（动物学专业论文）文昌鱼phgpx基因的鉴定、表达与进化分析.pdf

曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 摘要 头索动物文昌鱼被认为是从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中的一个重要 的过渡物种，是研究脊椎动物起源与进化的经典实验模型。它的基因序列和表达 模式被广泛的应用于比较基因组学研究以及发育同源性分析。 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶q ) h o s p h o l i p i dh y 出o p e r o x i d ec 摩x ；p h g p xo r g p x 4 ) 是在哺乳动物中发现的第二种含硒酶。是迄今为止发现的唯一能将膜过 氧化物还原成相应的羟基化合物，从而中止过氧化反应，直接保护生物膜免受过 氧化损伤的酶。对p h g p x 的系统研究主要是在一些较高等的脊椎动物( 如哺乳 动物) 中，而低等的脊椎动物和无脊椎动物中研究较少。 、本文从青岛文昌鱼肠c d n a 文库中，克隆了到编号为f 1 7 2 1 的c d n a ， b 狐s t p 结果显示其编码的蛋白可能是p h g 】陬，我们通过一系列的实验证明文昌 鱼中确实存在p h a p ) 【基因，并对其基因序列、表达模式和进化展开了研究。 首次从青岛文昌鱼中得到了克隆f 1 7 2 1 ，初步认为其是p h g p x 基因，其核 苷酸序列和氨基酸序列在n c b ig e n b a i l l 【中的接受号码为e i j 5 9 9 6 4 2 序列分析表 明，f 1 7 2 1 编码的蛋白具有p h g p ) 【家族的典型特征：具有三个保守区，这三个 保守区构成了p h g p ) 【的酶活中心。 系统进化分析显示文昌鱼p h g p x 的进化地位在无脊椎动物和脊椎动物之 间，提示p h g p x 的分化可能与5 5 亿年前脊椎动物和无脊椎动物的分化同步。 我们运用n o r t h e m 杂交技术检测了p h g p ) ( 基因在成体文昌鱼整体组织的 表达情况。p h g p x 仅有一个转录本，长度约为1 k b 。与文库中p h g p x c 饼寸a 克 隆片段的大小基本一致，这就说明此片段在文昌鱼中确实存在，即p h g 】p 】( 基因 在文昌鱼中确实存在。 切片原位杂交结果显示，青岛文昌鱼p h g 】阪基因在性腺( 卵巢和精巢) 、 肝盲囊、腮当中都有明显的转录信号，在肌肉中有微弱信号，而在脊索以及神经 管中没有信号。这不仅证明了p h g p x 基因在青岛文昌鱼中确实存在，而且显示 出其在文昌鱼中的表达有组织特异性。并且我们根据文昌鱼在不同组织中的表达 情况，对其功能进行了一些新的推测。 关键词：文昌鱼p h g p x 表达 曲阜师范大学2 0 。8 届硕士研究生毕业论文 a b s t r a c t a m p h i o 】s ，ac e p l l a l oc _ h o r d a 把，i s 吐l ec l o s e s t1 i v i i l gr e l a t i v et 0v e r t 醴i r a r t e ，a n dk l s b e e nw i d e l yk n o w n 觞也em o s ti i r l p o r 胁t 砌砌t 0s t u d y 也eo r i g i na n de v o l u _ t i o no f v e r t c i b r 疵：s i t sg e n e t i c 础白m l a t i o no ng e n es e q u e n c ea n de x p r e s s i o np a = mh a sb e e n 晰d e l y 吣e df o r 锄船渺i e sc o m 】珈碰i v eg e n o m es n 碰e sa n dd e v e l o p m e n t a l h o m o l o g ya n 乏l l y s i s i nt h i s p a p e r 也ec l o n i n g ，v e r i j e i c a t i o n ，【p s s i o n a n d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so fp h g 旧xg e n e 丘0 m 也eg u tc d n al i b 脚了o fa m 】p 1 1 i o x u s b m c h i o 女o m 姚e l i t i s i l l 舀a l l e ea r ec 两e d o l 醢 p h 0 s p h o l i p i d h y 出0 p e r o x i d eg l 纰n 址o n ep e 戚d a s e s p h g p x ) w e r e 矗m 西o n a l l y c h 嬲l c t e 比e d 嬲ap e c u l i a r t ) ，p e o fg l u t a “o n ep e r o x i d 嬲( c m 均r a d u c i l 玛 h y 血) p e r 0 ) ( i d e so f p h o 刚1 0 i i p i d sa n dc h 0 i