（基础兽医学专业论文）鸡防御素基因的克隆、组织分布及Gal2基因的原核表达.pdf

摘要 为了对鸡基因组中防御素基因的序列和表达情况进行研究。本实验选取不同 日龄的来航鸡为研究对象，应用分子克隆技术，分别设计了1 3 对特异性引物对 鸡体内的1 3 种防御素基因片断进行克隆和序列分析，成功克隆了g a l l g a 卜1 2 基因，并研究了其在脑、心脏、法氏囊、脾脏、肾脏、肺脏、肝脏、骨髓组织中 分布情况。利用麦芽糖结合蛋白表达系统p m a l - c 2 x 质粒表达系统对g a l - 2 基因 进行成功表达，经i p t g 诱导得到麦芽糖结合蛋白，为下一步纯化目的蛋白，研 制开发抗生素替代品提供科学的理论和实践基础。 1 鸡防御素基因的克隆及组织分布 应用t r i z o lr e a g e n t 试剂盒r n a 抽提法，对鸡的脑、心脏、法氏囊、脾脏、 肾脏、肺脏、肝脏、骨髓进行r n a 抽提，经2 o 琼脂糖凝胶电泳后出现2 8 ；和1 8 。r n a 两条清晰的条带。分光光度计检测其r n a 在2 6 0 h m 和2 8 0 n m 时的0 d 值，计算鸡 r n ao d 2 6 0 o d 2 8 0 值均在1 9 左右。实验所得r n a 纯度高，满足实验要求。 根据g e n b a n k 登录的g a 卜l g a 卜1 3 的基因序列，设计了十三对特异性引物， 运用反转录聚合酶链式反应( r t p c r ) 技术，首先反转录合成鸡的1 3 个防御素基 因的c d n a 第一链，然后进行p c r 扩增。6 a l 一1 g a 卜1 2 基因的r t p c r 产物均出 现特异性条带。测序结果进行b l a s t 比对结果显示：与报导的序列基本一致，同 源性均在9 5 以上，且每个序列都包括完整的开放阅读框在内，为以后利用巢氏 p c r 进行进步扩增表达做好了准备。首次在国内报导的6 a l - 4 g a l 一1 2 的基因 序列。 用十三对特异性引物对从八个组织中提取的r n a 反转录的c d n a 链进行p c r 扩增，g a l - l g a l - 1 2 在各个组织中均有分布，骨髓中有g a l 一1 7 表达，肾脏 中有g a l - 9 l l 表达，肝脏中有g a l - 1 和g a l - 8 l o 表达，脑组织中仅有g a l 一5 表达，心脏中也只有g a l 一1 2 表达，法氏囊中有g a l 一1 和g a l 一3 表达，脾脏中只 有g a l i 表达，肺脏中有g a l 一1 3 和g a l l o 表达。g a l 1 3 在以上八个组织中 未发现存在，表明可能防御素的分布存在着品种及个体差异，具体原因还有待于 进一步的研究。 2 鸡g a l - 2 基因的克隆及鉴定及表达 为了便于对鸡g a l - 2 基因进行表达，在g a l - 2 的引物p 。、p ：的5 、3 端设计 了e c o ri 、x b ai 酶切位点和相应的保护碱基。首先将鸡g a l 一2 基因的r t p c r 产物纯化，插入到克隆载体p g e m - te a s y 的多克隆位点中，构建重组质粒 p g e m t g a l - 2 ，转化大肠杆菌d h 5a ，a m p 抗性筛选，得到阳性克隆质粒。并将 该阳性克隆质粒进行p c r 鉴定，电泳得到约1 9 5 b p 大小的特异性条带，重组质粒 构建成功。然后将p m a l c ：x 质粒进行双酶切，然后将g a l - 2 片断插入到经过双 酶切的p m a l 质粒中，构建了表达载体p m a l c 。x - g a l 一2 ，菌落p c r 鉴定挑出阳性转 化子，将阳性转化子增菌后用i p t g 进行诱导表达，运用s d s - - p a g e 电泳鉴定融 合蛋白已经表达。 以上研究表明：本实验利用现代分子学技术对在鸡体内的新型抗菌肽一防御 素进行了成功克隆，并对起在鸡体内一些主要组织中的分布情况进行一些基础研 究；在g a l 一2 基因成功克隆的基础上，将其基因片断成功导入并构建克隆载体 p g e m - t g a l 一2 和表达载体i a m a l c 2 ) 【一g a 卜2 ，用i p t g 进行了成功诱导表达。 关键词：鸡防御素克隆鉴定组织分布o a l 2 原核表达 i i a b s t r a c t i no r d e rt os t u d yo nc h i c k e ng e n eo fc h i c k e ng e n o m e l a i h a n ge h i c k ew a st a k e n a sr e s e a r c ho b j e c ti n t h i se x p e r i m e n t t h i r t e e nk i n d so fi b - d e n f e n s i ng e n ei nc h i c k e n h a v eb e e ns u c c e s s f u l l yc l o n e da n ds e q u e n c ea n a l y s i s e db ym o l e c u l a rc l o n i n g t e c h n o l g y