（分析化学专业论文）食品中丙烯酰胺分析技术及其生成机理研究.pdf

摘要 摘要 本文共分四章。 第章：文献综述，概括了油炸淀粉类食品中丙烯酰胺分析方法的现状和进展情况。 对丙烯酰胺的物理和化学性质进行了简要介绍，详细总结了样品前处理技术和丙烯酰胺 检测技术的发展情况，以及这些技术在油炸淀粉类食品分析中的应用。 第二章：本文采用高效液相色谱- 二极管阵列检测器测定薯片中的丙烯酰胺，采用 甲醇提取丙烯酰胺，低温处理和正己烷联合去除油脂及杂质，c 1 8 固相萃取小柱净化提 取液，以二极管阵列检测器测定其含量。检测限( l o d ) 为1 1 5 p g l ( g ，回收率在7 5 蛐3 4 之间，相对标准偏差小于8 4 。 第三章：本文建立了高效液相色谱一二极管阵列检测法测定薯片中丙烯酰胺的不确 定度评定方法。通过建立数学模型，分析不确定度的来源，对各不确定度分量进行量化， 给出了丙烯酰胺测定结果的扩展不确定度。 第四章：本文通过检测不同反应时间不同反应温度下天冬酰胺与葡萄糖模拟体系中 生成的丙烯酰胺，对食品中丙烯酰胺的生成机理进行探讨。 关键词丙烯酰胺；薯片；高效液相色谱；固相萃取；天冬酰胺；葡萄糖 a b s t r a c t a b s t r a c t 1 1 l i st l l e s i sc 0 i l s i s t so f 士0 u rc h a p t e r s hc h a p 耶三ro n e ，1 1 1 ec u r r e n t 啦此a n dd e v e l o p m 锄to f 觚a 1 妒c 2 l lm e t l l o d so f a c r y l a n l i d ei n1 1 i 曲- t e m p e r a c u r e p r 0 c e s s e df o o da r cs 硼【1 i n a d z e d t 0 x i q i 锣o fa c r ) r l a i i l i d ci s i n t r o d u c e db 矗e n y t h em e n l o d so fs 锄p l ep r e t r e a 衄e n t 觚da c 巧l 锄i d ed e t e n l l i i l a t i o na r e s u m m 撕z e ds y s t e n l i c a l l y 趴dt l l e s em e t h o d sa p p l i e dt 0 锄a l y s i so fa c d r l 锄i d e 硒、e 1 1 i nc h a p t e r t w o ，a n 锄a l y t i c a lm 如o df o ra n 2 l l y s i n ga c r y l 锄i d ei np o t 咖c 脚s 吣 v a l i d a t e d 1 1 1 ea c r y l 锄_ l i d ei np o t a t oc h i p sw a se x t m c 伽哳t l lm e n l a n o l ，丘o z e n ，d e f 狐e d 、时t l l 力- h c x a n e ，a 1 1 dp u r i f i e d 、 ，i md i 18s o l i ( 1 p h 嬲ee x 缸a c t i o n ( s p e ) c 龇r i d g ea 1 1 dl l l e n a n a l ) ，z e db y l c _ d a df o rq u a n t i f i c a t i o n 1 k1 i m i to fd e t e c t i o n ( l o d ) w a l s1 1 5 弘g l 【g r l e c o v 鲥e so fa c r y l 锄i d er a n g e db e 帆e n7 5 9a n d9 3 4 、i mr e l a t i v cs t a i l d a r dd e v i a t i o 璐 s d ) o f 1 e s st l 啪8 4 t h ef e s u l t sd e m o n s 仃a t e dt l l a tt l l i sm e l o ds 1 1 0 u l db er e g 砌e d 娼a n e w l o w _ c o s t ，a n dr o b u s ta l t e m a t i v ef o rc o n v e n t i 6 n a li 1 1 v e s t i g a t i o no fa c r y l a i n i d e h lc h a p l e rt h r e e ，a n e v a l 啦曲唱m e 吐l o do f m e a s u r i l 培u n c e r t a i n 锣h 2 l sb e e ne s t a b l i 盘埘 f 砸也es 豳m a i 】e o l l sd 呶脚1 i i l a t i o i l so fa c 】叫觚l i d ei i lp 以吐0c h i p sb yl l i 曲p e r f o r n l m c el