（发育生物学专业论文）鲫鱼rag基因的克隆及表达分析.pdf

摘要 d n a 重组激活基因( r e c o 功b i n a t i o na c t i v a t i n gg e n e s ，r a g ) 是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因，也是脊椎动物进化分析的标 记基因之一。鲫鱼具有很强的适应性和抗病能力，是我国广泛养殖的 重要经济淡水鱼；由于具有不同的倍性和丰富的遗传多样性，又是研 究鱼类基因组进化的独特材料。本研究用p c r 方法扩增、克隆了鲫鱼 的r a g 基因。鲫鱼r a g l 基因从起始密码到终止密码总长4 1 8 8 b p ，由 三个外显子和两个内含子组成，其中开放阅读框长3 1 9 2 b p ，编码1 0 6 3 个氨基酸。r a 9 2 基因从起始密码到终止密码总长1 5 9 3 b p ，没有内含 子，只有单一的编码区，编码5 3 0 个氨基酸。r a g l 和r a 9 2 基因的o r f 和氨基酸序列在不同鱼类中的对比结果表明其在进化过程中非常保 守。不同鱼类r a g l 基因的第二内含子也是高度保守的，转录因子结 合位点分析表明在第二内含子的保守区域中有许多转录因子的可能 结合位点。其中有一段在所有已知鱼类中都存在的保守区域是与性腺 发育相关的转录因子s r y 和s o x 5 的可能结合位点，提示r a g l 基因的 表达可能与性腺发育具有相关性。用r t - p c r 方法进行的组织特异性 表达分析表明r a g l 基因在鲫鱼成体的头肾和精巢都能检测到表达， 提示r a g 基因不仅主导了免疫组织中的d n a 重组，也可能参与了生殖 细胞的d n a 重组。l i t p c r 检测证明r a g l 基因在鲫鱼胚胎发育至第5 天开始表达，在第7 天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可检测到r a g l 基因 m r n a 的杂交信号，在第9 天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可以检测到很强 的r a g lm r n a 原位杂交信号，说明该时期可能是鲫鱼免疫基因重组的 活跃时期。 关键词：重组激活基因，克隆，表达分析，鲫鱼 n a b s t r a c t r e c o m b i n a t i o na c t i v a t i n gg e n e s ( r a g ) a r ek e yg e n e si ns p e c i f i c i m m u n i t ys y s t e mo fv e r t e b r a t ea n da l s ou s e da so n eo ft h em o l e c u l a r m a r k e rf o ra n a l y s i so fv e r t e b r a t ee v o l u t i o n g o l d f i s h ，c a r a s s i u sa u r a t u s , w i t h s t r o n g a d a p t i v e a n dd i s e a s e s - r e s i s t a n ta b i l i t i e s ，i so n eo ft h e i m p o r t a n tf r e s h w a t e re c o n o m i cf i s he x t e n s i v e l yc u l t i v a t e di nc h i n a a n d i ta l s oa p p e a r st ob ea ne x c e l l e n tm o d e la n i m a lf o rt h ee v o l u t i o ns t u d yo f f i s hg e n o m ef o ri t sv a n e dp l o i d ya n da b o u n d i n gg e n e t i cd i v e r s i t y t h e g o l d f i s hr a gg e n e sh a v en o tb e e nc l o n e da n dt h es p e c i f i c i t yo fg o l d f i s h s p e c i f i ci m m u n i t ys y s t e mh a sn o tb e e ns t u d i e dy e t i nt h ep r e s e n ts t u d y ， g o l d f i s hr a 9 1a n dr a g2g e n e sw e r ec l o n e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) m e t h o d s ，a n dt h et e m p o r a la n ds p a t i a le x p r e s s i o np a t t e r no f r a g 