（病原生物学专业论文）双齿围沙蚕消化道菌群的分析和生物活性物质的研究.pdf

双齿围沙蚕消化道菌群的分析和生物活性物质的研究摘要海洋微生物是以海洋生物、水体为正常栖居环境的一类微生物，由于所处的特殊生活环境，使其具有产生生物活性物质的巨大潜力，已成为生物活性物质开发的重要来源。双齿围沙蚕是一种主要生活在海边潮间带的海洋生物，近年来研究人员已从其体内分离出多种生物活性物质。鉴于其可以生活在污染严重的环境，并能帮助改善和治理环境污染，故推测其体内可能具有多种生物活性物质或特殊的微生态菌群，以帮助其拮抗外界污染环境的损害。本研究对双齿围沙蚕消化道菌群进行了分析，筛选出了部分生物活性菌株，并对获得的嗜麦芽寡养单胞菌蛋白酶的酶学特征和纤溶活性进行了研究。本课题从不同来源双齿围沙蚕的消化道中共分离出1 7 株细菌，其中有6 株至少对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌等指示菌中的1 种有抑制作用，3 株细菌至少对1 种肿瘤细胞( h e l a 细胞和h e p g 2 细胞) 有细胞毒活性。菌株y 1 、y 7 均同时具有不同程度程度的抑菌活性和细胞毒性，经形态生理、1 6 sr r n a 基因序列鉴定，分别为e a u r a n t i a c u m 和s m a r i s f l a v i 。奶粉平板法筛选发现5 株细菌能产生蛋白酶，其中d 2 菌株具有较强的产酶能力。纤维蛋白平板法检测显示，菌株y 5 、d 2 株均具有体外纤溶解活性。沙蚕的消化道活性菌株总分离率高于海水等。在对从双齿围沙蚕消化道内分离出的具有体外纤维蛋白溶解活性的菌株y 5 进行鉴定时发现，其形态为革兰阴性直杆状，无芽孢和鞭毛，大小为0 51 tm - - 0 81 tm1 5um - - 3 01 tm ；生长温度范围为4 c - 4 0 ；具有嗜盐性，n a c i 耐受范围为1 1 3 ；氧化酶、过氧化氢酶、精氨酸双水解试验阳性，不还原硝酸盐：可利用葡糖糖、麦芽糖为唯一碳源；精氨酸脱羧实验阳性；细胞主要脂肪酸成分为c 1 8 ：1 7 c ，c 1 6 ：1 ( i ) 7 c ，c 1 6 ：o ，c l o ：0 3 - o h 。d n a ( g + c ) t o o l 为4 7 5 。其1 6 sr r n a 基因序列与9 种已确定的海单胞菌同源性为9 3 - 9 7 ，且都位于系统发生树的同一类群中，并与m a q u i m a r i n a 和mv a g a 共同构成一个独立的进化枝。根据菌株y 5的生理学、遗传学和系统发生特征确定，菌株y 5 属于海单胞菌属，但与已报道的该属其他菌种的某些特征不完全一致，可能为该菌属的一个未定种新种，暂命名为沙蚕海单胞菌( 肛a i b u h i t e n s i ss p n o v ) ，这也是首次从我国海域分离出该属细菌菌株。此外，该菌株具有一定纤溶活性。菌株d 2 同时具有强产蛋白酶能力和体外纤溶活性，经鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌，并对其产蛋白酶条件和蛋白酶学特征进行了研究。l o w r y 法检测显示该菌株产酶能力为1 1 0 4 u m l ，最佳产酶条件为p h8 0 、2 5 c 培养4 8 h 。酪蛋白酶图谱法和凝胶成像分析证实其蛋白酶分子量约为4 2k d a ，在培养上清液中纯度大于9 2 。经过饱和硫酸铵沉淀、d e a e s e p h a r o s e 阴离子交换层析、s u p e r d e xg - 7 5 凝胶过滤层析等步骤纯化获得的d 2 蛋白酶( 嗜麦芽寡养单胞菌蛋白酶，s m p ) ，比活性达到1 4 7 8 o u m g 。该酶活性的最适p h 值为9 o ，是一种碱性蛋白酶；最适温度为6 0 ，在5 5 以下及p h 6 一- , 9 的环境中具有较好的稳定性。s m p 的等电点为9 1 7 。c u 2 + 、c a 2 + 、m 9 2 + 、k + 等金属离子对s m p 活性有明显促进作用，e d t a 和p m s f 能强烈抑制酶活力，但对尿素、s d s 、d t t 等变性剂有较好的耐受性，因此可能是一种金属离子依赖性的丝氨酸碱性蛋白酶。在氨基酸序列测定时发现其n 末端被修饰，故未能得到该酶的n 一末端序列。随后改用e s i m s m s 质谱分析，获得的其两个内部肽段序列经过检索未发现与其序列一致性高的蛋白，提示s m p 可能是一种新的蛋白酶。鉴于s m p 良好的稳定性和较宽的温度、p h 活性范围，以及菌株d 2 的高产酶特性，该株有望成为新的蛋白酶生产资源。本研究还对s m p 的纤溶活性及机制进行了研究和初步探讨。体外实验( 试管凝块法和纤维蛋白平板法) 和体内实验( 大鼠动静脉旁路血栓模型) 均证实s m p 同时具有溶解纤维蛋白原和纤维蛋白的活性，且活性呈一定的量效关系，因此，具有抗凝和溶栓双重作用。此外，s m p 可不依赖于纤溶酶原的激活直接溶解纤维蛋白，能在实验动物体内可迅速发挥溶栓活性，并直接溶解已经形成的血栓。s m p 对实验动物体内的t p a 和p a i l 活性无明显影响，其溶栓活性不通过依赖t p a ，或抑制p a i 一1来发挥。