（营养与食品卫生学专业论文）双蛋白乳和大豆多肽的研制及营养功能评价.pdf

摘要 本文通过双蛋白乳配合试验、大豆分离蛋白酶解、大豆多肽降胆固醇体外试验、 高脂模型鼠建立及动物试验，主要研究了双蛋白乳对正常小鼠生长发育的影响，降胆 固醇大豆多肽的制备及其对高脂症小鼠的血脂指标及体脂指标的影响。 1 、双蛋白乳的工艺技术研究 以大豆分离蛋白粉、新鲜牛奶、乳化剂、增稠剂为原料，研究大豆蛋白和牛奶 蛋白复配型双蛋白饮料的配方及工艺技术。试验对大豆蛋白溶液和鲜奶的配合比、 乳化剂的种类和复合乳化剂的添加比、增稠剂的种类和添加量比、均质压力等工艺 参数进行研究筛选。通过对成品黏度、沉淀率、p h 值、感官评价等指标测定确定 最佳配方及加工工艺为：大豆蛋白溶液和鲜奶的配合比为2 ：3 、单甘酯0 2 、蔗 糖酯o 。1 6 、卡拉胶0 0 0 5 、黄原胶o 0 9 、c m c0 0 4 ，2 5 m p a 均质处理、1 1 9 灭菌l o m i n 。获得的双蛋白奶奶味纯正，色泽乳白，质构均匀，口感细腻，而且氨 基酸评分显著优于普通牛奶和豆奶。 2 、双蛋白乳营养评价的动物试验 选取雄性健康昆明小鼠3 0 只，编号为1 3 0 号，随机分成三组。a 组饲喂1 2 大豆分离蛋白水解液，b 组饲喂灭菌鲜奶，c 组饲喂双蛋白配制乳，每日各1 0 0 m l 。 7 周饲喂试验结果表明：双蛋白乳显著提高了试验鼠的股骨重量( p o 0 5 ) ，同时 具有提高试验鼠体重、提高血液血红蛋白含量的变化趋势，但对小鼠肝重及肝系数、 心脏及心脏系数、肾脏及肾脏系数、脾脏及脾脏系数、骨长度等指标均无显著影响。 3 、大豆分离蛋白双酶解方案的确定 试验比较中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和植物蛋白酶4 种酶水解大豆 分离蛋白的效果，筛选出木瓜蛋白酶和植物蛋白酶联合应用为大豆分离蛋白水解工 具酶。通过单因素及l 9 ( 3 4 ) 正交试验优化水解工艺条件为：酶解温度5 5 、初始 p h 7 0 、底物浓度1 2 、酶添加量8 、植物蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量之比为1 - 2 ，水解度可达1 4 2 0 。 4 、大豆多肽降胆固醇活性的体外测定 研究了水解度为8 2 7 - 1 6 5 7 的大豆分离蛋白双蛋白酶解产物的降胆固醇活 性。结果表明：用木瓜蛋白酶和植物蛋白酶双蛋白酶水解大豆分离蛋白，水解度为 1 4 7 1 的产物降胆固醇活性最高，对胆固醇胶束溶解度的抑制率为6 1 6 7 。 5 、大豆多肽降胆固醇活性的动物试验 选取雄性健康昆明小鼠3 3 只，随机分成三组。a 组1 3 只，为基础日粮对照组； b 组7 只，前期饲喂高脂饲料，成功建立高脂模型后，进行大豆多肽溶液对高脂模 型鼠降脂功能实验；c 组1 3 只，为高脂饲料对照组。a 、c 组自由饮水，b 组饲喂 大豆多肽溶液。饲喂高脂饲料至第6 周，高脂饲料组总胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t g ) 水平和高密度脂蛋白( h d l - c ) 与对照组均达到显著差异，小鼠高脂模型建立成功。 高脂模型鼠降脂功能实验4 周饲喂试验结果表明：大豆分离蛋白源降胆固醇肽可以 显著降低试验鼠甘油三酯含量，提高小鼠的肝脏系数( p o 0 5 ) 。同时，具有一定 降低小鼠体重、体重增长率和血液中总胆固醇水平、高密度脂蛋白胆固醇水平及低 密度脂蛋白胆固醇水平的生物活性。 关键词：大豆分离蛋白，双蛋白乳，多肽，高脂模型鼠，降胆固醇 u a b s t r a c t t h ep r e s e n te x p e r i m e n tw a sd e s i g n e dt os t u d yt h ee f f e c to fd o u b l ep r o t e i nm i l kf o r t h en o m a lm i c e sg r o w t h 、t h ep r e p a r a t i o no fs o y b e a np e p t i d ea n dt h ee f f e c tf o rt h e h i 曲f a t m i c e sb l o o df a ta n db o d yf a t b yt h e d o u b l e p r o t e i n m i l kc o o r d i n a t i o n e x p e r i m e n t 、t h ee n z y m o l y s i so fs o y b e a np r o t e i n i s o l a t e 、t h eh y p o c h o l e s t e r o l e m i ca c t i v i t y o fs o y b e a np e p t i d e si nv i r t r oe x p e r i m e n t 、t h ef o u n d a t i o no fm i c e sh i g h - f a ta n dt h e a n i m a le x p e r i m e n t 一 1 、s t u d yo nt e c h n o l o g yo ft h ed o u b l ep r o t e i nm i l k t h ef o r m u l aa n dp r o c e s st e c h n o l o g yo fd o u b l ep r o t e i nw i t hs o y b e a np r o t e i n 。