（果树学专业论文）五种柑橘病害的RTPCR及多重RTPCR检测研究.pdf

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( a ) 加尾的柑桔裂皮病同样可以用 0 1 i g o ( d t ) 反转录的r t - p c r 检测出，通过测序分析，其同源性在9 6 以上，并发现 在c e v 序列中有一个富含a 的区段。在此基础上结合二重r t p c r 体系，进一步 研究了同时检测c t v 、c e v 和c t l v 的多重r t p c r 检测体系。 关键词：柑桔衰退病( c t v ) ：柑桔碎叶病( c t l v ) ；柑桔裂皮病( c e v d ) ： 柑桔黄龙病( h l b ) ；柑桔溃疡病( c b c d ) ；r t p c r ；多重r t p c r 分类号 u dc 密级 单位代码 湖南农业大学 硕士学位论文 夏季遮荫影响猕猴桃生长发育的研究 e f r e c t so f0 v e r h e a ds h a d i n go ng r o w t h ，d e v e l o p m e n t o f k i w i 舶i ti ns u m m e r 研究生姓名 指导教师 副指导教师 学科专业 研究方向 堡科焦 王生焱 硒究虽 王茎熬授 星越主 墨挝生堡垒查 提交论文日期 2 q q 生县l 旦论文答辩日期2 q 竖生且1 2 目 答辩委员会土席鳢晓红 论文评阅人互雪旺熬握；奎盎信9 9 班塞虽 学位授予日期 二oo 六年六月 x 前言 古籍禹贡记载4 0 0 0 年前的夏朝，我国的江苏、安徽、江西、湖南、湖北 等地生产的柑桔，己列为贡税之物。到了秦汉时代，柑桔生产得到进一步发展。史 记苏奏传( 西汉司马迁著) 记载；“齐必致鱼盐之海，楚必致桔柚之园”，说明楚 地( 湖北、湖南等地) 的柑桔与齐地( 山东等地) 的鱼盐生产并重。 唐宋时代，随着经济的发展，柑桔产区域分布与我国现代柑桔分布范围大致相 同。宋代欧阳修等撰著的新庸书，地理志中列举了现在的四川、贵州、湖北、湖 南、广东、广西、福建，浙江、江西及安徽、河南、江苏、陕西的南部，向朝廷纳 贡柑桔。当时，凡气候适宜栽培柑桔的地方，户户栽桔，人人喜食。 唐代诗人岑参在诗中吟道，“庭树纯栽桔，园畦半种茶”。唐代韦应物有诗云：“怜 君卧病思新桔，试摘犹酸亦未黄”。明清时期，柑桔业已发展到商品生产时代。清 代著作南丰风俗物户志记载江西南丰等地，整个村庄“不事农功，专以桔为业”。 闽杂记( 清施鸿保著) 记述了福州城外，“广数十亩，皆种柑桔”。岭南杂记 ( 清吴震方撰) 记载：广州可耕之地甚少，民多种柑桔以图利。 我国古代人民创造的柑桔科学技术，在世界柑桔生产史上也一直处领先地位。 战国时代( 公元前三世纪) 就知道桔、香橙、枳是属同一类的果树。南北朝时代的 古籍异苑中分出了“柑、桔、橙、柚”。唐书本草拾遗中记载了“朱柑、乳柑、 黄柑、石柑、沙柑”等五种柑类和五种桔类：“朱桔、乳秸、塌桔、山桔、黄淡子”， 并描述了“岭南有柚大如冬瓜”。世界第一部柑桔专著桔录几乎用了五分之三的 篇幅记载了真柑、生枝柑、海红柑、洞庭柑、朱柑、金柑、木柑、甜柑、橙子、黄 桔、塌桔、包桔、绵桔、沙桔、荔枝桔、软条穿桔、油桔、绿桔、乳桔、金桔、自 然桔、早黄桔、冻桔、朱栾、香栾、香圆、枸桔等2 7 种柑桔。他从果实大小、形 状，果皮色泽，剥皮难易，囊瓣数目，风味，种子多少，成熟早晚，以及树冠形态， 来描述品种的特性，并指出了命名依据，就是现代，对柑桔品种的描述，也不外乎 这些内容。 目前全世界有1 3 0 多个国家栽培柑桔，其产量为所有水果之酋，柑桔国际年贸 易额为6 5 亿美元，仅次于小麦( 1 6 0 亿) 和玉米( 1 0 0 亿) ，为第三大国际贸易农 产品。8 0 年代初，世界柑桔产量为5 3 0 0 万t ，1 0 年后达到近9 0 0 0 万t ，增长3 2 9 ，近年达到1 亿余t 。柑桔类果树，是世界上经济价值最高、栽培最广、发展最 快的果树之一，也是我国南方最重要的果树。自1 9 5 0 年后柑桔生产已作为主要项 目列入国家农业生产规划。柑桔生产进入了个崭新的发展阶段。栽培面积和产量， 以由建国初期的4 7 万亩、2 0 万t ，发展到1 9 9 1 年的1 0 6 0 多万亩、6 3 3 4 万t ( 1 9 9 1 ) ， 2 0 0 2 年产量达1 1 9 9 万t ，总面积居世界首位，总产量居世界第三；2 0 0 4 年，中国 相桔的生产面积为1 6 3 万h m 2 居世界一位；产量为1 4 9 5 8 万t 仅次于巴西( 2 0 5 9 4 万t ) ，首次超过美国( 1 4 9 0 8 万t ) 成为世界第二大柑桔生产国。 柑桔的生产、加工、运销和技术服务体系已初具规模，成为我国的一大产业， 跻身于世界柑桔主要生产国之列。我国柑桔发展形势喜人，但同时面临着重大挑战。 