i q 砒 c ：h m a t o 鲫h ya n dd i o d e a r r a yd e t e c t i o n b ye s t a b l i s l l i n gm a 妇胁l a d c a jm o d e la 1 1 d 锄a l y z i i 培 m es 优眦燃；o fu l 】c e n l i i i 劬n l ec a i m p o n 伽她o fu i m r t a i r l 够o fm e a 双l 把m e n tw e r c 印m t i z e d 锄d e x p a i l d e d 咖c c 删e so f m e 踟血g1 1 e 砌t s0 fa c 巧1 a r n j d ew e r es h o w n h lc h a p t e rf o u r1 1 1 eo c c u 仃e n c eo fa c 巧l 锄i d ei sd e m e d 舶mh e a t i n d u c e d r e a c t i o nb 咖e e nt l l e 锄i n 0g r o u po fr e d u c i n gs u g a r s “n gb a k i n ga i l d 衄i i l g n l e n l e c h a i l i s mf o r 也ef o m l a t i o no fa c 巧l a m i d ei i ll l i g l l s t 锄c hp r o d u c 虺i sn o tc _ h e a r l yu n d e r s t o o d t h ep r e s e n tp 叩e rp r e s e n t sa qa n a l 如c a lm e l o df o rt h ed e t e n i l i n a t i o no fa c r y l 锄i d ei i l m a i l l a r dr e a c t i o no fg l u c o s e 砌髂p a r a g i n e k e y w o r d s ：a c 叫锄i d e ；p o t a | t 0 出p s ；肿l c ：g l u 9 0 s e ；舡p a r a g m n 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料i 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名：墨盖：函日期：丝望年量月l 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密d 。 ( 请在以上相应方格内打“一) 保护知识产权声明 某人为申请河北大学学位所提交的题目为( 侮中两辟l 碗盹撕蛾的学位 论文，是我个人在导师引始指导并与导师合作卞敢得的研究成果，研究工作及取得 哎蜒机哩研唳 的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全 了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北 大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书 面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反 本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人i班酗j日期：- 二l 生墨年厶月j 日 导师签名：盏l 苴盗 日期：丝全2 i 年上月l 日 第1 章绪论 第1 章绪论 摘要综述了油炸淀粉类食品中丙烯酰胺分析方法的现状和进展情况。对丙烯酰胺的物 理和化学性质进行了简要介绍，详细总结了样品前处理技术和食品中丙烯酰胺检测技术 的发展情况，以及这些技术在丙烯酰胺分析中的应用。 关键词丙烯酰胺；油炸淀粉类食品；综述 1 1 引言 食品是人类赖以生存和发展的物质基础，食品安全问题是关系到人民健康和国计民 生的重大问题。2 0 0 2 年4 月，瑞典斯德哥尔摩大学的1 m q v i s t 教授首次在油炸及焙烤的马 铃薯和谷物类食品中发现了具有神经毒性的潜在致癌物丙烯酰胺，这是国际上首次从 食品中检出高含量的丙烯酰胺。随后英国食品标准局( f o o ds t a n d a r d s a g e n c y ，f s a ) 和挪 威国家食品管理局( n a t i 9 n a lf o o da u t h o r i t y ，n f a ) 等机构证实了瑞典的研究结果。这次 在食品中检出足以对人体健康产生危害量的丙烯酰胺，立即引起了包括世界卫生组织等 国际机构的重视。 目前食品中丙烯酰胺的卫生标准尚未建立，食品中丙烯酰胺的检验已列为我国“十 五 国家重大科技专项课题，卫生部食品安全计划也将食品中丙烯酰胺检测方法建立作 为一个重要部分。 到目前为止，报道有关食品中丙烯酰胺的研究资料还不是很多，特别是发展中国家 有关食品中丙烯酰胺的研究成果几乎是空白，发达国家也只有部分报道，所以对于食品 中丙烯酰胺的含量及其产生因素还很难有一个全面而深入的了解。