a n d m i l kp r o t e i nh a v eb e e ns t u d i e d ，w h i c hw a sm a d eo fs o yp r o t e i ni s o l a t e ，f r e s hm i l k ， e m u l s i f i e r , t h i c k e n e r t h ee x p e r i m e n th a v es t u d i e dp r o c e s sp a r a m e t e r sa st h ec o n t e n tr a t i o s o fs o yp r o t e i ns o l u t i o na n df r e s hm i l k ，t h et y p e so fe m u l s i f i e ra n da d d i t i o nr a t i oo f c o m p o u n de m u l s i f i e r , t h et y p e sa n da d d i t i o nr a t i oo ft h i c k e n e r , h o m o g e n i z a t i o na n ds o o n t h eb e s tf o r m u l a sa n dt h ep r o c e s s i n gc r a f tw e r ed e t e r m i n e db ym e a n so ft h ef i n i s h e d p r o d u c tv i s c o s i t y , s e d i m e n t a t i o nr a t e ，p hv a l u e ，s e n s o r ye v a l u a t i o na n do t h e r i n d i c a t o r s i t w a st h a tt h em i x t u r er a t i oo fs o yp r o t e i ns o l u t i o na n dm i l kw a s2 ：3 ，t h em o n o g l y c e r i d e w a s0 2 ，t h es u c r o s ee s t e rw a so 1 6 ，t h ec a r r a g e e n a nw a s0 0 0 5 ，t h ex a n t h a ng u m w a s0 0 9 ，t h ec m cw a s0 0 4 ，t h eh o m o g e n i z a t i o nw a s2 5 m p a ，t h es t e r i l i z a t i o nw a s 1 1 9 ，1 0 m i n t h ed o u b l ep r o t e i nm i l kw a sp u r ef l a v o r , c o l o rw h i t e ，u n i f o r mt e x t u r ea n d s m o o t ht a s t e ，a n da m i n oa c i ds c o r ew a ss i g n i f i c a n t l yb e t t e rt h a nr e g u l a rm i l ka n ds o y m i l k 2 、t h ea n i m a le x p e r i m e n t so fd o u b l ep r o t e i nm i l kn u t r i t i o ne v a l u a t i o n 3 0m a l eh e a l t h yk u n m i n gm i c ew e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e eg r o u p sn u m b e r e d 1 3 0 ag r o u pw a sf e d1 2 s o yp r o t e i nh y d r o l y z a t e ，bg r o u pw a sf e ds t e r i l i z e dm i l k ，c g r o u pw a sf e dd o u b l ep r o t e i nm i l ko f1 0 0 m le a c hd a y t h er e s u l to f7 - w e e kf e e d i n g