（外科学专业论文）5脂氧合酶在梗阻性黄疸大鼠肝组织中的表达及意义.pdf

学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密囹。 学位论文作者签名：辱牟 p t - 年( ，月i 日 将撕签名：绿三夤 沙f 年6 月，目 分类号r 3 3 3 4r 5 7 5 江荨大擎 硕士学位论文 m a s t e r sd i ss e r t a t i o n 5 脂氧合酶在梗阻性黄疸大鼠肝组织中的表达及意义 e x p r e s s i o no f5 - l i p o x y g e n a s ei nl i v e ro f o b s t r u c t i v e ja u n d i c e r a t sa n di t ss i g n i f i c a n c e 指导教师 俭三苤 作者姓名 墓至 申请学位级别 亟 学科( 专业) 窆e 型堂 一 论文提交日期2 q 曼呈生垒旦论文答辩日期一2 q 曼曼生鱼旦 学位授权单位和日期 江菱太堂2 q 曼曼生鱼旦 答辩委员会主席 评阅人 江苏大学硕士学位论文 目的 摘要 研究5 脂氧合酶( 5 1 i p o x y g e n a s e ，5 - l o x ) 在梗阻性黄疸大鼠 _ _ ( o b s t r u c t i v e j a u n d i c e ，o j ) 肝组织中的表达及意义。 方法 ( 1 ) 将雄性s d 大n 4 8 只随机分为3 组：假手术组( s h a m 组) 、胆管 结扎组( b d l 组) 、a a 8 6 1 干预组( b d l + a a 8 6 1 组) ，每组1 6 只。 ( 2 ) 氯胺酮腹腔注射麻醉后经腹游离胆总管并结扎、切断，制作 梗阻性黄疸大鼠模型。s h a m 组仅开腹后游离胆总管，不结扎切断胆 总管。 ( 3 ) b d l + a a 8 61 组术后第一天起，每天腹腔注射a a 8 6 1 ，1 次d ， 剂量为：0 2 m g 10 0 9 - 1 d ，直至处死。s h a m 组和b d l 组则同期腹腔注 射等量生理盐水。 ( 4 ) 分别于术后第7 天、1 4 天处死大鼠，鲎试剂测定血浆内毒素含 量；用免疫组化检测肝组织5 l o x 的表达，e l i s a 法检测大鼠血清 l t b 4 ；t n f a 、i l 6 的水平；肝组织匀浆检测丙二醛( m d a ) 、超氧化 物歧化酶( s o d ) 的含量，全自动生化分析仪测定血浆a l t 、a s t 水平； 肝组织常规h e 染色，光镜观察肝组织的病理改变。 结果 ( 1 ) 血浆内毒素含量：b d l 、b d l + a a 8 6 1 组较s h a m 组血浆内 毒素含量显著增高( 尸 0 0 1 ) ，b d l 、b d l + a a 8 6 1 组在7 天、1 4 天 江苏大学硕士学位论文 时内毒素含量比较无统计学意义； ( 2 ) 肝组织5 - l o x 的表达：s h a m 组5 - l o x 轻微表达，b d l 组 明显表达，b d l + a a 8 6 1 组各个时点较b d l 组5 - l o x 表达显著降 低( 氏o 0 5 ) ； ( 3 ) 血浆l t b 4 水平的变化：b d l 、b d l + a a 一8 6 1 组较s h a m 组 血浆l t b 4 水平明显升高( 尸 o 0 1 ) ，b d l + a a 8 6 1 组较b d l 组7 天、 1 4 天时l t b 4 水平显著降低( 尸 o 0 5 ) ； ( 4 ) i f l i 浆t n f 一0 t 、i l 一6 水平的变化：b d l 、b d l + a a 一8 61 组较s h a m 组血浆t n f 仪、i l 6 水平明显增高( 尸 o 0 1 ) ，b d l + a a 8 6 1 组较b d l 组7 天、1 4 天时耵师- 伐、i l 一6 水平显著降低( 尸 o 0 5 ) ； ( 5 ) 血浆a l t 、a s t 水平变化：b d l 、b d l + a a 8 61 组较s h a m 组明显增高( 尸 o 0 1 ) ，b d l + a a 8 6 1 组较b d l 组每个时点a l t 、a s t 水平明显降t k 毛( 1 4 天时a l t ：p 0 0 5 ，余p 0 0 1 ) ； ( 6 ) 肝组织m d a 和s o d 含量的变化：b d l 、b d l + a a 8 6 1 组大 鼠肝组织m d a 含量明显高于s h a m 组( 尸 o 0 1 ) ，b d l + a a 8 6 1 组各 时点m d a 含量均明显低于b d l 组( 尸 o 0 5 ) 1 b d l 、b d l + a a 8 6 1 组s o d 含量明显低于s h a m 组，b d l + a a 8 6 1 组各时点s o d 含量 均明显高于b d l 组( 尸 0 0 1 ) ； ( 7 ) 肝脏病理形态学观察：胆总管结扎术后第7 天、1 4 天取标本 见肝脏肿大，呈黄褐色，胆总管近端明显扩张，且张力很高；假手 术对照组无上述改变。