柑桔病害的蔓延己成为柑桔发展的重要制约因素，柑桔病害的防治成为柑桔研究工 作者的重要课题之一。 l 研究进展 1 1 五种柑桔病害研究进展 1 1 1 柑桔衰退病研究进展 柑桔衰退病( c i h l l s 驴如，删v i n l s ，c t v ) 又称速衰病，是世界性的柑桔病毒病 害，广泛分布于世界各柑桔产地，对全世界的柑桔产业造成了严重威胁。3 0 年代以 来，毁树达一亿株以上【l 】，最早是在南美洲的阿根廷和巴西发现，先后有5 0 多个国 家和地区有此病的发生，2 0 多个国家将其列为检疫对象1 2 】。在我国福建、浙江及广 东分布相当普遍。危害轻者可引起树势衰退，产量下降，品质变劣：重者可引起桔 树死亡，对柑桔高产优质生产构成严重障碍。 c t v 粒子大小为2 0 0 0 呦1 2 n m ，病毒基因组由含1 9 2 9 6 个核苷酸的正义单链 r n a ( + s s r n a ) 组成，是已知植物病毒中基因组最大的病毒。到目前为止已有多 种分离物的基因组序列已被测定：佛罗里达衰退株系分离物t 3 6 【3 l 和弱毒株t 3 0 1 4 】、 以色列衰退株系分离物v t 【”、加利福利亚的茎陷点株系分离物s y 5 6 8 【6 】、西班牙弱 毒株t 3 8 5 l ”。对t 3 6 的序列分析表明，c t v 基因组包括1 2 个开放阅读框架( o p e n r e a d m gf r a m e ，o r f ) ，至少编码1 9 种大小不同的蛋白质。c t v 酌基因组可能分为 两大区域：靠近5 端的o r f l a 和o 褂、l b 的负责编码与c t v 复制相关的蛋白质，包 括甲基转移酶、螺旋酶和依赖r n a 的r n a 聚合酶。这些复制相关蛋白是由o r f l a 和0 r f l b 编码的多聚蛋白前体在两个类似木瓜蛋白酶的作用下产生的。靠近3 端 的另一区域包括剩下的1 0 个0 r f ，其中包含长线形病毒所特有的5 个基因 ( o r f 3 一o r f 7 ) 。这5 个o r f 在基因组中的相对位置以及基因产物的氨基酸序列 在长线形病毒属中高度保守。3 端的1 0 个o r f 不能直接从基因组r n a 表达，但 在一系列o 9 8 o k b 共3 末端的亚基因组r n a 形成后就可以表达【侧。 衰退病毒存在明显的株系分化现象，不同的株系或分离物存在较大的差异。根 据不同分离物在5 种指示植物上显示的不同症状，可以把c t v 株系分为3 个组群： 衰退组群( d e c l i n ei n d u c i n g ，d i ) 、茎陷点组群( s t e mp m i n g ，s p ) 和苗黄组群( s e e d i n g v e l l o w ，s y ) 。引起以酸橙为砧木的甜橙、宽皮桔和葡萄柚衰退病的分离物为衰退 组群，它们侵染接穗后引起砧木韧皮部的坏死和植株的衰退。s p 组群侵染接穗后不 论其砧木如何，常导致植株矮化、果实变小、品质降低，茎陷点症状可表现在砧木 和接穗上【9 】。不同柑桔种类甚至同种问不同品种都对s p 组群的抗性不同，按感病程 度从强到弱依次为葡萄柚、甜橙、酸橙、宽皮桔、柚、金桔和枳【1 0 j 。s y 组群指侵 染酸橙、柠檬和葡萄柚后引起矮化和黄化症状，而侵染甜橙和宽皮桔不显症状豹株 系。另外c t v 株系有强弱之分，c t v 强、弱株系的区分，常规应用指示植物鉴定。 c t v 可以通过嫁接传播，在田间还可以通过桔蚜( z 缸印阳阳c 咖把眺艚) 、棉蚜 ( a 譬s 妒f f ) 、锈线桔蚜( 一p 向耐c f 肛缸d 肠) 和桔声蚜( t 口“阳h 饼) 传播。一般情况 下棉蚜为c t v 的有效传播介体，桔蚜为c t v 的最有效传播介体，传毒能力最强。 此外，c t v 还可以通过两种菟丝子植物( c 埘c “胁s “6 加c z 淞日和c 朋m 8 r 耙口舰) 传播 【】。由于柑桔是多年生作物，而c t v 主要通过蚜虫传播，因此在田问经常为多株 系混存，通过单蚜传毒可得到单一株系“。 1 1 2 柑桔碎叶病研究进展 柑桔碎叶病毒( c i t m st a t t e rl e a f v i r u s ，c t l v ) ，主要危害以枳及枳的杂种为 砧木的柑桔树。感病树表现为枳砧嫁接口附近接穗肿大，结合处环缢，呈黄褐色界 层，植株矮化，受强风等外力推动，砧穗结合处容易断裂，裂面光滑，叶脉黄化， 类似环状剥皮引起的黄化，黄化叶易脱落，严重时全树枯死【1 3 】。 柑桔碎叶病毒属发状病毒属( 国矽f f i o v 护姗) 怍”j 。