（分析化学专业论文）茶叶功效成分茶多酚、咖啡因分析测定方法的研究.pdf

摘要 茶叶功效成分茶多酚、咖啡因分析测定方法的研究 摘要 本文研究了茶叶的功效成分一茶多酚、咖啡因的分析测定方法， 提出了茶多酚的四种测定新方法和咖啡因的一种测定新方法，并用于 实际样品的测定，获得满意结果。本文由以下几章组成： 第一章：综述。对茶多酚、咖啡因的分析测定方法进行了文献综 述。 第二章：间接原子吸收法测定茶叶中的茶多酚。艮文提出了间接 测定茶叶中茶多酚的原子吸收法。它是基于茶多酚能与碱式乙酸铅发 生络合反应，产生难溶于水的黄色沉淀，经离心分离后，用原子吸收 法测定上清液中过量的铅离子，间接确定茶多酚的含量。方法线性范 围为3 0 2 5 0ug m l ，相对标准偏差r s d = i 3 ，回收率为 9 8 4 1 0 0 。 第三章：钼酸铵分光光度法测定茶叶中的茶多酚。k 文首次提出 了钼酸铵分光光度法测定茶叶中茶多酚含量的新方法。该法是基于茶 多酚在酸性条件下能与铝酸铵反应生成黄色钼酸酯，此物质在3 4 1 r i m 处有最大吸收。方法的线性范围为4 0 - - - 3 6 0 u g m l ，表观摩尔吸 收系数- - 2 1 i 0 5 i t o o l 。1 c m ，回收率为1 0 0 1 0 5 。用于茶汤 中茶多酚的测定，本方法具有灵敏、简便、快速的优点。厂 第四章：差示分光光度法测定茶叶中的茶多酚。k 文提出了差示 、 西j e 大掌司【士掌位论文擅要 分光光度法测定茶叶中的茶多酚含量的新方法，方法线性范围为2 0 1 2 0ug m l ，表观摩尔吸收系数= 1 9 7 x1 0 5l t o o l 1 c m 1 ，回 收率为9 7 5 - 1 0 2 。f 第五章：流动注射抑制化学发光法测定茶叶中的茶多酚。f 本文 首次提出了流动注射抑制化学发光测定茶叶中茶多酚的分析方法。 它是基于茶多酚在碱性条件下还原h 2 0 2 ，抑制鲁米诺- h 2 0 2 i l q 0 4 体 系的化学发光，其抑制程度的大小与茶多酚的含量成线性关系。方法 的线性范围为0 8 - 2 4 ug m l ，检出限为0 0 3ug m l ，相对标 准偏差r s d 为1 3 ，采样频率为2 4 0 次h _ 1 ，回收率为1 0 2 1 0 5 。丫 第六章：邻苯二胺分光光度法测定茶叶中的咖啡因。伍文首次提 出了采用邻苯二胺分光光度法测定茶汤中的咖啡因含量。宅是基于咖 啡因在加热以及酸性条件下，能与邻苯二胺反应生成浅橙黄色苯并杂 环类物质，此物质在4 8 8 n m 处有最大吸收。该方法线性范围为4 0 - 2 5 0 ug m l ，表观摩尔吸收系数= 6 1 9 x1 0 4 l t o o l 。1 c m 一，相对标准 偏差r s d = i 2 ，回收率为1 0 0 1 0 5 。该法成功地用于茶汤中咖啡因 的测定。丫 关键词茶辞：茶；葫；咖靠卤；间接原享焱法；分嘉磊法： 流动注射化学发光法； 、 i i 西j e 大掌硕士掌位论文 擅要 s t u d i e so nt h em e t h o d so fd e t e r m i n a t i o no f f u n c t i o n a l c o m p o n e n t s i nt e a a b s t r a c t t h i st h e s i sh a ss t u d i e dt h ea n a l y t i c a lm e t h o d so fd e t e r m i n a t i o no f f u n c t i o n a lc o m p o n e n t so ft e a f o u rn e wd e t e r m i n a t i o nm e t h o d so ft e a p o l y p h e n o l s a n dt w on e wd e t e r m i n a t i o nm e t h o d so fc a f f e i n u ma l e r e p o r t e d t h e m e t h o d sh a v eb e e na p p l i e dt o a s s a y t h e s a m p l e s a n d s a t i s f a c t o r yr e s u l t sw e r eo b t a i n e d i ti n c l u d e ss i xp a r t sa sf o l l o w s ： p a r t1 ：r e v i e w ar e v i e wo f t h e p u b l i s h e da 1 1 州c a l m e t h o d sf o rd e t e m f i n a t i o n o f t e a p o l y p h e n o l s a n dc a f f e i n u mi sg i v e n p a r t2 ：i n d i r e c tm e t h o do fa t o m i c a b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y