（水生生物学专业论文）几种赤潮微藻的分子鉴定技术研究.pdf

上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位沦文作者签名：乃为红 h 期：御年6 月辂h 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 不保密d 文作：石盼艚撕签名：礅表 日期：矽沪年6 月f g 日 日期：枷年6 月悖日 上 姓名工作单位职称备注 赵金良上海海洋大学教授主席 _ i j _ - ，l _ j上海海洋大学教授委员 乔振国东海水产研究所研究员委员 王成辉上海海洋大学教授委员 程起群东海水产研究所副研究员委员 蒋科技东海水产研究所助理研究员秘书 答辩地点东海水产研究所答辩日期2 0 1 0 - 6 - 1 5 馥 上海海洋人学硕l 学位论文 几种赤潮微藻的分子快速鉴定技术研究 摘要 有害赤潮证成为越来越严重的全球性海洋灾害。赤潮微藻传统的分类鉴定主 要以形态学特征为基础，需借助显微镜对微藻进行鉴别，因而具有经验丰富的微 藻分类学专家才能胜任，因此不利于对大样品量的处理，不能达到快速检测的需 要。由于不同种属间基因的多样性，分子生物学技术常被用于赤潮微藻的分类和 鉴定。本文以环介导的恒温扩增技术( 即l a m p 技术) 和实时定量p c r 技术为研 究手段，对几种典型的赤潮微藻的快速检测和定量鉴定开展了研究。同时对目标 藻引物设计、筛选、验证开展了研究，并对这些引物进行了实验室验证以及初步 模拟现场样品检测。本文的主要研究内容和结果包括以下几个方面： 1 赤潮微藻基因组d n a 的快速制备研究。 本研究以塔玛亚历山大藻( a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) 、环状异帽藻 ( h e t e r o c a p s ac i r c u l a r i s q u a m a ) 和角毛藻( c h a e t o c e r o ss p ) 为研究对象，采用超 声波法、煮沸法和微波法等3 种方法分别对塔玛亚历山大藻( a l e x a n d r i u m t a m a r e n s e ) 、环状异帽藻( h e t e r o c a p s ac i r c u l a r i s q u a m a ) 和角毛藻( c h a e t o c e r o ss p ) 进行细胞破碎及快速制备基因组d n a 的研究。通过细胞计数和d n a 浓度测定的手 段对三种方法进行了比较，以选择适合不同藻种的细胞破碎方法。结果表明，塔 玛亚历山大藻和环状异帽藻用超声波法破碎效果较好：角毛藻用微波法较好。用 该三种方法制备的基因组d n a 做了p c r 扩增，电泳检测表明，与c t a b 法扩增效果 一样。本文建立的微藻d n a 快速制备方法有望应用在赤潮藻类的快速分子鉴定方 面。 2 环介导的恒温扩增技术快速检测几种典型赤潮微藻的研究 本研究以链状亚历山大藻似c a t e n e l l a ) 、微小亚历山大藻似m i n u t u m ) 、短凯伦 藻( 足b r e v i s ) 和微小原甲藻( 尸m i n i m u m ) 为研究对象，首先获得了四种目标藻的i t s 序列，然后对得到的序列和相近属种的其他微藻进行比对分析，选取合适的基因 片段设计引物，通过筛选，获得最佳引物。每种都以其他8 种藻作为阴性对照进 行l a m p 检测和以外引物f 3 b 3 进行常规p c r 扩增和测序，以验证目标藻的引物 特异性。同时，对目标藻的基因组d n a 进行一系列1 0 倍稀释，进行了敏感度检 测并与常规p c r 做了对比，得出链状亚历山大藻、微小亚历山大藻、短凯伦藻和 微小原甲藻的最低检测限度依次为5 6 p g 、4 5 p g 、s o p g 、3 6 p g ，敏感度比常规p c r 高1 0 1 0 0 倍。该方法引入肉眼检测的方法，阳性反应会出现白色混浊，与s y b r t r ：海海洋人学硕上学位论文 g r e e ni 反应呈现绿色，该检测方法简便且省去了胶电泳的过程。本研究所建立的 l a m p 技术特异性好，灵敏度高，稳定性好，重复性好，检测速度快，整个过程 在恒温6 5 。c 条件下，核苷酸的扩增和检测在1 个小时内即可完成，有利于处理大 量的样本；不仅可以对高浓度时的微藻样品进行快速检测，也可以对低浓度样品 进行检测。 3 实时荧光定量p c r 方法鉴定和定量检测环状异帽藻和微小原甲藻 首先获得了环状异帽藻和微小原甲藻的i t s 序列，然后对得到的序列和相近 属种的其他微藻进行比对分析，使用p r i m e re x p r e s s3 0 软件，以目标藻的i t s l 区 为靶序列设计特异性引物，通过筛选，获得最佳引物，并对引物进行了特异性验 证，以其他相近属种的9 赤潮微藻为阴性对照，以验证目标藻种的引物特异性。 同时，以超声波破碎藻液为模板，进行一系列1 0 倍稀释，进行敏感度检测，环状 异帽藻和微小原甲藻的最低检测限度分别为0 5 个细胞和o 1 个细胞。初步模拟 现场样品检测，以含目标藻超声波破碎藻液与其他藻液的混合物为阳性对照的模 板，不含目标藻的藻液混合物为阴性对照的模板，得出其他藻的藻液对目标藻的 r e a l - t i m ep c r 扩增没有影响。本研究r e a l t i m ep c r 的标准品采用超声波破碎所 得到的破碎藻液，以该标准品所得到的标准曲线，环状异帽藻的标准曲线方程为 尸一3 6 0 3 x + 3 2 5 9 8 ，相关系数为f f = o 9 8 9 ；微小原甲藻的标准曲线方程为 尸一3 2 7 7 x + 4 3 7 0 8 ，相关系数胙0 9 9 3 。