e x p e r i m e n tp r o v e dt h a t ，t h ed o u b l ep r o t e i nm i l kc o u l dp o w e r f u l l yi n c r e a s e dt h ew e i g h to f e x p e r i m e n t a lr a tf e m u r ( p 0 0 5 ) ，w h i l ee x p e r i m e n t a l r a t sw i t hi n c r e a s eb o d yw e i g h t ， i i i ，一， b l o o dh e m o g l o b i nl e v e l st o i m p r o v et h et r e n d ，b u tt h e 1 i v e r w e i g h ta n dl i v e rf a c t o r c o e f f i c i e n t ，h e a r ta n dh e a r tc o e f f i c i e n t ，k i d n e ya n dr e n a lc o e f f i c i e n t ，s p l e e na n dt h e s p l e e nc o e f f i c i e n t ，b o n el e n g t hh a dn os i g n i f i c a n te f f e c t 3 、t h ed e t e r m i n a t i o no f d o u b l e p r o t e a s eo fs o yp r o t e i ni s o l a t e p l a n tp r o t e a s ea n dp a p a i nw e r er e g a r d e da st h ec o m p o u n de n z y m eo fs o yp r o t e i n i s o l a t e ( s p i ) i nc o m p a r i s o nw i t hh y d r o l y s i se f f e c t so fn e u t r a lp r o t e i n a s ee n z y m i a t i c ， a l k a l i n e p r o t e a s e ，p a p a i n ，p l a n tp r o t e a s e t h ep r e m i u mw o r k i n gc o n d i t i o n sf o r e n z y m o l y s i sw e r ed e t e r m i n e db ym e a n so fs i n g l ef a c t o ra n dl 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s t h eo p t i m a le n z y m i ch y d r o l y s i sp a r a m e t e r sw a st h a tt h ee n z y m i ch y d r o l y s i s t e m p e r a t u r ea n di n i t i a lp hv a l u ew a s5 5 * ca n d7 0 ，t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a s12 ， t h eq u a n t i t yo fp r o t e i n a s ew a s8 ，t h em a s sr a t i oo fp l a n tp r o t e a s et op a p a i nw a s1 ：2 ， h y d r o l y s i sr a t eg a l lr e a c h1 4 2 4 、t h eh y p o c h o l e s t e r o l e m i ca c t i v i t yo fs o y b e a np e p t i d e si nv i r t r oe x p e r i m e n t t h eh y p o c h o l e s t e r o l e m i ca c t i v i t yo ft h eh y d r o l y s a t eo fs p lw i t h8 2 7 - 16 5 7 d h w h i c hw a sp r e p a r e db yt w op r o t e a s ew a ss t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es a m p l e p r e p a r e db yh y d r o l y z i n gs p lw i t hl a n tp r o t e a s ea n dp a p a i na td h = 1 4 7 1 s h o w nh i g h e