综上所述，本课题对双齿围沙蚕消化道菌群进行了研究，对生物活性菌株进行了筛选和鉴定，并对分离出的嗜麦芽寡养单胞菌蛋白酶进行了酶学特征和体内外纤溶活性进行了研究和探索，取得部分成果已经申请国家发明专利，以期将来能够转化成为新的蛋白酶或抗栓药物的生产资源。关键词：双齿围沙蚕；菌群；嗜麦芽寡养单胞菌；生物活性；蛋白酶；纤溶活性；博士研究生闫志勇( 病原生物学)指导教师王斌教授课题来源：国家“9 7 3 ”计划重大基础研究前期研究专项( 2 0 0 4 c c a 0 2 4 0 0 ) ；山东省“病原生物学”泰山学者工程资助项目s t u d yo ft h ef l o r ai nt h ea l i m e n t a r yt r a c to fp e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b ea n di t sb i o a c t i v i t ya b s t r a c tm a r i n em i c r o b e sa r ek i n d so fm i c r o o r g n i s mt h a ti n h a b i ti nm a r i n el i f eo rw a t e rb o d y n es p e c i a ll i v i n ge n v i r o n m e n t sp r o m o t et h e mp r o d u c i n gb i o a c t i v ec o m p o u n dw i t he n o r m o u sl a t e n tc a p a c i t ya n dt h u st h e ya r ei m p o r t a n ts o u r c ei nb i o a c t i v ec o m p o u n d 忍r 伽e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b ei so n ek i n do fm a r i n el i f et h a tm a i n l yl i v e si ni n t e r t i d a lz o n e t od a t e ，r e s e a r c h e r sh a v ei s o l a t e dv a r i o u sb i o a c t i v ec o m p o u n d si nv i v o r e s p e c t i n go ft h ea b i l i t yi nl i v i n ga ts e r i o u sp o l l u t i o ns u r r o u n d i n ga n da s s i s t i n gt oi m p r o v ea n dm a n a g ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n ，w ep r e s u m et h a tp o s s i b l yv a r i o u sb i o a c t i v ec o m p o u n d so rs p e c i a lm i c r o b i a lf l o r am a ye x i s ta n dh e l pt oo p p o s et h ed a m a g eo fp o l l u t i o n t h i ss t u d y , w ea n a l y z e dt h em i c r o b i a li n t e s t i n a lf l o r ao ft h eg r u b e 。s c r e e n e dp a r to ft h es t r a i nw i t hb i o a c t i v i t y , a n di n v e s t i g a t e dt h ee n z y m o l o g yc h a r a c t e r i s t i ca n df i b r o l y s i sa c t i v i t y p e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b ew e r ec o l l e c t e df r o md i f f e r e n tr e s o u r c e s 1 7b a c t e r i a ls t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h e i ra l i m e n t a r yt r a c t ，i nw h i c h5s t r a i n sh a v ei n h i b i t o r ya c t i o n st 0a tl e a s to n em i c r o b i a li n d i c a t o r ；3s t r a i n sw e r et o x i ct oo n es o r to ft u m o re e l l l i n e s t a i ny 1a n dy 7w e r ei d e n t i f i e da se a u r a n t i a c u ma n dsm a r i s f l a v ir e s p e c t i v e l y ，b o t hw i t