另一方面随着对丙烯 酰胺在食品中产生机理的逐渐确认，以此为出发点，可以尽早探明食品中丙烯酰胺的产 生及其分布规律，从而对丙烯酰胺的风险性进行分析并采取相应的预防措施。 河北大学理学硕士学位论文 1 2 丙烯酰胺简介 1 2 1 什么是丙烯酰胺? 图1 1 丙烯酰胺的结构式 丙烯酰胺( a a ) 俗称“丙毒”，分子式c h 2 c h c o i n h 2 ，结构式如图1 1 。无色透明片状 晶体，无臭，有毒，常温下能升华，熔点8 4 1 5 ，沸点1 2 5 ，易溶于水、乙醇、丙 酮，微溶于苯、甲苯，丙烯酰胺分子中含有胺基和双链，化学性质相当活泼，可以发生 霍夫曼反应、水解反应、迈克尔型加成反应和聚合反应等。当处于熔点以上温度、氧化 条件以及在紫外线的作用下，很容易发生聚合反应。当加热使其溶解时，释放出强烈的 腐蚀性气体和氮氧化物。 1 2 2 丙烯酰胺的用途 丙烯酰胺由德国于1 9 4 9 年首次合成，1 9 5 4 年开始大规模生产。世界上，美国、欧洲、 日本、俄罗斯及中国的生产规模较大。工业上多用聚合合成聚丙烯酰胺的单体。德国于 1 9 5 0 年开始生产聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺( p o l y a c 聊a m i d e ，p ! 无毒无害，常用作制造 过程中下列行业的高分子絮凝剂，如水质净化、废水处理、制药制糖、塑料赋型、纺织 印染、纸浆加工、饮料制备、选矿采油、水泥灌浆、土壤改良等，也有少量用作粘合剂、 染料和化妆品添加剂，近年来医学上也用于整形外科手术。 1 2 3 丙烯酰胺的毒性及对人体的危害 丙烯酰胺可通过皮肤、粘膜、呼吸道及消化道吸收，皮肤接触中毒常见。美国环境 保护署( e p a ) 报道，给大鼠静脉注射同位素标记的丙烯酰胺后，在肌肉、皮肤、脂肪、 血、睾丸、肝脏、肾脏、小肠、肺、脑、脊髓和坐骨神经均发现丙烯酰胺：静脉注射丙 烯酰胺给孕鼠、兔、狗和猪，在妊娠后期均可发现丙烯酰胺通过胎盘屏障在胎儿中的分 布【。丙烯酰胺具有中等毒性，急性丙烯酰胺中毒主要损害中枢神经系统，其次是对眼 睛和皮肤的刺激作用，慢性中毒主要损伤周围神经。急性毒性：人体的口服半致死量 ( l d 5 0 ) 为( 5 0 5 0 0 ) m 眺g ，大鼠经皮的l d 5 0 为4 0 0 m g 瓜g 。丙烯酰胺对于人的神经毒性 已得到了许多试验的证明【2 ，3 1 ，早期中毒的症状表现为肌肉无力、手足出汗、麻木、震动 2 第1 章绪论 觉减弱、膝条反射的丧失、感觉器官动作电位的降低、神经异常等周围神经损害，如果 时间延长，还可损伤中枢神经系统的功能，如小脑萎缩【4 ，5 1 。用动物做实验材料的研究显 示，丙烯酰胺的神经具有累积性，每一次的摄入量不会决定最终的神经损坏程度，而是 决定神经损坏开始的时间。 对小鼠细胞进行体内和体外的培养，发现丙烯酰胺会破坏生物的遗传物质d n a 和 r n a ，而且长期监测表明它可引起小鼠肿剧】。 丙烯酰胺的生殖毒性作用表现为雄性大鼠精子数目和活力下降及形态改变和生育 能力下降。有动物试验研究表明，以1 5 m g 他d ) 丙烯酰胺喂养小鼠5 d ，小鼠出现精子损 伤，精子数量、移动距离下降。丙烯酰胺对小鼠、大鼠无明显致畸胎作用。在胎鼠器官 形成时期，以1 5 m g ( 蝇。d ) 丙烯酰胺喂养小鼠、以4 5 m 耿蚝d ) 喂养大鼠，仅见轻微影响( 骨 骼改变、体重增加减少的发生率增加) 【9 】。崔群【1 0 】等人的研究表明，小鼠经口给予5 0 、 1 0 0 、1 5 0 m g 蚝的丙烯酰胺，每周5 次，6 周后断头取血检测指标，染毒小鼠体重明显下 降，血清脂质过氧化代谢产物( m d a ) 含量增高，超氧化歧化酶( s o d ) 及全血谷胱甘肽氧 化酶( g s h - p x ) 活性于1 5 0 m g l 【g 染毒组降低非常明显，1 5 0 m 眺g 染毒组小鼠血中胶体炭粒 清除速度明显降低，胸腺相对质量明显增加，说明丙烯酰胺有抑制机体抗氧化能力和降 低机体网状内皮系统吞噬功能的作用。 丙烯酰胺在体内和体外试验均表现有致突变作用，可引起哺乳动物体细胞和生殖细 胞的基因突变和染色体异常，如微核形成、姊妹染色单体交换、多倍体、非整倍体和其 他有丝分裂异常等，显性致死试验阳性。并证明丙烯酰胺的代谢产物环氧丙酰胺是其主 要致突变活性物质。刘胜学【l l 】等人研究了丙烯酰胺对人体白血病细胞次黄嘌呤磷酸核糖 基转移酶( h p 啪位点的影响，认为丙烯酰胺染毒细胞的突变频率在处理剂量范周内具有 明显的剂量一反应关系，在最高剂量组( 7 0 0 p 咖l ) 才有明确的致h p i 汀基因突变作用：同 时发现a a 染毒细胞的克隆效率随着剂量增加有轻度升高。李秀云等【1 2 】人用丙烯酰胺对 小鼠进行腹腔注射染毒，在5 0 m g 瓜g 体重剂量下发现丙烯酰胺可导致骨髓染色体畸变和 微核率增加，具有染色体损伤作用。 丙烯酰胺对人体健康的影响，主要是基于对接触丙烯酰胺的职业人群和因事故偶然 暴露于丙烯酰胺人群的流行病学调查。