（动物学专业论文）环境和营养因子对四倍体栉孔扇贝胚胎及早期幼虫的影响.pdf

专业 题目 福建师范大学学位论文使用授权声明 导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果。本人了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留送交的学位论文并允许论文被查阅和借阅； 学校可以公布论文的全部或部分内容；学校可以采用影印、缩印或 其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名二橄妒导教师签名 签名日期2 里翌星：垒：坚 摘要 摘要 本文以栉孔扇贝( c h a m y s 如r 阳r ，) 为研究对象，利用细胞松弛素b ( c b ) 抑 制栉孔扇贝受精卵第一极体( p b i ) 释放，获得四倍体材料。研究在不同环境和营养 条件下，药物诱导后的栉孔扇贝胚胎及早期幼虫的发育情况，以及早期幼虫倍化率 的变化情况。 本实验总共设2 个环境因子和5 个营养因子：温度、盐度、谷氨酸、牛磺酸、 谷氨酰胺、葡萄糖、维生素c 。通过统计各实验组的囊胚、原肠胚、担轮幼虫、畸 形幼虫及滞育幼虫的比例，以及检测担轮幼虫和d 形幼虫两个时期的幼虫倍性组成， 来揭示四倍体栉孔扇贝胚胎及早期幼虫的一些生理特性。结果显示，从囊胚到担轮 幼虫，处理组均以2 0 组发育最佳，而进入孵化期后，2 2 组的孵化率显著高于其 他组，这说明了处理组存在着温度补偿，适当地提高温度可以促进四倍体胚胎的孵 化。同时发现诱导后的四倍体胚胎对温度和盐度的变化比较敏感，最适盐度和温度 范围均缩小了，分别为1 8 2 2 和盐度3 0 - 3 4 。而从添加营养因子的实验结果来看： 胚胎发育过程中对谷氨酸需求量越来越大，谷氨酸的最佳添加量由囊胚时期的o 5 um o l l 上升至孵化时期的2 5 | im o l l ；在囊胚至担轮幼虫的发育过程中4 0um o l l 浓度的谷氨酰胺可以显著促进胚胎的发育； 1 0m m o l l 的牛磺酸则可以显著提高囊 胚率，但是随着胚胎的进步发育，其对牛磺酸的需求越来越小，至担轮幼虫时期 只有5 m m o l l 浓度的牛磺酸起作用积极的作用：葡萄糖对囊胚的发育没有积极的帮 助，而进入原肠胚时期时，胚胎对葡萄糖浓度的需量逐渐增加，到了担轮幼虫时期， 2 m m o l l 浓度的葡萄糖可以大大提高担轮幼虫的比例，显著降低胚胎的畸形率和滞 育率；0 0 0 9 9 l 浓度的维生素c 显著促进囊胚的发育，而高浓度的维生素c 则抑制 胚胎的发育，进入原肠胚时，胚胎对维生素c 的需求量减少了，当胚胎发育至担轮 幼虫时期时，维生素c 添加组除了0 0 0 3 9 l 组外，其他处理组均比对照组低。 本研究初步探明四倍体栉孑l 扇贝胚胎及早期幼虫的发育情况，以及其对环境和 营养的需求情况，首次报道了栉孔扇贝四倍体诱导后的胚胎幼虫存在温度补偿和营 养补偿。这将为攻克四倍体倍体育种中出现的高死亡率的问题提供解决方案，对贝 类四倍体技术的完善具有重要的参考价值。 关键词栉孔扇贝四倍体胚胎发育早期幼虫温度补偿营养补偿 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i ss t u d y ，w et e s t e dt e t r a p l o i di n d u c t i o ni nc h l a m y sf e r r e r ib yi n h i t i t i n g t h er e l e a s eo f p o l a rb o d yi ( p b l ) i nn e w l y f e i t i l i z e d e g g s t op r o d u c e t e t r a p l o i d ，f e r t i l i z e de g g so fc h l a m y sf e r r e r iw e r et r e a t e dw i t hc y t o c h a l a s i nb ( c b ) t oi n h i b i tt h er e l e a s eo ft h ep bi t h ed e v e l o p m e n ta n dp l o i d yc o m p o s i t i o n o fi n d u c e de m b r y oa n de a r l yl a r v a ew e r es t u d i e di nd i f f e r e n tc i r c u m s t a n c ea n d n u t r i t i o n sf a c t o c t h i ss t u d yw a sd i v i d e di n t o7p a r t s ，t h e r ew e r e ：t e m p e r a t u r e ，s a l i n i t y , g l u t a m i ca c i d ，t a u r i n e ，g l u t a m i n e ，g l u c o s e ，v i