g a l - 4 g a l 1 2g e n es e q u e n c ch a v eb e e nr e p o r t e df i r s tt i m ei n t e r n a l t h e t h i r t e e ng e n e s d i s t r i b u t i o ni nb r a i n , h e a r t , , k i d n e y , l u n g , l i v e r , s p l e e n ，b u r s ao ff a b r i c i u s a n dm a r r o wh a sa l s ob e e ni n v e s t i g a t e d b a s e do nt h ee s c h e r i c h i ae o l ig e n ee x p r e s s i o n p r i n c i p l e , m a l t o s e - b i n d i n gp r o t e i ne x p r e s s i o ns y s t e mp m a l - c ：xw a su s e d t o s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c tg a l 一2g e n ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r a 1 lt h ed o n ew o r k a b o v eh a sp r o v i d e dr a t i o n a b l ef o rf u r t h e rc o m p r e h e n s i o no fd e f e n s i n sb i o l o g i e a l f u n c t i o na n de x p l o i t a t i o no f n e wa n t i b i o t i c s t h er e s u l ta 8f o l l o w ： 1c l o n ea n dt i s s u ed i s t r i b u t i o no fg a l - l g a l 1 3i nc h i c k e n t r i z o lr e a g e n tw a sa d o p t e dt oe x t r a c tt h er n ao fc h i c k e n sb r a i n , h e a r t ，b u r s a o ff a b f i c i u s ，s p l e e n , k i d n e y , l u n g ，l i v e r a n dm a r r o w , 2 8 sa n d1 8 sr n ab a n d sw e r e f o u n db y2 0 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s i ts h o w e dt h a te x t r a c t e dr n ac o u l db e u s e df o rr t - p c re x t e n s i o n ；t h eo dv a l u e so fr n aa tw a v e l e n g h so f2 6 0 n ma n d 2 8 0 n mw e r ed e t e r r n i n a t e db ys p e e t r o p h o t o m e t e r ，t h er a t i o e sb e t w e e nt h er e a d i n g sa t 2 6 0 n ma n d2 8 0 n m ( o d 2 6 0 o d 2 8 0 ) w e f ca l la b o u t1 9 t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e p u r i t yo f o b t a i n e dr n a w a sh i 曲e n o u g ht os a r i s f yt h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t a c c o r d i n gt ot h eg e n es e q u e n c eo fg a l l i n a c i n - 1 g a l l i n a e i n 一1 3r e g i s t e r e di n g e n b a n k ，t h i r t e e np a i r so fp r i m e r sw e l ed e s i g n e dr e s p e c t i v e l y r n af r o mt h et i s s u e s w a sr e ：v e l s et r a n s c r i b e dw i t hr a n d o mp r i m e r sa n ds u p e r s c r i p t1 ir e v e r s et r a n s e r i p t a s e b yu s i n