e s t e r 0 1 p h g p x 丘a 位瞰由e di n t e r e s tb y i t s 幽脚t 0 酬yi n ：e 麟欢弧也p e r o 虹d 法迥l i p i d se v e ni f 也e c o m 曩e x 蛳d sa r e i n ：t e 铲a t e di nb i o m e m b 砌e s ，a n di th a s 也e r e f o r eb nc o 璐i d e r e dm em a i l ln n eo f 朗z ) ，m 丘cd e f e 】a s ea g a i l l s to ) 【i d 撕v eb i o m 朗1 b 黜ed e s t f u c t i o n s t u m e so fp h g 】p ) 【a r e m o s t l y 舶mm 黝m i a n ， h o w e v e ri n0 也e rv e r 晒b f a 据锄di n v 芒曛c i b i r a ：t et h e f ei so i l i y 勉r er e p o r t s t 、0 舢一l e n g t hc d n 舡( g e n b a n ka a c e s s i o nn m b e r ：e u 5 9 9 “2 ) e n c o 曲坞p h g p x w e r ei s 0 1 疵d 舶m 伍cc d n ah b r a r yo f 锄幽o x u sb r 趿c h i o 咖撇b d c h 耐 t s i i l 醇姗黜e t h ec l o n ei s9 4 3 b pl o 鸥a n de n d e s a f i l u l e n g 血s e q u 髓c ep r o t l 酹n 姗a lb l a s t ps e 砌a tn c b i 刚鲥e s 恤t 也ep r o t e 证h a sau 啦i l cf e a t u r eo f p h g p ) ( p r o 惦缸，a n ds h a r e s5 5 - 7 1 i d e n t 毋t 0d t h 盯b o 、) np h g p x 即t e 泌i ti s m u s 蛐e r c o m p a r e d 姒mo 出e rm e m b e r so fp h g p xf a 面l 弘 t 0v 硪矽慨也e p h g p xg e n ei s 鱼) m 锄p h i o x u s ，w ep e r f 0 蕊e dn o b l 地 删y s e s n o 曲e mb l o t t i n gr e v e 2 1 1 e s 也ep r e s e n c eo f as i l l 百eb a n do f10 0 0 b p 戗u l s 谢鸺 c 0 鹏罐) 0 n 血gt 0 也es 妇o ff l7 2 1 i i la d d i d o 玛i ns 如h y b r i d i z a t i o nl l i 咖c h e 血嘟 d e m o n 渤僦at i s s u e s p e c i 矗ce x p r e s s i o np 龇e mo f 也ec l o n ef17 21i na l 出0 x u s 仙也e s ee 出b i t 也a ：t 也ec l o n ef 1 7 2 1r e p r e s e n t s 锄锄出o x u sp h g p x g e n e t h e1 1 n - r 0 0 t e dp h y l o g e n e t i c 慨c o n s 讯l 酏c dl l s i n g 也ea m i n oa c i ds e q u c n c eo f n 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 啪出o x u sp h g p xp r o t e h l 扣1 dt h a to fo m e rh o w np h g p xp r o t e 妇的mv 撕o u s s p e c i e ss h o w e st 1 1 a t 也ee n v o l v e m e n tl o c 撕o no f 觚l p l l i o x l l sp h g p xi s b e t w e e n p h g - p x 脚i n s 缸1 0 mv 班b r a t e s 姐di r r v e m b r a ：t e s 1 1 1 i ss u g g e s t st ：h a t 廿1 e 击v e 唱e n c e o fp h g p xg e n e sp r o b a b l yo c c u r s 雠s 锄e 位m ct 0 也es p l i to fm 嘶e b r a t e v e n e b r a 土e 敏 mac o n l 】m o na n c e s t o ra r o u n d5 5 0m i l l i o ny e a r sa g o 1 1 1s i t uh y b d m z a ：t i o n1 1 i s t o c h 湎s 白叮 r e 、，e a l e sac 0 越1 p i 仪1 0 u s e ，p r e s s i o n o f a m p h i o x p h g p ) ( g