s t h y p o c h o l e s t e r o l e m i ca c t i v i t ya m o n ga l lt h es a m p l e s ，t h ei n h i b i t o r yr a t i oo fm i c e l l a r s o l u b i l i t yo fc h o l e s t e r o li s6 1 6 7 5 、t h ea n i m a le x p e r i m e n t so fh y p o c h o l e s t e r o l e m i c a c t i v i t yo fs o y b e a np e p t i d e s 3 3 m a l eh e a l t h yk u n m i n gm i c ew e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s t h e r ea r e 1 3m i c ei ng r o u paa n df e db a s i cf e e d i n g ，7m i c ei ng r o u pba n df e dh i g h f a tf e e d i n gu n t i l t h eh i g h f a tm i c em o d e lw a s f o u n d e d ，t h es t u d yf o rs o y b e a np e p t i d es o l u t i o n sl o w i n gf a t f o rh i g h f a tm i c ew a ss t a r t e d ：t h e r ea r e1 3m i c ei ng r o u pca n df e dh i g h f a tf e e d i n g a 、 c g r o u pd r i n kw a t e rf r e ea n dbg r o u pw a sf e ds o y b e a np e p t i d es o l u t i o n s i xw e e k sl a t e r ， b l o o ds e n l mt c 、t ga n dh d l - cw e r e s i g n i f i c a n t l y ( p 6 5 时也只有2 2 0 0 p a s ， 具有良好的流动性。而且肽溶液的黏度通常不受热处理的影响，加热也不会胶凝。 3 2 大豆多肽的生理功能 3 2 1 调节免疫功能 最早证实具有免疫刺激作用的肽类是从人乳蛋白中获得的，它是由人乳的酶解 产物中分离得到的一类具有刺激吞噬细胞功能的肽。研究表明，从大豆蛋白经酶解 或微生物发酵的产物中可以得l e u - l e u t y r 和t y r - t y r - m e t - p r o - l e u - t y r 肽，这2 种 肽可以通过鼠腹腔膜细胞激活并吞噬绵羊红细胞，可以增强动物的免疫功削2 2 1 。 y a m a u c h i 等【2 3 】观察用大豆蛋白、酪蛋白、大豆多肽饲喂大鼠，发现大豆多肽组 显著提高尘细胞的吞噬活性，增强尘细胞对调理的绵羊红细胞的吞噬作用和促进有 丝分裂作用。 3 2 2 抗氧化作用 c h e n h u a m i n 用微生物蛋白酶水解大豆球蛋白，得到分子量7 0 0 d a 一1 4 0 0 d a 的 6 种肽，试验证明，这些肽段具有抑制亚油酸自动氧化的作用【2 4 1 。体外模型试验证 明这些肽还具有清除自由基的作用，可用于食品抗氧化剂【2 5 】。 3 2 3 抗血栓形成 血栓形成是由于纤维蛋白原参与的结果，纤维蛋白原既参与血小板的凝固，又 参与纤维蛋白的形成，血纤维蛋白原碳端有h i s h i s l e u - g l y g l y 趟a - l y s g l n - a l a a s p - v a l 片段与a r g - g l y - a s p - s e r p h e 片段，这2 种肽能抑制血小板的凝集和纤维蛋 白原结合到a d p 活化的血小板上，大豆蛋白水解物中含9 肽m e t - a l a i l e p r o p r o l y s a s n a s p - l y s ，能有效地抑制a d p 诱导的血小板凝集。大豆多肽经小肠吸收进入血 液，能对血小板的凝集、纤维蛋白原与活化的血小板结合起到抑制作用，从而对动 物的健康起到保护作用f 2 6 - 2 7 1 。 3 2 4 易消化吸收性和低的抗原性 现代生物代谢研究表明，人类摄食蛋白质经消化管酶作用后，并不一定完全以 0 。 7 游离氨基酸形式吸收，更多的是以低肽形式吸收的，通过试验证实了低肽比氨基酸更 易、更快被机体吸收利，低肽的吸收率比氨基酸高，因而大豆多肽可以作为那些由 通常饮食不能充分满足蛋白质营养需求的特殊条件的人员的食品，同时大豆多肽的 低抗原性使得食后不会引起过敏反应。 