光镜下肝脏病理改变：b d l 组大鼠可见小胆 管增生，汇管区炎性细胞浸润，1 4 天标本见大量小胆管增生，部分 江苏大学硕士学位论文 区域肝细胞出现变性、坏死；相同时间点b d l + a a 8 6 1 组大鼠肝细 胞变性坏死较b d l 组轻；s h a m 组大鼠无明显变化。 结论 ( 1 ) 梗阻性黄疸时，血浆内毒素含量明显增高，肝组织在大量内 毒素刺激下5 - l o x 表达明显增加； ( 2 ) 5 l o x 的下游产物l t b 4 在梗阻性黄疸时血浆含量明显增高， 血浆中的t n f 0 【、i l 6 水平同步增高； ( 3 ) 使用a a 8 6 1 干预后，5 - l o x 表达明显减少，肝损伤明显减 轻，血浆中的炎症介质( r n f 0 【、i l 6 ) 明显下降。 关键词 梗阻性黄疸；5 - 月旨氧合酶；白三稀b 4 ；a a 8 6 1 ；内毒素性肝损 伤 江苏大学硕士学位论文 i v 江苏大学硕士学位论文 o b j e c t i v e a b s t r a c t t oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no f 5 - 1 i p o x y g e n a s ei nt h el i v e ra n dt h e r o l eo f5 一l i p o x y g e n a s ed u r i n go b s t r u c t i v ej a u n d i c e m e t h o d s ( 1 ) f o r t ye i g h tm a l es p r a g u e d a w l e yr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e d i n t ot h r e e g r o u p s ：s h a m o p e r a t i o ng r o u p ( s h a m ) ，b i l ed u c t - l i g a t i o n g r o u p ( b d l ) ，a n db i l ed u c t - l i g a t i o np l u sa a - 8 6 1 g r o u p ( b d l + a a 一8 61 ) ( 2 ) r a t s w e r ea n e s t h e t i z e dw i t hk e t a m i n e b yi n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n i nr a t so fb d l g r o u pa n db d l + a a 一8 6 1 g r o u p ，c o m m o n b i l ed u c tw e r el i g a t e d a n ds e c t i o n e d i ns h a mg r o u p ，r a t sw e r eo n l y e x p o s e dt h ec o m m o nb i l ed u c t ( 3 ) t h er a t si nb d l + a a 8 6 1g r o u pw e r ed a i l yi n t r a p e r i t o n e a l l y i n j e c t e dw i t ha a - 8 61 ( 0 2 m g 10 0 9 - d 1 ) i ns h a mg r o u pa n db d lg r o u p t h er a t sw e r ei n t r a p e r i t o n e a l l yi n j e c t e dw i t hn o r m a ls a l i n ei nt h es a m e p e r i o d ( 4 ) t h er a t sw e r es a c r i f i c e da t7a n d14d a y sa f t e ro p e r a t i o n t h e l e v e l so f p l a s m a e n d o t o x i nw e r em e a s u r e d u s i n g l i m u l u s t e s t ； i m m u n o h i s t o c h e m i t r y w e r eu s e dt od e t e c tt h e e x p r e s s i o n o f 5 - 1 i p o x y g e n a s eo fl i v e r t h e s e r u ml e v e l so f l t b 4a n dt n f a ， v 江苏大学硕士学位论文 i l 一6w e r ea n a l y z e db ye