t od e t e r m i n a t i o n o ft e a p o l y p h e n o l s a n e wi n d i r e c tm e t h o df o r d e t e r m i n i n g t e a p o l y p h e n o l sb ya t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p yi s s t u d i e d t h eb a s i si s t e ap o l y p h e n o l sc o u l dr e a c tw i t hp b 2 + a n dl e a dt oy e l l o w p r e c i p i t a t e t h e p r e c i p i t a t ei sc e n t r i f u g e d t os u b s i d e ，t h ep b 2 + i n s u p e m a t a n t i sd e t e r m i n e d b ya a s ，a n d t h ec o n c e n t r a t i o no ft e ap o l y p h e n o l si so b t a i n e d t h el i n e a l r e g i o n i s3 0 2 5 0u g m l 1 , r s d = i 3 a n d t h er e c o v e r yi s9 8 4 1 0 0 w h e nt h em e t h o di sa p p l i e dt od e t e r m i n et e a p o l y p h e n o l s ，i tc a no b t a i n g o o d r e s u l t p a r t3 ：d e t e r m i n a t i o no ft e ap o l y p h e n o l sb ya m m o n i u m m o l y b d a t e i i i 西j 匕犬掌硕士掌位 l ? 丈 棚| 要 s p e c t r o p h o t o m e t r y an e w m e t h o df o rd e t e r m i n i n gt e ap o l y p h e n o l sb y a m m o n i u mm o l y b d a t es p e c t r o p h o t o m e t r yw a ss t u d i e d t h eb a s i si s t e a p o l y p h e n o l sc o u l d r e a c tw i t ha m m o n i u m m o l y b d a t ea n d t h ey e l l o we s t e r m o l y b d a t ew o u l db ep r e s e n t e di n s o u rs o l u t i o n t h el i n e a rr e g i o nw a s 4 0 3 6ug m l e _ 2 1x1 0 5l m o l 1 c m 1 ，r s d = i 3 a n dt h e r e c o v e r yi s 1 0 0 1 0 5 w h e nt h em e t h o di s a p p l i e dt o d e t e r m i n et e a p o l y p h e n o l s ，i t c a l lo b t a i ng o o dr e s u l t p a r t4 ：d e t e r m i n a t i o no ft e a p o l y p h e n o hb y d i f f e r e n t i a ls p e c t r o p h o t o m e t r y i nt h ep a p e r , am e t h o df o rd e t e r m i n i n gt e ap o l y p h e n o l sb yd i f f e r e n t i a l s p e c t r o p h o t o m e t r y w a ss t u d i e d t h el i n e a r r e g i o n w a s2 0 - 1 2 0pg m l ， = 1 9 7 x1 0 5l t o o l 1 c m 1 ，r s d = i 3 a n dt h er e c o v e r yi s9 7 5 - 1 0 2 i tc a nb es u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ea s s a yo f t e a p o l y p h e n o l s p a r t5 ：d e t e r m i n a t i o no ft e a p o l y p h e