王慧兰等【1 3 】人对1 0 8 例丙烯酰胺中毒病人及所在 的1 0 个工厂进行的劳动卫生学调查表明，皮肤损害是丙烯酰胺直接刺激引起的接触性 3 河北大学理学硕士学位论文 皮炎和植物神经功能紊乱所致，手、足脱皮是手、足接触高浓度丙烯酰胺和吸收丙烯酰 胺的标志，脱皮后表皮薄嫩，又促进了对丙烯酰胺的吸收，手部皮肤污染是丙烯酰胺中 毒的主要途径。张寿林等【1 4 】对7 1 名生产丙烯酰胺的作业工人和5 1 名对照者进行了体检、 神经肌电图等多项目测定，发现丙烯酰胺主要影响神经系统，多数表现为周围神经病， 以四肢远端震动感觉障碍及跟腱反射迟钝较常见，其中少数重者出现小脑功能障碍。王 朝霞等【l5 】人对两例丙烯酰胺中毒患者的检测表明，丙烯酰胺中毒除导致神经系统受损， 还可引起周围神经和血管受损。有人认为丙烯酰胺是一种致癌物，但在职业接触丙烯酰 胺流行病学方面，还没有直接有效的证据充分证明其对人体有致癌性，1 9 9 3 年e p a 将 丙烯酰胺的致癌性排序列为b 2 组，认为其有可能对人体致癌；i 触屺考虑到对动物基 因的毒性，1 9 9 4 年将原来于1 9 8 7 年列为2 b 组的丙烯酰胺提升到了2 a 组即对人类可能 是危险的致癌物；e u 和德国的评价为2 级。 1 3 食品中丙烯酰胺研究现状 1 3 1 食品中丙烯酰胺的形成机理 自2 0 0 2 年瑞典报道油炸或焙烤的淀粉类食品中发现较高含量的丙烯酰胺以来，人们 在丙烯酰胺形成机理上开展了大量研究。最先提出的一种理论是氨基酸特别是天门冬酰 胺与含羰基的化合物还原糖通过美拉德( m a i l l a r d ) 反应形成丙烯醛，丙烯醛被氧化形 成丙烯酸，后者进步与氨基类化合物反应生成丙烯酰胺【1 6 1 7 】。鉴于一些抗氧化剂不能 有效抑制高温加工食品中丙烯酰胺的形成f 1 8 1 ，该机理受到置疑。 目前，各国的科学家们正在从生物化学的角度来探索丙烯酰胺在食物中的形成机 理。瑞士s t a d l e rrh 等和m o t 仃a mds 【1 7 ，1 6 】认为丙烯酰胺与食物在高温下进行的m a i l l a r d 反应有关，是m a i l l 砌反应的一部分，食物在高于2 0 0 发生褐变时某类氨基酸如天冬酰 胺酸与淀粉中的葡萄糖结合形成了丙烯酰胺，土豆、谷物类都是富含天冬酰胺酸的食物。 天门冬酰胺与还原糖的反应是食品产生丙烯酰胺重要途径。这一反应机理被称作天 门冬酰胺途径( 如图1 2 ) 1 9 1 。天门冬酰胺与还原糖形成s c h i 蹴后，通过两种方式形成丙 烯酰胺：一是通过美拉德反应继续生成含羰基产物，天门冬酰胺在有这些含羰基分子存 在下通过s 饥c k e r 降解脱酸脱氨后形成丙烯酰胺；二是s c l l i f | e 碱经过分子内环化生成唑烷 酮，然后经脱羧，形成中间产物偶氮甲碱叶拉德内翁盐，之后重排形成a m a d o r i 产物， 这一产物c _ n 键在高温下断裂生成丙烯酰胺( 如图1 3 ) 。 4 第1 章绪论 h h 一一年一c o o h c 川 n h l 天冬酰胺 葡萄糖 h 懈基o h i p o r k h 2 h + 乍h 2 一 譬一o n h 2 0 0 h 弘 筻n + h 下眦 譬一。 文 l u n h 2 3 一氨基丙酰胺丙烯酰胺 图1 2 丙烯酰胺形成的机理( 天门冬酰胺途径) 5 河北大学理学硕士学位论文 1 r 仝 a m a 如dp r 州0 穗 r r + n h 2 r n i a c l m a m l d e 峙r = g 嘞0 纠 j s c h 孵埝由锨y l a l 豫da m 雹d o r ip 陷d u 醴 r o ，潞z o i 嗣i n 毒el n 培丽o d i 霜恼a 踟蛳i n e y 嗣e 图1 3s l l i 行碱通过脱羧反应生成丙烯酰胺 _t 德国同时还提出了下面几种假设：游离糖类、含氮化合物在高温少水加热时间长的 条件下有可能生成丙烯酰胺；煎炸用食用油里的某些含硅添加剂可能对丙烯酰胺的形成 有积极影响：土豆贮藏的温度和时间也应考虑。 1 3 2 食品中丙烯酰胺分析检测技术 6 l r 2 、 树 凡 第1 章绪论 1 3 2 1 样品前处理技术 食品中的丙烯酰胺分析通常需经过样品制备、纯化富集、分离检测和综合分析等步 骤。而高效快速的样品前处理方法和高灵敏度、高选择性的检测技术已成为目前研究的 重点。以下分别对样品前处理方法和检测技术进行介绍。 对一系列经前处理后的样品进行定性和定量分析，其结果的可靠性和准确性将取决 于这些处理过程是否会将欲测组分丢失或使欲测组分发生一些不可预测的变化。进行食 品中的丙烯酰胺分析，面临基质复杂多样、待测组分多为微量或痕量等问题，因此，必 须采取适当的前处理方法，去除基质干扰、分离富集待测组分、提高检测的灵敏度和准 确性。 ( 1 ) 样品提取 丙烯酰胺是极性小分子物质，一般采用水或极性强的有机溶剂萃取。液体样品可直 接进行衍生或净化处理后衍生，而固体样品则需要萃取后再进行净化处理和衍生。目前 用于萃取的溶剂有：水、甲醇、甲醇水、乙醇、正丙醇、二氯甲烷乙醇等。 提取方法主要有以下几种： 振荡法：在盛有样品的容器中加入提取剂，振荡一段时间。此法简便并且提取 效果较好，普遍采用。周宇等采用振荡法提取薯片中的丙烯酰胺呦1 。 