n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) t ot e s tt h ec o n t e n to fm d aa n ds o do ft h el i v e rt i s s u eb yh o m o g e n a t e ， a l ta n da s tw e r et e s tb ya u t o m a t i cb i o c h e m i c a la n a l y z e r b e s i d e so f h e p a t i cp a t h o l o g i c a lc h a n g e s i nh e m a t o x y li na n de o s i n ( h e ) s t a i n e d s e c t i o n s r e s u l t s ( 1 ) l e v e l s o fe n d o t o x i ni ns e r u m ：l e v e l so fe n d o t o x i nw e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e ri ns h a mg r o u pt h a nb d la n db d l + a a 一8 61 g r o u p ( p 0 o1 ) ；c o m p a r i n g b d lg r o u pw i t hb d l + a a 一8 61 g r o u pi n t h e7o r14d a y s ，e n d o t o x i nc o n t e n ti sn os t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ； ( 2 ) e x p r e s s i o no f5 - l o x i nl i v e rt i s s u e ：e x p r e s s i o no f5 - l o xw a s s i g n i f i c a n t l yl o w e r i ns h a mg r o u p ，s i g n i f i c a n t l ye n h a n c e de x p r e s s i o no f 5 一l o xw a ss h o w e di nb d lg r o u pa n db d l + a a 一8 61g r o u p ，b u ti n b d l + a a 一8 61 g r o u p ，e x p r e s s i o no f5 - l o xw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e r t h a nb d l g r o u pa te a c ht i m ep o i n t ( 尸 0 0 5 ) ； ( 3 ) c h a n g e si ns e r u ml t b 4 ：l e v e l so f s e r u ml t b 4w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i nb d lg r o u pa n db d l + a a 一8 61 g r o u p t h a ni ns h a m g r o u p ( p 0 01 ) ，c o m p a r e dw i t h b d lg r o u p ，h o w e v e r , s i g n i f i c a n t l y l o w e rl e v e l so fl t b 4i nb d l + a a 一8 61 g r o u p a te a c ht i m e p o i n t ( 氏0 0 5 ) ； ( 4 ) c h a n g e si ns e r u mt n f - oa n di l 一6 ：l e v e l so fs e r u mt n f - oa n d v i 江苏大学硕士学位论文 i l 一6w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nb d l g r o u pa n db d l + a a 一8 6 1 g r o u p t h a ni ns h a mg r o u p ( 尸 0 01 ) ，l e v e l so fs e r u mt n f aa n di l 一6w e r e s i g n i f i c a n t l yl o w e ra te a c ht i m ep o i n ti nb d l + a a 一8 6 1 g r o u pt h a nb d l g r o u p ( p 0 0 5 ) ； ( 5 ) c h a n g e si ns e r u m a l ta n da s t ：l e v e l so fs e r u ma l ta n d a s