n o l s i nt e a u s i n gf l o w - i n j e c t i o n i n h i b i t o e h e m i l u m i n e s e e an o v e lf l o wi n j e c f i o nm e t h o d a s i t hi n h i b i t o r y c h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mf o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft e ap o l y p h e n o l sw a s p r e s e n t e d t e ap o l y p h e n o l s c o u l di n h i b i tt h ec lr e a c t i o no f l u m i n o l h 2 0 2 k 1 0 4s y s t e mi n a l k a l i n e a q u e o u s s o l u t i o na n dt h ec l e m i s s i o nw a s i n v e r s e l yc o r r e l a t e dw i m t h et e a p o l y p h e n o l sc o n c e n t r a t i o n t h el i n e a rr a n g ew a s0 8 2 4u g m l w i t h ad e t e c t i o nl i m i to f 0 0 3u g m l 一，t h er e c o v e r yw a s1 0 2 - 1 0 5 ，t h es a m p l i n g 疳e q u e n c yw a s2 4 0 t i m e s p e r h o u r w h e nt h em e t h o di sa p p l i e dt od e t e r m i n et e a p o l y p h e n o l s ， i tc a r lo b t a i n g o o d r e s u l t i v 西j e 大掌硕士掌位论文摘要 p a r t6 ：d e t e r m i n a t i o no fc a f f e i n u mi nt e ab y0 - p h e n y l e n e d i a m i n e s p e e t r o p h o t o m e t r y a n e wm e t h o df o r d e t e r m i n i n g c a f f e i n u m b y d p h e n y l e n e d i a m i n es p e c t r o p h o t o m e t r y w a ss t u d i e d t h eb a s i si s c a f f e i n u mc o u l dr e a c tw i t h d - p h e n y l e n e d i a r n i n e a n dt h e y e l l o wl i g h t o r a n g er e s u l t a n tw o u l d b ep r e s e n t e di ns o u rs o l u t i o n t h el i n e a rr e g i o n w a s4 0 2 5 0u g m l 一，= 6 1 9 x1 0 4 ，r s d = i 2 a n d t h er e c o v e r yw a s 1 0 0 1 0 5 i tc a nb e s u c c e s s f u l l ya p p l i e d t ot h ea s s a yo f c a f f e i n u m k e y w o r d st e a ；t e ap o l y p h e n o l s ；c a f f e i n u m ；a t o m i ca b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y ；s p e c t r o p h o t o m e t r y ；f l o wi r l j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e v 独创性声明 y 1 0 9 以0 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的成果，也不包含为获得西北大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中做了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签字：触吃签字日期：卿年争月z 日 西北大掌司e 士掌位论文 第一幸蟓遗 第一章综述 茶叶的化学成分，粗略的估计，经过分离和鉴定的有机化合物约 有4 5 0 种以上，无机矿物元素也不少于1 5 种。