hd e g r e e so fb a c t e r i o s a t s i s e sa n dc y t o t o x i c i t i e s 5s t r a i n sc a np r o d u c ep r o t e a s eo nm i l kp l a t e ，a m o n gw h i c hd 2s t r a i nw a si d e n t i f i e da s m a l t o p h i l i aw i t hs t r o n g e ra b i l i t yi ns e c r e t i n gp r o t e a s e b o t hs t r a i n sy 5a n dd 2s h o w e df i b r i n o l y t i ca c t i v i t i e so nf i b r i np l a t e s a tl a s t ，w ef o u n dt h ea c t i v es t r a i n sh a v eah i g h e ri s o l a t i n gr a t et h a nt h a to fi na q u am a r i n a n ec h a r a c t e r i z a t i o no fb a c t e r i a ls t r a i ny 5h a sb e e np e r f o r m e d b a c t e r i a lc e l l sa r eg r a m - n e g a t i v e ，r o d s h a p e d ，n o n - s p o r e - f o r m i n g , w h i c ha r e0 和m - 0 即mw i d ea n d1 0 缸m 4 a 缸ml o n g n of l a g e l l u mw a sf o u n d i t sg r o w t ht e m p e r a t u r er a n g ei sb e t w e e n4 a n d4 0 0 c n eo r g a n i s mr e q u i r e sn a + i o n s ，a n dg r o w si nt h ep r e s e n c eo f1 t 0 1 3 ( w v )n a c l i ti sp o s i t i v ef o ro x i d a s e ，c a t a l a s e ，a n da r g i n i n ed i h y d r o l a s e ，b u tn e g a t i v ef o rn i t r a t er e d u c t i o n ，i n d o l ea n dh 2 sp r o d u c t i o n ，a n dn e g a t i v ef o rg e l a t i n , t w e e n8 0 ，s t a r c h ，a n di f f e a h y d r o l y s i s d g l u c o s ea n dm a l t o s ea r eu t i h z e da ss o l ec a r b o ns o u r c e s t h em a j o rf a t t ya c i d sa r ec i s ：1 7 c ，c 1 6 ：1 日0 7 c , c 1 6 ：0 ，a n dc 1 0 ：o3 - o h t h ed n ag + cc o n t e n ti s4 7 5m o l o nt h eb a s i so ft h ea l m o s t - c o m p l e t e1 6 sr r n ag e n es e q u e n c e ( d q 2 7 9 8 5 2 ) ，s t r a i ny 5e x h i b i t e s9 3 9 7 s i m i l a r i t yw i t ht h en i n er e c o g n i z e ds p e c i e so fm a r i n o m o n a s a n dt h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s e su s i n gn - ja l g o t i t h ms h o wt h a ts t r a i ny 5i sw i t h i nt h es p e c i e sc l u s t e rc o m p r i s i n gt h eg e n u sm a r i n o m o n a s ，a n df o r m sac l a d ew i t hm a q u i m a r i n a( a j 8 4 3 0 7 8 ) a n d 肛v a g a ( x 6 7 0 2 5 ) t h e r e f o r e ，p h y l o g e n e t i c , g e n e t i ca n dp h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e so ft h eo r g a n i s mc o n f i r m st h a ts t r a