（动物学专业论文）一种改进的flutax方法的建立及游仆虫细胞微管骨架的研究.pdf

吴月华硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 沈锡祺教授华东师范大学主席 侯连生教授华东师范大学 朱振勤教授华东师范大学 倪兵 割教授 华东师范大学 鲁心安 副教授 华东师范大学 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：墓基垡 日期： 丝红。：易 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 厶 学位论文作者签名： 日期： 关1 3 i 举 导师签名： 加修，丘，1 日期：! ! ! ：堕 硕士学位论文一种修改的f l u t a x 矗法的建藏及游仆虫细胞骨架的研究 一种改进的f l u t a x 方法的建立及包囊游仆虫细胞 微管骨架的研究 专渡名称： 研究方向； 指舅老帮： 研究生姓名； 动物学 细胞与分子生物学 矮撩蔟教授 吴月华 中文攮要 腹毛翻纤毛虫燕有复条的镝胞骨架，熬有无性分裂以及在特定条件下形成休 眠傻囊和臌包囊等特殊现象，细飕嚣架在这些过程中必然发生复杂的变他。因此 纤嘏虫的细胞骨架的研究融成为原搬动物细胞学和细胞生物学的个重要的研究 镁域。为了进一步了解这些磐絮缝搦特 垂毅成分，本文对磷突方法送嚣了一系裂 的探索，建立了一种快速、有效的研究微瞥骨架的方法。弗用这种方法对包囊游 擞( e u p l o t e se n c y s t i c u s ) 翡苓瓣垒瑶辩籁静缡戆避行褒祭，羯豕徽警雷絮在细 胞生命活动中结构形态的交化；应用细胞骨架抽提的方法提取细胞骨架蛋臼，进行 s d s + p a g e 泡泳，对其青菜的蛋自斌分避行分析。浙得的络采如下： 1 。修改的f l i u t a x 方法的建立 在参考a r r e g u i 等方法( 2 0 0 2 ) 的基础上，作者提出了墩用于显示原生动物纤 毛虫徽管类腿器的羹为有效蕊方法。其中，鼹f l u t a x 试裁的配制镞了改逑：弗 对实验材料的要求，渗透及固定等方法做了蹩点的阐述。本文所用的方法可以有 效鳃显示不鼹类鳖熬野毛塞绥蕤焱警类耱嚣t 为蕊程领域黪鞣究者探索绎魄虫细 胞微管类胞器的形态、组装及其功能作用等提供了黧要的手段。 2 。游静盎徽警弩蘩鹣形态袭箕在苓藏生鬻条件节静分证 按作者提出的攒a g r r e g u i 警( 2 0 0 2 ) 修改的f l u t a x 的方法，摄示了股毛瞳 纤毛虫包囊游仆虫( e u p l o t e se n c y s f i c u s ) 纲胞的徽篱类胞瓣和相关结构微管的形 态及其在生命周期和不同生壤状态的变化。笼姓生皴过程中，腹部疑毛器包捶蜀 硕士学位论文一种修改的f l u t a x 方法躺建立及游朴虫细胞骨架的研究 围带、波动膜、额腹横辣毛和尾棘罨经历了瓦解进程，在细臁皮层的特定位罨经 历了掰纤琵器形态静发囊过程，觚稳应纤毛原蕊鹃发生、潦慕经摊窝迁移，至最 终形成前、后两套新的纤毛器，并姐新结构的形成和老结构的瓦解是一个拥伴随 的过程。豫露纤毛器的发生中，新纤毛原基在老绎毛基体后发生，最终形成翦、 岳两套掰赞纾毛。缁魏形成毽囊辩，旗瑟纾毛器经历了纾毛杼帮部分基车拳静退纯 过程，所残留的全部纤毛器伴随着胀体腹面的折摄，内陷入包囊内聚集在一起， 背面的纾礁列在体h 民细腿内完整存程，无明显的邋优现象。程细胞脱包囊过程中， 全部锾管粪纾毛器戳袋聱豁结擒为纂础经历了褥分亿，最终缨魏以变形虫狄脱包 囊而出，形成营养纤蔼虫。 总结镪囊游l 虫农无性分裂帮形成包囊及麟龟囊过程中微管类细胞嚣的分化 特征，髂赣攘测，微餐类艟器在纾磁虫生命活韵不固对期秘不同生理袄态下发生 了连续的变化，是细胞生命活动中黧关重要的结构；在形态发生和结构分化的过 程中，受存微警结构对凝结梅的形拔可能有扬葳烫漱，著且翼蠢结构诱导葶拜模式 定位的律弼。此外，镪囊游4 虫脱龟囊过程中，细胞成交形虫状，可能蹩微管分 化的特殊形式。 3 。包囊游l 虫不同蹲麓微管骨絮爨鑫缀成 应溺s d s p a g e 技术对包囊游仆虫蕾葬期绷胞及体眠缁臌微管骨架蛋酝组成 进行了分析，电泳结果履示，休眠细胞保留了部分营养细胞中的微管骨架爨白条 嫠：9 5 3 、8 2 。9 、7 7 。2 、6 5 。7 、6 2 。3 、s 8 3 、4 8 6 、4 0 4 、3 7 。2 、3 5 2 、3 1 ，0 、 2 5 i 、1 8 4 、1 6 3k d ( 即与营养期细胞共享酌祭带) ，又丢失了部分条带，同孵 还产生了一些特异性条带：7 0 1 、5 6 3 、4 6 2 、2 8 2 、2 6 2 、2 4 2 、2 2 2k d 。微管骨 架蛋自缎成分辑结果袭明野毛虫在形成毛基体吸收型包囊鲍j 建疆中，微管嚣絮蛋 白组成发生了较显著的变亿。作者捺测在包囊游朴虫的休l 嚣截囊中，蛋白缀成的 变化与微管类胞器的功能形态的变化相关。 