该组成员还包括苹果茎沟病 毒( a p p l es t c mg r o o v m gv i m s ，a s g v ) ，苹果主要潜隐病毒之一，马铃薯t 病毒 ( p o t a t ov i m st ，p v t ) ，丁香褪绿叶斑病毒( l i l a cc l l l o r o t i cl e a f s p o tv i n l s ，l c t v ) 和天南苎茎陷点病毒( k n 枥h 口s t e mp m i n gv i m s ，n s p v ) 。病毒粒子弯曲线状， 大小约为1 5 n m x 6 0 0 一7 0 0 姗，基因组为一条单链正义r n a 分子，外壳蛋白分子量 为2 7 k d a 【1 7 - 1 9 1 。 k a z u y u k i 报道了一个c t l v 百合花分离物的基因组全长c d n a 序列。该病毒全 长c d n a 包含6 4 9 6 个核苷酸，除c t l v 3 端的p o l y ( a ) 尾巴外，推测包含有两个 0 i ，0 r f l ( 位于3 7 6 3 5 4 ) 编码分子量为2 4 2 k d a 前体蛋白；o r f 2 ( 位于 4 7 8 8 - 5 7 5 0 ) ，编码分子量为3 6 k d a 蛋白，2 4 2 k d a 多肽包含几个非结构蛋白功能域， 如甲基转移酶，n t p 一结合解旋酶，类木瓜蛋白酶和聚合酶，其c 端推测是衣壳蛋白 ( 2 7 k d a ) 。3 6 k d a 蛋白的n 端与含3 0 k 移动蛋白s u p e 血m i l y 的序列一致。c t l v 全长c d n a 序列与a s g v 序列非常相似，由此可认为c t l v 与a s g v 为同一个种【1 5 】。 m a g o m e j6 j 研究了来自苹果、日本梨、欧洲梨和柑桔的c ( 矽f ? f d v f ，啪p s 基因组分 子变异，发现来自苹果、日本梨、欧洲梨的a s g v 至少含有2 4 个核昔酸序列不同 的序列变异体( s e q u 肌c ev a r i a n t s ) 。a s g v 和c t l v 分离物或序列变异体的0 r f l 和o r f 2 编码蛋自的氨基酸序列比较表明：o f r 2 编码蛋白( 3 2 0 a a ) 和推测的衣壳 蛋白( 2 3 7 a a ) 的氨基酸序列具高度的保守性。o r f 2 编码蛋白氨基酸序列在1 5 个 分离物或序列变异体问的同源性达9 2 8 1 0 0 ；2 1 个分离物或序列变异体的c p 蛋白氨基酸序列的同源性达9 2 4 一1 0 0 。然而，由0 r f l 编码的变异区( v 一区) 的2 8 4 个氨基酸序列，在1 5 个分离物或序列变异体问的同源性却很低，只有2 0 4 。 在变异区( v 区) 、衣壳蛋白和o r f 2 编码蛋白的氨基酸序列构建的系统发育树中， 这些分离物或序列变异体可分为几个簇，与寄主来源( 苹果、日本梨、欧洲梨、柑 桔和百合花) 无关。两个来自柑桔的分离物在v 区氨基酸序列构建的系统发育树中 归属两个簇，每个簇均含有来自苹果和日本梨的分离物或序列变异体。因此认为来 自柑桔的c t l v 和来自蔷薇科的a s 0 v 均为a s g v 的株系。 1 1 3 柑桔裂皮病研究进展 柑桔裂皮病( c i 缸u s 蹦d c d ，出v i r o i d ，c e v d ) 的地理分布非常广泛，在世界柑桔 产区均有报道，造成了巨大的经济损失。该病自6 0 年代从美国传入我国的四川、 广西、浙江等地后，接着在湖南、福建、广东等地也相继发生，成为一种严重的柑 桔病害。柑桔裂皮病主要引起病树的砧木部分外皮呈纵向开裂、翘起，随后呈鳞片 状剥落，同时树冠表现矮化，新梢少而弱，叶片比正常的小，有的叶片叶脉及叶脉 附近呈绿色而叶肉变黄，类似缺锌后表现的症状。一般病树开花较多，但落花、落 果严重，产量显著降低。有些病树只表现裂皮症状而树冠不矮化，或只表现树冠矮 化而没有明显的裂皮症状。由于世界上广泛使用对柑桔裂皮病敏感的砧木品种，所 以其对柑桔的影响很大，但其主要危害幼苗及幼树，很少导致树体死亡，对成年树 造成的影响不大。还有相当部分树体内带有裂皮病类病毒，而外表不表现任何症状。 此外，s k o r i c 等。“研究发现，c e v d 症状的表现与温度有关，不引起明显症状的弱 毒株系，在4 0 生长时可以引起严重的症状。柑桔裂皮类病毒的寄主范围相当广， 除可感染柑桔外，还可引起葡萄、豌豆、番茄等发病”“。 柑桔裂皮类病毒属于马铃薯纺缍块茎类病毒属( 助印加加村) ，大小一般为 3 7 0 一3 7 5 m 。不同株系在序列和致病性方面都存在不同程度的差异，强毒株系在p 区 的中央核心部分有一段保守序列，而弱毒株系没有这段保守序列。g a r c i a - a r e n a l 等 吲从葡萄上分离到的c e v d - g 株系与强毒株系c e v d a 【2 3 】有9 2 的同源性，在t l 区、v 区、和p 区存在少数几个核苷酸的改变，并具有p 区的保守序列，而与毒株 系c e v d d e 2 6 的同源性为8 9 。