i ny 5m a yb ean o v e ls p e c i e so ft h eg e n u sm a r i n o m o n a s ，f o rw h i c ht h en a m em a r i n o m o n a sa i b u h i t e n s i ss p n o v i sp r o p o s e d a n di t sf i b r i n o l y t i ca c t i v i t ym a yp r i v i d ean e wr e s o u r c eo ft h r o m b o l v t i cd r u g t h eh i g h p r o t e i n a s e - p r o d u c i n gb a c t e r i a , s t r a i nd 2 ( d e p o s i t e di nc g m c c , s t o r en u m b e r ：1 8 6 8 # ) ，w a si d e n t i f i e da s & m a l t o p h i l i a l o w r ym e t h o ds h o w e di t se n z y m ec a p a b i l i t yw a s1 1 0 4 u m lw i t ho p t i m i z a t i o nc o n d i t i o no fp h8 0i nc u l t i v a t i o nf o r4 8hi n2 5 c a s e a s em a p p i n ga n dg e li m a g i n ga n a l y s i sc o n f u m e di t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s4 2k d aw i t hm o r et h a n9 2 p u r i t yi ns u p e m a t ef l u i di nc u l t u r e n esm a l t o p h i l i ap r o t e a s e( s m p ) w e r ep u r i f i e db yas t e p w i s ep r o c e d u r ei n c l u d i n gc e n t r i f u g a t i o n ，a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，g e lf i l t r a t i o na n du l t r a f i l t r a t i o n e n z y m ea c t i v i t yi s9w i t ho p t i m i z a t i o np h ，s h o w i n gi ti sk i n do fa l k a l i n ep r o t e a s e ，a n do p t i m a lt e m p e r a t u r ei s6 0 w i t hb e t t e rs t a b i l i t yu n d e r5 5 1 2a n dp h6 9 n ep ii s9 1 7 c u “，c a 2 + ，m 9 2 + a n dk + h 嬲p r o m o t i o ni ne n z y m ea c t i v i t yw h i l ee d t aa n dp m s fs t r o n g l yi n h i b i ti t sa c t i v i t y t h ee n z y m eo w n sb e t t e rt o l e r a t i o nw i t hc a r b a m i d e s d sa n dd t t a m i n oa c i d sn t e r m i n u ss e q u e n c i n gs u g g e s t st h a ti t st e r m i n a t i o ni sp o s s i b l ym o d i f i e d e s i - m s m sm a s ss p e c t r o s c o p ya c q u i r e dt w oi n t e r n a lp e p t i d es e q u e n c e sa n dn oh i g hh o m o l o g yp r o t e i nw a sf o u n dw h i c hs u g g e s t e dt h a ts m pi sp o s s i b l yan o v e lp r o t e a s e s t r a i nd 2m a y b ean e wr e s o u r c eo fp r o t e a sp r o d u c t i o n m o r e o v e r , w es t u d i e da n di n i t i a l l ye x p l o r e dt h ef i b r o l y s i sa c t i v i t ya n di t sm e c h a n i s mo fs m pi nt h i sr e s e a r c h t e