近年来，倍受人们关 注的是茶多酚和咖啡因两种成分，它们被称为茶叶的功效成分，这不 仅是因为它们在茶叶中的含量高，而且更重要的是它们具有很高的食 用、医用价值。本文在近年来报道文献的基础上，总结了分析测定茶 多酚和咖啡因的方法，综述如下。 一茶多酚的分析测定方法研究 茶多酚( t e ap o l y p h e n o l s ，简称t p ) ，又叫茶单宁、茶鞣质，是 一类具有抗氧化作用的酚类化合物，其含量占鲜茶叶干物重的1 5 2 5 ，是决定茶汤滋味、颜色的主体成分，也是决定茶叶品质的关键 性物质。而且它具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血 脂、降血糖、抗龋护齿、抑菌等多种保健和药理作用卜2 1 。从二十世 纪8 0 年代开始，它已被广泛应用子食品、医药、化妆品等方面3 4 】。 例如：在食品工业中，茶多酚作为一种高效低毒的天然抗氧化保鲜剂 【3 1 ，主要应用于油脂及其制品，油炸及烘烤食品，鱼及肉制品的保鲜， 可代替现在食品工业中常用的人工合成抗氧化剂丁基化羟基茴香醚 ( b h a ) 、丁基化羟基甲苯( b h t ) 。在国外，在烤小沙丁鱼上覆盖一 层含儿茶素的粉状绿茶，以阻止沙丁鱼中的油脂氧化而导致的褪色， 因此提高了食品的商业价值；在方便面加工中，茶多酚的最佳添加量 西j e 大掌司e 士学位论文第一幸埭遗 为5 0 p p m ，添加后每包方便面成本只增加0 0 0 5 元，却有效地延长了 保质期，且有益健康。在医药应用方面，由于多酚类能沉淀菌体蛋白 质而表现出相当的抗菌能力。日本市场有用茶提取物或0 1m g m l 1 的茶多酚制成去除牙斑的牙粉、口香粉和漱口剂。实际调查还表明【4 】， 茶多酚对人的胃癌m k n 细胞株生长抑制作用明显超过抗癌药物5 氟尿嘧啶( 5 - f u ) ：1 2 5 1 t g 茶多酚的抑制率为1 0 0 ，而5 - f u 要达到 同样效果则需要5 0 0 1 tg 。茶多酚作用2 4 小时后就可看到明显的抗癌 效果，而5 - f u 此时效果不明显，且有毒副作用。因此，无论从时效 关系或量效关系看，茶多酚的抗癌活性都高于5 - f u 。近几年以来， 人们还根据茶多酚有抗氧化，吸收紫外线及杀菌，消炎祛臭，防止皮 肤过敏和衰老等功能特点，已研制开发出了茶多酚防晒霜、护肤霜、 清凉浴露等三种化妆品，均有良好的使用效果。 茶多酚的分析测定方法，近年来有很多报道胪q 刁，其中以分光光 度法 5 - 1 8 】、高效液相色谱法 1 9 - 2 q 为主。分光度法包括紫外可见 5 - 1 1 】、 原子吸收分光光度法【1 2 1 嬲等，它们广泛应用于茶汤中茶多酚的分析。 另外，气相色谱法【5 1 、毛细管电泳法1 2 7 3 1 】、高锰酸钾滴定法【5 】、红外 吸收光谱法 3 3 3 5 1 等亦用于茶多酚的分析测定。具体如下： 1 紫外可见分光光度法 s - 1 1 1 紫外可见分光光度法常用于茶汤中茶多酚的测定，它可以分为 直接紫外分光光度法和可见分光光度法。 1 1 直接紫外分析法阶6 1 茶多酚是一类具有2 苯基苯并吡喃的衍生物，其结构通式为： 西j t 大掣嘎士掌位论文第一 i 遗 由于结构中r l 、r 2 基的不同，茶多酚可分为六大类：黄烷醇类( 儿 茶素) 、花色苷类、羟基- 4 】一黄烷醇类( 花白素) 、黄酮类、黄酮醇类 ( 如槲皮素) 、酚酸类。 直接紫外分析法的原理是基于茶多酚的不饱和结构阁，在3 2 0 3 8 0 n t o ( 吸收带i ) 和2 4 0 2 7 0n n l ( 吸收带i i ) 的两个区域有深度 吸收峰，这种直接紫外分析法定量的依据是：黄烷醇、花白素和茶没 食子素在紫外光照射下显现出了两个显著的吸收带，其最大吸收峰分 别为2 0 5n l t l 和2 7 5 n m 。绿原酸和黄烷醇的吸收光谱不一致，且这些 物质仅占多酚总量的极少一部分量，故在2 0 5n m 和2 7 5 n m 波长处的 直接紫外测定可以认为是多酚总量测定的有用方法 6 1 之一。但在 2 7 5 n m 处进行测定时，首要解决的问题是必须将咖啡碱全部除去，因 为咖啡碱在2 7 2 n m 处亦有较大吸收。 1 2 可见分光光度法1 7 - 1 1 i 可见分光光度法的原理之是基于茶多酚所具有的多酚羟基结 构有很强的还原性，可以通过它还原一些金属离子，利用金属离子与 有机试剂的络合显色反应而间接地测定茶多酚的含量，如o i o w a h l 【7 】 用茶多酚定量还原三价铁为二价铁，使其与1 ，1 0 一二氮杂菲显色生成 稳定的红色络合物，其颜色的深浅与茶多酚的含量成线性关系，从而 西j t 大掌硕士掌位论文，书一j 燎遗 用比色法间接地测定茶多酚的含量。另外还可以通过茶多酚还原一些 有机物或无机化合物，通过显色反应而间接地测定茶多酚的含量。