以上述超声波破碎藻液为标准品定量未 知样品，结果显示，r e a l - t i m ep c r 定量结果与镜检结果吻合度很高。本研究所建 立的r e a l - t i m ep c r 方法，特异性好，灵敏度高，稳定性好，重复性好，检测速 度快，整个过程在2 个小时内完成，有利于处理大量的样本。对高浓度和低浓度 样本的定量检测都取得了理想的结果。 关键词：快速检测，l a m p 技术，r e a l t i m ep c r 技术，赤潮微藻，i t s 序列 i i s e n s i t i v ea n dr a p i d m o a b s t r a c t h a r m f u l a l g a lb l o o m s ( h a b s ) a r ei n c r e a s i n gg l o b a l l y t h e t r a d i t i o n a l c l a s s i f i c a t i o no fr e dt i d em i c r o a l g a em a i n l yb a s e do nm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，a n d r e q u i r e dm i c r o s c o p et oi d e n t i f ym i c r o a l g a e ，w h i c hn e e da ne x p e r i e n c e da l g a lt a x o n o m i c e x p e r t s s oi ti sn o tc o n d u c i v et oh a n d l i n gl a r g es i z eo fs a m p l e s ，a n dc a l ln o ta c h i e v e r a p i dt e s t i n gn e e d s b e c a u s eo ft h ed i v e r s i t yo fg e n e si nd i f f e r e n ts p e c i e sm o l e c u l a r t o o l sa r eo f t e nu s e df o rc l a s s i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o nm i c r o a l g a e i nt h i sp a p e r , a i m e d a tr a p i dc l a s s i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fn a b ss p e c i e s ，w ed e v e l o p e dl o o p m e d i a t e d i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ( l a m p ) a n dr e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c rt e c h n i q u e s e r i e so f s t u d i e sw e r ea l s ou n d e r t a k e nt od e s i g n ，s c r e e n ，a n dt e s tt h ep r i m e r s c o r r e s p o n d i n gt o t h ep r i m e r sd e s c r i b e da b o v e ，t h ea p p l i c a t i o np r o t o c o l sw e r ee v a l u a t e db o t hi nt h e l a b o r a t o r ya n di nt h ep r e l i m i n a r ys i m u l a t i o nf i e l d t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 r e l i a b l ea n dr a p i dg e n o m i cd n ae x t r a c t i o nm e t h o d so fr e dt i d ea l g a e t h e g e n o m i c d n ao fa l e x a n d r i u mt a m a r e n s e , h e t e r o c a p s ac i r c u l a r i s q u a m aa n d c h a e t o c e r o ss p w e r ee x t r a c t e du s i n gu l t r a s o n i c a t i o n ，b o i l i n ga n dm i c r o w a v em e t h o d s w em a d eac o m p a r i s o na m o n gt h r e em e t h o d sb yc e l lc o u n t i n ga n dg e n o m i cd n a c o n c e n t r a t i o ni no r d e rt oc h o o s es u i t a b l ec e l ld i s r u p t i o nm e t h o d sf o rd i f f e r e n ta l g a e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tu l t r a