gaf i r s t - s t r a n de d n as y n t h e s i sk i t ( p r o m e g a ) a c c o r d i n gt ot h ei n s t r u c t i o n s t h es u b s e q u e n tp c rw a sc a r r i e do u tw i t l lt h ef i r s t - s t r a n de d n aa n dg e n e - s p e c i f i e p l i n l e l sf o rg a l - 1 1 3 t h eg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w e dt h a t 印e c i f i c i l e s ss t r a pc o u l db e s e e ni nt h ef i g u r eo fg a l 一1 g a l 1 2 t h es e q u e n c e dr e s u l tw e r et h es a r n e 郡t h e r e p o r t e ds e q u e n c e ，a l lt h eh o m o l o g yr a t ew e r ea l li n o r et h a n9 5 a l lo ft h ec l o n e d s e q u e n c e sc o m p r i s e dc o m p l e t er e a d i n gf r a m et h a tg o tr e a d yf o rt h en e x ta m p l i f i c a t i o n b yn e s t e dp c r i na b l et os u m m e r i z et i s s u ed i s t r i b u t i o ni n f o r m a t i o no f1 3s p e c i e so f d e f e n s i n ，t h e p c rw a sc a r r i e do u tw i t ht h ef i r s t - s t r a n de d n aw h i c hw e r er e v e r s et r a n s c r i p t e df r o m r n at h a tw g l ee x t r a c t e df r o m8k i n d so ft i s s u ea n dg e n e s p e c i f i cp r i m e r so fg a l 一1 1 3 g a l 一1 g a l 一1 2w e r ef o u n di n8t i s s u e s g a l 一1 3h a s n tb e e nf o u n di nt h ea b o v e t i s s u e s g a l 一1 7w e r ei nm a r r o w ，g a l 一9 11w e r ei nk i d n e y ，g a l 一1a n dg a l 一8 1 1 i 1 0w e r ei nl i v e r , o n l yg a l 一5w a si nb r a i n ，o n l yg a l 1 2w a si nh e a r t ，g a l 一1a n dg a l 3 w e r ei nb u r s a o f f a b r i c i u s ，o n l yg a l 一1w a si ns p l e e n ，g a l 一1 3a n dg a l i 0w e r ei n l u n g t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ew e r ev a r i e t ya n di n d i v i d u a ld i f f e r e n c e si nd e f e n s i n d i s t r i b u t i o n ，s of u r t h e rr e s e a r c hw a ss i g n i f i c a n c e 2c l o n e ，i d e n t i f i c a t i o na n d e x p r e s s i o no fg a l - 2g e n ei nc h i c k e n r t - p c rp r o d u c t so fg a l 一2g e n ei nc h i c k e nw e r ep u r i f i e d ，t h e nw e r ei n s e r t e di n m u l t i p l ec l o n i n gs i t e so fp g e x - te a s yp l a s m i dv e c t o r , f o r m e dr e c o m b i n a n t p g e x - t - g a l 一2p l a s m i d ，w h i c hw a st h e nt r a n s f o r m e di n t oe c e l