如 a m i n a s t 8 1 发现，茶多酚在碱性介质中、9 0 c 温度下、反应1 5 m i n ， 能还原四唑蓝成为深色的甲簪( f o r m a z a a e ) 衍生物的原理，提出了一 种简便、快速、准确的茶多酚测定方法；t o r o n d z h a d z eg i 等人唧利 用高锰酸钾与茶多酚的氧化还原反应，在5 0 0 5 2 0 n m 处测定了吸光 度，比较氧化作用前后高锰酸钾溶液的吸收值，从而间接的测定茶多 酚的含量。 该方法的原理之二是茶多酚结构中的邻酚羟基能与一些金属离 子络合而显色。如：胡冠时等人将茶叶水浸提液用乙醇正丁醇 ( 1 ：1 ) 试液稀释约1 0 倍，依次加入n a n 0 3 、趾 0 3 ) 3 、k o h ，多酚 类物质与三价铝即显示稳定的红色，在5 0 5 n m 处有最大吸收，茶多 酚含量在3 2 0 - 1 6 0 o m g m l 。1 浓度范围内，吸光度和浓度成良好线 性关系；王丽珠等人1 1 】，利用酒石酸亚铁中的二价铁离子与茶多酚络 合而生成紫红色的络合物，这种络合物的颜色的深浅与多酚类物质的 含量成正比，因此可用比色法来测定多酚总量，此法虽可避免滴定法 中因终点难以掌握而产生的误差，但酒石酸亚铁与酯型几茶素呈色较 强，而非酯型儿茶素呈色较弱，再者茶中的组成也同样因不同样品来 源而异，这一切也都影响了此法的准确性，但因其方便而为人们常采 用。 2 间接原子吸收法1 1 2 1 8 l 原子吸收分光光度法本身并不能直接用于茶多酚的分析测定，它 西j 匕大掌硕士掌位忱- 文第一章蔫 必须借助于茶多酚与金属离子的反应，然后通过测定生成物中金属离 子或剩余的金属离子量而间接测定之。目前文献报道的用于测定茶多 酚的原子吸收法，主要是利用茶多酚分子结构中的邻酚羟基与金属铜 离子络合而生成沉淀，通过原子吸收法测定沉淀或上清液中剩余的金 属离子，从而间接地求得茶多酚的含量。如c o o m a n s 等人旧用 c u ( a c ) 2 与茶多酚反应生成难溶性的c u - 茶多酚化合物，经分离后， 用原子吸收法测定滤液中过量的c u 或将沉淀消化溶解后测定其中的 c u ，由此间接地测定茶多酚，由于生成的c u - 茶多酚化合物在水中的 溶解度较大( 浓度可达2 0 0 1 t g m l 以以上) ，因此，测定误差较大。 王吉德等人埔1 对上述方法加以改进，用甲基异丁酮和丁醇的混合物溶 剂萃取茶汤中的茶多酚，加入碱性c u 3 ( p 0 4 ) 2 悬浮液反萃取，并与茶 多酚作用生成水溶性的c u 茶多酚化合物，重新转入水相，离心沉降 未作用的c u 3 0 4 ) ：后，用原子吸收法测定水溶液中的c u ，可求得茶 多酚的含量。 3 高效液相色谱法【1 9 2 6 】 色谱法常用来分离测定茶汤中的茶多酚，分离后的茶成分可和一 定的显色剂作用，然后比色定量，由于它专属性强、灵敏度高，可同 时用于茶多酚的检测和含量测定。1 9 7 4 年美国h o e f l e ra c 等人5 1 提 出了测定茶叶中多酚物质的i - i p l c 法，配合使用反向键合填充剂，可 将茶汤直接注入色谱柱，3 0 m i n 之内就达到了理想的分离，配以紫外 检测器就能迅速准确的测定出多酚物质的含量。完全消除了气相色谱 【5 1 分析中样品萃取、浓缩、转溶、衍生、内标等繁琐步骤，大大缩短 西j 匕大掌司f 士掌位论文，f 一 i 连 了分析时间，减化了分析手续，提高了分析的准确性；r a h h h 等人 0 9 用h p l c 在c 1 8 柱上测定t j i , 茶素类，当将常规的a o a c 法流动 相，即m e o h m e c n h o a c i - 1 2 0 混合液改为0 0 6 磷酸盐溶液 m e c n - d m f e t o a c 混合液( 9 0 0 ：6 3 ：2 5 ：2 5 ) 时，其保留时间从原来的 4 5 m i n 缩短到2 8 m i n ，分析灵敏度得以大大提高；梅恒敬三等人口明用 带电化学检测器的h p l c 法分析食品中的儿茶素，实验用电化学检测 器为医理化9 8 5 ，色谱柱为c a p c e l lp a kc 1 8 ，流动相为含o 1 m m o l l 1 e d t a 和1 0 1 5 乙腈的1 0 0 mm o l l 。1 磷酸缓冲液 ( p h = 2 5 ) ，流速为l m l m i n 1 ，在室温条件下分析，此方法的灵敏 度为一般紫外检测器的1 0 0 0 倍以上，且专一性强。 4 乐文太尔滴定法i 卯1 该方法的测定原理是茶多酚具有强还原性，可利用高锰酸钾氧化 滴定法测定茶多酚含量，其经典方法是乐文太尔滴定法，此法以酸性 靛兰或靛红作指示剂，用高锰酸钾进行氧化滴定。其滴定值乘以换算 指数习即为酚类物质的总量。酸性靛兰或靛红成兰色，由于其分子中 具有丑结构，故可被氧化，氧化后双键饱和，颜色变为黄色， 所以滴定中颜色由蓝变黄时，即为滴定终点。但茶叶中的桂皮酸的衍 生物如咖啡酸中的烯链也可被氧化，因而滴定值是还原性多酚类的近 似值。此方法的含量换算指数原来是采用聂鲍尔的指数4 1 6 ，而在 1 9 7 4 年金杰森指出应改为5 6 4 ，认为更为准确。此法虽缺乏准确性， 但因其简便而为一些人所使用。 5 毛细管电泳测定法2 w 1 1 西j 匕犬掣蝎甄士学位论文】f 一，i 遣 毛细管电泳法是指溶质以电场为推动力，在毛细管中按淌度差异 而实现的高效快速分离的新技术。