t a m i n ec b yc o u n tt h ec h a n g eo f t h eb l a s t u l ar a t e ，g a s t r u l a er a t e ，h a t c h i n gr a t e ，t r o c h o p h o r e - s t a g el a r v a er a t e ， a b n o r m a ll a r v a e r a t e ，d e v e l o p m e n t a r r e s t e d l a r v a e r a t e ，a n d t h e p l o i d y c o m p o s i t i o no ft r o c h o p h o r e - s t a g ea n dd s t a g el a r v a et oo p e no u ts o m et r a i t so f p h y s i o l o g yo ne m b r y oa n de a r l yl a r v a eo ft e t r a p l o i dc h l a m y sf e r r e r i t h er e s u l t s h o wt h a t ：f r o mt h eb l a s t u l at ot r o c h o p h o r e s t a g el a r v a e ，2 0 。cw a st h eb e s t t e m p e r a t u r e t o d e v e l o p t h e e m b r y o i na l lt r e a t e d g r o u p b u t w h e nt h e t r o c h o p h o r es t a g el a r c a eb e c o m et oh a t c h ，t h eb e s tt e m p e r a t u r ew a sa s c e n d e dt o 2 2 ，t h i se x p l a i nt h a tt h e r eh a dt e m p e r a t u r ec o m p e n s a t i o nd u r i n gt h e d e v e l o p m e n to fp l o i d ye m b r y oa n de a r l yl a r v a e t h ei n d u c e de m b r y oa n de a r l y l a r v a ew e r es u s c e p t i v i t yt ot h ec h a n g eo ft e m p e r a t u r ea n ds a l i n i t y , t h eo p t i m u m r a n g eo ft e m p e r a t u r ea n ds a l i n i t y w e r ed e f l a t e d t h e r ew e r e18 - 2 2 a n d 3 0 一3 4 t h ee x p e r i m e n to fn u t r i t i o ns h o wt h a t ：t h en e e do fg l u t a m i ca c i dd u r i n gt h e d e v e l o p m e n to fe m b r y o w a sm o r ea n dm o r e t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no f g l u t a m i ca c i dw a sf r o m0 5l am o l lm o v e t o2 5l am o l lw h e n t h ee m b r y o d e v e l o p m e n tf r o mb l a s t u l at ot r o c h o p h o r e - s t a g el a r v a e 4 0 1 tm o l lg l u t a m i n e c a nb o o s tt h eb l a s t u l ad e v e l o pt ot r o c h o p h o r e s t a g el a r v a er a p i d l y 1 0m m o l lt a u r i n ec a ni m p r o v et h eb l a s t u l ar a t eb e s t ，b u tw h e n t h e i i 章及标题 e m b r y od e v e l o p m e n tt h en e e do ft a u r i n ew a sr e d u c e d ，w h e nt h ee m b r y o d e v e l o p m e n tt ot r o c h o p h o r e s t a g el a r v a et h eo p t i m u mc o r l c e n t r a