s o n i c a t i o nw a sa p p r o p r i a t ef o ra t a m a r e n s ea n d1 t c i r c u l a r i s q u a m a ，m i c r o w a v ef i tf o rc h a e t o c e r o ss p p c rr e a c t i o n sw e r ep e r f o r m e d w i mt h e s et e m p l a t e sp r e p a r e d b yu l t r a s o n i c a t i o n , b o i l i n g ，m i c r o w a v em e t h o d s r e s p e c t i v e l y t h ee l e t r o p h o r e s i sr e s u l t sw e r et h es a m e a sc t a b m e t h o d s t h er e s u l t s h a v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o no nt h er a p i di d e n t i f i c a t i o no f r e dt i d ea l g a e 2 al o o p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i c a t i o n ( l a m p ) a s s a yw a sd e s i g n e da n d e v a l u a t e df o rr a p i dd e t e c t i o no ft h et o x i cd i n o f l a g e l l a t e sa l e x a n d r i u mc a t e n e l l a ，a m i n u t u m ，k a r e n i ab r e v i sa n d p r o r o c e n t r u mm i n i m u m f i r s to b t a i ni t ss e q u e n c eo ft h e t a r g e ta l g a e ，t h e nc o m p a r et h es e q u e n c et os i m i l a ro t h e rr e l a t e dm i c r o a l g a eu s i n g m e g as o f t w a r et os e l e c tt a r g e tg e n e t h e nw ed e s i g np r i m e r s ，t h r o u g hs c r e e n i n gt o o b t a i nt h eb e s tp r i m e r l a m ps p e c i f i c i t yw a se x a m i n e di nc l o s e l yr e l a t e dt a r g e ta l g a e a n dm a n yo t h e ra l g a ea sac o m p a r i s o n ，s u g g e s t i n gt h es t r i c ts p e c i e ss p e c i f i c i t yo fe a c h l a m p o t h e rm e t h o dw a sp c ra m p l i f i c a t i o nu s i n gf 3 b 3p r i m e r sa n ds e q u e n c i n gt o v e r i f ys p e c i f i c i t y t h es e n s i t i v i t yo ft h i sl a m pa s s a yw a s10 - 1 0 0 一f o l dh i g h e rt h a nt h e p c r t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h el a m pa s s a yw a sf o u n dt ob e5 6p gd n ao fa c a t e n e l l as a m p l e ，4 5p gd n ao fa m i n u t u ms a m p l e ，5 0 p gd n ao fkb r e v i ss a m p l e i l l 卜海海洋火学硕士学位论文 a n d3 6 p gd n ao fp m i n i m u ms a m p l e t w ov i s u a li n s p e c t i o na p p r o a c h e sw e r ef e a s i b l e t oi n t e r p r e tt h ep o s i t i v eo rn e g a t i v er e s u l t s ，w h o s ep o s i t i v er e a c t i o na p p e a rw h i t e t u r b i d i t y , 、i ms y b rg r e e nis h o w e dg r e e n t h ev i s u a lm e t h o di ss i m p l ea n d e l i m i n a t e st h en e e df o rg e le l e c t r o p h o r e s i s t h ep e r f o r m a n c ec h a r a c