关键词：腹毛茸纾嘏虫包囊游仆虫f l u t a x 方法微管类胞器纤毛器 骨架蛋白分化 2 碗上学位论文一种修改的f l u t a x 方法的建立及游仆虫细胞骨架的研究 t h e i m p r o v e m e n t o ft h e m e t h o d - f l u t a x a n d v i s u a l i z a t i o n o ft h em i c r o t u b u l a r c y t o s k e l e t o no fe u p l o t e s s p e c i a l i t y ： s t u d y d i r e c t i o n ： d i r e c t o r ： g r a d u a t es t u d e n t ： a b s t r a c t w i t h s p e c i a lp h e n o m e n a o f e n c y s t m e n t ，e x c y s t m e n ta n db i n a r yf i s s i o n ，a sw e l la s c o m p l e xc y t o s k e l e t o n ，t h es t u d yo fc y t o s k e l e t o no fc i l i a t e s h a sb e e no n eo ft h e i m p o r t a n tr e a e a r c hf i e l d si np r o t o z o o l o g ya n dc e l lb i o l o g y t of u r t h e ri n v e s t i g a t et h e c h a r a c t e r sa n d c o m p o n e n t o fc y t o s k e l e t o no fc i l i a t e s ，t h ea u t h o rf o u n da nv a l i d m e t h o d f l u t a x ：戳也t h i sm e t h o d , t oo b s e r v e dt h ec y t o s k e l e t o no fc i l i a t e si n d i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a ls t a t e s ；b ym e a n so f s d s - p a g e ，t oi n v e s t i g a t et h ec o m p o n n t o f c y t o s k e l e t o no f c i l i a t e si ni nd i f f e r e n tp h y s i o l o g y t h er e s u l t sa r es h o w e da sf e l l o w ： 1 。t h e i m p r o v e m e n t o fm e t h o do ff l u t a x b a s e do nt h em e t h o do f a r r e g u i 0 0 0 2 ) ，t h ea u t h o ri m p r o v e dt h em e t h o d 镪a d a p t t os t u d y i n gc y t o s k e l e t o no f h y p o t r i c h c i t i a t e s t h ea r t i c l ee x p a t i a t e st h em o d i f i c a t i o no f t h e r e a g e n to ff l u t a x ，d e m a n d m e n t o f t h e m a t e r i a l ，e m p h a s i z e st h et e c h n i q u eo f p e r v a s i o na n df i x a t i o n 。w i t ht h e m o d i f i e dm e t h o do ff l u t a x 。w ec a l l c l e a r l y o b s e r v em i e m t u b u l eo r g a n d i e so ft h ed i f f e r e n th y p o t r i c hc i l i a t e s 。t h i sp a p e ra f f o r d s a i l i m p o r t a n tv a l i da p p r o a c ht oi n v e s t i g a t et h es h a p e ，a s s e m b l ya n df u n c t i o no ft h e m i c r o t u b u l e sc y t o s k e l e t o n 。 2 。