e n ei nt 1 1 eg o n a d 沁l u 凼呜o v a 巧a n dt e s t i s ，g i l la n dh e p a l i c c a e c 吼，盟dh i n d g u ta i i di n 也em u s c l e n os i g n a l sa r es e e ni ne n d o s 锣l e ， n e u r a l t u b ea n dn o t o c h o r d ni sc l e a r 也a tp h g 】p ) 【g e i se x p r e s s e di i la m p h i o x l l si na t i s s u e - s p e c 蚯cm 锄e r t a k e n 也eh i 庐d e g r e eo fs e q u e n c ec o n s e r v a t i o n i _ c 0 c o n s i d e r a ：t i o 玛“i sh i 幽l i k e l y 缸tp h g p xp f o t e i nm a yp e 怕ms 0 m e 出i c a l 觚 皲c i a l 也e dp h y s i o l o 百c a l 如【n c t i o ni nd i 任打e n t 缸s s u e so f 缸n p h i o x u s h o 、e v e r ，也i s n e e d ss c u d ) 吨a t 也ep r o t e i nl e v e l k e y w o r d s ：缸叩h i o x u s 占翮如泌幻嬲p h g p x e x p r e s s i o n m 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 缩略语 加n p i c i l l 蛐 b p 圆a s e p 啪 b s a ( b o v i s e m ma l b l l m j n ) c d n a ( c o m p l e m 咖d _ n a ) d a ( d a l t o n ) d e p c i e t l l y lp y r o c a r b o m t e ) d m s o i n l e 蚂哇s u 怕虹d e ) 椰( d e o x 两b o n u c l e o s i d et r i p h 0 s p 嗡哟 d 丌( d i t h i o 伍r e i t 0 1 ) e b 皿d h i d i u mb r o 血d e ) e c o l t 幔s c h e n c h i oc o l d e d t a ( n 【y l e n ed i 锄i n 积魉班c 鲥ca c i d ) h ( h 0 ) k b ( 1 m o b 嬲c ) k d a ( l o d a l t o n ) 口t g ( i s o p r o p ) 帕1 i o n - b - d g a l a c t o s i d e ) m i n m 砥) m o p s ( 3 一( n - m o 啪o l i l l o ) p r o p a n e s 曲n i ca c i d ) 划 斟a 似e s s e n g e r 砌叮a ) o r f ( o p e n r e a d i j 唱血l m e ) u t r 0m 昀n s l a t c 通r e g i o n ) p b s ( p h o s p h a t eb u 删s a h n e ) p c r 口o l 珊e r a s ec h 血r e 捌o n ) r 1 1 p c r ( r - e v e r s et r a i l s 嘶p t a s e p c r ) 鼬妇e ( r n ae n z 肿e ) i p m v o l 血o np e rm i n u t e ) s d s ( s o 击u md o d e c y l 刚f a t e ) s e c ( s e c o n d ) 而s 叫s 一出o x m 础玲a m 如m e 也撇) v ( v o n a g e ) 氨卞青霉素 碱基对 牛血清白蛋白 互补d n a 道尔顿 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 脱氧核糖核昔三磷酸 二硫苏糖醇 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 小时 千碱基对 千道尔顿 异丙基硫代半乳糖苷 分钟 3 - 甜- 玛琳代) 丙黄酸 信使r n a 开放阅读框 非翻译区 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 逆转录酶一多聚酶链式反应 核糖核酸酶 每分钟转数 十二烷基硫酸钠 秒钟 三( 羟甲基) 氨基甲烷 电压 曲阜师范大学博士硕士学位论文原创性说明 ( 在口划“ ) 本人郑重声明：此处所提交的博士口硕士论文文昌鱼p h g p x 基因 的鉴定、表达与进化分析，是本人在导师指导下，在曲阜师范大学攻读博 士口硕士砑学位期间独立进行研究工作所取得的成果。论文中除注明部分 外不包含他人已经发表或撰写的研究成果。对本文的研究工作做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中已明确的方式注明。