一1w e r ee x a m i n e dw i t hm e t h o d so fr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) a n dw h o l em o u n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n t h et o t a l l e n g t ho ft h eg e n o m i cs e q u e n c eo f t h eg o l d f i s hr a g lg e n ef r o mt h e i n i t i a t i o nc o d o nt ot h es t o pc o d o ni s4 1 8 8b p ，w h i c hc o m p o s e do ft h r e e e x o n sa n dt w oi n t r o n s t h el e n g t ho fe x o n l ，2a n d3i s3 0 8 b p ，11 3 6 b p ， 1 7 4 8 b pr e s p e c t i v e l y t h el e n g t ho fi n t r o n la n d2i s1 0 5 b p ，8 9 1 b p r e s p e c t i v e l y t h ee n t i r eo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) i s31 9 2 b pl o n g ，w h i c h p r e d i c a t e de n c o d i n gap r o t e i no f1 0 6 3a m i n oa c i d s t h eg o l d f i s hr a 9 2 h a sn oi n t r o ni ni t so p e nr e a d i n gf r a m e t h el e n g t ho ft h eg e n o m i c m s e q u e n c ef r o mt h ei n i t i a t i o nc o d o nt ot h es t o pc o d o ni s1 5 9 3 b p ，w h i c h w a sp r e d i c a t e de n c o d i n gap r o t e i no f5 3 0a m i n oa c i d s t h ep u t a t i v e s t r u c t u r eo fr a g p r o t e i ni nc a r a s s i u sa u r a t u sa r ec o n s i s t e do fb o t ha n n - t e r m i n a ld o m a i na n dac o r er e g i o n c o m p a r a t i v ea n a l y s i so nt h e s e q u e n c e so fo r f sa n dp r o t e i na m i n oa c i do fc a r c a s s e sa u r a t u s , d a n i o r e r i o , c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a , c y p r i n u sc a r p i oa n do n c o r h y n c h u s m y k 括s ，r e v e a l e dt h a t b o t hr a g la n dr a 9 2a r e h i g h l yc o n s e r v e di n e v o l u t i o n p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i so nt h e s ef i s h e sb a s e do nr a g lo r f s u g g e s t e dt h a tc a r a s s i u sa u r a t u si sm o r ec l o s e l yr e l a t e dt oc y p r i n u s c a r p i o p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i so nt h e s ef i s h e sb a s e do nr a 9 2o r f , h o w e v e r ，i n d i c a t e dc a r a s s i u sa u r a t u si sm o r ec l o s e l yr e l a t e dt od a n i o r e r i o t h es e c o n di n t r o no ft h er a g li sa l s oh i g h l yc o n s e r v e dd u r i n g e v o l u t i o n t