t h es h a p ea n dt h ed i f f e r e n t i a t i o no fm i c r o t u b u l e s e y t o s k e l e t o n o fe u p l o t e s e n c y s t i c u si nd i f f e r e n tp h y s i o l o g i e a l s t a t e s w i t ht h ei m p r o v e dm e t h o d p r o v i d e db y t h ea u t h o r ，t h e s h a p ea n dd i f f e r e n a t i o no f t h em i c r o t u b u l ea n dm i c r o t u b u l e - l i k es t r u c t u r eo fe u p l o t e s e n c y s t i c u s i nd i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a ls t a t e s ，c 矗nb ev i s i o n e dc l e a r l y d u r o n g ( - h eb i n a r yf i s s i o no f t h ec e l l t h e n e wc i r r ik i n e t o s o m e sc o m ei n t ob e i n gi nc e r t a i ng i v e n p o s i t i o no f t h ev e n t a ls i d e ，t h e y d e v e l o pi n t oc i r r ia n dm i g r a t ea n d d i v i d ei n t ot w os e t so f c i r r i s ，a tl a s tt a k et h e p l a c eo f t h eo l do e t e s 。0 nt h ev e n t r a ls i d eo fc e i l ，t h ea d o r a lz o n eo fm e m b r a n e ( a z m ) ，t h e u n d e r l a t i n gm e m b r a n e ( u m ) ，f r o t o - v e n t r a la n dt r a n s v e r s ec i r r i ( f v c ，t c ) a n dc a u d a l 3 渊一 m f 一 塾 硕士学位论文一种修改的f l u t a x 方法的建立及游仆虫细胞骨架的研究 c i r r im i g r a t ea n dt h e na r ed i s i n t e g r a t e d t h em o d eo ft h ea r i s e i n go ft h en e wd o r a l c i r r i sa r ed i f f e r e n tf o r mt h ev e n t r a lc i r r i s s ，w h i c he m e r g ec l o s e l yb e h i n dt h eo l dc i r r i ， a n dt h e nt h es e n o n d ，t h et h i r d a tl a s t ，t h o s en e wc i r r i sf o r mt w os e tc i r r i ，a n dt h eo l d o n e s d i s i n t e g r a t ea n da r ea b s o r b e d j u s tr i g h tb e f o r et h ee n c y s t m e m n to fe u p l o t e s e n c y s t i c u s t h ec i l i a r ys h a f t sa n ds o m ek i n e t o s o m e so f t h ef r o t a l a la n dv e n t r a lc i r r i sa r e d i s i n t e g r a t e da n dd i s a p p e a r d ，t h er e m a i n i n go n e sa g g r e g a t et o g e h e r ，a n dt h e na r e f o l d e dw i t ht h ec o r t i c a lp e l l i c l ew i t h i nt h ec y s t ，t h ec e l lb e c o m et h er o u n d c y s t ，w h i l e t h ed o r s a lc i r r i sr e m a i n si n t a c tw i t h o u tb e i n ga b s o r b e d r i g h tb e f o r et h ee x c y s t m e n to f e u p l o t e se n c y s t i c u s t h em i c r o t u b u l e - l i i ( es t r u c t u r e sa r ed i f f e r e n t i a t e di n t oc o m p o n e n t c i r r i sb a s e do nt h er e m a i n i n gs t r u c t u r e s ，t h ec e l lc o m eo u to ft h ec y s ta s “a m o e b a ”一l i k e f o r m ，a n dt u r nt ov e g e t a t i v ec e l l s u m m a r i z e i n g t h ec h a r a c t e r so ft h ed i f f e r e n t i a t i o no ft h em i c r o t u b u l e l i k e o r g a n e l l eo f t h ee u p l o t e se n c y s t i c u s ，d u o r i n gt h e o s ep r o c e s so ff i s s i o n ，e n c y s t m e n ta n d e x c y s t m e n t ，t h ea u t h o rs p e c u l a t et h a t ：m i c r o t u b u l e - l i k es t r u c t u r ei st h ep i v o t a ls t r u c t u r e i nt h ei r ea c t i v i t y , o ft h ec e l l ，w h i c hc h a n g ec o n t i n u o u s l yd o u r i n gt h el i f ea c t i v i t y t h e o l dc i r r i sp l a yv e r y i m p o r t a n tr o l et ot h en e w c i r r io r g a l l e s i tm a yc o n t r i b u t es u b s t a n c e s o n r c et ot h en e wo n e s ，a n di n d u c et h ed i r e c to r i e n t a t i o no ft h en e wo n e s i n a d d i t i o n ，d u r i n gt h ee x c y s t m e n t ，t h ec e l lf o r ma m o e b a - l i k e ，t h i sm a yb ec a u s e db y t h es p e c i a ld i f f e r e n t i a t e df o r mo f t h em i c r o t u b u l e 3 c o m p a r i s o no f p r o t e i nc o m p o n e n t b e t w e e n v e g e t a t i v ec e l l sa n dr e s t i n gc e l l s c o m p a r e d 、“t 1 1v e g e t a t i v ec e l l sa n dt h er e s t i n gc e l l so fe u p l o t e se n c y s t i c u sb y m e a n so fs d s p a g e ，t h er e s u l ts h o w e da sf e l l o w ：t h e r e s t i n g c e l l so fe u p l o t e s e n c y s t i c u sp r e s e r v es o m ep a r to f t h ep r o t e i nb a n d s ：9 5 3 、8 2 9 、7 7 2 、6 5 7 、6 2 3 、 5 8 3 、4 8 6 、4 0 4 、3 7 2 、3 5 2 、3 1 0 、2 5 1 、1 8 4 、1 6 3k d ( w h i c ha r es h a r e w i t h t h ev e g e t a t i v ec e l l s ，w h e r e a sl o s ts o m ep r o t e i nb a n d s ，m e a n w h i l e ，p r o d u c es o m en e w p a r t i c u l a rp r o t e i n s ：7 0 1 、5 6 3 、4 6 2 、2 8 2 、2 6 2 、2 4 2 、2 2 2k d t h er e s u l ts h o w s t h a t t l l ep r o t e i nc o m p o s i t i o nh a sc h a n g e dn o t a b l yi nt h ec o l , r s eo f e n