本声明的法律结果将完全由 本人承担。 作者签名： 曲阜师范大学博士硕士学位论文使用授权书 ( 在口划“ ) 文昌鱼p h g p x 基因的鉴定、表达与进化分析系本人在曲阜师范大学攻读 博士口硕士9 学位期间，在导师指导下完成的博士口硕士叮学位论文。 本论文的研究成果归曲阜师范大学所有，本论文的研究内容不得以其他单位 t 的名义发表。本人完全了解曲阜师范大学关于保存、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向有关部门送交论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅 和借阅。本人授权曲阜师范大学，可以采用影印或其他复制手段保存论文， 可以公开发表论文的全部或部分内容。 作者签名：，习希教 导师獬：勿身批 日期：昀7 臆h 日期：汐缈萝多，厂汐 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 文昌鱼p h g p x 基因的鉴定、表达与进化分析 一、文献综述 1 文昌鱼研究价值 1 1 文昌鱼简介 脊索动物门由三个亚门组成：头索动物亚门、尾索动物亚门和脊椎动物亚门。而文昌 鱼属于头索动物亚门。全世界现存头索动物亚门有2 9 种。最早发现的是主要分布在大西 洋东部和地中海沿岸的大西洋文昌鱼( 或欧洲文昌鱼，西溯幽砌物脚加d 砌z 删) 。此外， 分布广泛、研究较多的是分布于太平洋的白氏文昌鱼( 丑6 p 触州) 或称青岛文昌鱼( 晟 6 e ，c 办e ，f 括脚印孵瑚p ) ，以及分布于大西洋西部的佛罗里达文昌鱼( 丑加r 豇翻p ) 。 d f ， - 1 n t m ( 产- n c i 惑： 毒二e s - f i g 1 一ld 函s e c 6 0 no fa m p h j o x u s 图卜l 文昌鱼的解剖图 锄璐，肛门；出i o p o ，围鳃腔孔；a 椭皿，围鳃腔；c i f r i ，触须；d o r s a l 缸f ) ，背鳍；d 湖t i 妇l l 簦 粼c o r d ( n i 啪1t u b e ，n d ，背神经管；朋d o s t y l e ( e s ) ，内柱；印i p l 瑚弘酬伊0 0 v e ( e g ) ，咽上沟；g i l l k ( g b ) ，鳃棒；武蛳c e c u m ( h e p 砒i c 雠c 哦，h c ) ，中肠盲囊( 肝盲囊) ；m u 妣( m ) ，肌肉；础眺矾 ( n c ) ，脊索；o 豫l h 0 0 d ，口笠；p b 四，n 酬幽，鳃裂；p h 哪，咽；t a i l f m ，尾鳍；枷s ( t ) ，精巢； v 蹦吐_ a lf m ，腹鳍。b a 产1 0 0 u m 。 青岛文昌鱼b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u e n s e 体长约4 0 5 7 毫米；而美国产 的加州文昌鱼可长达1 0 0 毫米。如图卜l 所示，文昌鱼身体细长而侧扁，没有头的分化， 瓮 髻膨j 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 前端稍钝，后端较尖，像一把外科医生用的手术刀，因此西欧人称其为两尖鱼( a m p h i o x u s ) ， 或“海矛。文昌鱼全身粉红，呈半透明，有背鳍、尾鳍和臀鳍。它没有骨质的骨骼，只 有一条纵贯全身的脊索作为支柱。神经管在脊索的上方，其前端略微膨大，形成脑泡，是 脑的雏形。由于脊索向前越过神经管一直达到身体的最前端，故文昌鱼被称为头索动物。 在文昌鱼身体前端有一漏斗形的口笠，口笠的边缘有触须数十条，防止大沙砾进入口中。 口笠后面有咽，咽的两侧有垂直的鳃裂，文昌鱼的鳃裂不直接在体表开孔，而是被皮肤和 肌肉包裹，形成一对围鳃腔。腹部有颗粒状的生殖腺排列。腹前部两侧有纵褶，称腹褶。 腹褶和臀鳍的交界处有围鳃腔孔，或称腹孔。在腹孔后面臀鳍和尾鳍的交界处有肛门。 文昌鱼是营定居生活的滤食动物，神经系统不发达，运动能力不强，消化系统的功能 在其生命活动中占主导地位。文昌鱼大部分时间将身体埋在泥沙中，只露出身体的前端( 图 卜1 ) ，通过滤食系统和消化系统( 包括口、咽、鳃和肠) ，在水流经鳃裂到围鳃腔，再从 围鳃腔排出体外的过程中，就可完成赖以生存的呼吸和摄食两大基本生理功能。 文昌鱼为雌雄异体，2 龄时性腺开始成熟，性成熟时卵巢呈黄色，精巢呈乳白色( 图 卜2 ) 。卵巢和精巢都没有生殖导管，精、卵释放时是冲破鳃腔壁通过围鳃腔经腹孔排出体 外，在海水中受精发育。 图卜2 性成熟的青岛文昌鱼 1 2 发育生物学研究的模式生物一文昌鱼 文昌鱼作为分子发育生物学研究的模式动物主要有以下优点： ( 1 )文昌鱼为小型的半底栖生物，雌雄异体，繁育能力强。一条成熟的雌鱼每次可 排1 0 0 0 一5 0 0 0 个卵，卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快。 ( 2 )文昌鱼的胚胎和幼虫是完全透明的，使得研究者不仅能方便的观察其内部形态 结构，而且还可以跟踪观察每一个细胞的发育命运。 ( 3 )文昌鱼的胚胎发育具有典型性。文昌鱼的胚胎发育从受精卵开始，经历囊胚、 原肠胚、神经胚、幼虫等阶段。