m i s l m 等1 2 4 】从印度分离到的c e v d t 株系与澳大利 亚株系a 存在3 6 个核苷酸的差异，而与西班牙株系有5 2 个核苷酸的差异。 1 1 4 柑桔黄龙病研究进展 柑桔黄龙病( h u a n g l o n 曲i n g ，h l b ) 是柑桔生产上的一秘毁灭性病害，以前国 际上称该病为柑桔青果病( g r e e n i n g ) ，1 9 9 5 年1 1 月在中国福州召开的国际柑桔病 毒会议商定柑桔黄龙病作为该病统一名称口5 1 。柑桔黄龙病主要分布在亚洲和非洲 1 2 6 】。长期以来，该病在我国广东、广西、福建、台湾等地发生严重，造成巨大的经 济损失；在江西、浙江、四川、湖南、贵州、云南等省部分地区亦有发生，严重威 胁着中国的柑桔产业。 法国科学家l a n e c h e 和b o v e 于1 9 7 0 年首先在电镜下观察到来自南非和印度感 染黄龙病的甜橙叶片韧皮部的病原体，当时认为是类菌原体( m y c o p l a s m a l 珏( e o r g a l l i 锄s ，m l o s ) 。但g 锄i e r 和b o v e 发现黄龙病病原体的膜包被与典型的m l o s 不同，前者厚度在1 7 3 3 n n l 平均2 5 衄：后者只有7 - l o l l i l l 。故b o v e 建议黄龙病病原 应属于真细菌，为薄壁菌门( g m c f 船“胞) 中的一员【2 ”。以后通过电镜结合细胞化 学研究发现黄龙病病原体的外层壁与内层膜之间存在肽聚糖层( r 层) ，即与革兰 氏阴性细菌的细胞壁结构一致，g 锄i e r 【2 8 】认为黄龙病病原为革兰氏阴性细菌。由于 病原体至今还未能在人工培养基上培养成功，故称之为类细菌( b a d 【e r i u m 1 诖沱一 。蝗a n i s m s ，b l o s ) 或称难培养细菌( f a s 蛀d i o u sb a c t e f i a ，f b ) 也有称之为类立克次 氏体( 鼬c k c t t s i a - l i k eo r g a n i s m s ) 。 7 0 年代以来，我国学者对柑桔黄龙病开展了大量深入的研究，取得可喜的成就。 证明其病原物在形态结构等方而的性质与南非青果病病原十分相似，从而确定了黄 龙病的病原性质。以后研究发现我国( 包括亚洲其他国家) 的黄龙病与非洲青果病 在传病介体，热敏感性流行区域和血清学方面均存在差异分别称之为亚洲型和非洲 型【2 9 3 2 1 。 随着分子生物学的研究进展，为深入认识柑桔黄龙病病原性质提供了可能。 1 9 9 3 年v i l l e c h a n l o u x 等【”】人克隆了一个亚洲青果病菌系p o o n a ( 来自印度) 基因组 的1 个2 6 k b p d n a 片段并测定了其序列。发现该片段与高度保守的细菌g r p l k a i l r p o b c 操纵子一致，编码4 种核糖体蛋白( l 1 ，l 1l ，l 1 2 ，l 1 0 ) 。比较b l 0 5 操纵子和 来自基因数据库的其它细菌序列可以清楚地发现黄龙病( 青果病) 是b l o s 属真细 菌中的一员。以i n 2 6 k b p 片段与来自不同地区的柑桔青果病病原d n a 进行 s o u t h e m 杂交，发现i n 2 6 能在高度严格洗脱条件下与所有的亚洲菌系杂交，却不 畿与被测试的非洲菌系杂交：在不严格洗脱条件下链与非让硅菌系杂交，但其杂交图 谱表现不同反映了d n a 多态性。 以前的研究发现亚洲菌系与非洲菌系在传播介体、热敏性、流行区域和血清学 以及基因组特征方而存在差异。发生在亚洲的柑桔黄龙病属于耐热型病原，发病适 温为3 0 ，传播介体为亚洲柑桔木虱( d 垃p 厅d r 打聊c f 伊f ) m 1 ”；在非洲发生的柑桔黄 龙病属于冷凉型病原，发病适温为2 0 一2 5 1 ，传播介体为非洲木虱 ( n d z a g w 驴p a 口) o 。近来研究发现，两者在1 6 s r d n a 有9 7 7 同源性，但高度 保守的g r p l k a j l 堆o b c 操纵子却只有7 0 的同源性，因此认为亚洲菌系与非洲菌 系为同) 属于不同种，前者为c ( 眺出f “sz 而f m 6 c f e ，础抽“珥后者为g 引比如n 拈 ，f 6 p 阳6 口c 据，口挣f c d n 球珊【2 _ 7 。 1 1 5 柑桔溃疡病研究进展 柑桔溃疡病( c i t l l l s b a c t e r i a lc a l l i 【e r d i s e a s e ，c b c d ) 是一种世界性病害，被3 0 多个国家和地区定为植物检疫对象。此病起源于亚洲，分布于世界多个国家，以亚 洲国家发生最为普遍，故柑桔溃疡病又称亚洲病害。柑桔溃疡病也是我国柑桔产区 重要而又普遍的病害之一，尤以广东、广西、湖南、福建等省( 区) 受害严重。