tw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nb d l g r o u pa n db d l + a a 一8 6 1g r o u p t h a ni ns h a mg r o u p ( p 0 o1 ) ，c o m p a r e dw i t hb d l g r o u p ，h o w e v e r , s i g n i f i c a n t l yl o w e rl e v e l so f a l ta n da s ti nb d l + a a 一8 61 g r o u pa t e a c ht i m ep o i n t ( a t14d a ya l t ：尸 o 0 5 ，o t h e r sp 0 o 1 ) ； ( 6 ) c o n t e n t so fm d a a n ds o di nl i v e rt i s s u e ：i nb d la n db d l + a a - 8 61g r o u p ，h e p a t i cm d aw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ns h a mg r o u p w h e r a ss o dl o w e rt h a ns h a mg r o u p i nb d l + a a 一8 61g r o u p ，l o w e r m d a ( p 0 0 5 ) a n dh i g h e rs o d ( p 0 0 5 ) w e r ef o u n dc o m p a r e dw i t hb d l g r o u p ； ( 7 ) p a t h o l o g i c a lc h a n g e so ft h el i v e rb yo p t i c a lm i c r o s c o p ei nh e s t a i n i n g ：s m a l lb i l ed u c th y p e r p l a s i a ，i n f l a m m a t o r yc e l li n f i l t r a t i o n ， d e g e n e r a t i o na n dn e c r o s i so fl i v e rc e l li ns o m er e g i o nc a nb es e e ni nb d l g r o u pa n db d l + a a 一8 6 1g r o u p ；b u ta tt h es a m et i m ep o i n t ，l i v e rc e l l d e g e n e r a t i o na n dn e c r o s i si nb d l + a a 一8 6 1r a t sw e r el i g h t e rt h a nb d l g r o u p n os i g n if i c a n th i s t o p a t h o l o g i c a l l yh e p a t i cc h a n g e so b s e r v e di n s h a m g r o u p c o n c l u s i o n s v l i 江苏大学硕士学位论文 ( 1 ) w i t hl e v e l so fs e r u me n d o t o x i ni n c r e a s i n g ，e x p r e s s i o no f5 一l o x i nl i v e rt i s s u ei ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rd u r i n go b s t r u c t i v ej a u n d i c er a t s ( 2 ) c o n t e n to fp l a s m al t b 4 - - d o w n s t r e a mp r o d u c t so f 5 - l o xw e r e s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw h e ni no b s t r u c t i v ej a u n d i c e ；l e v e l so fs e r u m t n f aa n di l 一6w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw i t hc o n t e n to fp l a s m a l t b 4i m p r o v i n g ( 3 ) b ya a 一8 61i n t e r v e n i n g ，e x p r e s s i o no f5 - l o xi n l i v e rt i s s u e s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ，l