其囊胚期的发育类似棘皮动物，后面的发育时期又与脊椎 2 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 动物相似。 ( 4 )文昌鱼的发育事件及胚胎结构简单原始，与脊椎动物相比，研究文昌鱼的基因 表达图式更为容易。 ( 5 )发育周期短。文昌鱼1 天即可由受精卵发育成幼虫，性成熟期短，发育快，便 于观测其发育周期及监测与之相关的生化生理指标。 ( 6 )文昌鱼的成体呈半透明，形体结构也很简单，文昌鱼没有脊椎动物复杂的内脏 器官，器官少，且多是脊椎动物同源器官的原型。 ( 7 )文昌鱼个体小，养殖花费少，能大规模繁育，适于在实验室中培养。同时，室 内产卵技术的成熟为我们方便地收集到大量胚胎进行观察研究提供了便利。 由于上述原因，以文昌鱼为模式动物研究脊椎动物发育的机制是比较胚胎学和发育生 物学的重要内容，文昌鱼很快成为分子发育生物学家开展科学研究的新宠。文昌鱼代表着 从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中一个重要的过渡阶段，被认为是现存的与脊椎动物最 接近的无脊椎动物，在形态学和解剖学上看，文昌鱼可能是脊椎动物始祖的现存代表。此 外，来自分子进化研究的证据也揭示出头索动物是脊椎动物的姊妹类群。根据现存的低等 脊索动物的躯体构造看来，它们的原始祖先体内还没有坚硬的骨骼，所以很难在古代的地 层中留下化石，因而给探求和解决脊椎动物起源问题的工作带来了困难。因此，文昌鱼是 揭示脊椎动物起源从而进一步了解人类自身的宝贵材料，是研究生物进化和动物胚胎发育 的活化石。随着生命科学研究进入了分子生物学时代，对文昌鱼进行进化和发育的分子生 物学研究有着十分重要的科学价值口1 。 文昌鱼与无脊椎动物共同点文昌鱼与脊椎动物共同点 表皮为单层上皮，其外有角质层； 结缔组织不发达； 胚胎有纤毛，能在水中游泳； 许多器官有分节等 两者都有脊索； 都有位于脊索背部的神经管： 成体和胚胎均有鳃裂和肌节： 胚胎发生时期还有神经管和消化 道相通的神经肠管等特点嘲。 表l l 文昌鱼与脊椎动物和无脊椎动物的共同点 1 3 研究脊椎动物起源与进化的模式生物文昌鱼 文昌鱼的形体结构( b o d yp l a n ) 和胚胎发生与无脊椎动物有许多相似之处，同时， 又与脊椎动物有许多的共同特征，如表卜1 所示，这就从解剖学和胚胎学上说明文昌鱼是 无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类型动物。 在生物化学上，文昌鱼具有脊椎动物所具有的磷酸肌酸等物质，但却不具备脊椎动物 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 所有的血红蛋白。在生殖内分泌方面，国内外学者先后发现文昌鱼哈氏窝能够合成脊椎动 物促性腺激素样物质，体内存在促性腺激素释放激素与性腺周期呈正相关性，而且其性腺 中还存在着性类固醇激素。这就表明文昌鱼存在原始的生殖内分泌调控系统，即脑泡一哈 氏窝一性腺轴。 量i g u r e1 弓m o d e mp h y i o g e n e t cs c h e m 伪 t h e 锄p l 酶瞄i s 幽e da sas i s t c rg r o 唧t 0m cv 鲫e b f 眦s p 砌胁，ac 锄丽觚舡s i l i sb e l 研e dt ob e a 1 1 c e s n mt 0b ( m 锄蚵。舢鲫l dv e f 培s 图l o 现代系统进化图文昌鱼作为脊椎动物的姊妹类群。a 幻幻是一种寒武纪化石，被认为是文昌鱼 和脊椎动物的原始祖先。 另外，文昌鱼成为研究脊椎动物始祖的模式生物也得到了生物化石记录的强力支持h 1 凹3 。文昌鱼与脊椎动物已于5 2 亿年前就分开，其形体结构与寒武纪早期脊椎动物化石相 似，从中我们可以了解到文昌鱼在漫长的进化中并没有发生剧烈的变化以至于偏离其共同 始祖，而是相当的保守的。然而，尽管文昌鱼表面上很像现在的八目鳗，但它缺少脊椎动 物的许多关键的革新特征，如神经嵴、外胚层基板和内骨架。恰恰是由于这一点，我们可 以更好的了解基因在启动神经嵴的移动、骨架的形成、神经嵴的分化及其他组织的形成等 发挥的重要作用。 正如达尔文在他的著作物种起源中指出，文昌鱼的发现使人们看到了五亿年前脊 椎动物的模样。文昌鱼被认为是当今研究脊椎动物发育、起源和进化的新型模式动物。然 而，关于脊椎动物是如何起源于无脊椎动物的，仅靠形态学方面的证据还是不够的，还必 须了解形态学变化的遗传基础以及它们在发育中是如何引起这些变化的。人们利用分子生 物学手段对文昌鱼进行比较基因组研究、发育调控基因系统发生的研究，并结合比较解剖 学研究，慢慢得到了一些关于生物进化的答案，从核酸水平认识到文昌鱼在进化中的特殊 4 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 地位。 1 4 文昌鱼与基因组倍增理论 文昌鱼的基因组大小是人类基因组的1 7 ，而且相对于进化地位相近的尾索动物而言， 其异化较少3 。0 h n o 在1 9 6 7 年推测，在尾索动物从脊索动物原始祖先分化出来之后，在 头索动物和脊椎动物分化之前，头索动物( 文昌鱼) 和脊椎动物的基因组都发生了倍增， 而且很可能是通过多倍体化完成的。在过去的3 0 年中，人们广泛接受了o h n o 的基因组倍 增模型，并在这期间进行了一些细节的修订。