3 2 5 降压和抑制胆固醇的作用 大豆多肽通过抑制血管紧张素转换酶的作用，从而起到降低血压的作用，对原 发性高血压患者具有显著疗效；大豆多肽还能刺激甲状腺激素分泌增加，促进胆固 醇的胆汁酸化，使粪便排泄胆固醇增加，从而起到降低血液胆固醇的作用。 3 3 大豆多肽在食品工业中的应用 大豆肽由于具有良好理化性能和独特的生理活性，不仅可用于普通食品中，还 可用于营养疗效食品、功能保健食品和运动员食品等多类特种食品中幽剖】。 3 3 1 大豆肽在普通食品中的应用 大豆肽具有良好的吸湿和保湿性能，因而在豆制品、鱼肉制品、焙烤食品中有 着广泛的应用。另外，由于大豆肽水溶性高，溶液黏度低，且在酸性条件下不产生 沉淀，并还有较高的发泡作用，所以可用来生产酸性饮料、营养饮品和雪糕及冰淇 淋等冷饮食。 3 3 2 大豆肽在营养疗效食品中的应用 大豆肽具有直接被肠道吸收且吸收速度快的特性，因此，可用于特殊病人营养 剂，特别是消化系统肠道营养剂和流态食品，可被康复期病人、消化功能衰退老年 人及消化功能未成熟的婴幼儿食用。根据老年人生理特点和营养要求，以大豆肽为 基料，添加部分全脂奶粉和蜂蜜，强化蛋氨酸和半胱氨酸，并添入天然果汁，可研 制出高蛋白、高果糖、低动物性脂肪、易消化的速溶性老年奶粉。 3 3 3 大豆肽在运动员食品中的应用 由于大豆肽易被消化收且吸收速度快，并能促进脂类代谢和恢复体力，所以可 用于制造各种运动员食品，以强化蛋白质供给和迅速补充能量【3 2 1 。 3 3 4 大豆肽在食品及发酵食品中的应用 大豆肽可用于豆制品、焙烤食品、糖果、糕点和冷饮食品等食品加工领域，使 8 之加工产品的品质、风味更佳，营养更丰富。大豆肽能促进微生物生长发育和代谢， 已被广泛地应用于发酵工业，生产酸奶、干酪、醋、酱油和发酵火腿等；同时可提 高生产效率，稳定品质以及增强风味等，还可用于生产酶制剂f 3 3 3 4 1 。 4 大豆多肽降脂功能的研究进展 血脂是血液中的中性脂肪( 甘油三酯和胆固醇) 和类脂( 磷脂、糖脂、固醇类固醇) 的总称。它们是生命细胞的基础代谢必需物质。血脂在人体的正常代谢过程中具有 重要作用。人体内血脂的来源分两种，一种是外源性的，即摄入较多富含脂肪的肉 类及含胆固醇多的蛋黄、鱿鱼、动物的脑和内脏等食物；另一种是内源性的，即人 可从肝脏和小肠合成胆固醇和甘油三酯【3 6 1 。由于甘油三酯和胆固醇都是疏水性物 质，不能以单独游离的形式存在于血液中，必需是与其他脂质如磷脂和蛋白质一起 组成脂蛋白才能在血液中被转运。一旦总胆固醇( t c ) 、低密度脂蛋白胆固醇 ( l d l c ) 、甘油三酯( t g ) 高于正常值，高密度脂蛋白胆固醇( h d l c ) 低于正 常值时，机体患冠心病、脑血管病、糖尿病的可能性较大，维持血脂于正常水平是 机体健康的重要指标p 。 4 1 高脂血症 高脂血症是指血清中胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t g ) 和低密度脂蛋白胆固醇 ( l d l c ) 过高或血清高密度脂蛋白胆固醇( h d l c ) 过低的一种全身性脂代谢异 常。 高脂血症可以分成原发性与继发性，后者是继发于其它疾病，如糖尿病、肾病 综合症、甲状腺功能低下、慢性阻塞性肝病( 如原发性胆汁硬化) 、肥胖症、酒精 中毒、胰腺炎及痛风等；原发性高脂血症是指原因不明的高脂血症，目前认为它与 环境及遗传两大因素有关，轻度及中等血脂异常多是由于环境因素所致，最常见的 原因是高饱和脂肪及高胆固醇饮食，明显的血脂异常多数是遗传因素所致【3 8 3 9 4 5 矧。 4 2 高脂血症危害 高血脂对身体的损害是隐匿的、逐渐的、进行性的和全身性的。大量研究资料 表明，高脂血症是脑卒中、冠心病、心肌梗死、心脏猝死的重要因素【4 9 】。高血脂及 脂质代谢障碍是造成动脉粥样硬化的主要危险因素，动脉粥样硬化指主动脉、中等 9 动脉( 如脑、肾、冠状动脉) 内膜的脂类、碳水化台物等沉积坏死形成粥样瘤，平滑 肌细胞和胶原纤维增生、钙化和硬化，因为全身的重要器官都要依靠动脉供血、供 氧，一旦动脉被粥样斑块堵塞，就会导致严重后果，形成血栓而导致管腔闭塞，由 此而引起的心脑血管疾病严重危害人类健康。 高脂血症也是促进高血压、糖耐量异常、糖尿病的一个重要危险因素。高脂血 症还可导致脂肪肝、肝硬化、胆石症、胰腺炎、眼底出血、失明、周围血管疾病、 跛行、高尿酸血症等。 高胆固醇血症是动脉粥样硬化和冠心病发生的一个重要危险因素，其形成与膳 食结构密切相关。如何有效地通过营养干预降低动脉粥样硬化和冠心病的发生率是 当代营养学家的一个重要研究内容【5 。临床治疗表明，通过药物或膳食干预来降低 血清胆固醇水平，能有效地降低冠心病的发病危险性1 5 。有研究表明，在膳食中用 植物蛋白代替动物蛋白可以降低胆固醇水平1 5 2 1 。在我国，大豆是优良的蛋白质来源， 通过选择合适的蛋白酶水解大豆蛋白质，可以得到具有降胆固醇活性的生理活性肽 5 3 1 。 4 3 高脂动物模型建立 建立高脂动物模型是研究血脂代谢的重要手段，良好的动物模型的选择至关重 要。多年来人们在高脂血症模型研究上取得了很大进展，已成功开发出了鸟类、鼠 类、兔、猪、非人灵长类动物等模型动物进行实验性高脂血症的研究。