i v e rd a m a g e dl i g t e n i n go b v i o u s l y ；p l a s m ao f i n f l a m m a t o r yf a c t o ro b v i o u s l yd e c r e a s e d k e yw o r d s o b s t r u c t i v ej a u n d i c e ；5 - 1 i p o x y g e n a s e ；l t b 4 ；a a - 8 61 ；e n d t o x i c h e p a t i ci n j u r y v l i l 江苏大学硕士学位论文 缩略语 a a a a 8 6 1 o j m o d s s i r s h e 染色 l p s k c s 5 l o x l t b 4 r o s i h p d g f o d n s p b s m d a c k s o d a l t a s t e l l s a 英文缩写索引 a r a c h i d o n i ca c i d花生四烯酸 多西苯醌 o b s t r u c t i v ej a u n d i c e梗阻性黄疸 m u l t i p l eo r g a nd i s f u n c t i o n 多器官功能障碍综合征 s y n d r o m e s y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s e 全身炎症反应综合征 s y n d r o m e h e m a t o x y i n e o s i ns t a i n i n g 苏木素伊红染色 l i p o p o l y s a c c h a r i d e脂多糖 k u p f f e rc e l l s枯否氏细胞 5 - 1 i p o x y g e n a s e 5 一脂氧合酶 l e u k o t r i e n eb 4白三烯b 4 r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 活性氧簇 i m m u n o h i s t o c h e m i c a l免疫组化 p l a t e l e td e r i v e dg r o w t hf a c t o r血小板源性生长因子 o p t i c a ld e n s i t y吸光度 n o r m a ls a l i n e生理盐水 p h o s p h a t e - b u f f e rs a l i n e 磷酸盐缓冲盐水 m a l o n d i a l d e h y d e 丙二醛 c y t o k i n e细胞因子 s u p e r o x i d ed i s m u t a s e超氧化物歧化酶 a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e丙氨酸氨基转移酶 a s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s e 天冬氨酸氨基转移酶 e n z y m e l i n k e di m m u n os o r b e n t 酶联免疫吸附试验 a s s a y i x 江苏大学硕士学位论文 t n f q i l 一6 i e t m t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - a i n t e r l e u k i n 6 i n t e s t i n a le n d o t o x e m i a x 肿瘤坏死因子q 白细胞介素6 肠源性内毒素血症 江苏大学硕士学位论文 目录 弓l言1 1 材料与方法3 1 1 主要试剂3 1 2 主要仪器4 1 3 实验方法4 1 4 标本的检测5 1 5 统计学处理l5 2 结果1 6 2 1 各组大鼠血浆内毒素含量的变化1 6 2 2 各组大鼠肝组织5 - l o x 的表达情况17 2 3 各组大鼠血清l t b 4 水平变化18 2 4 各组大鼠t n f 0 【、i l 6 水平1 9 2 5 肝组织m d a 、s o d 含量的变化2 l 2 6 血浆a l t 及a s t 水平2 2 2 7 大鼠肝脏病理变化2 4 3 讨。论2 5 3 1 梗阻性黄疸肝脏损伤的机制2 5 3 25 - l o x 在梗阻性黄疸肝损伤中的作用2 6 4 参考文献2 9 本文小结3 5 综述3 6 在学期间发表的论文目录4 4 x i 江苏大学硕士学位论文 致谢4 5 x i i 江苏大学硕士学位论文 引言 胆道梗阻所致的梗阻性黄疸( o b s t r u c t i v ej a u n d i c e ，o j ) 是外科常见病，可以 造成全身多器官、多系统形态和功能的改变，术后易发生出血、感染、休克、胃 肠道功能损害、肝肾功能衰竭等并发症，病死率较高。