脊椎动物在进化中经历了两次大规模的基因 倍增或基因组四倍化，其中第一次大约发生在脊椎动物起源时，即文昌鱼与无颌类分异之 间，另一次大约发生在无颌类到有颌类之间。 由于文昌鱼的全基因组尚未公布，到目前为止只有文昌鱼基因组中少数的基因组区域 ( g e n o m i cr e g i o n s ) 通过基因组系统发生方法( p h y l o g e n o m i ca p p r o a c h ) 而得到分析。这 些包括h o x 、p a r a h o x 和n l ( l 基因簇以及主要组织相容性复合体( 删c ) 域的一部分基因 家族被用于系统进化分析。 a l 懈l 甜g 3强酣潮p t e r t o f 广1 广1 广1 广1 e v x ae 、，) 圆 iliillllll iill a 吨盼甜骥滑寻骶瀚争叫删 。b 吨悟雕犸母眺掩母一 一c 一雕雏卜_ 鲁雕闻悟争一 d 吨卜毋争鲁雕鳙埝争r f i g u 他l - 4o r g a n i z a t i o no f 伍e 日n xd u s t e ro fa m p h i o x u sa n dm 8 m m a j s ，a n dt h ep r 懿u m e dd s t 盯o f t h e l a s tc o m m o na n c 幅t o ro f 雠p h a l o c h o r d a t e sa n dv e r t e b 瑚t e s 图1 - 4 文昌鱼与噫乳动物日缸基因簇的排列以及它们共同祖先可能的捧列方式 h o x 基因一直被当作研究不同物种之间共同发育机制的纽带，它是包含一类由同源异 型框基因( h o m e b o xg e n e s ) 组成的多基因家族，在所有h o x 基因的序列中都含有1 8 0 个非 常保守的碱基对，即同源异型框，可转录6 1 个氨基酸，决定胚胎前后轴的分化。根据氨 基酸序列分析，该基因所编码的蛋白质序列的第4 2 至5 0 位富含精氨酸和赖氨酸，这9 个 氨基酸片段被认为是与d n a 相结合的区域，此区域含一个螺旋一环一螺旋 ( h e l i x 1 0 0 p h e l i x ，h l h ) 结构域，具有转录调节因子特征，可以和d n a 结合对基因进行 调控。由于这类基因在进化过程中有极大的保守性并在动物胚胎发育过程中起重要作用。 鼬 耐泔 h 蚓 一 一 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 已成为分子胚胎学领域中的研究热点。哺乳动物共有3 9 个h o x 基因，形成4 个基因簇。 而文昌鱼有1 4 个h o x 基因位于同一条染色体上，只形成一个基因簇。据推测原始的h o x 基因应该是1 3 个，文昌鱼的h o x l 4 可能是文昌鱼独立复制的结果n 】。文昌鱼的其他1 3 个 h o x 基因在染色体上的组织方式与脊椎动物四个基因簇中基因的排列方式相似，分别同它 们相对应( 图卜4 ) 。 以h o l l a n d 对文昌鱼姗c 与人删c 的比较进化分析为例( 图卜5 ) ：文昌鱼仅有位于一 个染色体上的一个删c 区域，而人有4 个姗c 区域，且这四个姗c 区域分别位子不同的4 个染色体上。 嘲l d c c 鼬1 o p 翩 取g n l - 5s c h e m ef o rw o l u t i o no ft h em h c 妒n o m i cr e g i o na n do r g a n i j 强石o o ft h em h cg e n eo f 叠m p h i o x u sa n dh u m a n 图1 5 文昌鱼和人类脚基因的结构和系统进化图 研究脊椎动物的基因倍增和丢失的进化历史，以文昌鱼为一个外类群尤其重要。被囊 动物及原口动物的模式生物如果蝇( d r o s o p h i l a ) 和线虫( c a e n o r h a b d i t i s ) ，其基因组由 于经历了相当大的基因丢失，而且在进化过程中，原口动物较早的与后口动物发生趋异进 化阳1 。因此，利用它们的基因组来研究基因倍增不如文昌鱼适合。更重要的是在系统发生 分析中，文昌鱼的基因处于脊椎动物分化的基部，是现存的与脊椎动物亲源关系最近的无 脊椎动物口1 。鉴于文昌鱼的进化地位和没有广泛发生倍增的简单的基因组，文昌鱼非常有 助于揭示脊椎动物基因组结构和形成的进化历史。 2 文昌鱼的发现及研究进展 2 1 文昌鱼的发现及研究历史 文昌鱼最早是由德国动物学家p s p a l l a s 于1 7 7 4 年在英国南部的c o r 咖a l l 发现 6 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 并首次报道的。当时他认为是一种软体动物，所以定名为l i m a xl a n c e o l a t u s ，为蛞蝓属。 1 8 3 4 年，意大利动物学家0 g c o s t a 在意大利那不勒斯附近也采集到了文昌鱼，他认为 文昌鱼是一种低等的脊椎动物，和圆口类相近，并将属名更正为b r a n c h i o s t o 腿，b r a n c h i 是鳃的意思，s t o 腿是口，所以也称为鳃口类，这一属名一直沿用至今。1 8 3 6 年英国的w y a r r e l l 根据其两头尖的形状给出了它的普通英文名a m p h i o x u s1 a n c e 0 1 a t u s ( 译为双头 鱼) 做为文昌鱼的总称。 