r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e sa n a l y s i so nt h ec o n s e r v e d r e g i o no ft h i si n t r o ns u g g e s t e dt h a tt h e r ea r es o m ep u t a t i v et r a n s c r i p t i o n f a c t o rb i n d i n gs i t e si ni t ac o m m o nc o n s e r v e da r e aw h i c hi sa p p e a r e dt o b et h e s r ya n ds o x 5t r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e sw a so b s e r v e di n a l lt h ee x a m i n e df i s h e s ，s u g g e s t i n gt h a tt h ee x p r e s s i o no fr a g lm a yh a v e s o m e r e l a t i o n s h i p w i t ht h e d e v e l o p m e n to fg o n a d t i s s u e s p e c i f i c e x p r e s s i o na n a l y s i sb yr t - p c rm e t h o d sr e v e a l e dt h a tr a 9 1e x p r e s s e d m a i n l yi nt h es p e r m a r ya n dh e a dk i d n e y t h i so b s e r v a t i o ns u g g e s t e dt h a t t h er a g sd i r e c t e dd n ar e c o m b i n a t i o nt a k ep l a c en o to n l yi ni m m u n i t y t i s s u eb u ta l s oi ng o n a d s r a g le x p r e s s i o nw a sf i r s td e t e c t e da td a y5 i v p o s t f e r t i l i z a t i o nb yr t p c r s t r o n gm r n a i ns i t uh y b r i d i z a t i o ns i g n a l w a sd e t e c t e di nt h et h y m u sp r i m o r d i u ma t d a y9p o s t f e r t i l i z a t i o n ， s u g g e s t i n gt h a tt h i sp e r i o dm i g h tb ea na c t i v ed n a r e c o m b i n a t i o ns t a g e o fi m m u n o g e n e si ng o l d f i s h k e yw o r d s ：r e c o m b i n a t i o na c t i v a t i n gg e n e s ，c l o n i n g ，g e n e e x p r e s s i o n ，c a r a s s i u sa u r a t u s v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：花f 钢门v l 夕口驴莎年月2 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大 学。同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 + 1 、保密在一! 年解密后适用本授权书 2 、不保密口 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：砭。匆习( 刁。f 日期如辟衫月日 导师签名：呵以 日期矽万年6 月乙日 鲫鱼r a g 基因的克隆及表达分析 第一章引言 1 1 r a g 基因的研究进展 1 1 1r a g 基因的发现 r a g 基因由r a 9 1 基因和r a 9 2 基因组成，它们编码的r a g l 和r a 9 2 蛋白组成一种重要的重组酶。该酶能特异性地识别免疫球蛋白 ( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) 基因和t 细胞抗原受体( tc e l lr e c e p t o r ，t c r ) 基因的v 、d 和jd n a 片段两侧的重组信号序列( r e c o m b i n a t i o ns i g n a l s e q u e n c e ，r s s ) ，并催化该r s sd n a 双链发生断裂，从而引发v ( d ) j 基因片段进行重排。 