梗阻性黄疸时，胆汁酸盐 不能随胆汁排入肠道内，而胆盐具有一定的抑制肠道内细菌的繁殖作用，在缺少 胆盐的情况下，肠道细菌繁殖过盛【l 】，其肠道内大肠杆菌数量增多1 0 倍，菌群发 生显著性改变，从而破坏黏膜的生物屏障【2 1 ，肠黏膜的免疫屏障也由于胆汁的缺 失失去了宿主防御作用。在梗阻性黄疸中小肠处于高氧化应激状态，细胞凋亡增 加，细胞增殖受到抑制，肠黏膜萎缩，肠壁细胞之间的紧密连接复合体被破坏， 最终导致小肠通透性增高以及各类细菌移位【3 】。移位的细菌中2 9 为大肠杆菌， 2 1 为克雷伯杆菌，其次为泄殖腔肠杆菌、产气荚膜杆菌等【4 】。这些细菌以及内 毒素转移至肝、脾、肾、肠系膜淋巴结以及全身的血液循环中，同时由于胆管阻 塞形成胆汁淤积性肝损伤，从而造成肝中枯否细胞的清除能力明显下降，使得肝 门静脉中的内毒素迅速扩散进入全身血液中，造成全身性内毒素血症【5 】。内毒素 血症还可激发全身性的炎性反应，造成远端器官的功能损伤，同时进一步加重了 小肠的黏膜屏障功能和胆汁淤积性的肝损伤，严重者还可导致全身器官衰竭而死 亡。 肝脏是机体主要的免疫器官，巨噬细胞的贮存库，在抗原识别和免疫应答 中起着核心作用【6 】。并且由于其富含自然杀伤细胞，在对抗病原体入侵形成的 第一道免疫防御中起关键作用【j 7 1 ，具有重要的物质代谢功能和免疫防御能力， 易受细菌、毒素攻击造成损害。枯否氏细胞( k u p f f e rc e l l s ，k c s ) 贝j j 是位于肝血窦 内的巨噬细胞，是体内固定型巨噬细胞中最大的群体。其表面存在多种l p s 受 体，如c d l 4 、t o l l 样受体、1 32 白细胞整合素( c d l l a c d l 8 、c d l l b c d l 8 、 c d l l c c d l8 ) 、s r a 等【8 9 1 。它作为体内单核巨噬细胞系统的主要成员，既是清 除细菌及其内毒素抗感染的重要防御细胞，同时也通过释放各种炎症介质在介 导多器官功能障碍综合征( m u l t i p l eo r g a nd i s f u n c t i o ns y n d r o m e ，m o d s ) ，尤其是 内毒素性肝损伤中发挥主导作用。目前认为它除了在宿主防御方面发挥关键作 用外，在肝脏疾病的发生、发展中也起重要作用【l o 15 1 。目前认为，感染时激活 单核巨噬细胞特别是k c s 产生和释放多种炎症介质( m e d i a t o r so f i n f l a m m a t i o n ) ， 江苏大学硕士学位论文 正是造成全身炎症反应综合征( y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e ，s i r s ) 和m o d s 的主要原因。 梗阻性黄疸形成内毒素血症时，l p s 进入肝脏，可直接干扰肝细胞的能量代 谢f 蛤18 1 。u t i l i 等b 9 1 用内毒素灌注离体鼠肝脏发现n a + 1 0 a t p 酶活性降低，肝细 胞功能发生障碍。内毒素还可导致肝脏急性微血管反应包括黏附、聚集于肝窦壁 的白细胞、血小板数目增加，滞留于肝窦或黏附于窦后静脉壁上，导致肝窦内血 流减少、细胞流速减慢阻塞血管、表达黏附分子和枯否细胞吞噬功能下降等。肠 源性内毒素血症( i n t e s t i n a le n d o t o x e m i a ，i e t m ) 对肝脏与机体的影响，远不止以上 的直接作用，还与内毒素激活单核巨噬细胞，k c s 及内皮细胞等产生与释放的炎 症递质与细胞因子有关，如果说众多不同的致肝损伤因子以其各自的损伤机制攻 击肝脏，是对肝脏的第一次打击的话，那么，由内毒素介导的细胞因子及炎症递 质的产生对肝组织的毒性作用以及所引发的微循环障碍，会使肝损伤持久存在， 不断加重，最后走向肝功能衰竭，则是对肝脏的第二次打击。 内毒素通过诱导k c s 细胞合成5 一l o x 、释放趋化因子如白三烯类( l t s ) 代谢 物，募集并激活免疫效应细胞，加重肝细胞损伤【2 0 】。许多研究证实5 l o x 及其代 谢产物在许多慢性炎症性疾病中起到很重要的作用。代谢产物l t b 4 是一个作用很 强的趋化因子，他可以激活并聚集许多炎性和免疫效应细胞，作用于各种免疫现 象所涉及的t 细胞释放各种细胞因子，j t l l i l 1 、i l 2 、i n f y 、肿瘤坏死因子及基 质金属蛋白酶2 、基质金属蛋白酶3 和基质金属蛋白酶9 等【2 1 艺3 1 。故5 l o x 在内 毒素间接肝损伤中扮演着重要角色即对由内毒素介导的细胞因子及炎症递质起 着放大作用。 当梗阻性黄疸患者因为各种情况无法及时解除梗阻时，如何减轻肝细胞的损 害，成为临床迫切需要解决的问题。关于5 l o x 在o j 中的作用国内却鲜有报道， 本实验通过结扎大鼠肝外胆管制作梗阻性黄疸动物模型，研究梗阻性黄疸时肝组 织5 l o x 表达、丙二醛( m d a ) 和超氧化物歧化酶( s o d ) 含量以及血清t n f a 、i l 6 水平的变化、肝组织的病理变化，并观察5 l o x 特异性抑制剂多西苯醌( a a 8 6 1 ) 对肝脏损伤的保护作用，目的旨在研究5 l o x 的活化在梗阻性黄疸时肝损伤中的 意义。 