t i o no f t a r u i n ew a sr e d u c e dt o5 m m o l l g 1 u c o s ew a sn o ta c t i v et ot h e d e v e l o p m e n to fb l a s t u l a ，w h e nt h ee m b r y od e v e l o pt og a s t r u l a et h en e e d o fg l u c o s ew a sb e c o m em o r ea n dm o r e 2 m m 0 1 l g l u c o s ec a r lb e s ti m p r o v e t h et r o c h o p h o r e s t a g el a r v a er a t e ，a n dr e d u c et h ed e v e l o p m e n t a r r e s t e d l a r v a er a t ea n da b n o r m a ll a r v a er a t er a p i d l y 0 0 0 9 9 lv cc a na c t i r e t oi m p r o v et h er a t eo fb l a s t u l a ，a n dt h eh i g hc o n c e n t r a t i o no fv cm a k e a g a i n s tt h ee m b r y od e v e l o p m e n t w h e nt h ee m b r y od e v e l o pi n t og a s t r u l a e a n dt r o c h o p h o r et h en e e do fv cw a sr e d u c e dg r a d u a lly t h i ss t u d yi n i t i a l l yp r o v eu pt h ed e v e l o p m e n to ft h ei n d u c e de m b r y oa n d e a r l yl a r v a e ，a n da p p r o x i m a t e l yc o m p r e h e n dt h en e e do fc i r c u m s t a n c ea n d n u t r i t i o n f a c t o r ，a n df i r s tr e p o r t t h ei n d u c e de m b r y oa n de a r l yl a r v a eh a d t e m p e r a t u r ea n dn u t r i t i o nc o m p e n s a t i o n t h i sr e s u l tm a ya f f o r d an e ww a yt o c a p t u r et h ep r o b l e mo fh i g hm o r t a l i t yr a t ed u r i n gt h ep l o i d yb r e e d i n g t h i si s m o r ei m p o r t a n c et oc o n s u m m a t et h et e t r a p l o i db r e e d i n g k e yw o r d s ：c h l a m y sf e r r e r tt e t r a p l o i dd e v e l o p m e n to fe m b r y oe a r l yl a r v a e t e m p e r a t u r ec o m p e n s a t i o n n u t r i t i o nc o m p e n s a t i o n i i i 中文文摘 中文文摘 贝类四倍体育种起步较晚，距今仅有二十年的历史。1 9 8 8 年s t e p h e n s 和d o w n i n g 成功通过抑制第l 极体的释放首次获得四倍体太平洋牡蛎幼虫后，在世界范围内掀 起了贝类四倍体研究热潮，但最终仅在在太平洋牡蛎、栉孔扇贝、地中海贻贝和菲 律宾蛤仔等少量的几种贝类中获得个别的四倍体成贝。目前有关贝类多倍体的研究 主要集中在生长特征、性腺发育状况、呼吸代谢状况、软体组织生化成分等生物学 性状以及诱导方法的改善方面的研究。对于四倍体胚胎及早期幼虫发育的研究目前 尚未见报道。而四倍体诱导过程中胚胎及幼虫出现高畸形率、高滞育率和高死亡率 等问题，至今还没有找到一个较好的解决办法，其成为四倍体育种的一个瓶颈，制 约了该技术的推广。 g u o 和a l l e n 根据对多年来实验的记录进行分析结合以往的经验大胆作出推论， 认为直接诱导的四倍体牡蛎难以培育至成体的原因是由于较大的四倍体核在正常体 积的卵中卵裂造成细胞数目不足引起的。他们用体积增大的三倍体的卵子与正常精 子受精后抑制第一极体的方法首次成功的获得了存活的四倍体太平洋牡蛎，并将四 倍体与二倍体杂交生产中，创造了较好经济效益。