1 9 8 8 年，s c h a t z 和b a l t i m o r e 用限制性内切酶酶切小鼠基因组d n a ，随 后将酶切产物连接在p s v - h i s 载体上，再转染到小鼠的成纤维细胞n i h3 t 3 中。根据对p s v - h i s 载体上组氯醛的抗性筛选出被转染的细胞；再根据霉 酚酸的抗性筛选出发生v ( d ) j 重组的细胞【1 1 。s c h a t z 和b a l t i m o r e 再用 限制性内切酶进一步切割这些重组细胞的核苷酸序列，并重复以上转染试 验，分析发生了重组反应的细胞，获得一段相同的外源d n a 片段。s c h a t z 和b a lti m o r e 克隆该片段并以此来转染其它n i h3 t 3 细胞，发现该片段具有 稳定的激活重组反应的能力，从而将该片段命名为重组激活基因- l ( r a 9 1 ) 1 2 1 。o e t t i n g e r 等对获得的r a g l 克隆进行分析，发现其中有一个缺失r a g l 的启动子以及编码r a g l 产物前3 0 个氨基酸残基的d n a 序列，但由于在r a g l 下游存在一个未知编码区，使得这段d n a 序列仍然具有与r a g l 相当的重组 激活能力，这段新发现的编码区被命名为重组激活基因- 2 ( r a 9 2 ) 1 3 1 。 硕士学位论文 1 1 2r a g 基因及其蛋白的结构 目前已有鲨鱼、虹鳟鱼、斑马鱼、草鱼、河豚、爪蟾、鸡、兔子、 小鼠和人等物种的r a g 基因被成功克隆降1 3 】。r a g 基因在染色体上以尾对 尾( 即r a g l 基因的3 端和r a 9 2 基因的3 、端相邻) 的方式紧密排列【1 4 1 。 斑马鱼的r a g 基因连锁存在于其第2 5 号染色体上。其r a g l 基因由 三个外显子和两个内含子构成。三个外显子分别长3 0 8 b p 、1 1 1 8 b p 和 1 7 4 8 b p ：两个内含子分别长8 8 b p 和8 5 0 b p ：c d n a 全长3 1 7 4 b p ，编码1 0 5 7 个氨基酸。r a 9 2 不含内含子，c d n a 全长1 5 9 3 b p ，编码5 3 0 个氨基酸i s 。 爪蟾r a g l 基因也不含内含子，只有一个编码的外显子，其c d n a 全 长3 1 3 8 b p ，编码1 0 4 5 个氨基酸；r a 9 2 基因的c d n a 全长1 5 6 3 b p ，编码 5 2 0 个氨基酸【1 0 1 。 小鼠的r a g 基因连锁存在于其2 号染色体短臂( 2 p ) 上，其r a g l 基因同样不含内含子。其c d n a 全长3 1 2 3 b p ，编码1 0 4 0 个氨基酸；r a 9 2 基因的c d n a 全长1 5 8 4 b p ，编码5 2 7 个氨基酸f 1 习；在小鼠r a g l 蛋白中， 第卜3 8 4 个氨基酸为n 端区域，其中第2 5 0 - 3 5 0 个氨基酸指环结构；第 3 8 4 - 1 0 0 8 个氨基酸为核心区域。在r a g 2 蛋白中，第1 - 3 8 2 个氨基酸为 该多肽的核心区域【1 5 - 1 6 1 。 人的r a g 基因连锁存在于人的1 l 号染色体短臂1 区( 1 l p l 3 ) 上， r a g l 基因的c d n a 全长3 1 3 2 b p ，编码1 0 4 3 个氨基酸；r a 9 2 基因的c d n a 全长1 5 8 4 b p ，编码5 2 7 个氨基酸【1 3 1 。在人的r a g l 蛋白中，第卜3 8 6 个 氨基酸组成区域含有核定位信号，可为核转运蛋白s r p l 的靶点，另外还 有两个参与了r a g l 蛋白的二聚体的形成的发夹结构域c 3 h c 4 和c 2 h 2 ； 2 鲫鱼r a g 基因的克隆及表达分析 第3 9 2 - 5 2 6 个氨基酸组成了含两个非常保守的功能域的中心区域：第3 9 2 4 4 8 氨基酸组成的功能域可识别重组信号序列r s s ，并将r a g i 和r a g 2 蛋白复合体锚定在r s s 区，而第5 0 4 5 2 6 氨基酸残基是重组酶活性区域； 余下的氨基酸区域是与r a g 2 蛋白相互作用的功能域。在人的r a g 2 蛋白 中，其第1 - 3 8 2 个氨基酸是它的活性区域，包含6 个由5 0 个氨基酸残基 组成的k e l c h m i p p 重复基序，折叠成六棱的9 螺旋。该区域的主要功 能是介导蛋白一蛋白和蛋白一d n a 之间的相互作用【1 9 1 。 1 1 3r a g 基因的功能 脊椎动物的免疫系统中，b 淋巴细胞所产生的i g 和t 淋巴细胞的t c r 能 特异性地识别抗原并与之发生反应。而r a g l 基因和r a 9 2 基因编码的蛋白复 合物能特异性地识另l j i g 基因和t c r 基因中的v 、d 和jd n a 片段两侧的重组信 号序列，并催化该重组信号序列d n a 双链发生断裂，进而引发v ( d ) jd n a 片段进行重排。 在每个v 、d 和jd n a 片段的两侧都有高度保守的r s s 。