现有的高血 脂动物模型有高脂饲料喂养法、表面活性剂法、免疫学方法和注射同型半胱氨酸法 笙【5 4 5 5 】 可 。 家兔、家鸽、鹌鹑、猪作为高脂血症的模型动物，其脂代谢与人差异较大，不 易饲养管理，高脂饲料的配制也较繁琐，且饲养成本较高。灵长类在解剖结构、生 理机能、代谢及疾病特点方面与人最为接近，是理想高脂血症的模型动物，但其共 同的缺点是来源不足，难以饲养，野外捕获者背景不清，个体差异大，不利于开展 广泛的研究。近年来人们较多应用大鼠或小鼠作为高脂血症的动物模型。大鼠的优 点是易于饲养管理，抵抗力较强，采样方便。但是，在国外高血脂研究中，大鼠的 使用呈逐渐减少的趋势，因为大鼠血清中高密度脂蛋白( h d l ) 是血液胆固醇的主要 载体【蚓，而人类是以低密度脂蛋白为主要载体。大鼠的个体大，不易于实验操作， 所用的高脂饲料中需添加猪油，蛋黄粉或抑制甲状腺功能的药物，如甲基硫氧嘧啶 或丙基硫氧嘧啶才能使血液胆固醇含量升高，工作比较繁琐。而小鼠在调节血脂药 物的临床应用越来越多，其价格便宜，造模成本低，采样方便1 5 7 1 。国外研究资料 又表明，小鼠的脂质也以l d l 颗粒为主1 5 引，并且在高脂饲料喂养下，以l d l c 显 1 0 著升高为主【5 9 】，与人类极为相似。 高脂饲料中的猪油所含热量高，胆固醇含量高。要加入一定量的胆酸盐，胆固 醇在肝脏中转变为胆汁酸是胆固醇在体内代谢的主要去路。若排入胆汁的胆固醇过 多( 如高胆固醇血症) 或胆汁酸盐及卵磷脂与胆固醇的比值降低( 小于1 ：1 0 ) ，则 可使胆固醇析出沉淀，引起结石。所以在饲料中加入胆固醇的同时，也要加一定比 例的胆酸盐，以避免实验动物因胆结石死亡i 删。 4 4 降胆固醇活性肽 大豆蛋白具有降血清中胆固醇的作用，而大豆多肽不仅具有这样的功能，而且 效果更佳。此外，大豆多肽降低血清胆固醇还有一些特殊的优点：( 1 ) 对于胆固 醇含量正常的人群，没有降低胆固醇的作用，而对于胆固醇含量较高的人群却有降 低胆固醇的作用；( 2 ) 对胆固醇值正常的人群，在食用高胆固醇含量的蛋、肉、 动物内脏等食品时，大豆多肽有防止血清中胆固醇值升高的作用；( 3 ) 大豆多肽 能使胆固醇中l d l 和v l d l 值降低，但不会使h d l 值降低【6 l 】。研究表明【6 1 删，大 豆多肽的降胆固醇的主要作用，是通过刺激甲状腺激素的分泌，促进胆固醇的胆汁 酸化，使胆固醇从粪便中排泄的量增加，从而降低血液中的胆固醇含量。 y a s u y u k i 等1 6 5 j 采用酶解技术和基因位点诱变技术，从大豆球蛋白的酶解产物中 获得了多种生物活性的肽，其具有减肥和降低胆固醇的作用。如l p y p r 是一种降 胆固醇活性肽，位于球蛋白a 5 a 4 8 3 单元，通过基因位点诱变技术将其引入到球蛋 白源a l a b l b 单元的特定位置，诱变后的球蛋白经大肠杆菌表达，之后又重新恢复 为不可溶的片段。胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶水解这种球蛋白源可释放出v p d p r ( 是 一种减肥和降低胆固醇效果更佳的活性肽) 6 6 1 。 l p l p r 是一种c 3 a 激动肽，通过基因位点诱变技术引入到球蛋白源a l a b l b 单 元的特定位置，结果同前一样，除获得l p l p 肽外，还获得了两种活性更强的肽 r p s y l p l p r 和p s y l p l p r l 6 5 】。n a g a o k a 等1 6 2 j 研究发现大豆多肽相对酪蛋白酶解物 显著抑制了c a c o 2 细胞对胆固醇的吸收，同时还发现大豆蛋白酶解物结合胆汁酸的 能力强于酪蛋白酶解物。另有报道【删，2 0 0 m g k g 的大豆多肽摄入量导致血清甘油 三酯的含量显著降低，1 0 0 0 m g k g 和5 0 0 0 m g k g 的大豆多肽添加量对甘油三酯和 血清胆固醇的影响均有显著效果，表明大豆多肽具有显著的降血压和降血脂作用。 引言 在我国，大豆是居民获得蛋白质的重要来源，大豆的蛋白质含量是现有农作物 中最高的，不引入脂肪和胆固醇，实现高蛋白、低饱和脂肪、低胆固醇和必需氨基 酸全面的营养特性，根据蛋白质消化率校正氨基酸评分( p d c a s s ) ，大豆分离蛋 白、浓缩蛋白与酪蛋白、鸡蛋白相同或相似，是一种优质蛋白质，而且中国式的豆 制品迄今为止已有2 9 0 0 多年的生产史了，但就目前形势来看大豆产业发展乏力，而 且仅靠传统的豆制品，达成中国居民膳食平衡宝塔推荐的“每人每天平均摄入 5 0 克大豆”的目标，显然不太现实。而牛奶可以提供丰富的钙和便于消化的优质动 物蛋白，以及人体所需要的钙和维生素a 、d 、b 2 、c 以及尼克酸等营养素，但是 我国居民广泛存在着较普遍的乳糖不耐反应，牛奶价格相对较高，现阶段广大农村 居民还是难以承受的。 随着生活水平的提高，人们逐渐认识到摄取优质蛋白的重要性，它是一种9 种 氨基酸种类齐全、数量充足、比例适当，与人体需要接近，脂肪、胆固醇含量较低， 人体吸收利用率高的完全易于吸收的蛋白质。