此后，利用这种方法又在合浦珠 母贝和美洲牡蛎中培育出存活的四倍体。 从前人的研究中可以看出，细胞质的多少与多倍体细胞的分裂及分化均有重要 的影响，多倍体胚胎畸形及滞育现象与能量分配不均有一定的关系。因此本文从营 养因子入手，在胚胎及幼虫的培育过程中人工添加一些营养因子，探讨多倍体胚胎 及早期幼虫发育过程中是否存在营养补偿。此外温度和盐度等环境因子也是胚胎及 幼虫发育的重要影响因子，是任何种类人工培育所必需考虑的环境影响因子。因此 栉孔扇贝四倍体诱导后胚胎及幼虫对环境变化的适应能力的研究也很重要，这两个 因素直接影响胚胎的发育。所以本文从环境和营养条件两个方面对栉孔扇贝四倍体 诱导后的胚胎及早期幼虫进行研究，以期掌握诱导后胚胎及幼虫的一些生理特性， 为以后深入地研究四倍体胚胎及幼虫发育机理提供参考。 本实验共设2 个环境因子和5 个营养因子，他们分别是：温度、盐度、谷氨酸、 谷氨酰胺、牛磺酸、葡萄糖、维生素c 。分别以c b 抑制第一极体后获得的栉孔扇贝 i v 第 四倍体受精卵为材料进行研究，统计在不同的因素影响下各组的囊胚，原肠胚，担 轮幼虫比例；畸形率；滞育率；孵化；以及单轮和d 形时期倍性组成的变化情况。 通过这些指标来判断各个因素对胚胎及幼虫发育的影响情况。通过本实验的研究得 知： ( 1 ) 温度 温度是影响胚胎发育的一种重要环境因子，在栉孔扇贝四倍体诱导后的胚胎培 育过程中，发现处理组存在温度补偿，即在幼虫的孵化前后将温度提高至2 2 则可 以提高孵化率，而对照组则没有出现这种现象。三倍体和四倍体对温度的变化比较 敏感，高温和低温会严重影响三倍和四倍体胚胎的发育。 ( 2 ) 盐度 在胚胎发育的早期，胚胎渗透调节能力比较小，对盐度变化比较敏感，高盐和 低盐的环境使胚胎产生大量的自由基，损害胚胎，导致囊胚和原肠胚比例显著下降。 当胚胎发育至担轮幼虫时期，对盐度的适应能力逐渐提高，其适盐范围逐渐扩大， 为盐度2 8 - 3 6 。而进入孵化前后，由于幼虫正处于壳腺的形成和分泌时期，需要大 量的能量，造成能量供应紧张，使幼虫的渗透压调节能力下降，对盐度变化比较敏 感，适盐范围比担轮幼虫时期窄，仅盐度3 2 适合幼虫的孵化。因此在生产上一定要 注意胚胎发育早期及孵化前后的盐度控制，盐度的波动极易导致幼虫畸形或滞育， 影响四倍体诱导的效果。 ( 3 ) 谷氨酸 谷氨酸对于诱导后的栉孔扇贝胚胎具有一定的积极作用，在囊胚时期，0 5u m o l l 浓度的谷氨酸可以促进囊胚的发育。进入原肠胚时，胚胎对谷氨酸的需求量 增加，此时的谷氨酸作用更加显著，1um o l l 组的原肠胚比例显著高于对照组。此 外，添加2 5um o l l 的谷氨酸还可以降低畸形率和滞育率，提高孵化率，这说明了 谷氨酸对于诱导后的栉孔扇贝胚胎及早期幼虫具有促进作用，弥补因药物诱导造成 的损害。 v 中文文摘 ( 4 ) 谷氨酰胺 谷氨酰胺是胚胎发育的主要能源物质，4 0i im o l l 的谷氨酰胺可以显著提高栉 孔扇贝四倍体诱导后的囊胚、原肠胚和担轮幼虫的比例，且该浓度的谷氨酰胺还可 以大大降低幼虫的畸形率和滞育率，其畸形率和滞育率分别是对照组的5 8 3 6 和 6 2 1 4 。这是因为谷氨酰胺可以促进抗氧化物的产生，从而降低自由基对胚胎的损 害，起到了保护作用，此外谷氨酰胺作为一种能源物质，弥补了多倍体胚胎发育过 程中能量供应紧张的问题，起到了营养补偿的作用。 ( 5 ) 牛磺酸 牛磺酸对于栉孔扇贝四倍体诱导后的早期胚胎具有积极的意义，1 0m m o l l 的 牛磺酸可以显著提高囊胚率，使囊胚比例上升2 8 8 2 。这是因为牛磺酸是早期胚胎 发育的能源物质之一，为胚胎提供能量，促进胚胎的发育。而进入原肠胚时期牛磺 酸的作用不显著，担轮幼虫时期只有5 m m o l l 组起作用，牛磺酸对胚胎的作用越来 越小这是因为胚胎发育的早期主要是以丙酮酸、乳酸和氨基酸等物质为能量代谢底 物，随着胚胎的发育，胚胎的能量代谢底物逐渐转变成以葡萄糖等物质。此外牛磺 酸一定程度上可以限制r o s 的作用，保护胚胎的发育，所以牛磺酸对于降低胚胎及 幼虫的畸形率具有一定的帮助。 ( 6 ) 葡萄糖 胚胎发育的前期主要以丙酮酸、乳酸和氨基酸等物质为能量代谢底物，所以低 浓度葡萄糖对囊胚比例影响不显著，而高浓度的葡萄糖则容易导致细胞产生大量的 活性氧，对胚胎造成伤害，不利于胚胎的发育。而进入原肠胚时期时，胚胎对葡萄 糖浓度的需量逐渐增加，到了担轮幼虫时期，其葡萄糖的需要量达到2 m m o l l 。从 畸形率、滞育率和孵化率的统计结果来看，2 m m o l l 的葡萄糖浓度可以显著降低胚 胎的畸形率和滞育率，提高幼虫的孵化率。这是因为诱导后的胚胎由多倍体细胞组 成，其细胞核增大了，在早期的卵裂过程中主要是靠细胞质中的能源物质提供能量。 而多倍体细胞质还是原来二倍体卵子的细胞质，所以能量供应紧张，随着胚胎的发 育，能量或缺问题越来越严重，细胞分裂分化速度下降，胚胎发育变慢，容易导致 胚胎畸形或发育停滞。因此在胚胎发育的中后期人工添加一些能源物质，比如葡萄 糖等，可以缓解能量供应紧张的现象，提高四倍体诱导的胚胎及幼虫的存活率。 