s t si nv i t r o ( t e s tt u b ec l u m pm e t h o da n df i b r i np l a t ep r o c e s s )a n di nv i v o ( t h r o m b u sm o d e lo fr a ta r t e r i o v e n o u ss h u t ) a l lp r o v e dt h a ts m ph a st h ea c t i v i t yo fd i s s o l v eb o t hf i b r i na n df i b r i o u sw i t hc e r t a i nd o s e - e f f e c tr e l a t i o n s h i p t h e r e f o r e ，s m ph a v ed u a le f f e c t si na n t i e o a g u l a t i o na n dt h r o m b o l y s i s i na d d i t i o n ，s m pc o u l dd i s s o l v ef i b r i nw i t h o u ta c t i v a t i o no fp l a s m i n o g e n , a n ds h o wi t st h r o m b o l y s i sa c t i v i t yq u i c k l yi ne x p e r i m e n t a la n i m a lt od i s s o l v et h r o m b u si nf o r md i r e c t l y s m ph a sn oc l e a re f f e c to nt - p aa n dp a l - 1i ne x p e r i m e n t a la n i m a l s 皿ea c t i v i t yo ft h r o m b o l y s i st h u sd o e sn o tp l a yr o l ed e p e n d i n go nt - p ao rp a l 1 t os u mu p ，t h i st o p i cs t u d i e st h em i c r o b i a lp o p u l a t i o ni nt h ea l i m e n t a r yt r a c to fp e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b e ，s c r e e n sa n di d e n t i f i e ss t r a i nw i t hb i o a c t i v i t y a l s o ，w es t u d i e da n de x p l o r e dt h ei s o l a t e ds m a l t o p h i l i ap r o t e a s ei ne n z y m o l o g yc h a r a c t e r i s t i ca n df i b r o l y s i sa c t i v i t y w eh a v ea p p l i e df o rn a t i o n a li n v e n tp a t e n tb yp a r to fo u rr e s u l t st ot r a n s f o r mt h e s ei n t op r o d u c t i o nr e s o u r c ei nn o v e lp r o t e a s eo rt h r o m b o l y t i cd r u g s k e yw o r d s ：p e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b e ：b a c t e r i a lf l o r a ：s m a l t o p h i l i a ；p r o t e a s e ：b i o a c t i v i t y ；f i b r i n o l y t i ca c t i v i t y d o c t o r a lp o s t g r a d u a t e t ：y a nz h i y o n g ( p a t h o g e n i cb i o l o g y )d i r e c t e db yp r o f w a n gb i nf o u d a t i o ni t e m ：n a t i o n a l9 7 3p r o g r a mo nk e yb a s i cr e s e a r c hp r o j e c t s ( 2 0 0 4 c c a 0 2 4 0 0 ) ,t a i s h a ns c h o l a r s h i pp r o j e c t学位论文独创性声明本人声明，所星交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中依法引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上融属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已翔予其缝学位申请的论文或成果。