而大豆蛋白就符合这种标准，它含有 丰富的钙、磷、铁及b 族维生素，氨基酸组成与牛奶蛋白质相近，是植物性的完全 蛋白质。另外，大豆蛋白质及其所含氨基酸的亲水性、疏水性、平衡性好，生物效 价高，极有利于人体的吸收利用，在营养价值上，可与动物蛋白相媲美，是最好的 植物性优质蛋白。而我国居民普遍缺乏优质蛋白质，这些都决定了未来营养膳食的 开发将以大豆蛋白为主角。 近年来，高胆固醇血症的发生率在逐渐升高，它是动脉粥样硬化和冠心病发生的 一个重要危险因素，其形成与膳食结构密切相关。如何有效地通过营养干预降低动脉 粥样硬化和冠心病的发生率是当代营养学家的一个重要研究内容。临床治疗表明，通 过药物或膳食干预来降低血清胆固醇水平，能有效地降低冠心病的发病危险性。有研 究表明，在膳食中用植物蛋白代替动物蛋白可以降低胆固醇水平。在我国，大豆是优良 的蛋白质来源，通过选择合适的蛋白酶水解大豆蛋白质，可以得到具有降胆固醇活性 的生理活性肽。与大豆蛋白相比，大豆肽往往具有更良好的物理性质，除此之外它还 具有调节免疫功能、抗氧化作用、抗血栓形成等生理功能。所以，开发多肽保健品来 防治心血管疾病是未来的主要趋势。 1 2 从我国国情出发，并借鉴国外经验，双蛋白应用于食品是国民健康和乳品业、 大豆食品业发展的综合需要，从而实现植物蛋白质与动物蛋白质开发并举的开发战 略，同时开发功能性膳食对于一些疾病的预防与治疗也是势在必行的。本文主要研 究了双蛋白乳对正常小鼠生长发育的影响，大豆多肽的制备及其对高脂状态下小鼠 的血脂指标及体脂指标的影响。初步建立了乳饮料营养价值评价方法，为新型双蛋 白乳及降胆固醇大豆多肽开发应用提供技术参数和实验依据。 1 3 1 1 试验材料与仪器 1 1 1 试验材料 牛乳 猪油 小白鼠 大豆分离蛋白w d f 9 5 0 f 分子蒸馏单干脂 蔗糖脂肪酸酯 卡拉胶 黄原胶b p 9 2 9 0 型 c m c 牛磺胆酸钠 胆固醇 1 1 2 试剂 盐酸分析纯 浓硫酸分析纯 甲醇分析纯 中性蛋白酶( 6 00 0 0u g - 1 ) 碱性蛋白酶( 2 00 0 0u g - 1 ) 木瓜蛋白酶( 35 0 0u m g 1 ) 植物蛋白酶( 2 0 00 0 0u m g 。1 ) 总胆固醇试剂盒 甘油三酯试剂盒 密度脂蛋白胆固醇试剂盒 低密度脂蛋白胆固醇试剂盒 1 材料与方法 安徽新希望乳业集团 家乐福购买 安徽合肥长临动物公司 山东万德福实业集团有限公司 广州品秀精细化工有限公司 浙江迪耳化工有限公司 阳江市奥先食品有限公司 山东省淄博中轩生物制品有限公司 威怡化工( 苏州) 有限公司 美国k a y o n 公司 b i ob a s i c i n c 公司 合肥桃园化工厂 上海建信化工有限公司试剂厂 美国s o l a r b i o 公司 南宁庞博生物工程有限公司 生工生物工程( 上海) 有限公司 南宁庞博生物工程有限公司 长春汇力生物技术有限公司 长春汇力生物技术有限公司 长春汇力生物技术有限公司 长春汇力生物技术有限公司 总蛋白( t p ) 试剂盒 血红蛋白( h b ) 试剂盒 长春汇力生物技术有限公司 长春汇力生物技术有限公司 1 1 3 试验仪器 h j 3 控温磁力搅拌器江苏金坛市金城国胜实验仪器厂 h h s 恒温水浴锅江苏国胜实验仪器厂 f a ( n ) j a ( n ) 系列电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司 b s2 2 4s 电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司 t u 1 9 0 1 紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司 n d j - 4 旋转黏度计上海精科天平 g y b 6 0 6 s 高压均质机上海东华高压均质机厂 p h s 3 b 精密p h 计上海精密科学仪器有限公司雷磁仪厂 d t 5 1 1 低速平衡台式离心机北京时代北利离心机有限公司 移液器上海精密科学仪器有限公司 培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂 鼓风恒温干燥箱上海实验仪器有限公司 t d l 5 0 b 离心机上海安亭科学仪器厂 h i - i s 系列恒温水浴锅上海医疗器械五厂 f s 2 型可调高速分散器江苏海门市麒麟医用仪器厂 7 8 h w - 1 恒温磁力搅拌器江苏金坛金城国胜实验仪器厂 f d 1 c e 冷冻干燥机北京德天佑科技发展有限公司 t g l 6 w 微量高速离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司 o p t i m am a xu l t r a c e n t r i f u g e b e c k m a nc o u l t e r 1 2 试验时间地点 试验于2 0 0 9 年3 月至1 2 月在安徽农业大学茶与食品科技学院畜产品实验室进 行。 1 3 试验设计与试验内容 1 3 1 双蛋白乳的工艺技术研究 1 3 1 1 鲜奶和大豆分离蛋白溶液的最优配合比例 不同的大豆分离蛋白溶液与鲜奶的配比会影响成品的p h 值，近而影响成品的 风味口感和外观。