r s s 由一个具有 回文结构的七聚体和一个富含a + t 的九聚体及它们中间相对不保守的间隔 序列( 1 2 或2 3 b p ) 组成。具有1 2 个碱基间隔的r s s 只能与具有2 3 个碱基间隔 的r s s 重组，这就保证d 片段只能和j 片段进行重组、v 片段只能和d 片段进 行重组。 v ( d ) j 重组的过程为r a g l 和r a 9 2 组成的复合蛋白特异性地识别并结 合在r s s 上，随后切断d n a ，再将待重组的两个片段凑近，并切除两个片段 之间的d n a 序列，然后将片段连接起来。由于存在不同的v 、d 、j 片段，所 硕士学位论文 以会产生不同的v d 3 组合。因此，r a g 基因所主导的v ( d ) j 重组是产生多 种i g 和t c r 的主要原因，在特异性免疫反应中发挥重要作用 1 , 2 0 - 2 2 1 。在成 熟的b 细胞中，r a g 基因可通过对v 、d 、j 基因片段的第2 次重组再次改变抗 体基因，从而产生新的特异性抗原受体f 2 0 】。 用基因打靶技术研究小鼠的实验证明r a 9 1 和r a 9 2 在v ( d ) j 重组和淋 巴系细胞发育中起着关键性作用瞄- 2 4 。r a g l - - 和r a 9 2 十小鼠均产生了严 重的t b 淋巴细胞早期发育阻滞：t 淋巴细胞在c d 3 - c d 4 一c d s - c d 2 5 + 阶段停 滞发育，b 淋巴细胞在b 2 2 0 一c d 4 3 + i g m 一祖b 细胞阶段停滞发育。该小鼠的外 周血液中没有成熟的t b 淋巴细胞。在发生r a g 基因错义突变的人体中，r a g 基因编码的重组酶活性部分或完全丧失，v ( d ) j 重组受阻，t b 细胞只能发 育到早期，结果导致血液循环中严重缺失t b 细胞，最终引发一种临床上 称为o m e n ns y n d r o m e 的免疫缺陷症【2 5 1 。如果r a g 蛋白主导了非标准的连接 过程，还可能发生抗原受体基因与癌基因之问的易位，引起淋巴细胞的恶 性变质【2 6 1 。 1 1 4r a g 基因的时空表达 r a g l 基因在受精后第4 天斑马鱼胚胎的胸腺原基中开始表达 8 2 7 1 ， 在斑马鱼成体的前肾、中肾和胸腺中有较强表达，在心脏和脾脏中不表 达【8 】。r a g l 基因在受精后第4 天鲤鱼胚胎的胸腺原基中开始表达网，在鲤 鱼成体的胸腺、前肾和中肾中有较强表达，在脾脏和肝胰腺中没有表达。 r a g l 基因在虹鳟鱼受精后第十天的胚胎中开始表达，在其成体的前肾和 胸腺中有很强表达，在中肾和脾脏有很弱表达阴。在爪蟾幼体中，r a g 4 鲫鱼r a g 基因的克隆及表达分析 基因在胸腺有很强的表达，在肝脏、脾脏和肾脏有较弱表达；在爪蟾成 体中，r a g 基因在胸腺和骨髓中都有表达【1 0 l 。鸡的r a g 基因在胸腺中表 达【1 1 1 。老鼠的r a g 基因在骨髓和胸腺中表达。由此可见，r a g 基因一般 在发生v ( d ) j 重组的一级免疫器官( 如鱼类的肾脏和胸腺以及其它脊 椎动物的骨髓和胸腺) 中表达【1 4 1 。除此以外，r a g 基因还在少数其他器 官中表达，如斑马鱼和爪蟾的卵巢1 8 1 0 】，斑马鱼嗅觉神经元【2 9 1 。r a g 基 因在大多数情况下是一起表达，但是在少数情况，比如在鸡的法氏囊和 哺乳动物的中枢神经系统f l l ，刈，只有其中一个表达。 1 1 5r a g 基因作为重要分子标记的运用 系统发生树( p h y l o g e n e t i ct r e e ) 是描述生物发生或进化顺序的拓扑 结构，表示不同物种间的进化关系。分子测序技术在p c r ( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ) 技术产生后得到飞速发展，许多物种的d n a 碱基序列已经 被测出，人们开始在分子水平上研究进化论。由于大多数生物的遗传物质 为d n a ( 某些病毒的遗传物质为r n a ) ，所以我们可以通过比较d n a 的碱基序 列来研究不同物种的进化关系。相对于从形态学和生理学层面上研究进 化，在分子水平上研究有以下优点：首先，细菌、植物和动物的d n a 都是 由a 、t 、c 、g 这4 种碱基组成。其次，物种的形态性状在一段较短时间的 进化演变都有可能非常复杂，根据形态的建立系统发生树并不可靠，而用 数学模型来探求d n a 进化演变中的规律，描述各物种、甚至是亲缘关系较 远的生物间进化关系就相对准确。第三，所有生物的基因组的核酸序列所 包含的信息要比形态性状包含的多得多。因此，根据d n a 碱基序列建立的 硕士学位论文 进化树可以很好地告诉我们些进化机制以及不同进化事件的产生以及 彼此之间的关系等等【3 1 1 。 r a g 基因在脊椎动物中普遍存在，在进化过程中非常保守【4 , 6 , 7 , 3 2 ，而 且分子大小适中，因此可被用作脊椎动物进化分析的标记基因。s u l l i v a n jp 等用r a g 基因做分子标记分析鲇鱼主要群体的进化关系【3 3 】；v e n k a t e s h b 等用r a g 基因做分子标记分析有颌脊椎动物的进化关系1 3 4 1 ；w a n gx 等用 r a 9 2 基因做分子标记研究东亚鲤科鱼类的进化关系【3 5 】。 