v i 第 ( 7 ) 维生素c 低浓度的维生素c 可以起到保护胚胎的作用，因为四倍体诱导的胚胎在培育过 程中受到外界环境的刺激，产生大量的自由基，此外，由于染色体增加，导致细胞 自身的调节出现紊乱，不能产生足够多的抗氧化物来抵抗自由基的伤害，从而导致 胚胎不能正常发育。而人工添加一定量的维生素c 则可以清楚自由基，保护胚胎， 降低多倍体胚胎的畸形率。由于维生素c 其化学性质为酸性的缘故，所以高浓度的 维生素c 会影响养殖水体的p h ，不利胚胎的发育。 i 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题背景 栉孔扇贝 c h l a m y s ( a z u m a p e c t e n ) 如r 阳r j ( j o n e s p r e s t e n ，1 9 0 4 ) ，属于 软体动物们( m o l l u s c a ) 、瓣鳃纲( l a m e l l i b r a n c h i a ) 、珍珠贝目( p t e r i o i d a ) 、扇 贝科( p e c t i n i d a e ) 、栉孔扇贝属( c h l a m y s ) 。主要分布在大西洋、地中海和黑海等。 主要生产国家为法国、意大利、希腊、阿尔及利亚、智利、日本、朝鲜、韩国和中 国等。我国主要分布在北起辽宁省的长海县，南到山东省的荣成、海阳、日照等地。 其中以山东长岛县庙岛群岛的北五岛，即砣矶、大钦、小钦、南隍和北隍等海区自 然分布最多。栉孔扇贝是北方海区的重要经济贝类之一，由于其闭壳大，口感好， 营养价值高，很受群众的欢迎。从上世界7 0 年代以来，随着栉孔扇贝人工养殖技术 不断提高，其养殖面积不断扩大，已成为北方水产业养殖的一大产业。 1 2 贝类四倍体育种的意义 传统贝类，每年的春、秋季节两个繁殖季节，由于生殖繁育活动而消耗了大量 的能量在性腺的发育上，从而导致闭停止生长甚至变的消瘦，影响口感。近年来， 越来越多的人开始关注贝类多倍体育种，人们发现三倍体具有肉质好，生长速度快， 产量高等特点，特别是整年可食用，使的人们越来越关注三倍体育种，目前贝类 三倍体育种已经得到了广泛的推广和应用。在很多种类中已经得到了规模化生产， 如合浦珠母贝乜1 、栉孔扇贝口1 、美洲牡蛎、太平洋牡蛎5 - 8 1 等。但是由于用物理、 化学方法直接诱导三倍体的诱导率不稳定，且很难达到1 0 0 三倍体，同时人工诱 导贝类三倍体，无论是用冷热休克、静水压等物理方法处理，还是使用c b 、6 - d m a p 、 咖啡因等药物进行化学处理，都会对受精卵的发育，胚胎与幼虫的存活等生理活动 产生一定的影响，随着处理强度的加大，三倍体处理组较之二倍体组的胚胎孵化率 及幼虫的存活率均明显降低，而且胚胎的畸形率也大大的上升口t 引。另外，三倍体很 难繁殖后代，需要每年进行重新诱导，其操作步骤繁琐，技术要求高，不利于技术 推广。 四倍体之所以成为目前贝类多倍体育种的研究热门方向之一，主要是因为四倍 体具有较高的繁殖能力，能产生较大的生殖细胞，与二倍体杂交产生1 0 0 的三倍 体后代，可以建立稳定的群系。从而为三倍体贝类的大规模生产提供了一条有效途 福建师范大学x x x 硕士学位论文 径阻。通过四倍体和二倍体杂交的方法获得三倍体，其操作方便安全，避免了物理、 化学处理对受精卵及胚胎发育的影响，能够提高孵化率和幼虫的存活率。而且也大 大降低了成本，为推广三倍体贝类大规模化生产起到了积极的促进意义。 1 3 贝类四倍体育种研究的现况 虽然从1 9 8 8 年s t e p h e n s 和d o w n i n g 抑制太平洋牡蛎( c r a s s o s t r e ag i g a s ) n 们受精卵第一极体的释放首次成功获得了四倍体牡蛎幼虫，至今仅有1 0 多年。但 是随着三倍体在多种贝类上成功诱导，以及四倍体和二倍体杂交成功获得1 0 0 三 倍体，促使贝类四倍体育种成为各国学者研究的热点，希望通过四倍体解决贝类三 倍体产业化过程中的的一些问题。到目前为止，世界上已经对太平洋牡蛎 ( c r a s s o s t r e ag i g a 曲 1 l - 1 3 、食用牡蛎( o s t r e ae d u l i s ) n 钔、美洲牡蛎( c v i r g i n i c a ) 1 钔、近江牡蛎( er i v u l a r i s ) n 6 1 、栉孔扇贝( c h l a x y sf a r r e r d 1 7 1 、虾 夷扇贝( p a t i n o p e c t e ny e s s o e n s i s ) i s , z g 、合浦珠母贝( p i n c t a dam a r t e n s i d c 2 0 , 2 1 、 贻贝( 修 j j 嬲e d u l i s ) 昭引、地中海贻贝似g a l l o p r o v i n c i a l i s ) 瞳朝、菲律宾蛤仔 ( r u d it a p e sp h i l i p p i n a r u m ) 2 劓、侏儒蛤( m u l i n i al at e r a l i ss a y ) 2 引、皱纹盘鲍 ( h a l i o t i sd i s c u sh a n n a d 汹3 等l o 余中贝类进行了四倍体育种研究，虽然都获得 了四倍体胚胎或幼虫，但是仅在太平洋牡蛎、栉孔扇贝、地中海贻贝和菲律宾蛤仔 等少量的几种贝类中获得个别的四倍体成贝。