匀浆法：将样品放在匀浆杯( 捣碎杯) 中，加入提取剂，快速匀浆( 捣碎) 数分钟。 此法简便、快速、效果好、普遍采用。 超声波提取法：样品经粉碎或匀浆捣碎后，加入提取剂，在超声波仪中提取一 定时间。此法现已普遍采用。 除了上述方法以外，加速溶剂萃取( a s e ) 和索氏萃取也已应用于丙烯酰胺的测匙 ( 2 ) 净化 采用适当的净化方法对于测定至关重要。净化方法包括液液萃取、固相萃取、以 及诸如离心、过滤、超滤等其他物理方法，而且通常是几种方式并用。下面介绍几种典 型的净化方法。 液一液萃取法：利用丙烯酰胺在两种互不相溶的溶剂中溶解度( 分配系数) 的 差异而达到分离目的的净化法。通常采用极性溶剂和非极性溶剂配成溶剂对进行多次分 配，使干扰杂质和丙烯酰胺分离，达到净化目的。在处理丙烯酰胺样品过程中，尤其是 7 河北大学理学硕士学位论文 脂肪含量高的样品时，通常采用液液萃取法来去除油脂。n e m o t o 等处理样品时采用正 己烷进行液一液萃取除去水相萃取物中的非极性成分【2 1 1 。， 冷冻法：采用低温处理样品提取液，待脂肪、蜡质、蛋白质等杂质析出后，在 低温条件下过滤除掉杂质。 固相萃取( s p e ) 固相萃取是一种由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来的试样处理技术。就是 利用固体固定相将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然 后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的【2 2 1 。 与传统液液萃取相比，s p e 具有如下优点： 速度较快，缩短了预处理时间：较高的精密度和准确度；分析物的高回收率； 有机溶剂的低消耗，减少了对环境的污染；不出现乳化现象，易获得较为纯净样品；操 作简单，易于自动化。 固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其主要分离模式也与液相色谱相同，可分为 正相、反相、离子交换和吸附。其作用机理包括氢键、偶极作用、疏水性相互作用和静 电吸引力等。固相萃取所用的固定相也与液相色谱常用的固定相相同，只是在粒度上有 所区别。目前用于h p l c 的填料几乎均可用于s p e 。但s p e 柱的填料粒径大于阳? l c 填料，因此s p e 柱效远低于h p l c 色谱柱，所以适于分离保留性质差别很大的化合物， 主要用于处理样品。 应用于丙烯酰胺净化的填料包括硅胶、弗罗里硅土、活性炭、离子交换树脂及一些 混合填料。 正相s p e ：萃取所用的固定相都是极性的，如硅胶、氧化铝、硅镁固定相等，用来 萃取( 保留) 极性的丙烯酰胺。 反相s p e ：萃取所用的固定相通常是非极性的或是弱极性的，如c 8 、c 1 8 、苯基柱 等，所萃取的目标化合物通常是中等极性到非极性的化合物。触等的净化过程合并 使用了石墨化炭黑柱和凝胶渗透色谱：样品经水萃取后，抽滤，经过石墨化炭黑柱除去 大分子和疏水性分子。再加入内标n n 二甲基丙烯酰胺( 2 ，3 d b p a ) 从水相转移到有 机相，再通过g p c 以乙酸乙酯环己烷( 1 ：1 ) 洗脱进一步净化四1 。 尽管固相萃取的分离模式多种多样，但其操作程序基本类似，一般由下面三步组成。 8 第1 章绪论 条件化：在萃取样品前用适当的溶剂淋洗固相萃取小柱，使吸附剂保持润湿，可以 吸附目标化合物或干扰化合物。 加样：将液态的样品倒入已条件化的固相萃取小柱，视样品情况不同，可利用重力： 抽真空、加压和离心等不同形式使样品进入吸附剂。 洗涤和洗脱：视分离模式和样品性质，可采用适当的洗脱剂将目标化合物直接淋洗 下来；也可先将干扰化合物淋洗掉，再用适当的洗脱剂将目标化合物洗脱。通常采用后 一种方法更有利于样品的净化。 ( 3 ) 浓缩 氮吹法：采用吹干燥空气或氮气，使溶剂挥发的浓缩方法。由于氮气是保护性 气体，避免了样品中的物质被氧化，简便快速，尤其适合痕量分析，因此丙烯酰胺的测 定实验大多采用此种浓缩方法。 真空旋转蒸发法：在减压、加温、旋转条件下浓缩溶剂的方法。此法浓缩速度 快，是最常用的浓缩方法。 1 3 2 2 食品中丙烯酰胺检测方法 各国广泛开展食品中丙烯酰胺的研究，尝试了多种方法测定食品中丙烯酰胺如气相 色谱法、高效液相色谱法和各种联用技术。这里就目前应用较多；有良好前景的方法做 一简述，为寻找简便、灵敏、准确、易于普及的方法提供参考。 ( 1 ) 气相色谱法( g c ) 该法是日前广泛应用的一种分析检测方法，具有高效、快速、灵敏、应用范围广等 特点。气相色谱法通常包括溴化衍生气相色谱法和不衍生气相色谱法。g c 为食品中丙 烯酰胺的痕量测定提供了方法基础，但其固有的特点要求分析的化合物必须具备良好的 热稳定性和挥发性。丙烯酰胺本身属于热不稳定化合物，熔点8 4 7 ，3 3 4 l 【p a 的压力 下，沸点为1 2 5 ，分子中含有活泼的双键，当加热至熔点时易发生聚合反应，也不具 有良好的挥发性。针对这一问题，开发了衍生化方法，改善丙烯酰胺的稳定性和挥发性； 同时也改善了其相应和色谱行为。 