t e r i s t i c so fs p e c i e s s p e c i f i c i t y ，s e n s i t i v i t y ，a n dr a p i d i t ys u g g e s tt h a tt h i sm e t h o dh a st h ep o t e n t i a l i t yo ft h e m o n i t o r i n g o ft h et o x i ca c a t e n e l l a ，a m i n u t u m k b r e v i sa n dp m i n i m u m 3 d e v e l o p m e n t o far e a l - t i m ep c ra s s a yf o r r a p i d d e t e c t i o na n d q u a n t i f i c a t i o no fh c i r c u l a r i s q u a m aa n dp m i n i m u m 。f i r s to b t a i ni t ss e q u e n c eo ft h e t a r g e ta l g a e ，t h e nc o m p a r et h es e q u e n c et os i m i l a ro t h e rr e l a t e dm i c r o a l g a eu s i n g m e g as o f t w a r et os e l e c ti t s1s e q u e n c ea st a r g e tg e n e t h e nw ed e s i g np r i m e r su s i n g p r i m e re x p r e s s3 0s o f t w a r e ，t h r o u g hs c r e e n i n gt oo b t a i nt h eb e s tp r i m e r r e a l t i m e p c r s p e c i f i c i t yw a se x a m i n e di nc l o s e l yr e l a t e dt a r g e ta l g a ea n dm a n yo t h e rm i e r o a l g a e s i g n a l so n l yf r o ms a m p l e st h a th a dc o n t a i n e dt a r g e ta l g a e ，a n dn o n s p e c i f i cs i g n a l sw e r e n o td e t e c t e df r o ma n ym i c r o a l g a e i nt h i ss t u d y ，w eu s e dc r u s h e da l g a eb yu l t r a s o u n da s t h es t a n d a r d s t a n d a r dc u r v e sw ee s t a b l i s h e d ，h a v eh i g hl i n e a r i t y , a n dc o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t 露w e r e0 9 8 9o fh c i r c u l a r i s q u a m a ，w h o s ee q u a t i o nw a sy = 一3 6 0 3 x + 3 2 5 9 8 a n dr 0 9 9 3o fp ，m i n i m u mw h o s ee q u a t i o nw a sy = 3 2 7 7 x + 4 3 7 0 8 m o r e o v e r , t h i sa s s a yc a nd e t e c t0 5 且c i r c u l a r i s q u a m ac e l la n d0 1 尸m h ；h n u mc e l l ， s h o w i n gi t sh i g hs e n s i t i v i t y t h ep e r f o r m a n c ec h a r a c t e r i t i c so fs p e c i e ss p e c i f i c i t y , s e n s i t i v i t y , r a p i d i t ya n da c c u r a c ys u g g e s tt h a tt h i sm e t h o dc o u l db es e r v e da sau s e f u l t o o lf o rr e dt i d ea l g a ed e t e a i o n k e yw o r d s ：r a p i dd e t e c t i o n ，l a m p ，r e a l - t i m ep c r ，r e dt i d em i c r o a l g a e ， i t ss e q u e n c e 1 v 上海海洋大学硕士学位论文 目录 第一章引言1 1 1 赤潮及其危害1 1 2 赤潮藻类传统的分类方法概述2 1 3 赤潮藻类分子生物学的分类方法2 1 3 1 藻类分子鉴定的基本原理2 1 3 2 r d i n a 及i t s 序列在藻类分类方面的应用3 1 3 3 荧光原位杂交技术3 1 3 4 三明治杂技术4 1 3 5 双特异探针技术5 1 3 6 实时荧光定量p c r ( r e a l t i m e p c r ) 技术6 1 3 7 l