c y s t m e n t t h ec h a n g e o ft h ec o m p o m e n to fm i c r o t u b u l e si sc o n s i s t e n tw i t hs h a p eo ft h ec y t o s k e l e t o n a s w e l la st h ef u n c t i o no f t h em i c r o t u b u l es t r u e t r e k e yw o r d s ：h y p o t r i c hc i l i a t ee u p l o t e se n c y s t i c u s f l u t a x m i c r o t u b u l e - - l i k es t r u c t u r ec i r r i e y t o s k e l e t o np r o t e i n d i f f e r e n t i a t i o n 4 颂卜学位论文一种修改的f l u t a x 方法的建立及游仆虫细胞骨架的研究 第一章研究综述 原生动物纤毛虫细胞骨架及休眠现象的研究进展 原生动物纤毛虫是单细胞的真核生物，具有复杂的细胞器和微管骨架结构， 具有无性分裂的特征：并且有些原生动物在一定条件下如温度的突变，食物的缺 乏、p h 的改变及种群密度过高等，细胞会团缩化并逐渐失去某些结构，同时分泌 物质形成保护性的包囊壁，成为休眠细胞。对原生动物细胞特别是微管骨架和休 眠现象的研究，已成为揭示真核细胞的结构与功能，细胞模式形成与控制机理的 一个重要方面。多年来，对原生动物休眠细胞的形态学、细胞结构的分化等方面 己做了较详细的研究。近十年来对休眠细胞的生命活动特征、结构分化的调控机 理等方面也进行了多方面的探索。纤毛虫具有着复杂的纤毛器及皮层微管骨架结 构，是细胞生物学研究的一个重要的内容。 1纤毛虫细胞骨架的组成 1 1 基本组成成分 纡毛虫细胞表面覆盖着大量的纤毛，具有两种不同类型的细胞核，长期以来， 人们利用该种生物为材料探讨真核细胞的分化特性以及生命活动规律。当前，主 要通过研究营养细胞和分裂期细胞的皮层模式来确定种的特征。其中涉及纤毛、 毛基体及与之相连的纤维衍生物的分布情况等，这些结构都是由微管组成，微管 是组成真核细胞细胞骨架的成分之一，由n 、b 微管蛋白首尾相接形成的原纤维 构成。徽管蛋白的负极常常位于微管组织中心( m i c r o t u b u l e o r g a n i s i n gc e n t r e ， m t o c ) 。该中心的形态和结构随着细胞种类的不同而存在着一定的差异。虽然 m t o c 的表现形式既有中心体、毛基体，又有纺锤体，但它们在生化特性和分子 组成方面却存在着一定程度上的相似，田沁等( 2 0 0 2 ) 应用光镜和透射电镜术， 显示了包囊游仆虫休眠细胞中纤毛器骨架的形态，并对该纤毛虫休眠细胞和营养 细胞的纤毛器及其n 、b 微管蛋白进行了免疫荧光定位的比较研究。免疫荧光显 微术显示：包囊游仆虫形成休眠包囊后，背部毛基体完整地按原有模式保存下来； 纤毛杆解聚后微管蛋白多集中在细胞皮崖，小部分均匀散布在细胞质中。据所得 结果认为，包囊游仆虫形成包囊后，微管蛋白主要有3 个去向，即：处于自噬 泡内被逐步消化以“微管蛋白库”的形式分布于细胞皮层及细胞质中保留 在残留的基体中。此外，以往研究中发现的棘毛基部纤维网络未被标记上，提示 这些纤维体系可能不属于微管系统。除了a 、f 3 微管蛋白，现在又发现了几种新 的微管组成成分，它们都具有特定的亚细胞定位和功能。在真菌a s p e r g i l l u s n i d u l a n s 中首先发现的、由觚触编码的y 微管蛋白( o a k l e y c ea n d 硕士学位论 史=一种修改f l u t a x 方法的建立及游仆虫细胞骨架韵研究 o a k l e y b 。r ，1 9 8 9 ) 与。和b 微篱蛋白的相似性达到了3 0 。这在真核生物中都 有存在，主要癌魂徽鬻鹃经装活动。8 镞警蛋爨蓉先是在袭漓塞c h l m n y d o m o n a s 中发现的，此后，在入、鼠、锥体嫩( c h a n gp ，2 0 0 0 ) 及原生动物p 1 a s m o 戚t l f f 中 都有发现。微管蛋囱晟先是在哺乳动物细胞中发现的( c h a n gp2 0 0 0 ，) ，只存 在于某些褰孩生物缨瓣中，由b l d 2 基邃凌玛。免疫印迹实验搦示：宅在缨藏中懿 定位情况随细胞周期的不同而发生变化，例如崧细胞周期的犟期阶段，它主要与 旧的中心体相结合，随着细胞进入分裂后期，才与新旧两种中心体都有结合。尽 管目前对该种微管蛋融舱生理作用尚不+ 分了够，但c h a n g 簿( 2 0 0 0 ) 的实验显 示：中心体可激在微管蛋鑫含爨缀低懿谤凌下照常调节微篱兹组装，邀结采 可能暗承着e 微管蛋融在微管组歉中不起主要作用。微管缀自首先在锻体虫中 被发现，也是目前唯一一个已知全序列的微管蛋自。它一般使予毛基体或中心体 区域。