目前已发表的有关食品中丙烯酰胺测定的气相色谱法多采用溴化衍生。用来测定的 最终产物包括2 ，3 二溴丙酰胺( 2 ，3 一d b p a ) 和2 溴丙烯酰胺( 2 b p ：a ) ，前者应用较 广泛。 9 河北大学理学硕士学位论文 在溴化制剂的作用下，丙烯酰胺中活泼的双键与溴分子之间发生加成反应首先生成 2 ，3 二溴丙酰胺，其反应方程式如图所示。 h h a a b ro n h 2 2 ，3 - d b p a 图1 - 4 丙烯酰胺溴化生成2 ，3 d b p a 和2 b p a h 2 b p a 仲维科等【2 4 j 在样品中加入7 5 克溴化钾，用h b r 调p h 值为1 3 ，再加溴水8 m l 衍 生，在4 条件下过夜，衍生结束后用硫代硫酸钠反滴至溴水褪色出去过量的溴水，然 后再经过一定的净化处理进样分析，最终测定结果表现出良好的线性和再现性。 当然，也有不进行衍生直接采用气相色谱进行测定的，这些方法尽管有分析周期短 的优点，但检测限普遍偏高【2 5 1 。 ( 2 ) 高效液相色谱法( h p l c ) 该法引入了气相色谱理论，在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器， 实现了分离速度快、效率高和操作自动化。几乎所有的化合物包括高极性离子型待测物 和大分子物质，均可用印l c 进行测定。刘红河报道h p l c 法测定食品中丙烯酰胺【2 6 1 ， 该法用水提取样品中的丙烯酰胺，经离心和微孔滤膜过滤，c 1 8 固相萃取小柱纯化处理， 二极管阵列检测。采用c 1 8 固相萃取柱对样品进行纯化处理，此柱对丙烯酰胺基本无吸 附，而对样液中共存物质有较好保留作用，较活性碳等萃取吸附剂更能有效分离样品中 干扰物质；在2 1 0 i l i i l 检测波长用紫外光谱扫描丙烯酰胺有最大吸收峰。此法操作简便、 重现性好，精密度和检测限符合痕量分析要求。肿l c 常用的检测器有紫外检测器、荧 光检测器和电化学检测器，该法中的二极管阵列检测器是进1 0 年来肿l c 技术的重要进 步，它可在全部紫外波长上检测色谱信号，同时接收整个光谱区的信息，在色谱峰流出 同时能进行每个瞬间的动态光谱扫描并快速采集信号，经计算机处理得到色谱光谱的 三维图谱，信息量大大增加，不仅可进行定量检测，而且可提供组分的光谱定性信息。 l o 第1 章绪论 ( 3 ) 气相色谱一质谱联用技术( g c 。m s ) 此法使气相色谱的分离能力和质谱的定性能力有机结合，为气相色谱分析开辟了新 的途径。a l a i l lp i t t e t 等【2 刀报道g c m s 测定谷物食品中丙烯酰胺，将样品和1 3 c 标记的丙烯 酰胺样品用水溶解，经c 锄e zi 和c a r r e z i i 酸化纯化，溴化衍生为2 ，3 二溴丙酰胺，溴 化产物经乙酸乙酯萃取，f l o r i s i l 净化，用三乙胺脱去其中一个溴，衍生产物变为2 。溴丙 烯酰胺，色谱柱分离，m s 检测器测定。尤其适合低含量丙烯酰胺的分析。但该法使用 液一液萃取分离，使用溴化试剂衍生，反应时间长，操作费时、繁琐。 ( 4 ) 液相色谱质谱联用口8 2 9 】( l c m s 、l c m s m s ) 此方法是一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统，它既发挥了液相色谱 对化合物的分离能力，又体现了质谱特异性、灵敏度，提供了组分分子量及结构信息。 串联质谱( m s m s ) 也已用于检测食品中丙烯酰胺，与单级质谱相比，它能明显改善信号 的信噪比，对测试样品的需要量也大大减少。b e n n u d oe 等人d 0 】，将样品和2 ，3 ，3 d 3 丙烯 酰胺标准液用水溶解，经离心、滤膜过滤、鼬a t 2 卜x c 柱和e n v r2 次净化后l c m s 测 定。该法使用2 次s p e 净化样品可改善共存物干扰，提高信噪比。 1 4 结语 本章介绍了丙烯酰胺的物理化学性质、毒性、对人体健康存在的风险、产生机理及 检测技术。 近年来对丙烯酰胺的研究有了迅速的发展，但是达到满意的检测效果还有许多深层 次的因素需要考虑。德国b g v v 进行的丙烯酰胺实验室间协同实验研究，表明食物中痕 微量组分的分析测试有更深层次的复杂因素，如：生物样本组成变化幅度大，影响成分 的不定因素多，要考虑待测组分的化学性质和生化特性，还要考虑成分之间发生的化学 生物化学反应、酶促反应、基体效应等。食物源性接触丙烯酰胺对人类健康影响的评价 与分析方法的可靠性有直接关系，其定量评估更是依赖于检测结果的准确性。食物中这 i 一类痕微量物质的检验，需要从几个环节来把握才能得到满意地分析方法：样品的前处 理( 包括取样、待测组分的提取、富集、净化、分离) 、检测、测试数据的统计处理、 检测成本等。 根据上述已报道的丙烯酰胺分析方法来看，要提高痕微量丙烯酰胺检测方法的灵敏 度、准确度和精密度，要降低检测的成本，还需做大量工作。丙烯酰胺在食物中的微量 河北大学理学硕士学位论文 分析，当前仍没有取得在全球范围内既准确灵敏经济可操作执行，又有良好再现性的统 一方法，提供的各种分析方法还有待评价、验证和完善；丙烯酰胺的毒性及反应机理还 需要进一步的探讨。 