本人翔违反主述声舞，愿意承担由此弓| 发的一切责任和后果。论文作者签名：e0 乏管日期：年，月夕爵学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的学饿论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校艨发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛大学。本学位论文属于：保密口，在年解密后适用于本声明。|不保密刚( 请在以上方框内打“ )论文作者签名：导师签名：日期：j 舞l 谓影日日期：2 年 p 月p 日( 本声明麴版权归青岛大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不髻导援鲁使焉)双齿围沙蚕消化道菌群的分析和生物活性物质的研究己i吉j -口所谓生物活性物质，是指来自生物体内的对生命现象具有不同程度影响的微量或少量物质。“海洋生物活性物质 则是指海洋生物体内所含有的对生命现象具有一定程度影响的物质，主要包括海洋药用物质、生物信息物质、生物毒素和酶类等海洋生物体内的天然产物。在我国辽阔海域中生活着丰富海洋生物物种，其中也蕴藏着十分丰富的微生物资源。海洋微生物是栖居在海洋水体或海洋生物体中的一大群微生物。由于所处的高盐、高压、低温、低照、寡养等特殊的生活环境，使海洋微生物也相应具有嗜盐，耐高渗、高压和低温等生理特点，这些特点使其往往能产生种类繁多、结构特异、活性强的新型生物活性物质，其中相当部分生物活性物质是陆地生物所没有的。与海洋动植物相比，海洋微生物具有生长周期短、代谢易于调控、菌种相对容易选育、可通过大规模发酵实现工业化生产等特点，故海洋微生物相关的天然产物开发具有潜在产业化优势。从生态和环境保护角度来看，海洋微生物的开发不会导致海洋物种与海洋生态环境失衡，更具有自然资源的可持续利用性。此外，以海洋微生物作为生产资源，将无原材料短缺的后顾之忧，可以利用现代微生物发酵技术进行生产，并实现大规模的产业化，而无需占用土地和空间，这在国土资源日益紧张、人类更加重视生存环境条件的今天具有特别重要的现实意义和社会效益。因此，海洋微生物及其产生的生物活性物质目前正成为国内外研究的热点领域。目前，研究较多的能够产生活性物质的海洋微生物主要包括海洋真菌、海洋放线菌和海洋细菌三大类群。所产生的生物活性物质也种类多样，主要包括新型抗肿瘤、抗病毒、抗菌、降压、抗凝血或纤溶等具有广阔前景的药物，酶和酶的抑制剂，以及生物毒素等。此外还有不少海洋微生物代谢物结构新颖，但其功能还有待开发。除了自由生活于水体和海底沉积层外，相当多的海洋微生物与其它的海洋生物处于共生、附生、寄生或共栖关系。随着研究的深入，不少学者发现海洋动植物中的活性物质相当一部分来源于共栖微生物，这些微生物与宿主之间存在着紧密的联系：一方面它们可以从其动植物宿主中获得必需的各种营养；另一方面，它们也可以产生多种生物活性物质( 如抗生素、毒素、酶等) ，释放于水体中或宿主体内，以利于宿主生长代谢或增强宿主的抵抗能力。另外，某些宿主可以通过生产某种化学物质来调节其体内的附生微生物的组成、生理活性和功能，以帮助宿主自身适应周围环境的改变。引言沙蚕是海洋环节动物门多毛纲动物的总称，也是环节动物门典型的代表，其幼虫为鱼、虾等喜食的饵料。双齿围沙蚕是属于环节动物门多毛纲游走目沙蚕科的一种海洋生物，在我国沿海滩涂地带分布广，资源丰富。我国的沙蚕种类约有8 0 多种，研究表明，沙蚕组织中含有丰富的不饱和脂肪酸，大量的谷氨酸、精氨酸等人体必须的氨基酸，以及碘、锌等微量元素，是一种非常理想的健康食品和滋补品。此外，沙蚕体内还含有r 胍基异丁酸、羟高铁血红素、磷酸脒基牛磺酸、海蚯蚓素等多种活性和药用成分，其应用开发前景十分广泛。近年来研究人员已从其体内分离出多种生物活性物质，在本课题组的前期研究过程中，也曾经先后成功地从沙蚕的组织匀浆或消化道上皮细胞内克隆、表达出沙蚕激酶和蛋白酶。目前我国的沙蚕利用率还很低，除少数出口作为鱼饵以外，绝大多数未得到充分利用，造成了资源的严重浪费。双齿围沙蚕主要生活在海岸边石下或海藻间，甚至在城市的排污口附近，主要以废水里的有机物为食。人们早已发现在池塘内养殖沙蚕有助于改善水体底质，减轻环境污染，促进海水养殖环境的良性循环，因此，沙蚕又被称为“泥滩的清洁工，环保部门已经把它作为监测水域污染的指示物种之一。鉴于可以生活在污染严重的环境，并能帮助改善和治理环境污染等特点，我们推测，其体内可能具有多种生物活性物质或特殊的微生态菌群，以帮助其抵抗外界污染环境的损害。尽管沙蚕的营养成分丰富、应用价值广泛、开发潜力大，但目前国内外对沙蚕深度开发的研究并不多，尤其是对于其体内微生态菌群的研究还未见报道。本研究对双齿围沙蚕消化道菌群进行了分离和鉴定，对具有各种生物活性菌株进行了筛选，并对获得的嗜麦芽寡养单胞菌蛋白酶的酶学特征和纤溶活性进行了研究。通过这些研究以期能帮助我们更加了解海洋生物沙蚕，了解沙蚕体内的微生态环境，并希望能获得更多的具有应用、经济价值和开发前景的海洋微生物或海洋生物活性物质。2第一章双齿围沙蚕消化道菌群的分离鉴定及生物活性菌株的筛选摘要目的研究和分析双齿围沙蚕消化道菌群结构组成，并对分离获得的菌株其进行生物活性的筛选和检测。方法取不同来源的双齿围沙蚕，分离其消化道菌群。