因此四倍体育种研究目前还不成熟， 存在着许多有待于解决的问题。 1 3 1 诱导方法 1 3 1 1 抑制卵子减数分裂过程中极体的释放 一般是利用物理或化学方法抑制受精卵第一体积的释放或者同时抑制第一第二 极体的释放。 抑制第1 极体释放，四倍体主要由非混合三极分离或独立二极分离方式产生，mi 四倍体的比例为2 0 。利用这种方法诱导四倍体己在太平洋牡蛎n 、美洲牡蛎n 引、 栉孔扇贝嘲、皱纹盘鲍、菲律宾蛤仔乜们等多种贝类中做过尝试，均诱导出一定比 例的四倍体胚胎，但仅在栉孔扇贝田3 中检测出5 个四倍体幼贝，在菲律宾蛤仔豳1 中检测出2 个偶发性的四倍体，在其他种类中均未培育至成体。 同时抑制第1 极体和第2 极体的释放也可能产生四倍体。当2 个极体都被抑制 之后，受精卵中存在5 套染色体，精卵原核融合时有可能产生五倍体，但有时由 于2 个原核融合不彻底也有可能产生四倍体或是其它倍性的胚胎。通过同时抑制第 2 第1 章绪论 l 极体和第2 极体极体释放这一途径在地中海贻贝中得到了少数存活至成体的四 倍体个体幢引。 1 3 1 2 抑制受精卵的第一次分裂 当正常二倍体受精卵发育到第一次卵裂时，用物理化学方法抑制细胞质分裂， 使细胞核中已复制的染色体不再分离，引起染色体加倍，从而由二倍体产生四倍体。 温度休克、c b 、6 - d m ap 、秋水仙素等都能抑制受精卵的分裂。利用抑制卵裂的 方法已在太平洋牡蛎、食用牡蛎、近江牡蛎、栉孔扇贝、合浦珠母贝、贻贝、菲律 宾蛤仔和皱纹盘鲍等贝类中进行了四倍体诱导，并获得了不同比例的四倍体胚胎或 幼虫，g u o 等啪3 利用热休克( 3 5 - 4 0 。c ) 抑制太平洋牡蛎的第1 次卵裂，得到了4 5 9 6 的四倍体胚胎，但仅成活到d 形幼虫。蔡国雄等啪1 利用6 - d m ap 抑制紫贻贝的第1 和第2 次卵裂以诱导四倍体，分别产生了8 2 8 和5 8 6 的四倍体胚胎。但迄今 为止，还没有见到利用这一途径获得四倍体贝类成体的报道。 1 3 1 3 细胞融合技术 在贝类研究中应用不多。该方法的原理是通过某种手段使两个有特殊性质的细胞 合二为一，染色体也随之加倍。该方法所借助的手段有多种，最常见的是电融台法、 化学物质诱导融台法以及利用病毒为介质融台法等。常用的融合剂主要有聚乙二醇 ( p e g ) 和脂质体，电脉冲也有一定的应用价值。目前来说此项技术在淡水鱼类及藻类 的杂交育种方面有过尝试和应用，取得了一定的进展，但在贝类中作的研究较少。 g u o 等啪1 以聚乙二醇( p e g ) 为融合剂，采用合子一合子融合、精子一精子融合、2 细胞期的分裂球融合等方法诱导太平洋牡蛎四倍体。结果发现：合子一合子融合效 果较好，但并未产生较高比例的四倍体：精子间的融合效果很不好：分裂球间的融 合产生了3 0 的四倍体，但仅成活到d 形幼虫汹1 。包振民等利用p e g 和脂质体介 导进行皱纹盘鲍的合子融合，融合合子的四倍体率分别为2 5 9 6 和1 2 a o oc a d or e t 等利用6 0 0 v c m 的电脉冲进行2 细胞期的分裂球融合，在太平洋牡蛎和贻贝中分 别获得了2 0 和2 6 9 6 的四倍体胚胎口。 1 3 1 4 人工雌核发育 其原理是使雄性亲本精子内的核酸物质失活，又使精子保持话力，这样的精子 与卵子结合后，再同时阻止第一二极体释放来产生四倍体的。精子染色体的失活方 法有幅射处理和化学处理，辐射处理包括紫外线、x 射线等，较常用的是紫外线：可 用于精子灭活的化学物质有：甲苯胺兰、乙烯脲、二甲基硫酸盐、吖啶黄、噻嗪等。 3 福建师范大学x x x 硕士学位论文 这种方法在太平洋牡蛎四倍体诱导中尝试过口幻，卵子与经紫外线失活的精子受精 后，再用c b 抑制受精卵第l ，2 极体的释放，胚胎四倍体率最高达9 5 ，但在幼 贝中未检测出四倍体。 1 3 1 5 利用三倍体贝类诱导四倍体的方法 1 9 9 4 年，g u o 和al l e n 根据对实验结果的分析及以往的经验认为直接用正 常的二倍体牡蛎诱导的四倍体难以培育至成体是由于较大的四倍体核在正常体积的 卵中卵裂造成细胞数目不足引起的啪1 。他们用体积增大的三倍体的卵子与正常精子 受精后抑制第一极体的方法首次成功的获得了存活的四倍体太平洋牡蛎，并将四倍 体与二倍体杂交生产全三倍体的路线方法应用于生产中，创造了较好经济效益。此 后，利用这种方法又在合浦珠母贝和美洲牡蛎( g u oe ta l ，交流数据) 1 中培育出 存活的四倍体( 表1 ) ，但未见应用于生产的报道。 