近 1 0 年来，其发生及流行有加重趋势，给柑桔业带来巨大的经济损失，引起了国内外 研究学者的高度重视，对此病的发生、检疫、防治等方面进行了深入研究。 柑桔溃疡病是一种细菌性病害，柑桔被害后在叶、枝、果上形成火山口状的病 斑，大小2 8 m m ，后期造成落叶、落果，影响产量和果实品质。病菌主要潜伏于病 部组织内( 病叶、病枝梢和病果) 越冬，翌年春季，细菌从病斑溢出，幼嫩组织只 要保持水湿2 0 m i n ，病菌便可经气孔、水孔、皮孔及伤口侵入，潜伏4 _ 6 天后，在 受侵染组织中迅速繁殖，刺激寄主细胞增大，使组织肿胀破裂，木栓化后死亡。病 菌侵入寄主组织后也可处于隐症状态，能存活数月，条件适宜时便可大量繁殖，成为 病害的主要初侵染来源【3 ”。病菌在寄主组织中可存活6 1 0 个月，此病菌耐干燥、 低温，抗寒力极强，冻结2 4h 后并不影响其存活力：而高温高湿对其生活力影响甚 大，饱和湿度下3 0 ，经2 4h 则完全死亡，暴露日光下，2 m i n 即死亡。病菌在寄 主及周围环境中存活且具有侵染力的时限不超过一年，这为此病的根治提供了有价 值的理论依据【3 9 4 0 】。 病害发生时期在每年的4 月上白f 至l1 月下旬，主要为害春梢、夏梢和秋梢， 以夏梢、秋梢发病最重，梢萌芽展叶后6 8 天见病症。高温、高湿、台风阵雨易于 病害发生及流行。此病具有高度的传染性，借风雨溅打、人畜和树枝接触传播，也 能通过昆虫如张桔渚畸蛾( p 姆l i o c n i s f i sc i 汀e l l n ) 积抛桔谐时昂( 孤r c w s s qc 酚1 ) 传播，还能通过苗木、接穗和种子长距离传播【4 0 】。 目前凡是侵染柑桔种及近缘种并引起柑桔溃疡病的甘蓝黄单胞菌都定名为x a n t h o m o n a s c 聊pe s 廿i sp v c i t r i ( h a s s e ) d y c 。世界上关于病菌菌系分化看法也是 比较一致的，根据病原菌的地理分布和对寄主植物致病性不同，分为5 个菌系f 2 7 l 。 v a u t e r i 一4 ”根据病菌致病性和寄主专化性不同分成3 个致病型，分别为x a x o n o p o d i s p v c i 砸致病型i ，即为a 菌系；x a ) 【o n o p o d i sp v 啪t i f o l i a 致病型i i ，即为b 、c 、 d 菌系和x a x o n o p o d j s p v c i t n ：吼e l o 致病型i i i ，即f 菌系，其中a 型致病性最强， 我国柑桔溃疡病菌属毒力较强的a 致病型【4 2 】。美国专家近期在佛罗里达州发现另一 个新菌系，该菌株与a 1 e l i s a 反应显阴性，与h a r l u n g p c r 反应也显阴性，同时 经p l a s m i d 基因图谱分析与其它菌系不同，该菌株暂定为w 菌系h 甜。 1 2 植物病害检测技术研究进展 1 2 。l 生物学检测方法 植物病害的生物学诊断方法，主要是鉴别寄主反应或指示植物等。这种仅仅 以鉴别寄主反应或指示植物为依据的方法，虽曾广泛运用，目前却由于其检测速度 慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制，而运用较少【4 5 。4 7 1 。生物学鉴定目前己 不再作为植物病毒鉴定和分类的主要依据，但它依旧是其它病毒鉴定方法的一个重 要基础，尤其在病毒株系鉴定力方面【4 s l 。对某一病毒分离物进行分子生物学或血清 学研究之前，最好进行生物学鉴定，以使结果更为可靠【4 9 l 。 1 2 2 电子显微镜观察 研究者虽可通过光学显微镜来观察植物病毒的内含体，但植物病毒鉴定却更多 地依赖于电镜。自从k a u s c h e 等首次在电镜中看到t o b a c c o m o s a i c v i m s ( t m v ) 以 来，电镜己成为植物病毒研究必不可少的常规手段之一。目前通常认为运用负染和 超薄切片电镜观察能够诊断和鉴别植物病毒，一般可诊断到属的水平。在植物病毒 的诊断和形态鉴别中，最有用的特征是病毒粒子的形态结构和寄主病变，有些细胞 病变特征还能用于区分不同的病毒种甚至株系。 h a t t a 等【5 0 l 用负染和超薄切片电镜观察区分了c u c u m b e rm o s a i cv i m sfc m v ) 的6 个不同株系。陈集双等【5 1 】也用该方法，通过比较柱状内含体的种类和形态，鉴 别了马铃薯y 病毒属的9 个病毒种。1 9 7 3 年，d e r r i c k 【5 2 】把电镜与免疫学技术结合， 发明了更为灵敏的免疫吸附电镜技术，该技术现己成为植物病毒研究的一个重要手 段。1 9 8 4 年，l 0 1 l r o 等1 5 3 j 在此基础上建立了悬浮样品的胶体金属标记免疫修饰法。 