中国的文昌鱼最早向国外报道是在1 9 2 3 年，在厦门大学任教的美国学者s f l i q h t 在s c i e n c e 杂志上发表了厦门大学附近的文昌鱼渔业的报告，引起了国际上的轰动。 我国学者金德祥教授对文昌鱼资源进行了详尽系统的考察，并于1 9 3 3 年在菲律宾的生物 杂志上发表了首篇研究论文厦门文昌鱼的调查报告。1 9 5 3 年，金德祥教授将厦门文昌 鱼正式定名为屡r 鲫动j d s 芒溯6 p 动州g r a ym 】。从此，中国的文昌鱼逐渐闻名于世，吸 引了许多国外的生物学家和胚胎学家远渡重洋，来考察研究，采集标本，中国文昌鱼在世 晃上的影响力与日俱增。目前国内从事文昌鱼生物学研究的学者主要有海洋局三所方永强 教授、山大张红卫教授、中科院海洋所张培军教授、中科院生化和细胞生物学研究所g u oz y 、 c h e nh 和f e n g1 f m 、中山大学徐安龙教授、吉林大学w a n gs 、s h e nl 和z h a n gy j 以及中 国( 青岛) 海洋大学张士璀教授等，研究主要集中在文昌鱼生殖神经内分泌系统结构和功 能、胰岛素结构和进化、免疫系统组成以及中胚层和外胚层细胞发育分化等方面。 从文昌鱼被发现至今的两百三十多年中，文昌鱼的研究几经沉浮。 ( 1 ) 研究初始阶段早期的研究由于受科研技术和相关学科发展程度的制约，文昌 鱼的研究主要集中于形态观察、结构解剖以及胚胎发育方面的工作。胚胎发育( 个体发育) 一直被视为推测动物彼此之间进化关系( 系统发育) 的可靠线索之一。 最早对文昌鱼胚胎发育进行描述的是一位年轻的俄国胚胎学家b o k o v a l e v s k i i ，他 致力于文昌鱼发育的研究并撰写了文昌鱼发育史一书，从而揭开了系统研究文昌鱼的 序幕。他在1 8 7 6 年证明文昌鱼早期胚胎发育具有无脊椎动物的特征，如空心囊胚内陷形 成的原肠胚类似于海胆原肠胚；而它的晚期发育则出现类似脊椎动物的特征，如形成脊索 等。他的研究填补了无脊椎动物和脊椎动物进化之间的空白，驳斥了法国gc u r i e r 关于动 物界各门之间相对孤立的学说，为达尔文的进化论提供了有力的证据。 因此，达尔文对 文昌鱼的发现评价很高，他认为：“这是伟大的发现，它提供了指示脊椎动物起源的钥匙 。 在他著名的物种的起源中阐述了“文昌鱼的发现使人们看到了脊椎动物5 亿年前的模 样一。 ( 2 ) 1 9 世纪后叶高潮期在著名德国生物学家e 删h a c k e l 的普通形态学( 1 8 7 4 ) 的推动下，再加上当时组织学技术的发展，文昌鱼的研究达到空前的高涨，当时多数工作 主要集中在文昌鱼的胚胎发育和成体解剖学上。 ( 3 ) 2 0 世纪前叶缓慢发展期由于文昌鱼研究技术难有新的突破，研究的热情也随 7 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 之减退，文昌鱼研究论文的发表速度显著下降。1 9 3 7 年，中国著名的实验胚胎学家童第周 教授首次使实验室中培养的文昌鱼产卵成功，后来采用控制温度的方法延长了文昌鱼的产 卵时间，为更好的研究文昌鱼胚胎发育提供了条件。 ( 3 ) 2 0 世纪6 0 年代后再掀新高潮随着文昌鱼室内产卵技术的成熟和电子显微技术 的广泛应用，文昌鱼研究才重新掀起一个新的高潮。从2 0 世纪9 0 年代开始，分子生物学 技术的出现为文昌鱼的研究起了推波助澜的作用n 。1 9 9 2 年第一篇关于文昌鱼发育分子 遗传的论文发表n 幻，从而再次激发了人们研究文昌鱼的兴趣。今天，已有三十多家实验室 专门从事文昌鱼细胞生物学和发育生物学的研究，文昌鱼分子生物学、发育生物学、生物 化学的研究论文每年呈指数增长。各种先进的分子生物学手段如c d n a 文库的构建、 s ou ：血e mb 1 0 t 、n o r 血e mb 1 0 t 、i m p c r 技术、酶标技术、原位杂交的广泛应用，为研究文昌 鱼基因的结构、时空表达的模式以及阐明脊椎动物的进化和起源提供有力的证据n 朝。 人类基因组计划的实施和完成，迅速波及到了文昌鱼的研究。美国f o r i f 0 r d 文昌鱼的 全基因组测序已经于2 0 0 5 年由美国加利福尼亚洲的联合基因组研究中心完成。所有上述 国内外学者的研究结果集中表明文昌鱼可能是脊椎动物原始祖先的代表类型，具有脊椎动 物最简单的基因组( 尚未复制加倍) ，发育相关基因的表达模式代表脊椎动物原始类型n 们。 2 2 文昌鱼部分基因的研究进展 1 9 9 2 年h 0 1 l a n dp w h 等克隆了佛罗里达文昌鱼( 毋锄动j 舌溯口讲如p ) 砌脚f 砌稆 基因，并研究了它在文昌鱼胚胎发育过程中的表达图式，这是文昌鱼中克隆的第一个发育 调控基因n 钉。近十几年来，由于文昌鱼基因组文库和成体及胚胎c d n a 文库的构建以及p c r 等技术的应用，现在大量的文昌鱼基因在世界各地的实验室被克隆。目前，在g e n b a n k 中 能搜索到的文昌鱼基因有1 6 5 0 0 多个( 包括许多e s t 片段) ，其中有功能意义的文昌鱼基 因有6 0 0 多个。这些基因可依据不同的基因家族进行人为分组。根据基因在发育调控中的 作用，可以将文昌鱼有功能意义的基因大体可以分为2 类，一类是在发育调控中起重要作 用的基因家族；另一类是与发育模式调控或细胞分化没有直接关系的基因家族。