分别检测菌群中各菌株对指示菌( 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、白色念珠菌) 等的抑菌作用，对肿瘤细胞( h e l a 和h e p g 2 ) 的细胞毒作用；奶粉平板法和l o w r y 法检测其产蛋白酶活性；纤维蛋白平板法检测菌株纤维蛋白溶解活性。对获得的生物活性菌株从形态、生理、1 6 sr r n a 基因序列等方面进行分类鉴定。结果从沙蚕消化道中共分离出1 7 株细菌，其中有6 株细菌( 3 5 3 ) 至少对1种指示菌有抑制作用；3 株细菌( 1 7 6 ) 至少对1 种肿瘤细胞有细胞毒活性；5 株细菌( 2 9 4 ) 能产生蛋白酶；2 株细菌具有纤维蛋白溶解活性，活性菌株分离率高于海水等。d 2 菌株为嗜麦芽寡养单胞菌，具有较强的产胞外蛋白酶能力。菌株y 1 、y 7 分别为ea u r a n t i a c u m 和s m a r i s f l a v i ，二者均同时具有不同程度程度的抑菌活性和细胞毒性。菌株y 5 、d 2 分别为m a r i n o m o n a s s p 和s m a l t o p h i l i a ，均具有一定程度程度的纤维蛋白溶解活性。结论双齿围沙蚕消化道内存在有抑菌、抗肿瘤、产蛋白酶和纤维蛋白溶解等多种活性菌株，这些菌株一方面可以帮助沙蚕抵抗或分解生活环境中有害物质，另外也有可能成为生物活性物质生产的新资源。关键词：双齿围沙蚕；消化道；菌群；分离鉴定；生物活性3i s o l a t i o na n dc l a s s i f i c a t i o no fm a r i n o m o n a ss p p o s s e s s i n gf i b r i n o l y t i ca c t i v i t ya b s t r a c to b j e c t i v et oa n a l y z et h ec o m p o s i t i o no fm i c r o b i a lp o p u l a t i o ni nt h ea l i m e n t a r yt r a c to fp e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b ea n dt od e t e c ti t sb i o a c t i v i t i e s m e t h o d sp e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sf r o md i f f e r e n tr e s o u r c e sw e r ec o l l e c t e da n dt h ea l i m e n t a r yt r a c t sm i c r o b i a lp o p u l a t i o n sw e r ei s o l a t e d b a c t e r i o s t a t i ca c t i o n st oi n d i c a t o r ，c e l l u l a rt o x i ca c t i o n st ot u m o rc e l l s ，p r o t e a s ea c t i v i t i e sp r o d u c t i o n sw e r ea n a l y z e dr e s p e c t i v e l y f i b r i np l a t ep r o c e s sw a sp e r f o r m e dt od e t e c tt h ef i b f i n o l y t i ca c t i v i t yo ft h es t r a i n t h ea c q u i r e db i o l o g i c a la c t i v i t i e sw e r ec l a s s i f i e da n di d e n t i f i e db yf o r m s ，p h y s i o l o g ya n d1 6 sr r n ag e n eo r d e r r e s u l t s ( 1 ) 1 7s t r a i nb a c t e r i u mw e r ei s o l a t e df r o mt h ea l i m e n t a r yt r a c to fp e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b e ，i nw h i c h6s t r a i n ( 3 5 3 ) h a v ei n h i b i t o r ya c t i o n st oa tl e a s to n ei n d i c a t o r ；t h r e es t r a i n s ( 1 7 6 ) h a v ec e l l u l a rt o x i ca c t i o n st oo n es o r to ft u m o rc e l ll i n e ：5s t r a i n s ( 2 9 4 ) h a v ea b i l i t i e si np r o d u c i n gp r o t