鉴于r a g 基因主导b t 淋巴细胞的v ( d ) j 重排，在b t 淋巴细胞的发育 过程中表达【3 ，3 6 1 ，所以r a g 基因也可以做为研究b t 淋巴细胞的成熟过程， 迁移途径等方面的分子标记。m a it r e y ad u n h a m1 3 7 1 、n a d i ad a n il o v a l 3 8 1 、 w i l l e t tce 【3 9 l 用r a g l 基因作为分子标记用来鉴定和跟踪斑马鱼胚胎发育 过程中t 淋巴细胞的位置，以探索斑马鱼胸腺的发育过程。 1 2 克隆基因的方法 2 0 世纪7 0 年代末，人们发现了限制性内切酶并开始用质粒作载体，这 使得d n a 体外重组技术有了长足发展，使基因克隆成为可能。基因克隆技 术在过去的3 0 多年间获得了快速发展。许多克隆方法产生并且不断发展和 完善，以满足不同研究的需要。以下我们简要介绍一些克隆基因的方法。 1 2 1c d n a 文库的构建 c d n a 文库的构建是基因克隆的重要方法之一。真核生物基因组d n a 碱基序列非常庞大，直接从基因组中分离目的基因片段是比较困难的。通 鲫鱼r a g 基因的克隆及表达分析 过从构建好的e d n a 文库中分离目的基因的e d n a 序列，这在很大程度上增加 了我们搜寻目的基因的成功率。在h o f s t e t t e r 于1 9 7 6 年成功构建了第一个 e d n a 文库之后，构建e d n a 文库的方法得到了很大的改进和提高，同时利 用构建好的e d n a 文库筛选、一克隆出许多基因。 1 2 1 1 经典e d n a 文库 构建经典e d n a 文库的方法如下：以m r n a 为模板和o l i g o ( d t ) 与随 机六聚体为引物逆转录合成c d n a 的第一链；再用r n a 酶去除d n a r n a 杂交 链中的r n a 链，再以末端残余的r n a 为引物，引导e d n a 第二链的合成； 合成的c d n a 链经过补平或连上接头后，插入到噬菌体载体或质粒载体中， 再分别进行包装转染或转化至感受态细菌【加】。经典e d n a 文库一般用于获 得高丰度m r n a 的c d n a 克隆。 1 2 1 2 差减c d n a 文库 差减c d n a 文库又称扣除文库( s u b t r a c t e dc d n al i b r a r y ) ，是反映不 同组织或同一细胞的不同功能状态下，基因差异性表达的c d n a 文库。构 建差减文库，在很大程度上减少所需筛选的克隆。差减c d n a 文库主要用于 研究细胞的发育、分化、细胞周期、细胞对药物和生长因子的诱导反应以 及肿瘤等疾病。其构建方法如下：首先提取不同组织细胞中的m r n a ，再将 其中一种细胞的m r n a 反转录出e d n a 的第一链，随后与另一种细胞的m r n a 进行杂交；然后分出没有形成杂交体的c d n a ，并合成c d n a 的第二链，最 后以此双链c d n a 构建差减e d n a 文库【4 1 1 。 硕士学位论文 1 2 1 3 标准化c d n a 文库 在标准化e d n a 文库( n o r m a l i z e de d n al i b r a r y ) 中，靶组织细胞中不 同表达丰度的m r n a 逆转录后的c d n a 含量趋于相等。其原理是根据e d n a 退火的动力学特性，使未复性部分的单链c d n a 逐渐趋于等量化。由此可 见，标准化c d n a 文库很适于克隆极低丰度表达的m r n a ，适合于分析不同 发育阶段的基因表达及突变检测【4 2 1 。 i 2 i 4 染色体或区域特异， 生c d n a 文库 分离一些与染色体相关的疾病基因，尤其是肿瘤基因，可用染色体或 区域特异性c d n a 文库。构建方法如下：用含感兴趣染色体的体细胞的c d n a 与丢失该区域染色体的细胞的过量m r n a 进行减数杂交；然后分离出没有 杂交的c d n a 并将它们进行p c r 扩增；最后克隆到载体中，建立染色体或 区域特异性c d n a 文库【4 3 1 。 1 2 2 基因组文库法 基因组文库( g e n o m i cl i b r a r y ) 由来自基因组d n a 的全部d n a 片段组 成。建立基因组文库，我们通常选用久噬菌体d n a 作为载体。构建基因组 文库的基本步骤为：首先提取出要制备的目的组织中基因组d n a ，并用限 制性内切酶处理基因组d n a ，产生大小适宜的d n a 随机片段；然后将这些 d n a 片段克隆到久噬菌体中；随后用久噬菌体重组体感染大肠杆菌细胞， 再培养以感染的大肠杆菌，即可获得基因组文库【件蜘。 鲫鱼r a g 基因的克隆及表达分析 1 2 3p o r 技术 1 9 8 3 年，k b m u l l i s 发明了能在体外快速扩增特异性基因核苷酸序 列p c r 技术。其原理是：在存在d n a 模板、引物、d n t p s 和合适的缓冲液反 应体系中，热稳定d n a 聚合酶催化引物所界定的d n a 片段进行扩增。