2 江苏大学硕士学位论文 1 材料与方法 1 1 主要试剂 盐酸氯胺酮注射液1 0 0 r a g 支； a a 一8 6 1 ( 美国s i g m a 公司) ； t n f ae l i s a l 式齐i j 盒( 美国i n v i 仃o g e n 公司) ； i l 一6 e l i s a 试剂盒( 美 i n v i t r o g e n 公司) ； l t b 4e l i s a 试剂盒( 美国r & d 公司) ； 鲎试3 0 ( 厦门鲎试剂厂) ； 兔抗大鼠5 l o x 多克隆抗体( 北京博奥森公司) ； e n v i s i o n 试剂盒( d a k o 公司) ； 丙二醛( m d a ) 测定试剂盒( 南京建成生物工程研究所) ； 超氧化物歧化酶( s o d ) 测定试剂盒( 南京建成生物工程研究所) ： h e 染色试剂： h a r r i s 苏木素液：苏木素2 5 9 纯乙醇2 5 m l 钾明矾5 0 9 蒸馏水5 0 0 m l 氧化汞1 2 5 9 冰醋酸2 0 r a l ； 伊红染液：取0 5 9 水溶性伊红染料，溶于10 0 m l 蒸馏水中； 乙醇：8 0 9 5 酒精； l 盐酸； 二甲苯； 中性树胶； 生理盐水( n o r m a ls a l i n e ，n s ) ：n a c l 0 9 9 ，加蒸馏水至- 1 0 0 m l 充分溶解； 磷酸盐缓冲盐水溶液( p h o s p h a t e - b u f f e rs a l i n e ，p b s ) n a c l l 8 9 ，n a h 2 p 0 41 1 5 9 ， k h 2 p 0 40 2 9 , 加蒸馏水至- 1 0 0 0 m l 溶解后，调整p h 值至7 2 ； 3 江苏大学硕士学位论文 1 2 主要仪器 动物实验器械包括：医用手术刀，组织剪，眼科剪，止血钳，持针器、镊子， 丝线，缝针，注射器，无菌纱布等； r m 2 1 2 8 徕卡轮转式切片机； r m 2 2 3 5 切片机； o l y m p u sa u 2 7 0 0 全自动生化分析仪； 普通光学显微镜； 7 2 1 分光光度计； h w s 2 0 电热恒温水浴箱； 5 5 0 酶标仪( 美国，b i o r a d ) ； i k at 1 0b a s i c 内切式超细匀浆机； u l t 7 9 0 3 v 超低温冰箱( 同本三洋公司m d f 3 8 2 型) ； 冷藏冰箱( 伊来克斯) ( 湖南长沙，b d c 2 8 0 e ) ； w p 7 5 0 型微波炉； c h t 2 1 3 e 奥林巴斯生物显微镜； 超净工作台( 苏净集团) ； 高压蒸汽消毒器( 黑龙江省鸡西市医疗器械厂) ； 制冰机( 美国i m ic o r n e l i u s 公司) ； 旋涡振荡器( v o a e x ) ( _ l 海青浦泸西仪器厂，x w - 8 0 a ) ； 低温冷冻离心机( s i g m a 美国，1 1 5 k ，3 k 1 5 ) ； 电子天平( s t a r t o f i o u sb p 2 1 1d ) ； 实验动物：成年健康雄性s p r a g u e - d a w l e y 大鼠4 8 只，体质量2 0 0 士2 0 9 ，( 江苏大 学实验动物中心) 。 1 3 实验方法 1 3 1 动物准备及分组： 将大鼠随机分成3 组：假手术组( s h a m 组) 、胆管结扎组( b d l 组) 、a a 一8 6 1 干 预组( b d l + a a 8 6 1 组) ，每组1 6 只。 1 3 2 动物模型的建立： 手术前禁 g l r l 2h ，自由饮水，以氯胺酮1 0 0 m g k g 腹腔注射麻醉，无菌条件下 4 江苏大学硕士学位论文 取上腹正中切口入腹，游离胆总管后用4 0 号丝线双重结扎，结间横断胆总管， 关腹。假手术组仅行胆总管游离，不予结扎和切断。 ( 造模的关键步骤：寻找胆总管并结扎见图l 、2 ) 图1 寻找胆总管 1 3 3 处理方法及标本取材： 图2 结扎胆总管 5 江苏大学硕士学位论文 b d l + a a 8 6 1 组术后第1 天起，正常饮水和进食，每天经腹腔内注射a a 8 6 1 ， 1 次d ，剂量为：0 2 m g 1 0 0 9 - l - d 一，直到处死大鼠为止；s h a m 组和b d l 组则同期 腹腔注射等量生理盐水。分别于术后第7 天、1 4 天处死大鼠( n 一8 ) ，下腔静脉采 血，制备血清，部分用于检测肝功能，其余置7 0 。c 冰箱保存待测细胞因子。取 右中叶肝组织，部分置于4 多聚甲醛溶液固定，用于常规病理和免疫组化，其 余置液氮再转存7 0 。c 深低温冰箱。 