生的颜色 范围较广，该炎色素产生姨浅黄嚣蓬紫豹全部颜色蓬添【鲫。第二类爱葫萝卜素类毪类， 难溶于水，以结晶或沉淀的形式存在于细胞质中，故又称为质粒色素类，类胡萝卜素 ( c a r o t e n o i d s ) 积累主要产生黄色和橙色花 8 ”。第三类是与生物碱有关的其它水溶性 色素，躲嚣絮素、小檗碱、警粟馘等。鼯菜素( b e t a l 越n s ) 鹣积累主要产生黄色和红 色花( 划石泉，2 0 0 4 ) 。另外花魏还受其他因素的影响，包括色素细胞的蹦值、金属 离子、辅助色素及花瓣表皮形态等均影响花色 8 2 - 8 4 1 。如花菖蒲的紫色不仅与高含量的 花色素有关，还受矫花被表皮缅勰酌长度和 j 确静影响 8 2 1 。前两类色素在植物莽中广 泛存在，恧甜菜素只存在藜目植物。由予芯色豢不稳定，在檬物中燕要以提色营( 浆糖 体) 存在。花色苷是花色索与糖以糖苷键结合丽成的一类化合物，广泛存在于械物的 花、栗实、萎、秆和根器留酌缅溉液中，控制花获红色至紫色、藏色的一系捌变化， 焚含量的增蔑戏降低均可缝改变芯的颜凭，兹色素萤也是类黄酮象让合戏兹产携。 1 1 5 2 类黄酮的生物合成 类黄酮物质是普遍分布于植物体内的次生代谢物，为植物所特有。已知类黄酮有 3 0 0 0 种，参与植物许多功能，如与花色、防u v 损伤、难长素运输、抵御瘸原、诱导病 爨摭瘸，花羧霄洼，禳瘗豹形残等兹有关系强弱。类黄辩生物禽成受发育、维织专一经 调节，而且也受光、真菌引发物、紫外辐射、创伤等环境因豢的诱导。其含成涉及多 个代谢步骤，由多种酶催化，因而与之相关的络构基因及调节基因也较多，它们的作 攥桩瑾卡分复杂。 1 ；5 2 。 类黉鞭爨生镄台残途径 筵色素替会藏豹遮簧攀磅寒越戆予嚣德承艇魏受莛色麓逶传磷窕( 题潞珠， 1 9 9 7 ) 。月前对植物中普遍腿于类黄酮的花色素瞥的台成途径以及岛之相关的基熙研 究较为深入嗣，而且穗经分离到了合成逸径中几乎所宥酶的撼因鄙墙田( 国i - i ) 。孤米、 金叁鼙秘矮拳串等骜怒磅究蓰色素营秘类黄醺生穆合成途径翡常熏赫鹩l 蝤。蓰氅紊莹 ( a n t h o c y a n i n s ) 是一类主要的类黄阐色索花敷素的代谢途径是受一系列酶控制的， 存在有两类影响花色豢苷生物合成的基因；一类鼹不同植物种袋共嗣具有的直接编码 惫素生物会或途径熬缭稳萋羧，纂二类虽控毒l 终褥基霆表迭煞强度麓程式，影曦夔素 的时空积累的调节基因f 8 8 删。 g 由苯丙氨酸到花青索的合成可以分成3 个阶段，第一阶段凼苯丙氨酸到香豆酰 c o a ，这是诲多次生钱滋共有酶；第二除段由香显簸e 8 盎到二氢焚褒酵，这是裳黄聚鼗 谢的关键反应，它合成花青索和其它黄酮物质，查尔酮合成酶( c h a l c o n e s y n a t h a s e ，c h s ) 起了关键作用；第三阶段是各种花色素苷的合成，黄烷酮- 3 - 羟化酶 ( f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ，f 3 h ) 撩纯二氢黄浚聚( n a r i n g e n i n ) 生成= 爨荑酮簿 ( d i h y d r o f l a v o n 0 1 ) 。f 3 5 h 是合成菔色的花翠索- 3 - 葡萄糖莆的关键酶1 9 9 j 。二氢黄 酮醇还原酶( d i h y d r o f l a v o n o l4 一r e d u c t a s e ，d f r ) 是催化d h k 、d h q ( = 氯栎皮黄 醒) 、d h 鞋二氢耪褥黄鬻) 分裂形袋笼色莛葵素、兹专素、蕊淤索豹关键懿。无色莼 色素在花色索合酶( a n t h o c y a n i d i ns y n t h a s e 。a n s ) 催化下产生有色花色索。在这 一过程中，f 3 h 和f 3 5 h ，d f r 是最关键的酶，它们最终决定合成花色索瞥的种 类窝兹豹凝篷。 1 1 5 2 2 花色素基因 蓬躲藏毪形戏涉及裂多穆基因懿镑鼹终鼹。筏色簇嚣毽糕麓毪索墓嚣、凌慈豢耋 基因、筏戆熹分毒萋躐、耱韵色素鏊灏、转座予蒸露、控截猩瓣骚 蓬静蒸阂等【7 霹。 甑素的嫩物合成受多基因控制，丽筏德的表现还髓到其它因索的影响。f o r k m a n n ( t 9 9 1 ) 将这蓬花色蒸羧分麓鞋下足类：( 1 ) 羧露焚浆类望携会藏拳个步骤浆蒸霆； ( 2 ) 与舞鬻黉修钵毒蔑熬鏊霾；( 3 ) 舞兼全帮戴舔努念戒途经弱谖带基髫；( 4 ) 影响 黄酮类浓度的旗因( 增强或减弱色索合成，阻皮散素积累，弓i 起酶健溅化学褪 魏) ，( 5 ) 麓稳形结秘露关的基透( 筏瓣特意粼袋毯素不瓣熬产蹩或积累，藏褒 合体静形成，转痊予譬| 越麴基鞫苓稳定表达) ，氆) 影酶旄怠瓣基嚣或嚣予( 簇着 色，黄酮类与金属离子的互作，渡泡p h 值) ，( 7 ) 控制旄瓣黾、乳突、散素