1 2 第2 章二极管阵列检测器高效液相色谱法测定薯片中的丙烯酰胺 第2 章二极管阵列检测器一高效液相色谱法测定 薯片中的丙烯酰胺 摘要本文采用高效液相色谱一二极管阵列检测器测定薯片中的丙烯酰胺，采用甲醇提 取丙烯酰胺，低温处理和正己烷联合去除油脂及杂质，c 1 8 固相萃取小柱净化提取液， 以二极管阵列检测器测定其含量。检测限( l o d ) 为1 1 5 p g l ( g ，回收率在7 5 9 9 3 4 之间。相对标准偏差小于8 4 。 关键词丙烯酰胺；薯片；高效液相色谱法 2 1 引言 土豆是一种重要的农产品，深受世界各国人民的欢迎。8 0 的国家食用土豆，每年 的消耗量超过3 亿吨，仅次于小麦，玉米和大米。自2 0 0 2 年4 月，瑞典国家食品局愀) 和斯德哥尔摩大学( s t 0 c k h o l i n u l 】i v e r s i 奶的科学家的最新公布的研究结果表明，像油炸薯 条这类含有淀粉碳水化合物高的食物，经1 2 0 以上高温长时间烘烤、油炸，均检测出 有致癌可能性的丙烯酰胺( a c 巧l 锄i d e ) 【3 1 1 。研究者们证实在某些热处理食品中丙烯酰胺 的含量达到了m g l ( g 【2 5 】级。随即引起了世界各国食品业界的广泛关注。因此对薯片中 丙烯酰胺的研究具有重要意义。 长期接触丙烯酰胺能引起人类和动物的毒性反应，造成人体与动物神经系统的损害 【3 邸7 】，充分的证据表明，丙烯酰胺不仅对动物有神经毒性，还有生殖毒性、胚胎毒性、 致畸性和致癌性3 8 4 0 】。因此对薯片中丙烯酰胺的研究具有重要意义。 目前测定食品中丙烯酰胺的方法很多，经典的方法是高效液相色谱和气相色谱检测 技术【2 7 ，4 1 嘲】，但是采用最多的是色谱和质谱串联技术，例如h p l d _ m s 【3 1 4 5 问和 g c - m s 【4 7 1 。 采用g b m s 等检测器时，丙烯酰胺必须溴化衍生为o 【，b 二溴丙酰胺才能在检测器上产 生电信号作为定性和定量的依据【3 2 4 8 ，2 1 1 ，试样前处理中的溴化加成颇具技术性。溴的高 河北大学理学硕士学位论文 挥发性不仅对人体有毒对环境有害，不符合绿色化学的理念，溴化衍生还要求在减压条 件下进行，增加了对反应装置的要求，衍生化反应是否进行得完全彻底、是否会引进新 的干扰物又是决定整个分析准确性的关键步骤。 高效液相色谱法免去了衍生化反应【4 9 1 ，试样经过提取富集洗提，即可直接进样， 安全方便快捷。 本文采用二极管阵列检测器高效液相色谱测定薯片中的丙烯酰胺，采用甲醇提取 丙烯酰胺，低温处理和正己烷联合去除油脂及杂质，c 1 8 固相萃取小柱净化提取液，以 二极管阵列检测器测定其含量。去除油脂和干扰杂质是薯片样品处理中的关键环节，对 于保证实验的成功具有重要意义，各国科学家致力于薯片样品净化的研究，本采用低温 处理和正己烷联合去除油脂及杂质净化效果好，降低了干扰，简便有效，可作为样品净 化处理的方法，结果表明高效液相色谱法可以作为测定薯片中丙烯酰胺的一种方法。 2 2 实验部分 2 2 1 主要仪器和试剂 日本岛津l c 1 0 a 高效液相色谱仪，配s p d m 1 0 a v p 二极管阵列检测器，l c s o l u t i o n v e r l 1 1 色谱数据处理工作站；a g 2 4 5 型电子分析天平：恒温振荡器( 常州国华电器有 限公司) ；l 6 4 0 1 离心机( 吴桥电机厂) ：w h 8 6 1 变速混匀器( 太仓市科教器材厂) 。 丙烯酰胺标准，纯度不少于9 6 。薯片从超市购买。d 州i 1 8c 1 8 固相萃取小柱 ( s u p e l c o 公司提供) 。甲醇为色谱纯，正己烷为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。 2 2 2 标准溶液的配制 丙烯酰胺储备液的配制：准确称取2 5 m g 丙烯酰胺于2 5 n 儿容量瓶，用甲醇定容， 此储备液浓度为1 0 0 p 酌：i l l ，4 存放于冰箱中。 丙烯酰胺标准溶液的配制：将丙烯酰胺储备液分别配制为0 1 ，o 5 ，1 o ，5 0 ，1 0 o m g l 不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，4 存放于冰箱中，保存期为一个月。 2 2 3 色谱条件 色谱柱：日本岛津公司v p o d s ( 2 5 0 姗4 6 衄i d 5 ：流动相甲醇：水( 体积比 为5 ：9 5 ) ；流速o 8 m l m i n ：柱温为4 0 ；检测波长2 1 0 衄；全波长光谱扫描：进样体 】4 第2 章二极管阵列检测器一高效液相色谱法测定薯片中的丙烯酰胺 积l o 止。 2 2 4 实验方法 2 2 4 1 样品提取 称取1 0 0 0 9 薯片，研磨混匀，置于l o i 此的离心试管中，加入甲醇4 n 1 l 混匀2 分钟， 置于振荡器上振荡2 0 分钟，然后在4 0 0 0 r r n i n 下离心1 0 分钟，移取上层清夜。残渣再 用3 l l 甲醇萃取两次，萃取步骤同上，合并上层清液。 