ld h 5 a ，p o s i t i v ec l o n e p l a s m i dw a ss c r e e n e dw i t ha m pr e s i s t a n c es c r e e n i n ga n dc o l o n yp c r as p e c i f i e n e s s s t r a po f1 9 5b ph a s db e e no b t a i n e d ap a i ro fp r i m e r st oa m p l i f i c a t eg a l 一2g e n ew a s d e s i g n e d u p s 仃e a mp d m e r ：g c g a a t t c c a t g a g g a t t c t i t a c cc o n t a i nae c o ri e n z y m es i t e ；d o w n s t r e a mp r i m e r ：g c t c t a g a t c a t c 把a t r c c a a g g cc o n t a i na x b aie n z y m es i t ea n dr e c i p r o c a lp r o t e c t e db a s i cg r o u p r t - p c rp r o d u c t so fg a l - 2 g e n ew e r ei n s e r t e di np m a l - e 2 xp l a s m i dv e c t o rw h i c hw a sd o u b l ee n z y m ec u r e db y e e o rie n z y l ea n dx b aie n z y m e ，f o r m e dr e c o m b i n a n tp m a l - c 2 x - g a l 一2p l a s m i d e x p r e s s i o nv e c t o r i no r d e rt oc o n f i r mt h ep r e s e n c eo ff o r e i g n g e n e ，p o s i t i v e r e c o m b i n a n tp l a s m i dw a si d e n t i f i e dw i me c o ri ，x b aid o u b l ee n z y m ec u t t i n g ，t h e e l e c t r o p h o r e s i sr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ea n t i c i p a t e ds i z e ( 1 9 5 b p ) g e n ef i a 舯e n t w a so b t a i n e d ；a n dw a sa p p r a i s e db yp c r ，s p e c i f i cb a n da b o u tt h e1 9 5 b ps i z ew a s f o u n dw i t l lt h ee l e e t r o p h o r e s i s t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h eg a l 一2g e n ew a s i n s e r t e dt op m a l - c 2 x p l a s m i d sa n dr e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dw a sc o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l l y f o l l o w i n gi n d u c t i o nw i t hd t g s d s p a g ed e t e c t i o n t h ea b o v er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h en e wt y p eo fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d e - d e f e n s i n w e r es u c e f f u l l yc l o n e db ym o d e mm o l e c u l a rt e c h n o l o g y ，d e n s i nd i s t r i b u t i o ni n c h i c k e n st i s s u ew a sa l s ob es t u d i e d o nt h eb a s eo fs u c c e s s f u l l yb e i n gc l o n e dg a l 一2 w a ss u c c e s s f u l l yi n s e r t e di n t op g e x - tc l o n ev e c t o ra n dp m a l - c 礁x e x