毽徽警蛋叁謦宠在p a r m n e c i u m 中被发瑗，峦鼎1 9 墓瓣绫玛，当该蒸嚣发 生突变时，细胞表现为基体复制滔动被抑制、口嚣发育不完全、y 微管蛋翻发生 错误定位镣。由于f t s z 在序列上岛微管蛋白相似性不高，起初被认为是与细菌细 胞分裂有茨的蛋白，缎其三维结构却每微管蛋白十分相戗。f t s z 最初被捌分为缨 蓥缎魏分裂蛋鑫，序捌分析发瑰箕每搬警蛰鑫乏惩具有鞍低的耱镁缝，毽它的三 维立体结构却与微管徵白极为相似。通过与o i 和b 微管蛋囱的氨基酸组成的序 列比对詹发现：这些新发现的微管鬣自经历了与a 和1 3 微管餐白不同的转录后 掺爨过疆，蘩蠹予在经患4 e 楚缺少簇蘸酸，瑟淡不会发生乙酸纯雩霉矮；在绫褥主， 6 ，e 和的序列中肖许多插入和缺失序列，而屐它们在序判上表现出更多的变 异性：实验显示在特定区域，a ，b ，y ，8 ，e 的序列鼠有高度的保守性 ( i n c l a n ，2 0 0 1 ) ，6 ，8 ，q 都佼予细胞中心倦或基体蛉像爨( d u t c h e r ，2 0 0 t ) 。 徽丝、徽管_ 穑中瀚纤维( i n t e r m e d i a t ef i l a m e n ti f ) 蔻大多数真棱生物细 胞骨架的盎要成分。每种纤维系统郯由自己独特的骨架蛋自及其相关蛋白组成。 原生动物中已确定含肖徽丝和微管缡梅，但是谮食有中间纤维还有待研究，但胡 蓬群等( 2 0 0 3 ) 裁瘸蔑接受疫荧必察免疫窝遮发现蟪竣独缭虫( c a r c h e s i u m p o l y p i n u m ) 中存在两种分子量为5 8 k d 和6 6 k d 的蛋白。这两种蛋白能分别与抗 波形蛋白和抗核纤层蛋白b 的抗体反应。分子堂6 6 k d 的蛋自位于大核边缘。另 外，细跑缀分缓抽挺爨发现在大孩蔗围存在核绥艨样结构。基于上述结果，霹戬认 为蟪获独缩虫中存在炎中闻纤维。就矫，利蘑常艉电镜蕊察爨示蟪状独绾擞嗣部 单毛基索( h k ) 、第一( p 1 ) 和第二嘲膜( p 2 ) 旁备有一片微纤维结构。进步抽提 后，这些微野维结构仍存在。三步抽提显示它们是由直径1 2 n m 左右的类中间纤 维稳藏戆潮辏缝掏，爨蕤拯蔻素b 不戆爱其惩髂。h k 寒p l 努豹徽纾维绥鞫隧著 向胞口延伸逐渐变宽，弗形成典型的网格结构( 胡国群等，2 0 0 3 ) 。利用皮滕耐高 硕士学位论文一种修改的f l u t a x 方法的建立及游仆虫细胞骨架的研究 盐和各种洗涤剂的特性，应用s d s - - p a g e 和免疫标记方法对皮层的组成成分进 行了鉴定，s d s - - p a g e 的结果显示，组成成分的分子量随种类的不同而存在一定 的差异，利用单克隆和多克隆抗体与皮层蛋白的反应揭示：同种或相近种属的皮 层成分间存在交叉反应，该结果对进一步深入探讨以上蛋白成分的共同起源提供 了重要的线索。 1 2 皮层细胞骨架 1 9 9 2 年，m a r r s 和b o u c k 首先在分子水平上鉴定了小眼虫( e u g l e n a g r a c i l i s ) 细胞皮层中的主要蛋白成分，被命名为连接蛋白( a r t i c u l i n s ) 。伪小胸虫 ( p s e u d 口l m i c r o t h o r a x ) 的皮层主要由分子量分别为7 8 k d 一8 0 k d 和1 l k d 一1 8 l ( d 的两类多肽组成，此外，还包含一小部分分子量在1 8 k d - - 6 2 k d 的蛋白成分。序 列分析显示：分子量为7 8 k d 一8 0 k d 的蛋白成分就是连接蛋白( h u t t e n l a u c h 等，1 9 9 8 ) ，连接蛋白是有一个由缬氨酸( v a l i n e ) 和脯氨酸( p r o l i n e ) 交互排列而 成的核心区，有1 2 个残基组成，称为v p v 区。利用分子及免疫学手段对其他一 些种类的纤毛虫进行研究时发现，皮层中还有一种与连接蛋白截然不同的蛋白成 分，分子量3 0 k d - - 5 0 k d ，命名为表质蛋白( e p i p l a s m i n s ) ，这种蛋白是由一组生 化特征相似的多肽组成，在四膜虫和草履虫中都有发现。数据库分析已证明连接 蛋白是原生动物所特有的组成成分，而表质蛋白是否也和连接蛋白一样，还有待 于进一步证明。顾福康等( 1 9 9 5 ) 利用透射电镜技术对包囊游仆虫休眠包囊在去 分化和再分化中皮层纤毛器和其他附属结构进行了研究，结果显示：各类纤毛器 的毛基体上方的大部分纤毛杆退化，或仅保留毛基体，有时部分额棘毛的毛基体 也瓦解消失。残留纤毛的纤毛杆周围微管和中央微管仍具有“9 + 2 ”结构特征， 也有少数纤毛杆出现2 套“9 + 2 ”结构微管共处于层纤毛膜的现象。毛基体中 周围三联体微管的中央形成微管形结构聚合体，基体附属结构仅存在基体间连接 及纤毛器托架的残余物；非纤毛区皮层表膜下未见微管层。纤毛区皮层含纤毛器 腔周围微管层( 相当于表膜下微管层) 、纤毛器深部及附近的微管束和分散的微管 群。纤毛区皮层囊泡内含有呈不同形态的纤毛杆结构；大核核孔明显变大，核孔 数目减少，核孔内膜附着染色质。