试验中采用单甘酯作为乳化剂，大豆分离蛋白溶液与鲜奶的添加 量以干重中蛋白质含量4 0 ，成品中蛋白质含量3 为标准。配制3 的大豆分离 蛋白溶液，用磁力搅拌器搅拌均匀，水浴加热至7 5 ，加入鲜奶，进行均质，均质 温度在7 5 ，均质压力为2 5 m p a ，二次均质，均质完毕后装瓶( 每种配方装入两 个锥型瓶) 、压盖，高压灭菌( 1 2 1 ，1 0 m i n ) 1 6 7 】，杀菌结束冷却至室温进行测定。 依据氨基酸评分标准( 表1 ) ，产品黏度，沉淀率，p h 值，确定鲜奶和大豆分 离蛋白溶液的设计配合比例如表2 。 表1 氨基酸评分标准 t a b l e1a m i n oa c i ds c o r e 氨基酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 苯丙氨酸+ 酪氨酸 苏氨酸 4 0 色氨酸 1 0 缬氨酸 5 0 大豆分离蛋白 m g g p l d ) 4 0 9 6 7 6 4 7 9 1 5 - 3 5 3 3 白 埘 蛋 鲜 j 悔 嚏 5 6 7 ：| | | 钙 罩： 表2 大豆分离蛋白与鲜奶配比的设计配方 t a b l e2t h e o p t i m a lf o r m u l ar a t i oo fs o yp r o t e i ni s o l a t ea n dm i l k 1 3 1 2 乳化剂选择及用量优化 试验中采用单甘酯与蔗糖酯作为乳化剂，研究其对双蛋白奶稳定性的影响。首 先按照表3 配方，乳化剂以单甘酯与蔗糖酯的不同比例，总的添加量按o 5 进行试 验。乳化剂用量优化配方如表3 。 表3乳化剂用量优化配方襄 t a b l e3o p t i m u me m u l s i f i e rt a b l e 1 3 1 3 复合稳定剂的试验安排 稳定剂的选择对产品的稳定性至关重要，资料显示使用单一乳化剂和增稠剂的 效果不如使用复合乳化剂和增稠剂的效果【硎。表4 是乳化剂和增稠剂复合稳定剂筛 选正交实验。 1 7 表4 复合稳定剂的正交实验( i - 4 3 4 ) t a b l e4t h eo r t h o g o n a lo f c o m p o s i t es t a b i l i z e r 1 3 2 双蛋白乳营养价值评价的动物试验 1 3 2 1 试验动物 雄性健康昆明小鼠3 0 只，编号为1 - 3 0 ，9 - - 1 6 9 ，安徽合肥市长临公司提供。 1 3 2 2 日粮组成与饲养管理 饲养试验按卫生部颁布的“保健食品功能评价程序和检验方法”实施。试验用基 础饲料购自安徽合肥市长临公司。 饲养管理：在环境温度为2 0 - - 2 6 ，相对湿度为5 0 - - 7 0 ，噪音小的房间里， 金属笼具饲养。笼内垫料每周更换2 - - 3 次。 1 3 2 3 试验设计 试验用小白鼠先期饲养1 周。再随机分成3 组，分别标记为a 、b 、c 组，其 中a 组小鼠1 0 只，每日饮用大豆分离蛋白溶液；b 组小鼠1 0 只，每日饮用灭菌鲜 奶；c 组小鼠1 0 只，每日饮用配制好的双蛋白乳，分别记录各组的日饮用量。试 验过程中全程饲喂基础日粮，小鼠自由采食，记录其日采食量，并且每周称其体重。 试验期为5 6 天。 1 3 3 大豆分离蛋白双酶解方案的确定 1 3 3 1 水解酶的筛选 前期进行预试验，得出4 种蛋白酶的最适酶解温度、p h 值，在此基础上，其它酶 解条件相同( 酶添加量5 ，底物浓度1 2 ，水解时间3 h ) 时水解度比较，依据水解度确 定最佳水解工具酶。 1 3 3 2 双酶解适宜底物浓度 底物浓度为6 、8 、1 0 、1 2 、1 4 时，在温度5 0 ，p h 7 0 ，酶与底物浓 度比5 ，两酶比例为l ：l ，水解1 8 0 m i n 条件下，依据水解度确定适宜底物浓度。 1 3 3 3 双酶解适宜酶与底物浓度比 酶与底物浓度比为3 、4 、5 、6 、7 、8 时，在温度5 0 c ，p h 值7 0 ， 底物浓度1 2 ，两酶比例为1 ：1 ，水解1 8 0 m i n 条件下，依据双酶水解大豆分离蛋白 的水解度确定适宜酶与底物浓度比。 1 3 3 4 酶解条件的优化 根据单因素试验的结果，进行l 9 ( 3 4 ) 正交实验，以确定植物蛋白酶与木瓜蛋白 酶复配水解大豆分离蛋白的最佳工艺参数组合。正交试验因素水平参见表5 。 表5 酶解条件正交试验因素水平 t a b l e5t h el e v e lo f o r l h o g o n a lf a c t o r s 1 3 4 大豆多肽的降胆固醇活性的体外测定 1 3 4 1 大豆多肽的制备 按一定的底物浓度准确称取大豆分离蛋白于烧杯中，加入适量蒸馏水搅拌均匀， 然后在9 0 下热处理1 5 r n i n , 冷却到酶反应温度后，用0 5m o l l 1 的n a o h 溶液调至 酶反应所需p h 值，加入酶进行水解。反应一段时间后，将酶解液迅速水浴加热至1