提取液4 0 氮吹至3 n 儿，放入4 的冰箱冷藏两个小时，4 0 0 0 转分下离心1 0 分钟， 移取上层清夜。 向提取液中加入3 m l 正己烷，混匀，4 0 0 0 r m i n 下离心1 0 分钟，同样的方法共萃 取三次。移除上层清液，4 0 氮吹至0 8 i n l 。 2 2 4 2 样品净化 将样品注入已预先用5 m l 甲醇、5 矗l 水、5 m l 甲醇预先处理过的d w i 1 8 固相萃 取柱，加入1 m l 甲醇淋洗2 次，收集样品流出液和甲醇淋洗液，4 0 氮气吹干，加入 1 m l 5 甲醇水溶液，混匀1 分钟，过o 4 5 岬滤膜，供高效液相色谱检测。 2 3 结果与讨论 2 3 1 提取溶剂的选择 本文比较了甲醇、水、丙酮对加标样品中丙烯酰胺的提取效果，发现用丙酮提取杂 质的响应值比较高，对丙烯酰胺的峰造成的干扰比较大，故不可取；丙烯酰胺在水中的 溶解度比在甲醇中的大，所以用水提取更充分，因此选用h p l c m s 检测时通常选用水 作为提取剂【3 2 3 5 2 2 7 ，5 0 ，5 1 1 ，但是同时提取的色素、糖类、食品添加剂等物质给样品净化带 来难度，干扰测定。丙烯酰胺在甲醇中也有很高的溶解度( 1 5 5 o 1 0 0 m l ) ，而且甲醇不 提取淀粉和多糖，能获得更澄清的提取液，更易浓缩，故用甲醇做提取溶剂。 2 3 2 冷藏 为了获得更澄清的样品溶液，增加了冷冻解冻操作【5 2 1 ，4 冷藏2 小时后，溶液中 出现絮状沉淀，离心后样品溶液比较澄清，得到的杂质峰较少。 2 3 3 脱脂 为考查正己烷萃取是否对丙烯酰胺有损失，对不同浓度的标准溶液和萃取过的标准 1 5 河北大学理学硕士学位论文 溶液分别进行测定，测定结果见表2 1 。由此可知用正己烷萃取对测定结果影响不大。 表2 1 正己烷萃取前后的测定结果 2 3 4s p b 柱的选择及条件化 本文比较了正相f l o r i s i l 和反相的e n v i 1 8 柱对样品的分离净化效果。 丙烯酰胺分子具有较强的极性，在e n v i 1 8 柱上不保留，极性弱的杂质保留在固相 萃取柱，从而分离达到净化样品的效果。为了确定最小淋洗体积，做了丙烯酰胺的流出 曲线，如图2 1 所示，从图中确定最小流出体积为3 m l 时，丙烯酰胺净化完全。 在0 1 一1 0 m i ，m i n 范围内调节s p e 柱流动相的流速，最后确定0 8 m l r n i n 为最佳流 速。 垂 d a 卫 口 e 正 孓 窘口王 o c o 芭口 芒 謦 o ? _ 工 z一 一 e i u t w i u m m l 图2 1 丙烯酰胺的流出曲线 我们也考察了f l o r i s i l 柱的净化效果。自制f l o r i s i l 固相萃取柱( 5 0 0 m d ，将1 m l 2 0 p p m 的丙烯酰胺标准溶液加入到预先处理过的s p e 柱中，预处理过程为6 i n l 体积比 为l ：4 的丙酮正己烷混合溶液，6 m l 体积比为1 ：1 的丙酮正己烷混合溶液，用6 1 m l 丙酮正己烷混合溶液洗脱，收集流出液和洗脱液，4 0 氮气吹干，体积比为1 ：1 的丙 1 6 第2 章二极管阵列检测器一高效液相色谱法测定薯片中的丙烯酰胺 酮正己烷混合溶液定容至1 m l ，上印? l c 检测。意外的是色谱图中没有丙烯酰胺的吸收 峰，更换极性更大的洗脱剂如：体积比为3 1 丙酮正己烷混合溶液、甲醇、水均未发现 丙烯酰胺的吸收峰。考虑原因可能是f l o r i s i l 和丙烯酰胺的极性都比较大，二者形成了紧 密的连接，以至于不能被上述洗脱液洗脱。 所以本实验选择d i 1 8 柱作为固相萃取，j 柱。 2 3 5 色谱分析 采用二极管阵列检测器可以在线扫描到丙烯酰胺的紫外吸收光谱图因此，我们可以 采用丙烯酰胺的保留时间和紫外吸收光谱图对样品峰进行准确定性。图2 2 为丙烯酰胺 的光谱图、图2 3 为丙烯酰胺的色谱图。 图2 2 丙烯酰胺光谱图 图2 3 丙烯酰胺色谱图 采用标准曲线法进行定量。将标准应用液分别配制为o 1 ，o 5 ，1 0 ，2 0 ，5 o m g l 1 7 河北大学理学硕士学位论文 不同浓度的丙烯酰胺标准溶液进样分析，以质量浓度( m g 】一) 为横坐标，以峰面积为纵坐 标绘制标准曲线。峰面积与质量浓度之间有良好的线性关系。标准曲线见图2 _ 4 。 线性方程：y 吒7 0 1 3 8 4 9 9 7 x ；相关系数：r 卸9 9 9 9 7 葛 与 c 叽c 曲蚯叽，卵m 图2 4 丙烯酰胺标准曲线 2 3 6 精密度 取0 5 m g l ，1 m g l ，2 m g l 标准溶液分别测定，每份溶液平行测5 次，计算平均值 和标准偏差，结果见表2 2 。 表2 2 精密度测定结果( n - 5 ) 2 3 7 加标回收率及变异系数 o o o o o o o o o o o o o o o o n o o o 口 o o o o o l o 5 o 墨 i 2 2 ， ， 第2 章二极管阵列检测器一高效液相色谱法测定薯片中的丙烯酰胺 对薯片分别添加不同浓度的丙烯酰胺标准品，每个平行做三份，测定。所得到的回 收率及r s d 值见表2 3 。 表2