1 4 标本的检测 1 4 1 血浆内毒素水平的检测 内毒素测定的原理： 鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品，鲎试剂中 含有c 因子、b 因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下( 温度，p h 值及无干扰物质) ，细菌内毒素激活c 因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶 原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对 硝基苯胺( 入m a x = 4 0 5 n m ) 。在一定时间，对硝基苯胺的生成量与细菌内毒素浓 度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。同时，对硝基苯胺也可用 偶氮化试剂成玫瑰红色( 入m a x = 5 4 5 n m ) ，避免了供试品本身的颜色对4 0 5 n m 处 吸收峰的干扰。 血清样品的制备： 1 、吸取配套的血液抗凝剂l m l 于无热原试管中，用无热原注射器准确抽 取血l m l 注入试管中，和抗凝剂混匀，置于冰水中，加盖，迅速低温 离心1 0 m i n ( 1 0 0 0 转m i n ) 吸出上清液，制成二倍稀释液备用。如暂时 不用可3 0 密封保存。 2 、取上述二倍稀释液0 2 m l ，加入血液处理剂1 10 8 m l ，混匀，制成十倍 稀释液备用。 3 、取十倍稀释液于6 5 7 5 恒温水浴中加热1 0 分钟。加热时不得封闭管 口以免水珠流入样品内。 4 、加热完毕用封口膜封闭管口，在常温离心1 0 m i n ( 4 0 0 0 转m i n ) ，取上清 液检测。 内毒素测定的步骤： 6 江苏大学硕士学位论文 1 、细菌内毒素标准溶液的配制：标准曲线所采用的内毒素浓度可以为o 1 、 o 2 5 、o 5 、1 0 e u m l 。 表格1 内毒素标准溶液配制 2 、阴性对照为细菌内毒素用水。 3 、鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂等的溶解 鲎试剂：按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻摇使鲎试剂 完全溶解，1 0 分钟内用完； 显色基质：按标示量加细菌内毒素检查用水显色基质中，轻摇使显色 基质完全溶解； 偶氮化试剂1 ：按标示量加反应终止剂盐酸于偶氮化试剂1 中； 偶氮化试剂2 ：按标示量加细菌内毒素检查用水偶氮化试剂2 中； 偶氮化试剂3 ：按标示量加细菌内毒素检查用水偶氮化试剂3 中。 4 、实验操作( 见下表) 表格2 实验操作 木大鼠血清十倍稀释液 7 江苏大学硕士学位论文 5 、数据处理 建立标准曲线：y = b x + a ，其中y 为5 4 5 n m 处吸光度值，x 为内毒素 的浓度，b 为直线斜率，a 为y 轴截距。 1 4 2 肝组织5 l o x 的表达情况 免疫组化法检测肝组织5 l o x 的表达 原理：采用免疫组化e n v i s i o n s 步法检测，d a k oe n v i s i o n 显色系统是将二抗 和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体( 即e n v i s i o n ) 直接放大信号 4 0 5 0 倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方 便、背景低( 避免了内源性生物素干扰) 。 操作步骤： 1 、制作涂胶载玻片：以多聚甲醛和蒸馏水以l ：1 混合，涂于干净硅化玻片上，以 防实验过程中组织掉片，2 0 温箱中保存备用； 2 、切片：取石蜡包埋组织，置冷冻台冷却5 - - - , 1 0m i n ，切取3 4 l x m 厚组织片，冷 水中摊平，硅化玻片捞取，再入4 5 水中摊平，6 0 过夜彻底烘干； 3 、组织切片脱蜡：二甲苯中脱蜡3 x 1 0 m i n ( 共3 道，每道1 0 m i n ) ； 4 、水化组织切片：无水酒精2 x 3 0 s ，9 5 酒精2 x 3 0 s ，8 0 酒精2 x 3 0 s ，7 0 酒精 3 0 s 依次浸润组织切片，自来水冲洗，再由蒸馏水漂洗，使其水化； 5 、抗原修复：于1 m mp h 8 0 的e d t a 修复液中修复，隔水煮沸1 0 m i n ，保温2 0 m i n ， 室温自然冷却，蒸馏水漂洗两遍； 6 、阻断内源性过氧化物酶：将组织切片浸入3 h 2 0 2 溶液中孵育1 0 m i n ，以消除 内源性过氧化物酶的干扰，后于蒸馏水漂洗两遍； 7 、0 0 1 mp h 7 2 的p b s 缓冲液振荡冲洗3 x 3 m i n ； 8 、切片置于湿盒中，分别滴j j 1 5 0 1 , t l 非免疫动物血清，以封闭组织中非特异性吸 附，室温下孵育1 0 m i r a 9 、0 0 1 mp h 7 2 的p b s 缓冲液振荡冲洗l x 3 m i