e a s e ：2s t r a i n sh a v ef i b r i n o l y t i ca c t i v i t i e s ；a n da c t i v es t r a i n sh a v eah i g h e ri s o l a t i n gr a t et h a nt h a to fi na q u am a r i n a ( 2 ) 1 n h ed 2s t r a i nw a si d e n t i f i e da ss t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i aw i t hs t r o n g e ra b i l i t yi ns e c r e t i n gp r o t e a s e ；( 3 ) t h ey 1a n dy 7w e r ei d e n t i f i e da se a u r a n t i a c u ma n dsm a r i s f l a v i ，r e s p e c t i v e l y ，b o t hw i t hd e g r e e so fb a c t e r i o s a t s i s e sa n dc y t o t o x i c i t i e s ( 4 ) t h ey 5a n dd 2w e r ei d e n t i f i e da sm a r i n o m o n a s s pa n d & m a l t o p h i l i a ，r e s p e c t i v e l y ，b o t hw i t hd e g r e e so ff i b r i n o l y t i ca c t i v i t i e s c o n c l u s i o nv a r i o u so fa c t i v es t r a i n si na l i m e n t a r yt r a c to fp e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b ea x ep r e s e n t t h o s es t r a i nc o u l da s s i s th o s tr e s i s to rd e c o m p o s et h en o x i o u ss u b s t a n c e sa r o u n dl i v i n ge n v i r o n m e n t m o r e o v e r , t h e yc o u l db eu t i l i z e da st h en o v e ln a t u r a lr e s o u r c e si nb i o t i ca c t i v a t o r k e yw o r d s ：p e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b e ；a l i m e n t a r yt r a c t ；b a c t e r i a lf l o r a ：b i o a c t i v i t y4双齿围沙蚕消化道菌群的分离鉴定及生物活性菌株的筛选_ 上_ - j 一刖吾海洋微生物( m a r i n em i c r o b e ) 是以海洋水体为正常栖居环境的一群微生物。一般认为，分离自海洋环境的微生物均可视为严格的海洋微生物。海洋微生物资源丰富，种类众多，主要种类包括细菌、真菌、放线菌及噬菌体等。由于其所处的特殊生活环境，使海洋微生物有产生生物活性物质的巨大潜力，已成为海洋药物开发的重要来源。目前，已从海洋微生物( 包括海洋细菌、海洋真菌和海洋放线菌等) 中分离到许多海洋生物活性物质，这些物质化学结构丰富多样，许多分子结构新颖独特，是陆地生物所不具有的1 1 1 。此外，与陆源微生物的代谢产物相比，由于海洋微生物生活环境更加复杂，种类更加多样化，使得其天然产物具有很多新型的结构骨架和独特的化学结构，同时，在生物活性方面也具有更强烈的作用【2 1 。随着研究的深入，不少学者发现海洋动植物中的活性物质相当一部分是来源于体内或体表与其共栖的微生物。由于海洋动植物中的活性物质含量低，生物量有限，所以海洋微生物作为活性物质的资源正日益受到国内外研究工作者的重视【”l 。双齿围沙蚕( p e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b e ) 是一种与蚯蚓具有很近亲缘关系的海洋生物，属环节动物门、多毛纲、游走目、沙蚕科，俗称海蚯蚓、海蜈蚣、水百脚等，其体内富含蛋白，营养丰富，是鱼、虾、蟹类等的主要摄食对象，被称为“万能钓饵 ，而且由于其营养丰富，氨基酸、微量元素等含量丰富，故也可以作为人类的健康食物。近年来，研究人员开始把目光转向开发沙蚕体内的生物活性物质。例如，日本学者从几种沙蚕中分离出对环节动物食管具有强收缩作用的多肽，有望开发为一种新型胃动力药网：张伟云等1 6 从沙蚕体内纯化得到一种分子量为3 30 0 0d a具有溶栓活性的丝氨酸蛋白酶；而p a n 等1 7 l 从其组织匀浆里纯化出一种抗细菌、真菌的活性多肽。沙蚕主要生活在海边潮间带的石下或海藻间，甚至在海边排污口，并且主要以废水里的有机物为食，被称