这种 扩增的周期包括d n a 模板和引物之间d n a 片段的变性、退火和延伸；一般在 进行2 5 - 3 0 次周期循环后，可得到大量的d n a 目的片段。扩增的快速性和 特异性是p c r 技术的两大特点。该技术一般用来克隆已知核苷酸序列的基 因或其同源基因脚】。 1 2 4 差异表达基因克隆技术 功能性基因研究的基础是分离并克隆差异表达基因。差异表达基因克 隆技术在近年来不断得到完善与发展，成为了研究相关疾病基因的重要手 段。 1 2 4 1 差异显示反转录p e r 1 9 9 2 年，p l i a n g 和a d p a r d e e 发明了差异显示反转录p c r 技术 ( d i f f e r e n t i a ld i s p l a yo fr e v e r s et r a n s c r i p t i o n a lp c r ，d d r t p c r ) 。 该技术的原理为：根据真核细胞大多数基因的m r n a 尾部都具有p o l y ( a ) 结构，设计一套3 端引物( 1 2 条) 和针对5 端的随机引物( 2 0 条) ，r t - p c r 扩增后，从凝胶上回收差异片段并进行分析。通过p c r 扩增和调整引物量， 使得丰度较低的目的m r n a 在数量上得以放大。该技术的缺陷在于：所获 得的c d n a 假阳性较多；差异条带分离困难；获得的差异片段一般在 硕士学位论文 l o o b p - 6 0 0 b p 之间，长度受限等【4 刀。 1 2 4 2 代表性的差异分析 1 9 9 4 年，m h u b a n k 等人将代表性的差异分析技术( r e p r e s e n t a t i o n d i f f e r e n c ea n a l y s i s ，r d a ) 成功应用到克隆差异表达基因中。r d a 的基本 原理是：靶方( t e s t e r ) 和驱动方( d i v e r ) 的c d n a 均被一种识别4 碱基序列 的限制酶切割成平均长度为2 5 6 b p 的c d n a 片段群，随后，慢慢提高t e s t e r 和d i v e r 杂交反应时的总量比：通过降低c d n a 群体复杂性和多次更换c d n a 两端接头，利用p c r 的特性( 双链模板扩增的呈指数形式增长，单链模板 以线性形式增长) 来特异扩增目的基因片段【删。r d a 技术的缺点是实验周 期长，而且所需的起始材料较多。 1 2 4 3 抑制性扣除杂交 1 9 9 6 年，d i a t c h e n k o 等人提出抑制性扣除杂交技术( s u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 。该技术主要用于研究上调基因的表 达。s s h 的基本原理如下：先用限制性内切酶将驱动方与靶方的c d n a 酶切 成小片段，再将靶方的c d n a 分为平均两份，连接上不同的接头后，与过量 的驱动方e d n a 进行杂交。然后将两份杂交样品混合，并加入新的变性驱动 方c d n a 以进行第二次扣除杂交；补平完成杂交的c d n a 末端，加入合适的 引物接头并进行p c r 扩增。含有相同的接头的d n a 双链，其p c r 扩增受抑 制，而含不同接头的d n a 双链p c r 扩增呈指数增长，其产物就是目的片段 【4 9 】。 鲫鱼r a g 基因的克隆及表达分析 1 2 5 化学合成法 基因就是一段核苷酸序列。在实验室中，我们可以用化学方法进行基 因的人工合成。现在已经可以进行d n a 的自动合成，基因的化学合成已经 变得非常容易。化学合成法常用于合成那些其它克隆技术不易分离到的基 因。现已有合成人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介 素一2 和集落刺激因子等基因的报道【5 0 1 。 1 2 6 生物信息学在基因克隆中的应用 生物学与计算机科学以及应用数学等相互交叉组成一门新兴科学一 生物信息学( b i o i n f o r m a ti c s ) 。它的应用为基因克隆提供了强有力的手 段。人类基因组计划已经完成，在积累了大量有关基因序列定位、表达和 功能研究等方面数据。将这些数据通过英特网相联，从而实现了信息资源 的共享。利用这些数据资源来克隆新基因，这已经逐渐成为了人类发现和 克隆新基因的重要策略。 1 2 6 i 利用e s t 数据库进行基因克隆 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) 技术于1 9 9 5 年开始建 立和应用。e s t 包含了基因结构区的信息，是完整基因上能特异性标记基因 的一部分核苷酸序列。e s t 的基本原理为：从组织特异性或细胞特异性的 d n a 文库中随机挑选克隆，并进行5 和3 端部分测序，再检索g e n b a n k ， 即可判断基因库中的已知基因与所获序列及其对应的多肽序列是否有同 源性。最后对发现的新基因进行突变及表达分析，可以发现许多未知的基 硕士学位论文 因【5 1 1 ，如o k a n o 利用该技术克隆到一组新的哺乳动物d n a 甲基化酶基因【5 2 1 。 