该方法利用抗对病毒进行免疫修饰，再用胶体金属标记二抗或蛋白a 处理，形成病 毒抗体一金属颗粒免疫复合物。由于在病毒表面的抗体“晕圈”上结合了直径5 一1 0 岫 的金属颗粒，该复合物的电镜下的可见性好，比单纯免疫修饰法更易判断。 1 2 3 免疫学方法 早期血清学测定的方法是液体介质和琼脂凝胶反应的免疫扩散法。尤其是双扩 散技术，可用来比较同源、异源抗原，甚至可能区别病毒的不同种和不同株系。在 现今的植物病毒检测中，使用最广泛的免疫学方法是酶联免疫吸附测定 ( e n z y m e - l i n k e di 姗u n os o r b e ma s s a ye l i s a ) 【5 4 】。它是一种固相吸附和免疫酶技 术相结合的方法，将抗原和抗体包被在固相支持物上，使免疫反应在固体表面进行， 并借助结合在抗体或抗原上酶与底物的反应所产生的颜色来进行检测。它具有灵敏 度高、特异性强、操作简单的优点，而且克服了常规血清学方法受病毒浓度、粒体 形态和抗血清用量等因素的限制。e l i s a 基本类型间接法( i e l i s a ) 和直接法 ( d a s 。e l i s a ) 等删自v o l l e r 等1 9 7 6 年首次将e l i s a 方法用于检测植物病毒后， 该方法己成为病毒诊断与检测的常规手段，特别是在一些经济作物种苗的病毒检测 中，发挥了重要的作用1 5 4 j 。 在e l i s a 的基础上，发展出了组织印迹法，包括斑点免疫结合测定法 ( d i b a e l i s ao rd o t e l i s a ) 、直接组织斑点免疫测定( i d d t b e l i s a ) 等【”j 。 这些技术直接将组织印迹在膜上，不仅保持了e l i s a 的灵敏性和特异性等特点，而 且简化了操作程序，使病毒检测更加快速、简单、方便，且印迹在硝酸纤维膜上的 样品保存时间较长，检测结果能直观地显示出病毒感染的部位，适用于植物病毒的 大规模普查。 1 2 4 分子生物学方法 1 2 4 1 分子杂交 酸分子杂交技术的基本原理是：具有一定同源性的2 条核酸单链在一定的条件 下( 适宜的温度及离子强度等) 可按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高 度特异性的。杂交的双方是使用的探针和要检测的核酸。待测核酸可以是克隆的基 因片段，也可以是未克隆化的基因组d n a 和细胞总r n a 。根据使用的方法，被检 测核酸可以是提纯的( 膜上印迹杂交或液相杂交) ，也可以在细胞内杂交( 细胞原 位杂交) 【5 6 】。最初的核酸杂交试验是用放射性同位素( 如p 3 2 ) 来标记探针：但这 对常规检测工作是不利的，而且探针寿命短。近几年来应用非放射性探针分子，如 生物素和地高辛标记的探针分子，它更安全、应用限制更少、寿命更长、与放射性 标记的探针一样灵敏和实用。采用斑点杂交法检测菊花矮化类病毒( c s v ) 【5 7 1 ，地 高辛标记的c d n a 探针能够检测其r n a 的最低含量为5 0 龟，而生物素标记的为5 p g 。 d i e t z g e n 等【5 8 】用d i g 标记的c d n a 探针检测花生的两种马铃薯y 组病毒：p s t v 和 p e m o v 。对于r n a 检测灵敏度为1 0 p g ( 相当于2 5 0 p g 病毒) ，而且避免了e u s a 检测的p s t v 和p e m o v 的交叉反应现象。利用d i g 标记探针检测植物病毒的报道 在国内外都有不少【5 9 石2 1 。 1 2 4 2 双链r n a ( d s r n a ) 电泳技术 s s r n a 病毒在植物体内增殖，通过核酸互补而形成一种健康植物没有的碱基配 对d s r n a 。d s r n a 经提纯、电泳、染色后，在凝胶上所显示的谱带可以反映每种 病毒组群的特异性，并且有些单个病毒的d s r n a 在电泳图谱上也显示一定的特征。 因此，利用病毒d s r n a 的电泳图谱可以检测出病毒的类型和种类【6 3 删。此法已用 于一些病毒组( 如黄化病毒组、马铃薯y 病毒组、番石竹潜病毒组、烟草坏死病毒 组、黄瓜花叶病毒组、绒毛烟斑驳病毒组的分类研究。2 0 0 2 年牛建新等j 将这一技 术应用于葡萄病毒病的检测。 1 2 4 3 多聚酶链式反应技术 1 9 8 3 年美国p e c e t u s 公司的m u l l i s 等人发明了聚合酶链式反应，并推出了第 一台p c r 仪。它是一种体外模拟自然d n a 复制过程的核酸扩增技术，即通过引物 延伸核酸的某个区域而进行的重复双向d n a 体外合成。能把痕量的遗传物质迅速 而简便的扩增百万倍，使原来无法进行分析和检测的各种项日得以完成。