这类方法的特点是操作简单分离效 率高速度快。近几年，这种方法用于茶叶中茶多酚的分离检测日益增 多，有关的文献也不少。如a c r el1 2 7 采用5 7 c m x 7 5 um 内径x 3 7 5 l am 外径的毛细管柱，用0 1 5 m o l l 1 硼酸作为缓冲液( p h = 8 5 ) ， 在2 1 0 n m 处进行荧光检测；h i d e k ih 【2 明采用硅毛细管柱和硼砂缓冲 剂( p h = 8 o ) 将茶叶浸出液各成分分离，在2 0 0 n m 处的紫外光谱下 检测其含量。 6 其它的分析方法 3 2 - 3 7 l 还有其他的些分析方法也可用于茶多酚的分析，例如核磁共振 法【3 2 1 、近红外分析法【3 3 q 6 】、示波电位法【3 ，】等。如d a v i sa i 等人【3 2 】 采用2 d 质子- 碳关联h m q c 和h m b c ，以及1 d n o e 差示光谱仪， 以丙酮d 为溶剂对茶多酚进行了1 h 和1 3 c 的核磁共振分析；丁亚平 等人口刀利用k b r 0 3 和k b r 的氧化还原反应与茶多酚的溴代反应间的 速度差异，将动力学分析与示波电位法结合起来，在0 0 3 2 m o l l 1 h c l 介质中，k b r 0 3 和k b r 浓度为0 0 0 0 5 和o 0 0 1 t o o l l d 时进行了茶多 酚含量的测定，方法检出限为3 8 l a g l ，r s d = 2 8 。 随着对茶多酚的深入研究，特别是茶多酚作为食品保鲜剂、天然 食用素、保健食品、抗肿瘤食品、防紫外线化妆品、抗龋牙膏以及环 境净化剂等新用途的开发，一定会有一些灵敏度更高、更简便的方法 涌现。 西j 匕大尊蜗孵士学位论文】亨一，l 囊逮“ 二咖啡因的分析测定方法研究 咖啡因的化学名称为1 , 3 ，7 一三甲基一2 ，6 一二氧嘌呤，分子式为 c s ! - 1 1 0 0 2 n 4 ，其结构式为： ，在茶叶中的含量约为1 5 ，是决定茶汤滋味、颜色的主体成分， 也是工业上提纯天然咖啡因的主要来源之一；而且它具有重要的药理 功能，如能兴奋神经中枢、消除疲劳、解酒、急救呼吸衰竭、利尿等 等，历来为食品界、医学界人士所重视。在茶叶化学成分中对咖啡因 的研究比较早，远在1 9 2 7 年o u d r y t 5 1 就从茶叶中分离出咖啡因，接着 对其进行提取、纯化，并进行了定性、定量方法的研究。 以前常用的分析测定方法是重量法、碘量法、比色法，这些方法 各有其特点。重量法是用氯仿抽提出一定量的咖啡因，经过称重求得 其重量。碘量法是在酸性条件下，加标定过的碘液，使咖啡因和碘结 合形成不溶的过碘化物，用淀粉滴定溶液中剩余的含碘量，经换算求 出咖啡因含量。而比色法是用磷铝酸和咖啡因显色后，经比色求出咖 啡因含量。这些方法虽然简便，但因其灵敏度低而逐渐被一些新的方 法所代替。近年来，已广泛应用紫外分光光度法和色谱法测定茶叶中 的咖啡因，具体介绍如下： 1 紫外分光光度法 紫外分光光度法大量地用于咖啡因的检测，其中主要有直接紫外 西j t 大掌硕士掌位论文第一， _ 篷 分光光度法和导数紫外分光光度法。 1 1 直接紫外分光光度法 3 8 3 9 1 该方法的原理是利用咖啡因结构上的瞟呤环具有共轭双键体系， 有着独特的吸收光谱。研究表明，咖啡因在2 7 2 2 7 4 n m 范围内有最 大吸收，其吸光度值与咖啡因含量成线性关系，因此可用分光光度法 测定之。如咖啡因国际标准测定法d s ，是用氨溶液提取样品中的咖啡 因，在分别装有碱、酸性介质的色谱柱中用乙醚与淋洗剂纯化咖啡因， 然后用氯仿提取，并用分光光度法在2 7 2 2 7 4 n m 范围内检测；u l l a h m r 【3 明等人用氯仿回流提取，以氯仿为空白，在紫外2 7 6 n m 处测定溶 液的光密度值，溶液中咖啡因的浓度在2 0 - - 6 0 l ag m l 1 范围内符合 b e e r 定律。 1 2 导数紫外分光光度法1 4 0 。“1 导数紫外分光光度法是利用导数技术进行分光光度分析，解决混 合组分测定时的相互干扰，同时更有效地消除浑浊液的散射影响、背 景吸收，也可以提高光谱分辨率。近年来，此方法被广泛用于咖啡因 的分析。如a b d e l m o e t ye m 【4 0 l 发现在波长为2 8 7 n m 处，咖啡因水溶 液的( 入) 数值为2 9 7 5 2 ，采用一阶导数分光光度法测定咖啡因 可消除其它组分对吸光度的干扰；g a r c i ac c 等人【4 1 佣二阶导数分光 光度法测定了咖啡和茶叶浸提液中的咖啡因含量，用最大波长 2 9 2 5 n m 和最小波长2 7 2 5 n m 的测定差值来计算咖啡因的含量，用 m g o 和c a r r e z 试剂抑制干扰物质的干扰；a b u i r i e i em a 等人4 刁用同 一样品测定了三种物质，所用光度计要求有导数光谱附件，一、二阶 西北大掌硕士掌位论：b 第一幸i 囊逮 导数光谱狭缝宽度为2 n m ，扫描速度为2 0 n m s ，用氧化钬矫正波长， 用2 4 8 n m 的一阶导数光谱测定可可碱，用2 7 8 n m 的二阶导数光谱测 定茶碱，用零阶光谱补偿法测定咖啡因，此方法用于茶叶中生物碱的 测定，具有很高灵敏度和准确度。 