1 2 6 2 电子克隆 电子克隆( i n s i l i c o nc l o n i n g ) 就是利用计算机来协助克隆基因。它 以拟南芥、果蝇、小鼠和人等模式生物的基因组信息为基础，采用生物信 息学的方法延 申e s t 序列，以获得未知基因的部分乃至全长的c d n a 序列。 其思路为：首先在n c b i 上用靶序列作为信息探针做b l a s t 分析，筛选出感 兴趣的外显子序列，并通过超级链接得到其所在的基因组序列；随后按这 些外显子在基因组上的位置把序列依次进行连接，构建包含这些e s t 的重 叠群；再比较重叠群与非冗余数据，验证重叠群并分析其开放阅读框；再 通过g e n b a n k 完整e s t 数据，找到一个高度同源的基因组d n a 序列；最后 以该基因组d n a 序列设计引物，进行p c r 扩增得到新基因f 5 3 1 。 1 3 基因表达分析的方法 随着功能基因组学研究的兴起，基因表达研究的分析方法也在不断发 展。常规的基因表达分析方法有n o r t h e r n ，s l o t ，d o t 杂交，r t - p c r ，核 糖核酸酶保护实验等。最近这些年发展起来的一些方法可以同时在多个实 验样品中分析所有有差异表达的基因。以下我们简单介绍一些研究基因表 达分析的方法。 1 3 1n o r t h e r n 杂交技术 1 9 7 7 年，a l w i n e 等发明的n o r t h e r n 杂交技术1 5 4 是基因表达分析方法 鲫鱼r a g 基因的克隆及表达分析 上的重大突破。利用这项技术，用标记的e d n a 或r n a 探针与r n a 进行印迹杂 交，以此来研究m r n a 转录本的表达类型。 1 3 2 应用m r n a 反转录扩增c d n a 反转录p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e p c r ，r t - p c r ) 是一种从r n a 扩 增e d n a 拷贝的方法。其基本流程为：提取组织或细胞中的总r n a ，以其中 的m r n a 作为模板，采用o l i g o ( d w ) 或随机引物，利用逆转录酶反转录成 e d n a 。再以e d n a 为模板进行p c r 扩增。最后获得目的基因或检测基因表达。 r t - p c r 使r n a 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量r n a 样品 分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物，获取目的基因，合 成c d n a 探针等【5 5 1 。 1 3 3 原位杂交 原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 是用标记的核酸探针，经放射 自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行 定位和相对定量研究的一种手段。通常可以分为r n a 原位杂交和染色体原 位杂交两大类【5 6 1 。 原位杂交的基本原理为：在适宜的条件下，两条核苷酸单链片段通过 氢键结合，形成d n a - d n a 、d n a - r n a 或r n a - r n a 的杂交分子。通常选用带 有标记的( 比如放射性同位素、荧光素生物素、地高辛等) d n a 或r n a 片段 作为核酸探针，与组织内或细胞内待测核酸片段进行杂交，然后用放射自 显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的m r n a 或d n a 的存在和定 硕士学位论文 位，准确探测基因表达的位置。原位杂交有很高的敏感性和特异性，已成 为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。 1 3 4 代表性的差异分析 代表性的差异分析( r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s ，r d a ) 原理在1 2 4 2 中已有所介绍。r d a 利用消减杂交和p c r 技术( 这两种技术 结合起来，能提供了高纯度的靶c d n a ) ，分析差异基因表达【4 8 朋。利用r d a 技术成功地分离出有疾病的细胞和生长因子刺激的细胞中的差异表达基 因【5 8 - 6 0 l 。 1 3 5d n a 微阵( d n am i c r o a r r a y s ) 将成千上万种基因的d n a 片段有组织的点在固相片基上，将这种芯片 作为探针，去检测不同组织和不同细胞的基因表达情况，这就是d n a 微阵 技术。1 0 0 0 0 或更多的基因表达能够在一块芯片上进行分析1 6 1 】。这项技术 的优点是可同时平行测定数千种基因。 1 3 6 差减杂交 差减杂交( s u b t r a c t i o nh y b r i d i z a t i o n ) 的原理是：通过一个样品( t ) 的