p r e s s i o nv e t o n k e yw o r d s ：c h i c k e n ，d e f e n s i n ，c l o n i n ga n di d e n t i f i c a t i o n , t i s s u ed i s t r i b u t i o n ，g a l 一2 ， p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n 英文缩写词表 中文译名英文全称 氨苄青霉素 a m p i c i l i n 焦碳酸乙二酯d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 乙二胺四乙酸 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d 溴化乙锭 e t t l i d i u mb r o m i d e 异丙基硫代一p d - 半乳糖苷i s o p r o p y l t h i o p - d - g a l a c t o s i d e 小半乳糖苷酶基因l a c t o s e z 磷酸盐缓冲液p h o s e p h a t e b u f f e r e ds a l i n e l b 培养基l u r i a - b e r t a n i 聚丙烯酰胺凝胶电泳p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚合酶链式反应p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 逆转录聚合酶链式反应r e v u et r a n s e r i p t a s e - p o l y m e r a s e c h a i nr e a t i o n 5 一溴4 氯3 吲哚- b d 5 - b r o m o - 4 c h l o r o 一3 i n d o l y l - b d 半乳糖苷 g a l o c t o d e 三羟甲基氨基甲烷t r i 一( h y d r o x y m e t h y l ) 一a m i n o m e t h a n e 核糖核酸 r i b o n u c l e o t i d ea c i d r n a 酶抑制剂 r i b o s o m en u e l e o t a s ei n h i b i t o r 核苷酸 n u c l e o r i d e 碱基对 b a s ep a i r 互补d n a c o m p l e m e n t a r yd n a 脱氧核糖核酸d e o x y r i b o n u c l e o t i d e a c i d 克 g r a m 光密度 i n t e g r a t e do p t i c a ld e n s i t y 国际单位 i n t e r n a t i o n a lu n i t 千道尔顿 1 0 d a l t o n 千碱基对k i l o - b a s e p a i r 毫克m i l l i g r a m 毫升 m i l l i l i t e r 每m i n 转数 r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 单位 u i l i t 微升 m i c r o l i t e r v 英文缩写 a m p d e p c e d l a e b 皿t g l a e z p b s l b p a g e p c r r t 二p c r x - g a l t r i s r n a r n 鹪i n n t b p c d n a d n a g i o d i u k d k b m g m l r p m u 皿 文献综述 1 抗菌肽研究概况 抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ，a m p s ) 是一类对抗外源性病源茵的防御性 肽类活性物质，是生物机体免疫系统的一个重要组成部分。近年来，对a m p s 的研 究主要集中在两个方面，一方面是在分子水平上弄清a m p s 在动物免疫系统中精细 的合成过程及其调控机制；另一方面是探讨a m p s 的药用开发价值，为解决细菌对 传统抗生素日益增强的耐药性这一难题提供新的途径。在这种力量推动之下，其 研究进展极为迅速，迄今为止，在动植物包括人类中有超过7 5 0 种的抗菌肽已经 被报道，其中许多a m p s 的c d n a 已被克隆测序。 先前研究热点集中在某些a m p s 基因初步的基因定位和表达调控机制方面。近 年，已有一些抗菌肽研究至临床实验测试研究阶段，例如，a 一螺旋肽m s i 一7 8 作 为治疗糖尿病、脚部溃疡局部药物正进行测试；b 一链肽i b 3 6 7 作为治疗包括牙周 疾病，龋齿，念珠菌病，口腔粘膜炎与骨髓移植病人免疫抑制治疗局部药物正在 进行研究；n i s i n ( 尼生素，乳酸链球菌肽) 用作胃幽门螺旋杆菌感染与溃疡治疗 药物正在测试；m y c o p r e x ( 由b p i 衍生的肽) 用在全身的念珠菌病感染以增强呋喃 喹酮的活性m 。 