2 色谱法1 4 5 - - 5 3 1 这种方法的原理是基于组分通过互不相溶的两相而进行先分离、 后检测的方法。用于咖啡因的检测主要有高效液相色谱法( h p l c ) 、 薄层色谱法( t l o 和气相色谱法( o s ) ，具体介绍如下： 2 1 高效液相色谱法( h p l c ) 4 5 铷1 由于它专属性强、灵敏度高，可同时用于有关物质的检测和含量 测定。用于样品测定一般不受其它组分的影响，如咖啡、茶叶浸提液 可直接测定。此外还用于样品的分离分析。如功刀章1 4 5 等取咖啡、 红茶、绿茶的热水浸提液装入e x t r e l u t 柱，l o m i n l 后，用二氯甲烷淋 洗，收集溶出液。色谱柱为l i c h r o s o r bs i b o ( 4 r a m x 2 5 0 m m ) ，流动相 为水饱和二氯甲烷：乙醇( 9 7 ：3 ) ，流速为l m l m i n ，波长为2 7 5 n m ， 用紫外检测法测定；n a i kj e 4 叼用b o n d a p a kc 1 8 柱，以乙腈水作流 动相，测定红茶和速溶茶中的咖啡因，获得满意的效果。 2 2 薄层色谱法 薄层色谱法虽然比高效液相色谱法灵敏度、分辨率差些，但操作 简单快捷，常用硅胶g ( 加适量c m c ) 或硅胶g f 2 5 4 板，所用溶剂系 统一般为氯仿、甲醇或苯加上一定量的有机酸、有机碱如甲酸、乙酸、 浓氨水、三乙胺等，检测常用紫外2 5 4 n m 、3 6 0 n t o 。如张秋萍【5 2 1 等人 西j 匕大掌硕士学位论文 ：l l g 一a l e - 遣 采用硅胶g f 2 5 4 薄层板，以苯乙醚乙酸- 甲醇( 1 0 0 ：5 0 ：1 5 ：1 ) 为展开 剂，分离茶叶和饮料中的咖啡因，再以日本岛津c s 一9 3 0 薄层扫描仪 测定咖啡因含量。 2 3 气相色谱法1 5 2 - - 5 3 1 茶叶浸提液中的咖啡因用气相色谱法分析的文献也不少，如 a b d e l m o e t ye m h 叫以样品分析柱为填充柱，内装涂有3 甲基硅酮 的硅藻土( 经酸洗和硅烷化) ，以巴比妥为内标物，检测器为f i d ， 测定结果与导数法相同；郭炳莹5 2 1 利用氮磷检测器对含氮化合物的高 选择性，对咖啡因进行气相色谱分析，使用该法，连续进样1 0 0 个， 仪器灵敏度不下降，基线不漂移，测定灵敏度比标准法高。 3 其它方法 还有一些其它方法用于咖啡因的测定，例如间接原子吸收法嘲、 近红外分光光度法1 3 3 1 【5 叼等，如丁宁5 卅等人在1 3 0 0 - - 2 4 0 0 n m 波长范围 内用近红外分析法测定绿茶中的咖啡因获得满意效果。 总之，随着对咖啡因研究的不断深入，特别是它作为茶叶、咖啡 两大世界饮品的主要成分，一定会有一些新的测定方法出现。 苜北大学硕士掌位论文一第= ，i 间接康于吸收法测定茶叶中藁多盼的舌1 第二章间接原子吸收法测定茶叶中茶多酚的含量 l 引言 茶多酚又叫茶单宁、茶鞣质，是决定茶汤滋味，颜色的主体成分。 它的药用价值很高，具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血糖、 抑菌等多种保健和药理作用。其测定方法主要有高锰酸钾滴定法【6 0 】、 酒石酸亚铁比色法【1 1 】。近年来，用原子吸收法间接测定茶多酚已有报 道7 1 8 1 ，但存在一些弊端，如c o o m a n s 等人1 7 1 用c u ( a c h 作为茶多 酚的络合沉淀剂，其生成物在水中溶解度较大( 浓度可达2 0 0 u g m l 。1 以上) ，因此误差大，难以达到测定的目的；王吉德等人1 8 1 对上述原 子吸收法虽进行了改进，但需要用有机溶剂进行萃取，操作繁琐。 本文利用碱式乙酸铅做茶多酚的络合沉淀剂【5 】【1 6 】产生难溶的黄 色沉淀，通过原子吸收法测定上清液中p b 2 + 的浓度，从而得到一种间 接测定茶多酚的方法。本法具有简便、快速、灵敏度高、试剂用量少 等优点，用于实际样品测定，结果满意。 7 2 实验部分 2 1 仪器和试剂 t a s 9 8 6 原子吸收分光光度计( 北京普析通用仪器有限公司) ；铅 空心阴极灯；数显恒温水浴锅 玎壬4 ( 常州国华电器有限公司) ；酸度 计：p l u s4 2 0 a ( 美国o r i o n 公司) ；x y j s o 一2 离心沉淀机( 江苏医疗仪器 厂) 。 西j t 大掌硕士掌位论文第= 幸间接屎子吸收法测定，叶中蓁多盼的含量 茶多酚标准溶液：用茶多酚标准品( 鼎国生物责任有限公司提供) 配成1 0 m g m l 。1 的储备液，使用时稀释成o 1 m g m l 。1 的标准使用 液；碱式乙酸铅溶液：1 0 m g m l ，用时稀释成0 i m g m l 。的标 准使用液。 以上试剂均为分析纯，水为二次去离子水。 2 2 仪器最佳条件 波长2 1 7 n m ；通带宽度0 4 r i m ；灯电流3 0 m a ；燃烧器高度5 m m 。 