基木原理 是：以待扩增的d n a 样品为模板，两条分别与待扩增d n a 正链相同和互补的d n a 片断为引物，在t a q d n a 聚合酶的催化下，反复进行变性、退火、延伸循环，就可 以使d n a 无限扩增。当上述二个过程中一个循环过程完成后，d n a 的总量则可增 加一倍，每次循环所得产物都是下一个循环的模板。理论上，循环n 次就增加为2 “ 倍。一般经过大约3 0 次循环d n a 的量可扩增1 0 0 万倍以上。对于d n a 病毒可以 直接进行扩增，而对于r n a 病毒则需先将m r n a 反转录成c d n a 再做p c r 扩增 此方法称r t 平c r ( r e v c r s et r a n s c r i p t i o n p cr ) 。r t p c r 是一种检测r n a 病毒的 行之有效的方法。过去常提取m r n a 后做滤膜打点杂交或n o e m e mb 1 0 t ，因病毒 m r n a 含量太低，往往不能获得成功。s a i k i 等 6 6 1 于1 9 8 5 年首创r t p c r ，先将m r n a 反转录成c d n a ，再做p c r 扩增，即可检测特异的嘲黼a 或得到其c d 】q a 克隆，使 其敏感性大大提高。在李属( 竹姗凇舻) 植物病毒检测中，该法已成功用于p l 砌o x v i m s ，c h e y1 c a f r o l lv i m s ，p n l n ed w a r f v i n l s ，p m n us n e c t o t i cr i n gs p o tv i r u s 等病毒的 鉴定和诊断【6 7 - 7 ”。k i h y l m r y u 、潘俊松等【7 2 ，”】利用剑兰花叶病毒( c y m m v ) 外壳蛋 白基因设计引物，建立了r t p c r 反应体系，用于兰科植物的c y 瑚m v 检测。一步法 ( o n e s t e p ) r t - p c r 反应体系已建立【7 4 4 7 5 】。几种常用方法检测植物病毒灵敏度比较 分析虽然分子生物学方法检测植物病毒可以达到p g 甚至绝级水平，然而对不同的 寄主植物、不同的病毒种或株系( 分离物) ，各种方法的检测灵敏度各不相同。 p c r 扩增技术是植物病毒检测中最有效和最灵敏的方法之一，并得到了广泛的 应用，常规p c r 技术在诊断中主要的限制因素是需要高质量的核酸，大多数核酸提 取方法都不能完全去除木本植物的多糖及酚类化台物，而这些物质对随后的 r t p c r 有抑制作用，而造成漏检现象。赵文军等 7 6 】在研究番茄环斑病毒中建立了 一套杂交诱捕r t p c r 酶联免疫法，利用共价结合在p c r 管壁上的引物进行特异性 核酸诱捕，去除了核酸粗提液中的杂质和聚合酶抑制物。 实时荧光r t p c r ，该法利用t a q m 锄探针实时监测目的基因的扩增，实现 r t - p c r 扩增与探针检测同时进行，不需p c r 后处理，消除了p c r 产物的污染， 不需电泳和e b 染色，减少了检钡8 步骤，节省了时间。而且根据它的特殊性还可以 做定量分析7 7 1 。2 0 0 3 年，朱建裕等7 研报道了利用实时荧光r t p c r 一步法检测番 茄环斑病毒，其灵敏度比r t p c r 高1 0 一l o o 倍。 多重p c r ( m u m p l e xp c r ) 是在普通p c r 的基础上加以改进，于一个p c r 反 应体系中加入多对特异性引物针对多个d n a 模板或同一模板的不同区域扩增多个 目的片段的p c r 技术。这一概念由c h a m b e r i a n 等【7 9 j 率先于1 9 8 8 年提出。由于多重 p c r 同时扩增多个目的基因具有节省时间、降低成木、提高效率的优点，特剐是节 省珍贵的实验样品。该技术己被广泛的应用于基因组结构与功能基因及数量性状基 因座( o u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s ，q t l ) 的定位【8 0 _ 8 2 1 ，病原微生物检测等【8 5 ，9 1 ，9 7 1 删研究。 1 3 研究的目的和主要内容 柑桔是我国仅次于苹果的第二大水果产业，也是我国农村经济的重要支柱产业， 在我国南方农业产业中占有十分重要的地位。但长期以来，柑桔病害是影响柑桔生产 的重要限制因子，其中柑桔衰退病、碎叶病、裂皮病、黄龙病和溃疡病发生普遍，在 全世界的柑桔产区均分布，可引起巨大的经济损失。国外科学工作者对柑桔衰退病、 碎叶病、裂皮病、黄龙病和溃疡病进行了广泛的研究。目前国内已有柑桔衰退病、碎 叶病、裂皮病、黄龙病和溃疡病的一些检测方法的报道，但尚未形成完整的检测体系。 本研究的目的旨在建立简便快速且灵敏度高的柑桔病害的检测体系，为无毒原种材料 的获得和无毒苗木的生产和检疫提供保证。 