表1 1 目前世界上已获得存活的四倍体贝类 t a b l e1 1v i a b l et e t r a p l o i di n d u c e di nm o l l u s c s 1 3 2 诱导贝类四倍体的诱导方法及主要诱导参数 目前世界上比较主要的贝类四倍体诱导方法和诱导参数见表1 2 表1 2 贝类四倍体诱导方法及主要参数 t a b l e l 2m e t h o d sa n dr e s u l t so fc h r o m o s o m e m a n i p u l a t i o no ft e t r a p l o i db r e e d i n gi nm o l l u u s c s 4 第1 章绪论 雌核发育 抑制卵裂i u v + 0 5m g l c b 4 n 胚胎9 5 个 4 n 胚胎4 5 个 合子融合( p e g ) 3 5 4 0 c 热休克 4 n 胚胎3 0 个 分裂求融合6 0 0 v c m 电脉冲 4 n 幼冲2 0 个 3 n 2 n + 抑制p b l 0 5m g l c b 4 n 幼贝6 7 个 抑制p b l 4 5 叩m o l 6 - d m a p4 n 胚胎4 0 个 3 n x 2 n + 抑制p b l 0 5m g ；l c b 3 n x 2 n + 抑制p b l 0 5m g l c b 食用牡蛎抑制p b l o e d u l i s 抑制卵裂i 1 m g l c b 1 m g l c b 美洲牡蛎抑制p b l0 5m g l c b c v i r g i n i c a 近江牡蛎抑制卵裂i 3 9 c 冷休克 c r i c u l a r i s 抑制卵裂i 1 0 c 冷休克 栉孔扇贝 c f a r r e d 抑制p b l0 5m g l c b 抑制卵裂10 5m g l c b 抑制p b l0 7 5m g l c b 抑制p b l0 6m g l c b 虾夷扇贝抑制p b l0 8m g l c b 4 n 稚贝9 6 个 4 n 幼虫4 0 个 4 n 胚胎4 0 个 4 n 胚胎5 3 个 4 n 幼贝4 2 个 4 n 胚胎3 0 个 4 n 胚胎2 8 个 4 n 胚胎3 9 7 5 个 4 n 胚胎2 9 3 5 个 4 n 幼贝1 8 个 4 n 幼贝1 7 4 6 个 4 n 幼虫5 6 5 个 p y e s s o e n s i s 抑制卵裂i8 1 6r a g l6 d m a p 4 n 幼虫2 1 7 个 抑制卵裂i 5 0 0 m g l 秋水仙素 4 n 幼虫1 3 0 个 合浦珠母贝抑制p b l0 6m g lc b4 n 胚胎4 6 7 个 p m a r t e n s f i抑制p b l 3 5 0 k g c m 2 静水压 4 n 胚胎9 2 个 5 福建师范大学x x x 硕士学位论文 贻贝 m e d u l i s 抑制卵裂i 抑制卵裂i ： 3 n x2 n + 抑制p b l 3 n 2 n + 抑制p b l 抑制p b l 抑制卵裂i 抑制卵裂 分裂球融合 0 6m g l c b 1 5 p e g + 0 6m g lc b 3 n x 2 n + 0 5m g l c b 3 n 2 n + 0 6m g l c b 0 5m g l c b 4 0 0 m m o l6 - d m a p 4 0 0 u m o l6 - d m a p 6 0 0 v v m 电脉冲 4 n 胚胎1 0 修个 4 n 胚胎2 4 ，8 个 4 n 胚胎2 0 个 4 n 胚胎1 1 4 个 4 n 胚胎2 2 个 4 n 胚胎8 2 8 个 4 n 胚胎5 8 ，6 个 4 n 幼虫2 6 个 地中海贻贝抑制p b l 和p b 2 l m g l c b 4 n 稚贝1 7 2 个 m r o v i n c i a l i s 菲律宾蛤仔 e i n a r u m 抑制p b l 抑制卵裂i 侏儒蛤雌核发育 m 1 a t c r a l i ss a y 皱纹盘鲍 抑制p b l h d j s c t l sh a n n a i抑制卵裂i 抑制p b l 抑制p b i l m l l c b l m l l c b l m g l c b 0 0 5 9 l 秋水仙素 2 2 5 u m o l6 - d m a p 0 8 m g lc b 4 n 胚胎6 4 4 个 4 n 胚胎2 8 3 个 4 n 胚胎6 0 个 4 n 胚胎2 1 9 个 4 n 胚胎1 3 o 个 4 n 胚胎2 2 ，5 个 4 n 幼虫3 5 9 个 对于四倍体的诱导问题，不管采用哪种方法都各有自己的影响因素。比如上面 所述的抑制p b l 和卵裂的方法为例，影响四倍体诱导率的主要因素是处理开始的时 间、处理持续的时间及处理强度3 个方面。处理开始时间和处理持续时间是要根据 细胞分裂的时间而定，选择刺激的时间刚好抑制核分裂就能导致高倍化率。对于处 理强度，则要视贝类对各种处理药物的忍受力而定，一般来讲强度越大，四倍体的 诱导率越高，但是处理后幼虫的孵化率就越低，而畸形的比例也会大大的增加。因 6 第1 章绪论 此在选择最佳的处理强度时，往往要在诱导率核孵化之间权衡考虑。 受精卵的发育同步状况也是提高和稳定四倍体诱导率的一个关键。受精卵发 育的同步性与卵的质量有关，经实验观察核分析总结，卵的质量对四倍体的诱导效 果影响极大。虽然卵子质量的好坏不能用具体的数据来衡量，但是可以从亲贝的性 腺发育状况、催产所用的刺激强度的大小、对照组幼虫发育状况等一些指标也能反 映出来。