2 3 方法原理 茶多酚的基本结构通式为： 由于茶多酚分子结构中存在酚羟基，故茶多酚在中性介质中能与铅离 子发生络合反应而产生难溶的黄色沉淀，经离心分离后，通过原子吸 收法测定上清液当中过量的p b 2 + ，从而可以间接测定出茶多酚的含 量。 2 4 实验方法 移取一定量的茶多酚标准使用液于1 0 m l 离心试管中，加l m l 1 0 m g m l 。1 的碱式乙酸铅溶液，用水冲至刻度，充分混匀，在8 0 ( 2 水浴中反应2 0 m i n ，冷却后离心分离，小心吸取上清液2 m l 于1 0 m l 比色管中，用水冲至刻度，以水为空白，喷入空气乙炔火焰，测定 其吸光度。 西北大掌硕士掌位论文第= 幸间接康子吸收法删定著叶中繁多酚的含量 2 5 工作曲线的绘制 2 5 1 以铅为标准的工作曲线 依次移取0 0 、0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 m l 的0 1 m g m l j 碱式 乙酸铅溶液于1 0 m l 比色管中，加水至刻度，标准系列浓度为0 0 、 5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 、2 5 0l ag m l ，喷入空气一乙炔火焰测其吸光 度，以爿g 。绘制工作曲线，结果见图1 。其线性回归方程和相关系 数分别为a = 0 0 2 5 5 6 c + 0 0 0 0 6 ( c ：ug m l j ) ，r = 0 9 9 9 4 。从以铅为 标准的工作曲线可直接查出上清液中剩余铅的含量，从而计算出反应 的铅的量。 051 0l bz 0z 53 u c ( ug 啊l 一1 ) 图1 以铅为标准的工作曲线 f i g 1c a l i b r a t i o n c u r v e so f l e a d 2 5 2 以茶多酚为标准的工作曲线 依次移取0 0 、0 3 、0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 m lo 1 i n g m l 。1 的茶 多酚使用液于1 0 m l 离心试管中，标准系列浓度分别为0 0 、3 0 、5 0 、 1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 、2 5 0ug m l 一。按实验方法测定，以吸光度a 对 茶多酚使用液的浓度绘制工作曲线，结果见图2 。其线性回归方程与 相关系数分别为为：a = - 0 0 0 9 7 c + 0 5 0 5 2 ( c ug m l 1 ) ，r = 0 9 9 9 5 。 8 6 4 2 o o o o o 弋 曹j 匕大掌硕士学位论文，t 二章间接屎子吸收法测定茶叶中蓁多昀的舌| 在此工作曲线上可直接查出茶多酚的含量。 0 6 0 4 0 2 0 01 02 03 0 c ( ug m l 一1 ) 图2 以茶多酚为标准的工作曲线 f i g 2c a l i b r a t i o nc l l r v e $ o f t e ap o l y p h e n o l s 3 结果与讨论 3 1 反应温度的影响 取2 m l 茶多酚标准使用液，按实验方法在2 0 1 0 0 c 范围内进行 实验，测定其吸光度，结果如图3 所示。结果表明，随着温度的升高， 沉淀增多，温度超过8 0 c 以上a 值稳定，因此，本文实验在8 0 。c 水 浴中进行。 02 04 06 08 01 0 0 t 图3 反应温度的影响 f i g 3e f f e c t o f r e a c t i o n t e m p e r a t u r e 3 2 反应时间的影响 西j e 大掌硕士掌位论文第= 章间接原子吸收法测定蓁叶中繁多盼的音量 取2 m l 茶多酚标准使用液，按实验方法操作，在沸水浴中反应不 同的时间，测定其吸光度，如图4 所示，结果表明，反应时间2 0 m i n 以后吸光度值趋于稳定。本文选用反应时间为2 0 m i n 。 o 6 0 4 0 2 o 01 02 03 04 0 t ( m i n ) 图4 反应时间的影响 f i g 4e f i e c t o f r e a c t i o nt i m e 3 3 溶液p h 值的影响 取2 m l 茶多酚标准使用液，在溶液不同p h 值条件下，按实验方 法进行实验。结果如图5 所示。由图看出溶液p h 在5 8 范围内，a 值小而稳定，说明此时沉淀最多，反应比较完全。当p h 8 以后，溶液成强碱 性，铅容易形成p b 0 2 2 酸根，使一部分沉淀生成物溶解，使测定结 果偏低。因此本文反应在中性介质中进行。 3 4 试剂的浓度及用量的影响 碱式乙酸铅溶液的用量对测定结果有一定的影响，本文选用不同 量的铅试剂进行试验，结果表明沉淀剂用量太少，沉淀不易生成；用 量太大时，造成标准曲线弯曲，且本实验是测定上清液中铅离子的剩 西北大掌硕士掌位论文第= 章间接瓜子吸收法测定摹叶中繁多酚的含量 余量，铅试剂过多，给稀释带来麻烦。综合考虑，本文选用l m g 1 l 。1 的碱式乙酸铅溶液l m l 。 o 6 o 4 o 2 o o51 0