小分子阳离子抗菌肽从三维结构上目前可以分为四类嘲：( 1 ) 由2 4 对二硫键 形成稳定b 片层结构的抗菌肽，如防御素；( 2 ) 无结构折叠或a 螺旋抗菌肽( 如 h u m a nm a g a i n i n ，i l - 3 7 等) ；( 3 ) 一个或二个氨基酸( 如脯氨酸，组氨酸，色氨 酸) 占主导的扩展延伸肽( 如猪p r 3 9 ) ；( 4 ) 成环肽( 如牛b a c t e n e c i n ，牛白细胞抗 菌肽) ，还有一些其它的经蛋白水解酶降解后产生抗菌活性物质，如乳铁蛋白等。 所有抗菌肽都具有两个明显特点。 近几年来，抗菌肽中防御素开始引起研究者的重视，与其它抗菌肽相比具有 特殊的作用机理。它主要作用于病原微生物的细胞膜，使膜通透性增加，使病原 微生物不易对其产生抗药性，因此防御素具有其它抗生素无可比拟的优势。而且 体外实验表明它具有十分广泛的抗菌谱，可以抗细菌、真菌、囊膜病毒等多种微 生物，而且对一些恶性肿瘤细胞和艾滋病毒等也有杀伤作用。防御素不但抗菌作 用机理独特，而且抗菌谱广，因此无论是在药用开发还是在动植物抗病育种中， 防御素都显示出了广泛的应用前景。 2 防御素的研究概况 防御素( d e f e n s i n ) 是一类内源性l p s ，在动物、植物、昆虫体内广泛存在、 具有广谱抗菌功能。”。同其他a m p s 不同，防御素具有独特的反向平行的b 片层 结构。对防御素的生物学活性研究表明，它具有抗细菌、霉菌、病毒、螺旋体活 性及抗肿瘤细胞毒性作用睁。 2 1 防御素分类 防御素最早是在兔子肺巨噬细胞中分离鉴定出来的。随后在许多不同组织和 其他细胞中也被发现，包括上皮细胞等。大多数脊椎动物防御素都具有由保守的 6 个半胱氨酸相互连接形成三对分子内二硫键结构，根据二硫键的位置不同及核 苷酸、氨基酸结构序列差异可将防御素家族明显地分为三类：a 、1 3 、o 一防御 素。n ，b ，o 一防御素二硫键结构示意图： i 。r - - - - - - - - - - - - - - - 1 1 - n 般i i b ，6 ：芒：i 二：石i 己t i i 。i x i i 亡占 肿蠢一。e 忑忑磊蠢磊焉吾i i 丑r l2 3 4 56 图11 ：防御黍二硫键结构示意图 f i 9 1 1d i s u l i d e l i n k a g es t r u c t u r e c o n c e p t u a l d i a g r a m o f d c f e n s i n a 一防御素的三对二硫键分别以卜6 ，2 4 ，3 5 连接为特征，b 一防御素的三 对二硫键分别以卜5 ，2 - 4 ，3 - 6 连接为特征“，o 一防御素则是以卜6 ，2 - 5 ，3 - 4 ； 虽然二硫键结构及氨基酸序列一级结构有差异，但它们具有相似的三级结构，即 三条反平行b 层结构，产生很强的抗菌活性，并且基因位置在染色体上紧密成丛 存在，表明是从一个共同祖先基因进化的分化。 2 1 2a 一防御素的特点和分类 a 防御素通常称为经典防御素，在大多数动物的中性粒细胞、巨噬细胞、 粘膜隐窝、潘氏细胞中都含有“。研究发现在刚分离的人的富含t 细胞与n k 细胞 的淋巴细胞，用i l 一2 刺激培养5 天，发现也可以表达h n p 一1 3 和其他抗菌肽分子。 a 一防御素最初是从豚鼠和兔子的多形核嗜中性粒细胞中分离纯化出来的“，这 类从中性粒细胞来源的防御素称为髓源防御素。类似的肽随后从仓鼠、人类、猴 子与老鼠等多种哺乳动物的许多器官和组织中发现“+ ”1 。 肠源n 一防御素发现于位于肠绒毛内乳糜管壶腹底部隐窝的p a n e t h 细胞，所 以称为隐窝素“”，第一次是在小鼠中发现。n 一防御素先合成电中性、无活性 2 的前体多肽分子形式，含8 7 9 7 个氨基酸残基，包括1 8 2 0 个氨基酸残基的信号肽、 3 9 4 5 个氨基酸残基的前原肽与2 9 3 6 个氨基酸残基的成熟肽。无活性的分子经过 蛋白酶两次水解作用成有活性的成熟肽，贮藏在嗜中性粒细胞、巨噬细胞颗粒和 小肠肠腺基底部p a n e t h 细胞、上皮粒细胞中。第一次水解去掉信号肽，第二次水 解则去除前原片断。释放出来的有活性的肽才具有抗菌功能，对大多数微生物包 括细菌、真菌、囊膜病毒”1 都具有抗菌活性，而且也有报道有防御素对真核细胞 具有细胞毒性作用。“。q 一防御素可以灭活不同的病毒，如单纯疱疹病毒、巨细 胞病毒、流感病毒、h i v 一1 。它们对革兰氏阳性菌、阴性菌、分支杆菌、真菌、 包膜病毒的有效浓度为1 - 1 0 0m g l 。 循环的嗜中性粒细胞是髓源防御素的初始来源。在人和许多小的哺乳动物如 豚鼠、兔子、大鼠、小鼠的嗜中性粒细胞苯胺蓝颗粒中这些肽以高浓度贮藏，特 别在吞噬细胞的细胞器小体内( 如粒细胞和一些巨噬细胞) 和潘氏细胞”4 1 删p _ 卜4 组成了人嗜中性粒细胞细胞内蛋白总量的5 1 0 嘲，占苯胺蓝粒细胞总蛋 白的3 0 5 0 。兔防御素n p 一1 ，2 ，3 a ，3 b ，4 ，5 ( r a b b i tn e u t r o p h i l ep e p t i d e ) 组成了 兔嗜中性粒细胞细胞内蛋白的1 5 2 0 。