乱质量好的处理组不但四倍体率高，而且胚胎在染色体制片种也能得到较 清晰的分裂相。因此，在四倍体诱导前对亲贝的精心培育、以获得高质量的卵子是 影响四倍体诱导的重要环节。 当然受精卵发育的同步性与操作方法也有关。在四倍体诱导过程中要绝对避 免意外受精，在亲贝培育时原则上要雌雄分开培养，防止混养时末排卵子受先熟雄 体排出的精子的污 染；在获取精卵的操作过程中，雄性配子和雌性配子要严格隔离，操作工具重复 利用时也要严格消毒。如果是通过解剖取卵子和精子的贝类，则在解剖过程种不能 用海水冲洗刚解剖下来的生殖细胞，因等到所有的亲贝解剖结束后再同时加入海水， 确保生殖细胞发育的同步性。 另外四倍体的诱导率还与贝类种类、实验条件等因素有关，这说明阻止第一极 体释放后所导致的染色体的多极分离方式有一定的偶然性和随机性，会因种类和实 验条件的不同而表现出很大的差异。 1 4 进展和展望 虽然目前国内外许多学者在四倍体育种方面做了很多工作，但是贝类四倍体的研 究还处于初步阶段，绝大部分的种类还没有办法培育初成活的四倍体成贝，更谈不 上四倍体贝类的生产推广。所有贝类四倍体育种方面要做的工作还很多，发展的空 间还很大，前景诱人。可以说要最终实现三倍体产业化，四倍体是其根本途径。 利用三倍体产生的较大卵子诱导四倍体是当前贝类四倍体育种中最为可行的 方法，迄今利用这种方法已在太平洋牡蛎、美洲牡蛎和合浦珠母贝中诱导出存活的 四倍体，而利用四倍体生产全三倍体仅在太平洋牡蛎应用于生产。利用三倍体诱导 四倍体技术能够在牡蛎和珠母贝中获得突破，主要原因是牡蛎和珠母贝可以解剖取 卵并进行人工授精。由于三倍体性腺发育程度低下，少量发育的配子自然排放或诱 导排放的可能性较小，对那些不能通过解剖方法获取卵子的贝类来说，四倍体的诱 导仍是1 个待解的难题，需要进一步深入地研究。 7 福建师范大学x x x 硕士学位论文 从g u o 的实验及推论中可以看出，四倍体胚胎容易败育的原因和可能与细胞 质的分配不均有关。因此应该把目光对准诱导后的胚胎发育过程，很可能是因为能 量供应不足而导致细胞发育停滞或畸形。那么通过人为添加一些营养因子，如氨基 酸，葡萄糖等物质，为胚胎发育提供足够的营养，弥补因细胞质分配不均导致的败 育现象。 此外，从前人的经验来看，多倍体诱导出来的贝类只有在良好的生存环境中才 会表现出生长优势，而在环境变化较大的水域，多倍体贝类的优势没有了，而且存 活率还不如正常的二倍体贝类。这给我们一个启示，就是诱导后的胚胎及幼虫的培 育环境控制方面也应重视，因为经历过药物等方法的诱导，受精卵受到了极大的伤 害，再加上遗传物质的增加，可能导致基因表达方面出现紊乱，受精比较脆弱，无 法随外界环境的波动作出及时的调整，所以，要提高多倍体的成活率，必需先摸透 其适宜的环境范围，或者通过人为的辅助，为多倍体贝类提供一个良好的生长环境。 1 5 本研究的目的和意义 贝类多倍体诱导的研究起步较晚，目前相关的研究大多集中在成贝生长特 性、性腺发育状况、呼吸代谢状况、软体组织生化成分等生物学性状以及诱导方法 的改善方面的研究。对于诱导后的胚胎及早期幼虫的研究目前尚未见报道。而多倍 体诱导诱导后导致胚胎及幼虫出现高畸形率、高滞育率和高死亡率等问题，已成为 多倍体体育种的一个瓶颈，制约了该技术的推广。本文以栉孔扇贝为材料研究不同 环境因子和营养因子对四倍体诱导后的胚胎及早期幼虫的影响，通过人为地控制培 育环境和添加一些营养因子，探讨胚胎发育过程中是否存生态因子或营养因子补偿， 以期通过人为改善胚胎及幼虫的培育环境来获得较高的多倍体存活率及减少畸形和 滞育率，为贝类多倍体育种研究提供一个新的研究领域，对于贝类多倍体育种来说 具有重大的意义。 8 第2 章温度对栉孑l 扇贝四倍体诱导后的胚胎及早期幼虫的影响 第2 章温度对栉孑l 扇贝四倍体诱导后的胚胎及早期幼虫 的影响 o - - 刖舌 温度是影响贝类胚胎发育的重要生态因子之一，确定贝类胚胎发育的适宜范围 是大规模生产育苗所必需的。因此多年来国内外众多学者就温度对不同养殖贝类胚 胎发育的影响做了大量的研究工作m 侧，为促进相关经济贝类的育苗生产以及增殖 资源提供了重要的资料。多倍体育种是近年来在贝类遗传育种方面新兴的- - i _ 技术， 目前就多倍体诱导后胚胎及幼虫高死亡率和高滞育率的问题，大多数研究是从优化 诱导条件入手，寻求解决办法口7 驯。但是从目前的研究结果来看效果都不是非常理 想，由于诱导过程中化学药物及自身遗传物质变化的影响，导致了受精卵变得比较 脆弱，对于外界环境变化比较敏感，因此本文从诱导后的胚胎培育条件入手，观察 不同温度下多倍体胚胎及幼虫早期幼虫的发育情况，以期寻找一个比较适合诱导后 多倍体胚胎发育的温度范围，为以后的生产提供有价值的参考。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 1 1 1 亲贝来源 栉孔扇贝 c h l a m y s e r r e r i 亲贝采捕于山东蓬莱长岛 2 1 1 2 实验器材 流式细胞仪p a r t e cc c a ，移液枪，5 0 0 0 m l 塑料量杯，恒温水浴锅，n i k o ny s l 0 0 显微镜，计时器，观察皿，擦镜纸，计数器，水银温度计，移液管，胶头滴管等， 2 0 0 目