倪兵等( 2 0 0 0 ) 应用生化去膜方法，按不同时 间提取游仆虫皮层内不同层次的骨架结构，结果显示：游仆虫整个皮层细胞骨架 由纤维篮组成，其中，口皮层骨架包括口围带小膜托架及其上方附着纤维和下方 的深部纤维，以及波动膜托架：腹皮层骨架包括表膜下纵纤维层及其上方纤维网， 棘毛基部纤维及其向周围伸展的放射纤维，以及下方的深部纤维层：背皮层骨架 包括表膜下纵纤维层及其上方的纤维网；口皮层骨架和有腹皮层骨架之间的纤维 结构发生过渡状态的交互式联系；此外，根据现有的资料，总结了游仆虫整个皮 层细胞骨架的结构组成。顾福康等( 2 0 0 3 ) 应用非离子去垢剂抽提和扫描电镜样 硕j j 学位论文一种修改的f l u t a x 方法的建立及游仆虫细胞骨架的研究 品制备、观察相结合的方法，显示了镰游仆虫的腹面皮层细胞骨架，详细描述了 处于毛基体和毛基体下水平的口围带、口侧膜、额腹横棘毛骨架，以及口围带小 膜托架、口侧膜托架、额腹横棘毛托架的主要附属纤维和非纤毛区表膜下皮层骨 架的立体图形。据所述各种纤毛器托架附属纤维的定位和分布特征推测，这些附 属结构可能与细胞内各种纤毛器间的联系，以及包括纤毛器运动在内的整个细胞 运动的协调等有关。 b o u c h a r d 等( 1 9 9 9 ) 根据类表质蛋白( e p i p l a s m i c p r o t e i n ) 不溶于高盐溶液的 特性，推测它属于中间纤维蛋白家族的一分子，该蛋白可能与连接蛋白和表质蛋 白有较近的亲缘关系。类表质蛋白c ( e p i c ) 中既没有观察到连接蛋白所特有的 v p v 区，又没有表质蛋白所特有的q p v q h 七螺旋区，若确实如此，那么类表质 蛋白就有可能是纤毛虫的第三种皮层骨架成分。n u m a t a e ta 1 ( 2 0 0 0 ) 首次提出四 膜虫中的一种分子量为2 3 k d 的蛋白有可能是e p i c ，并在随后的免疫印记实验中 进一步加以证明。t e t r i n 是四膜虫口区细纤维的组成成分，免疫学证据证明t e t r i n 及与之相关连的蛋白组成了一类新的中心体，基体相关蛋白家族，该类蛋白在真核 细胞中广泛存在。研究人员对t e t r i n 4 中比较有代表性的2 6 的氨基酸序列进行了 研究，发现这- 4 , 段序列具有像a 螺旋c o i l e d c o i l 蛋白一样的七重螺旋结构，而 在b l a s t 的比对中，又与这些c o i l e d c o i l 蛋白( 如肌浆球蛋白重链，原肌球蛋白， 血影蛋白等) 有较低的相似性。j e r r y 等( 2 0 0 3 ) 对四膜虫的这两种主要的皮层蛋 白进行了研究，重点放在类表质蛋白，尤其是近年来被广泛关注的e p i c 及t e t r i n 纤维蛋白上，探讨了这些皮层蛋白在体内和体外的装配过程，以及调控机制。 1 3 核骨架 人们对细胞核作为细胞中最稳定的组成部分的认识已有近1 5 0 年的历史了， m i e s c h e r t 首先从白细胞中获得细胞核。在随后的一个多世纪里，大量的实验显示， 细胞核有很强的耐受压力、细胞匀浆中的摩擦力、强渗透压等( p e d e r s o n ，1 9 9 7 ) 。1 9 4 2 至1 9 6 3 年的研究揭示，细胞核中有一类特殊的蛋白，可以耐受1 0 m 到2 0 m n a c i 的抽提。此外，在分离出的染色体中也发现了这类蛋白。利用光镜和电镜观察经 1 0 m 到2 0 m 的n a c i 抽提后的细胞核，发现其中存留有大量的蛋白成分，使细 胞核、核仁，异染色质的界限清晰可见( s h a n k a r 等，1 9 6 7 ) 。也就在那时，人们开 始用“细胞核网络”这一术语来描述上述的生化抽提残留物。1 9 7 4 年，b e r e z n e y 和c o f f e y 首次提出“核骨架”这一概念，在此基础上，人们开始从不同角度针对 这一结构展开研究。1 9 8 2 年，c a p l e o 等对核骨架的抽提方法进行了一定的改进， 利用( n h 4 ) 2 s 0 4 替代了n a c l ，而它们的离子强度彼此接近( 分别为o 7 5 和1 0 ) ： 观察经乙酸铀酰染色后的细胞核可发现，染色质阍的空隙处有两种核蛋白( r n p ) ， 分别为染色质周纤丝( p c r i c h r o m a t i nf i b r i l s ) 和染色质间颗粒束，它们与m r n a 前 硬士举证论文一耱修改豹f l u t a x 方洼羲建立及游铃虫缎魏蚤檠辩麟究 体转录和加工俄点相联系( s p e c t o r , 1 9 9 3 ) 。染色质周纤丝的直径通常为3 n m 到5 n m ， 最宽的可达2 0n m 左右，量现不规则的螺旋型。染色艨间颗粒柬由纛径2 0 n t o 到 2 5l l m 静弦辍缀藏( m o r m e r o n 等，1 9 6 6 ) 。 2纤毛虫你眠现象研究的意义 2 1 绎毛虫形成惫囊熬生物缮意义 纤毛虫形成包囊后，除“生殖型”龟囊缁胞在内部进行生殖井，大部分包囊 的细胞处于休瞩的生理状态，没有生长和嫩殖，细胞内的生活物质仪在消耗少部 分孵吸能的情况下维持下去。