鼠嗜中性粒细胞q 一防御素( r a t n p 一1 4 ) 在骨髓中由嗜中性粒前体细胞中合成，贮藏在成熟的嗜中性粒细胞”1 ，鼠肠源a 一防御素( 称为隐窝素) 是在p a n e t h 细胞粒合成与贮藏，有近2 0 种；这些前体被基质 金属蛋白酶v i i 裂解，成熟肽分泌进入腔内”1 。 2 1 3b 一防御素的特点和分类 同经典的d 一防御素相比，b 一防御素具有不同的初级结构基序及完全不同 的二硫键连接方式( 三对二硫键以1 5 ，2 - 4 ，3 - 6 方式配对) 。且一防御素主要在粘 膜上皮细胞中广泛表达。o 一防御素前体是一个多肽，含有一个一致的信号肽( 1 8 2 2 个氨基酸残基) ，一个短的0 5 个氨基酸的前原片断与3 8 4 2 个氨基酸残基的具 有活性的c 一端”1 。b 一防御素成熟肽富含精氨酸，具有抗菌谱广、抗病毒及细胞 毒性活性。 p 一防御素家族中的第一个成员是d i a m o n d 等( 1 9 9 1 ) 在从牛气管粘膜提取物 中寻找宿主防御肽类时，在牛的气管上皮柱状细胞发现的，这种肽称为气管抗菌 肽( t r a c h e a la n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，t a p ) 。在t a p 发现不久，1 3 种牛中性粒细 胞含有3 8 4 2 个氨基酸残基的b 防御素也从牛的中性粒细胞中分离出来了，经研 究发现它们对葡萄球菌和大肠杆菌具有抗菌活性。这些肽与a 一防御素的初级结 构和二硫键结构完全不同，是一种新的防御素多肽。直到另外一个b 一防御素由 ”1 s c h o nw e t t e r 等( 1 9 9 5 ) 在牛舌头鳞状上皮细胞中发现后，称为舌抗菌肽 ( 1 i n g u a l e sa n ti m i c r o b i a lp e p t i d e ，l a p ) 。 第一个人的d 一防御素( h b d i ) 是在分析从肾脏病人末期来的大量透析血中 发现。”，随后发现h b d 一1 在胰脏、肾脏、气管上皮、唾液腺、前列腺、胎盘和雌性 生殖道也大量分布”“。另外，h b d - 1 唯一的类似物在小鼠中发现，p q m b d 一1 ，在 鼠肺和生殖泌尿道上皮细胞表达。”。人第二个b 一防御素h b d - 2 在牛皮癣患者( 银 屑病) 皮肤中鉴定出来。由角质化细胞产生m 1 ，在气管表面上皮、粘膜腺血细胞也 发现。2 0 0 1 年，h a r d e r 等又从人体鳞癣皮肤中分离得蛩j h a d 一3 。研究还发现在正 常女性阴道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢等组织及妊娠相关组织绒毛膜、 绒毛、胎盘、脐带中均有h b d 一1m r n ! l 的表达；子宫颈、子宫内膜、输卵管、织绒 毛膜、绒毛、胎盘有h b d 一2m r n a 的表达，表明防御素在正常妇女生殖道及妊娠相 关组织中广泛表达，在维护正常妇女及孕妇生殖道内环境稳定、宿主天然抗感染 机制中起着重要的作用1 。n 一防御素在嗜中性粒细胞颗粒、巨噬细胞、p a n e t h 细胞中表达可能与宿主全身性防御有关，而在不同的上皮组织和广泛的皮肤表面 只有大量的b 一防御素表达，这些地方n 一防御素没有重叠分布，暗示人9 一防御 素在上皮和表皮中局部防御作用。利用计算机搜寻“7 3 又从人的基因组中寻找至1 | 2 8 个新的b 一防御素，初步分析表明其中1 2 个己被转录；从鼠的基因组中找到4 3 个 新的口一防御索，其中1 4 个已被转录，不过还没有见e d n a 克隆的报道。 第一个猪b 一防御素( p b d 一1 ) 基因由z h a n ggl ，w uh 等呻1 克隆出来，编码6 4 个氨基酸，成熟肽长3 8 个氨基酸。用r t p c r 方法检测发现猪b 一防御素p b d l m r n a 在呼吸道、消化道、胸腺、脾脏、淋巴结、肝脏、肾脏、膀胱、睾丸、皮肤、心 脏、肌肉、骨髓、外周血中性粒细胞、肺巨噬细胞、脐带都有表达。 绵羊b 一防御素s b d l ，s b d 一2 在整个胃肠道都有表达( h u t n e r ，1 9 9 8 ) ”1 。盛 金良( 2 0 0 3 ) 从成年绵羊的表皮组织中分离提取扩增出绵羊防御素s b d 一1 基因。 f i s h 与r b a n d i n g 定位表明其位于染色体2 4 q 1 3 位置。山羊也发现有两个前体形式 b 一防御素g b d i ，g b d 一2 ，核苷酸与氨基酸水平相似性分别为9 6 8 与8 8 2 ，但是 g b d l 主要在舌头与呼吸道表达；g b d 一2 在整个肠道表达。 在家禽上，四个火鸡的b 一防御素( t h p 一1 ，t h p 一2 ，t h p 一3 ，g p v 一1 ) ，这些肽 含有3 6 3 9 个氨基酸残基，同样也是由前体前原多肽经过降解而产生成熟肽。对 大肠杆菌与单核增生李斯特菌具有抗菌效果。现在对鸡防御素g a l - 3 研究的比较 多，g a l 一3 在舌头，法氏囊与气管中表达含量丰富，在皮肤、食管、呼吸道、大 肠、肾脏也有表达。当气管感染副嗜血流感杆菌时，g a l 一3 在气管的表达量显著 的增加1 表明其可以诱导表达。