本研究具体内容有： ( 】) 建立c t v 、c t l v 和c e v d 的i m p c r 检颖0 体系； ( 2 ) 建立h l b 和c b c d 的p c r 和r t p c r 检测体系，筛选合适的引物，以 期实现这五种病害的同步化检测； ( 3 ) 采用多重r t - p c r 同时检测多种柑桔病害。以提高检测效率，简化检测步 骤，降低检测成本。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 植物材料 以中柑所提供的各病害阳性材料以及广东省农业科学院果树研究所防虫隔离 网室内嫁接的分别感染各病害的柑桔植株为材料。 嫁接感染c t v 材料：莱檬，北京柠檬，桠柑1 ，桠柑2 ，沙田柚，暗柳橙； 嫁接感染c e v 材料：香橼一1 ，香橼2 ，枳壳1 ，枳壳2 ，械柑1 ，槛柑2 ， 沙田柚，暗柳橙； 嫁接感染c t l v 材料：枳壳1 ，枳壳2 ，桠柑1 ，褴柑2 ，沙田柚，暗柳橙； 嫁接感染h l b 材料：红江橙，十月桔； 柑桔溃疡病材料采于广东省农业科学院果树研究所。 2 1 2 酶及主要试剂 反转录酶m m l v 、d n t p s ，r n a 酶抑制剂( r n a s i n ) 、聊d n a 聚合酶、r 忍口d n a 聚合酶购自北京鼎国生物技术有限公司。 gp l u s d n a 聚合酶、h o t s t a n 购d n a 聚合酶、p c r 增强剂和o l i g o ( d t ) 1 8 购 白天为时代生物技术有限公司。 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ：取饱和酚2 5 m l 、氯仿2 4 m l 、异戊醇1 m l ，充分混 匀后，用t e ( p h 8 o ) 覆盖，棕色瓶中保存。 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ：取氯仿4 8 m l 、异戊醇2 i n l ，充分混匀后，t e ( p h 8 0 ) 覆 盖，棕色瓶中保存。 t e ：含1 0 m m o l lt r i s c l ，1 i 眦o l le d l l a ，调p h 值至8 o 。 t b e ( 5 ) ：称取2 4 2 9 t r i s b a s e ，加入5 7 1 m l 冰乙酸，1 0 0 i i l lo 5 m o l l e d l a ， 调p h 值至8 ，o 。 c t a b 提取液：2 c t a b ，o 1 m o l lt i s h c l ( p h 8 0 ) ，1 4 m 0 1 ln a c l ，2 0 1 1 1 i i l 0 1 l e d l a ( p h 8 o ) 。 提取液l ：1 s d s ，o 1 8 m 0 1 lt i s ，h c l ( p h 8 o ) ，o 0 9 m o l ll i c l ，4 5 i m 0 1 l e d l a ( p h 8 o ) 。 提取液i i ：3 s d s ，3 p v p ，o 5 m 0 1 ln a c l ，5 0 m m 0 1 le d t afp h 8 o1 ， 0 1m 0 1 ln a a c 2 1 3r t p c r 引物的设计及合成 试验过程中所用引物，均参考已发表文献( 表1 ) ，由上海生物工程技术有限 公司合成。 表l 多重r t p c r 中应用韵弓i 物 t a b i el t h e p r i m e rp a i 聃u s e df o rm u l t i p l e xi h 一p c r 引物引物序列5 3 ，片段大小位置 来源 型! 竺! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ：墅业! ! ! ! 堡塑! ! 翌!翌! 竺竺 c t v c lt c a a a c g c g 培卅g a a m c c c a a g c2 9 9 b p 1 6 7 31 1 6 7 5 3 r o w h 柚ir a c t v - c 2a a c g c c c t t 髂a g t c t 艘t a g g a 1 6 4 8 3 - 1 6 5 0 7 c t v c 3 t g a c a 牡a 垂c t a c g a c a tc a t c a g c c c 3 5 3 b p 1 4 7 9 4 1 6 7 6 5m a t l l e w sd m 斛1 c t v c 4 a t g a c 鲈c g c c a c g g g t 雒强c 昏a c a c t c j 6 4 4 1 - 1 6 4 7 0 c e v - e l c c g g g g a t c c c t g a a g g a c n3 7 1 b p 7