包囊壁和细胞的休眠特缎怒纾毛虫抵御外界各种有 害戳子，在橡端繇麓下垒存瓣蕉要条传。大部分奄囊能羝抗高温、鬣滚、于澡等 多种有害因予，甚至能在这贱因子的长时间影响下存满下来。包囊的上述特征一 方面为纤毛虫种群的延续提供了条件，另方面又为纤毛虫从一处向另一处扩散 或蹙撵鬟袋了途经。有久捡套，每立方米燮气孛含嚣个缀皇餮物包囊，并且在鸟 的羽毛或腿粘麓的泥土上，躐在东生甲壳动物的体表瞧番原生动物锈囊，因此推 测，包囊可能随空气流动携带一定距离，藏经由某些动物的迁移向嬲一处传播。 另外，某些寄擞纡毛虫形成镪囊也是其避歼严酷环境的影响，保证露效地感染宿 主瓣释最“安众”静方法。纾毛虫的年龄粒衰老程度燕崮无性努爱次数决定酶， 包瀵形成可能使纤毛虫较长时间停止分裂，这也是纤嘏虫延缓其无性系衰老的一 种方法。 2 。2 终乏虫惫囊溪象臻究对爨潺缨貔模焱形成壤理夔焱义 单细胞纤嘏虫具有复杂的细胞结构，猩生命史一定阶段经历了缡构的显著分 化，尤其是细胞皮层产生多种复杂的纤琶和非纤毛结构，其结构分化的复杂性也 是凑棱缨您中少撼的，因此疲忍纾毛虫研究细胞模式形成已成为一个活跃豹领域。 根据纤毛呔菠常生命蠲簸( 无瞧生蔟翻寄往垒蘧) 戳及人工干涉条徉下形态 发生的结果，对纤毛虫模式形成机理的一种假设是，纤龟虫皮层先存结构的空间 构趔对新结构的形成和定位越着控制作用( f r a n k e l 等，1 9 8 4 ) 。草膜虫和四膜虫 孛瑟毛基莽慧燕霞稳透老毛薅侮兹方、与之藏躲。兹惫发缝装露残( a l l e n ，1 9 6 9 ； d i p p e l 1 9 6 8 ) 以及这两种纤嘏虫经手术盾获得的一小段颠倒的纤毛序列能在无健 生殖中保持下去等许多现象便是证据。然而，形成毛基体吸收型包囊的纤毛虫中， 没饔l 壬馋毛基体辩毛基体嚣缝惹残塑物的体眠包囊，缨胞脱包囊羼瞧能形成与原 模戏完全一样的纾毛结梅，铡如伪失毛虫成囊单体脱包囊后必然是禽一套纤毛小 器宙的纤毛虫，成囊双体脱钒囊后仍为含掰套纤毛小嚣宙的双体，似乎它们都能 记往原有的纤慧模式，为此谢人提出模式形成机理的另假设：纤嘏出还存在菅 一令褰开露续褥两起终弱瓣信惠系统，窀癌动整套痰髹结构静发襄，并决定煮 0 疆七攀霞论文一耱肇竣懿f l u t a x 方法爨建立夏游癸斑缎蕤曹繁鹩秘究 发育区纾毛结构的极性和不对称性( g r i m e s ，1 9 7 3 ) 。辩清楚这类纤嘏虫纤毛结构 聪分纯和再分化的详细特征，将为探索寞核缨魏模式形成枫理提供激豹资料。男 羚。对纤毛虫鬯溪中包囊璧缓搦酶形成和怒源，弼髓程驻显徽汞平躐察分辑静茭 础上，深入到分子水平的工作，那对阐明上述理论问题也将是有意义的。 2 3 纤毛虫包囊现象研究对纤亳虫系统学的意义 尽管没有毽滋谈鸯绎毛窳澎袋包囊其蠢耪罄特舅戆，毽获一定癸鼗鹣纾毛囊 产嫩特定结构的休眠包囊，而袭现出一定酌遗传和发育特点来看，纤笔虫的休眠 现敷可能与其系统进化有联累。这些已经引起各个学者的重视。近年来对纤毛虫 毽粪翘感翡研突懑成为搽讨纤毽虫系统学鹃缱成都分。 w a l k e r 等( 1 9 8 0 ) 蓄毙强出了禳据体瞵毯囊静特缀瓣羧毛嚣绎磁盎静荐势类 问题。r e i d 等检查了多膜纲( p o l y m e n o p h o r e a ) 中某些代表属的包囊发现，尽管 不同属的营养细胞结构变异十分明显，但相应包囊结构则相当稳定，他们推测“包 囊臻橡毒藐是确定不嚣类群绎遣宝之阕系绫擎关系豹鬟癸檬疆之一”，予是疆交了 这一纲中几类裔不同包囊缩构的纤毛虫其衡不同起源的假设。b u s s e r 镣也曾认为， 包囊壁中有无几丁质与腹毛目中属的特征肖关( b u s s e r 铸，1 9 7 4 ) 。丽目前已经肯 定，毛基体菲吸收型包囊豹戗囊壁含有几丁菔，毽在舅馀泰拉虫属、失毛虫属、 和隧柱虫属等形成的包囊串，包囊壁无足下震( r a w l i n s o n 等，1 9 8 6 ) 。可觅，包 囊髓的组成对纤壤虫分类有参考价值。 魏氏拟尾柱搬的包囊结构已经揭示出其在素统学上的有关问题。b o r r o r 等麓 穗窀归在是柱蠡辩，嚣寒稷攒其形态帮形淼发生豹特燕，又将它敖在尖毛盔辩 ( b o r r o r 等，1 9 7 2 ) 。目前来辫，这一纤琵嫩形成的包囊鼯介于毛基体吸收型包囊 和耀柱虫类包囊之间的第四类包囊，因此富的包囊有两个科的特征，有人认为它 是葶孛处予撵露驻嚣( s f i c h o t r i e h i n a ) 帮散逶亚囊( s p o r a d o t r i c h i n a ) 之闯弱“过 渡黧纤毛虫”( s m a l l 等，1 9 8 5 ) 。 3 体眠细胞的结构分化和生错活动的特铖 3 。l 傣眠鬃魏缝稳静努证 3 。1 1 休眠细胞的包囊壁结构的分化 原生动物形成包囊期间。细胞收缩，绷臌质向细胞外分泌物质形成包囊壁结 载，最终缨照鲶予包囊爨，成为罄球形或避骥黥影豹体i 爨缨瑰。诲多情提下，包 囊鼹的形成与内葳网和商尔蒸体有关。在阔口尖毛虫( o x y t r i c h a p l a t y s t o m a ) 中。 细胞形成包囊时，细胞质内出现内质网和水同大小的囊泡组成的包囊壁的前体， 其静体