华南农业大学张辉华等首先对鸡b 一防御素内含 子长度进行了研究，发现鸡b 一防御素有2 个内含子，3 个外显子，基因结构组成 不同于其他动物b 一防御素。g a l 一1 基因两个内含子大小分别为4 8 6 b p 和4 9 0 b p ， g a l 一2 基因两个内含子大小分别为1 8 3 b p ，6 7 5 b p ，g a l 一3 基因两个内含子大小分别 为9 8 0 b p ，1 2 8 0 b p 。g a l 一3 可以被l p s 、灭活卡介苗诱导表达，分布也较广泛。 4 基于序列相似性、表达位点与基因调控元件的分子结构分析和表达表明b 一 防御素可以进一步分为3 亚群。第一群成员以t a p 作为典型，包括l a p ，e b d ( 牛肠 源b 一防御素) ，牛b 一防御素l 1 3 、人1 3 一防御素一2 和绵羊9 一防御素一1 ，2 。它们 在氨基酸序列上相似，肽长度约6 4 个氨基酸左右，在湿的粘膜上皮、嗜中性粒细 胞和皮肤上表达，炎症介质对其表达有作用。牛上皮b 一防御素( t a p ，l a p ，e b d ) 和h b d 一2 在体外可由感染和炎症因子诱导表达“，在体感染和炎症也能诱导其 表达。第二群包括h b d - i 、r h b d 一1 和m b d i ，肽长度稍长为6 8 6 9 个氨基酸；它们 含有一个约l o k b 的内含子，主要在泌尿生殖道和气管表达，在炎症介质下不诱导 表达。第三类为家禽b 一防御素，对这类b 一防御素研究还不多。 2 1 40 一防御素的研究概况 近年来，在恒河猴的白细胞中发现一种抗菌肽分子，为1 8 个氨基酸残基的大 环状含三对二硫键的肽，命名为恒河猴防御素( r h e s u st h e t ad e f e n s i n l ，r t d 一1 ) “”。用免疫组化法，在骨髓的粒状细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞中也发现r t d i 的存在。通过序列测定和酶解、化学消化及分子量分析获得了r t d i 的结构。r t d i 形成一个几乎对称性的圆环状结构，不象a 、b 一防御素的多条链状结构。r t d 一1 环状肽的骨架通过三对分子内二硫键固定，产生两个反向平行的b 链，r t d 一1 的生物合成涉及两个九肽头对尾的连接“。r t d i 的结构同某些短杆菌肽和来自 于无脊椎动物抗菌肽相似，如猪的嗜中性粒细胞肽p r o t e g r i n s ，牛的十二指肠 肽，螃蟹的p o l y p h e m u s i n s “7 1 ，蝎的a n d r o c t o n i n “”，这些肽的大小约为2 k d ，含 b 折叠结构，一个或两个二硫键。与r t d 一1 最相似的是1 7 1 8 个氨基酸残基的 p r o t e g r i n s ( 内源性抗微生物多肽) 和t a c h y p l e s i n s ( 速普肽，中国鲎肽) ；它 们的两个二硫键与0 防御素三个中的两个相同。低浓度( 毫摩尔浓度) 的r t d 一1 对 真菌和细菌都具有杀菌作用。环状肽的抗菌活性是开环肽的3 倍。在1 5 0 m m 浓度的 氯化钠中。只有环状构象的肽才有活性，因此环状结构是其抗菌活性所必需的。 2 2 防御素的生物活性 各种防御素对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、分枝杆菌、真菌、囊膜病毒有 不同程度的抑制作用，其有效作用剂量在卜1 0 0 崛l 之间。 2 2 1 抗细菌作用 与其他抗微生物肽相比，防御素具有独特的抗菌机理。首先，带正电荷的防 御素与带负电荷的靶细胞膜相接触；随后通过靶细胞膜所产生的电动势将形成疏 水面的防御素二聚体注入细胞膜；最后多个二聚体在一起形成跨膜的离子通道， 使膜通透化，从而扰乱细胞膜的通透性，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制 以及细胞a t p 含量严重下降，最终使靶细胞死亡。 与其他抗微生物肽相比，防御素具有更广的抗菌谱，尤其n p 一1 、n p - 2 ，不 5 但抗菌谱广，抑菌活性也较强。粒细胞中防御素的活性往往会受到血清或阳离子 如n a + 、c a 2 + 等不同程度的抑制；n a + 对其影响主要表现在抑制了带正电荷的防御 素和带负电荷的微生物表面的非特异性静电互作；毫摩尔级的c a ”就能影响防御 素与细菌竞争寄主的特异结合位点，尤其在抗革兰氏阴性菌时表现突出。此外， 溶液的p h 、温度以及防御素分子电荷性质等也会影响其对细菌的杀伤作用。研 究表明，1 3 一防御素在高盐和酸性条件下，会失去抗菌活性嘲。 2 2 2 抗真菌作用 a 一防御素和8 一防御素都有很强的抗真菌作用，如实验观察到n p l 和n p - 2 均可在几分钟之内以相当低的剂量杀灭真菌c a l b i c a n s 。这类防御素的抗真菌 活性也依赖于目标菌的种类、外界因素( 如离子强度、温度等) 。 2 2 3 抗病毒作用 防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活 性。许多a 一防御素，如兔n p 一2 、人h n p i - 3 、鼠r a t n p - i