这类基因 编码的蛋白质主要包括：与特异的细胞分化相关的蛋白、具有普遍代谢活性的蛋白或者是 在每个细胞中发挥“管家 ( h o u s e 妇p i n g ) 作用的蛋白。这些基因也可能在胚胎中表达， 但是它们的作用可能被限制在细胞命运决定以后的生命活动中。这类基因的数目比较多， 如与细胞的运动有关的基因家族：此l c - 口腩( 址a l im y o s i i ll i 出c h a 蛐，口c f f 疗，加6 ”，切和 抑d ，z 加复合体的两种成分。其他的已经被克隆到的基因编码的蛋白涉及到了钙调节蛋白、 几种酶、推导的转膜质子载体、延伸因子l a 、核糖体蛋白和r n a 蛋白质复合体等等， 如在g e n b 锄k 中能搜索的来自不同亚种的文昌鱼核糖体蛋白基因就有5 0 个( 包括3 0 个核 糖体大亚基基因和2 0 个小亚基基因) 。 8 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 3 ，磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶研究进展 硒( s e ) 是1 8 1 7 年瑞典学者b e r z e l i u s 发现的性质似硫的元素。直到1 9 5 7 年 s c h w a r z 和f o l t z 才证实s e 是动物必需的微量元素。硒与人类和其它动物的生长、发育 和疾病的发生有着密切联系。而其生物学作用主要通过硒蛋白来发挥。硒蛋白的研究已成 为当前国际上研究的热点，且近几年进展迅速。迄今为止在哺乳动物中发现的硒蛋白已达 4 0 余种，其中谷胱甘肽过氧化物酶家族是一类重要的抗氧化酶类。含硒的谷胱甘肽过氧 化物酶( 9 1 u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g p x ) 主要有四种，即细胞内谷胱甘肽过氧化物酶 ( g p x l ) 、胃肠谷胱甘肽过氧化物酶( g p x 2 ) 、细胞外谷胱甘肽过氧化物酶( g p x 3 ) 和磷脂氢 谷胱甘肽过氧化物酶( g p x 4 ) 。 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶( p h o s p h 0 1 i p i dh y d r o p e r o x i d eg p x ；p h g p xo rg p x 4 ) 是 在哺乳动物中发现的第二种含硒酶。1 9 8 2 年u r s i n i 等从猪肝脏和心脏中部分分离并描述 了一种新的抑制过氧化的蛋白质。1 9 8 5 年分离纯化并确定为含硒的谷胱甘肽过氧化物酶， 因它能特异性地使磷脂氢过氧化物还原，故名磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶n 5 】。与g p x 家族 的其它成员不同，p h g p x 是单体酶而非四聚体，它具有更小的体积和疏水性，可以直接作用 于细胞膜系统上的磷脂氢过氧化物，是迄今为止发现的唯一能将膜过氧化物还原成相应的 羟基化合物，从而中止过氧化反应，直接保护生物膜免受过氧化损伤的酶。磷脂氢谷胱甘 肽过氧化物酶其基因位于人类1 9 号染色体上，曾被认为是一种保护质膜的普通的抗氧化 酶，现在认为具有多种功能，与人类多种疾病如男性生殖、冠心病、克山病、炎症、动脉 粥样硬化、神经退行性变化、衰老等的发生发展有关。而其在细胞凋亡及癌症的辅助治疗 中的作用也是一个新的研究方向，有望在人类的肿瘤治疗等相关方面发挥作用。p h g p x 也 因此成为众多科学家研究的新星。 到目前为止，对p h g p x 的系统研究主要是在一些较高等的脊椎动物的物种中( 如人、 猪、牛、鼠等) ，一些低等的脊椎动物和无脊椎动物中研究较少，在头索动物文昌鱼中更 是未见报道。下面先介绍一下哺乳动物中p h g p x 的研究进展。 3 1p h g p x 的基因序列与氨基酸序列结构分析 k e l n e r l 等n 叼利用染色体fi s h 技术已将人类p h g p x 的基因定位于第1 9 号染色体的 短臂末端1 3 1 3 处，其基因全长2 1 8k b ，结构基因中含有7 个外显子，启动序列位于第1 外显子中，在其57 一非翻译区有数个激素反应元件，这可能与p h g p x 在睾丸中的功能有 关。p h g p x 只有第3 和第5 个外显子编码的氨基酸序列与g p x 序列有很高的同源性，与 g p x 相同，p h g p x 的硒代半胱氨酸残基也是由ug a 编码的，位于第3 个外显子中。n 锄等 n 力用c d n a 末端快速扩增技术从大鼠睾丸中分离出p h g p x 的c d n a 克隆，发现c d n a 编码 一段1 9 7 个氨基酸的多肽，在3 一ut r 内含有编码硒代半胱氨酸的密码子ug a ，ug a 既 是终止密码子又是编码硒代半胱氨酸的密码子，在肽链生成过程中，由3 一ut r 的茎环 曲阜师范大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 结构确定u g a 是引导硒代半胱氨酸的插入或是终止肽链的合成。 卜l j 厂lf 釜硼lfll l 谴堵：l 蠢5 f l g l - 6 s c h e m 蚶c p r 嚣e n t i t i 蚰o fr 砒星p 州a n ds u p p o s e d p r o m o t e 限t h ez 甜扩6 a 捌他印嚣c n t