a m p 技术7 1 3 8 酶联免疫法( e l i s a ) 一8 1 4 研究内容及意义8 1 5 小结和展望8 第二章赤潮微藻基因组d n a 快速制备方法的研究1 0 2 1 材料与方法1 0 2 1 1 实验材料l o 2 1 2 实验仪器1 1 2 1 3 微藻的培养与处理1 1 2 1 4 细胞破碎方法1 1 2 1 5 d n a 纯度和含量的测定1 2 2 1 6 p c r 扩增1 2 2 2 结果与分析1 3 2 2 1 不同破碎方法对微藻细胞破碎效果的影响1 3 2 2 2 不同破碎方法下时间对微藻d n a 浓度的影响1 4 2 2 3 p c r 扩增1 5 2 ：；讨论1 6 2 4 小结与展望1 7 第三章环介导恒温扩增技术快速检测几种赤潮微藻方法的建立一18 3 1 材料与方法2 0 3 1 1 实验藻种2 0 3 1 2f 2 培养基配制2 0 3 1 3 显微镜观察2 l 3 1 4 基因组d n a 的制备2 l 3 1 5p c r 扩增及测序2 1 3 1 6l a m p 引物设计2 2 3 1 7l a m p 反应2 4 3 1 8l a m p 产物特异性验证和敏感度检测2 5 3 1 9 初步模拟现场样品检测2 5 3 2 结果与分析2 5 上海海洋大学硕士学位论文 3 2 1 显微镜观察结果2 5 3 2 2p c r 测序及序列分析2 6 3 2 3 内外引物比例优化2 8 3 2 4 敏感度检测2 8 3 2 5 特异性检测3 2 3 2 6 沉淀观察3 7 ：；3 讨论3 7 3 4 小结与展望3 8 第四章实时荧光定量p c r 方法检测鉴定赤潮藻类4 0 4 1 材料和方法4 1 4 1 1 实验材料。4 1 4 1 2 实验仪器4 l 4 1 3 舵培养基的配制4 1 4 1 4 显微镜观察4 1 4 1 5 基因组d n a 的制备4 1 4 1 6 p c r 扩增及测序4 2 4 1 7 r e a l t i m e r c r 扩增4 2 4 2 结果与分析4 3 4 2 1 显微镜观察结果4 3 4 2 2p c r 测序及序列分析4 3 4 2 3 环状异帽藻引物设计与特异性验证4 5 4 2 5 环状异帽藻r e a l t i m e p c r 标准曲线的建立和敏感度检测一4 7 4 2 6 微小原甲藻r e a l t i m e p c r 标准曲线的建立和敏感度检测4 7 4 - 2 7 环状异帽藻和微小原甲藻r e a l t i m e p c r 稳定性检测4 8 4 2 8 初步模拟现场样品检测4 9 4 3 讨论4 9 4 3 1r e a l t i m e p c r 方法的确立4 9 4 3 2 分类标准的选择5 0 4 3 3 标准品的制备5 0 4 3 4 标准曲线及敏感度5 1 4 3 5r e a l t i m e p c r 引物特异性及稳定性5 1 4 3 6 小结与展望51 第五章小结5 2 5 1 主要研究结果或结论5 2 5 2 研究的不足：5 3 5 3 本研究的创新点5 3 参考文献5 5 科研情况6 3 至l 谢6 6 上海海洋大学硕士学位论文 第一章引言弟一早 l 罱 1 1 赤潮及其危害 赤潮( r e dt i d e ) 又称为“红潮”，泛指是海洋中的浮游植物、原生动物或 细菌( 主要是甲藻类) 发生暴发性增殖或聚集，引起水体变色甚至发臭的一种异 常生态现象【l - 3 】。这是含义最广泛的历史沿用名，它包含所有能改变海水颜色的 有毒藻或无毒藻引发的赤潮，以及那些虽然生物量低又不能改变海水颜色，但是 却因含有藻毒素而具有危险性的藻华。近年来，一些科学家将那些造成直接危害 的赤潮，称为有害藻类水华( h a r m f u la l g a lb l o o m ，h a b ) ，而把一些无直接危害 的赤潮不归于此类。所以一些国际学术会议或论文、文件都用h a b 的字样。在 亚洲，特别是我国和日本仍使用赤潮一词【3 】。 赤潮本是一种自然现象，但在近2 0 年中其对公众健康及经济影响日益加剧， 频度、强度和地理分布都在增加【1 4 】。中国是世界上赤潮灾害的重灾国之一， 1 9 7 7 - - - 1 9 9 8 年间，仅大陆沿海就发生了3 1 5 次，香港水域发生4 8 4 次，平均每年 3 0 多次。自1 9 9 8 年至今，每年都发生了面积超过10 0 0 平方公里的特大赤潮； 据不完全统计，我国因赤潮而造成的经济损失每年在1 0 亿元以上，一次大规模 的赤潮可能会带来几亿元的直接经济损失【3 】。有些有害赤潮生物产生的毒素经贝 类或鱼类累积后危害人类的健康和生命；另外，赤潮频发也是大自然发出的一个 危险信号，它预示着赤潮发生区的海洋生态环境已经受到严重干扰，生态系统的 正常结构和功能已经或正在被改变。总之，赤潮已成为全球性的海洋灾害之一【5 】o 引发赤潮的生物统称为赤潮生物。除少数属于细菌和原生动物外，绝大部 分属于浮游微藻类，据不完全统计【6 】，海洋中有3 3 6 5 4 0 2 4 种浮游藻类，其中 赤潮种类约占6 0 ，分属1 2 个纲，1 8 9 2 6 7 个种，包括蓝藻门( c y a n o p h y t a ) 中的蓝藻纲( c y a n o p h y c e a e ) 3 4 个种；甲藻门( d i n o p h y t a ) 中的甲藻纲 ( d i n o p h y c e a e ) 9 3 12 7 个种；硅藻门( b a c h l a r i o p h y t a ) 中的中心硅藻纲 ( c e n t r i c a e ) 3 0 6 5 个种、羽纹硅藻纲( p e n n a t a e s ) 15 18 q 种；着色鞭毛藻门 ( c h r o m o p h y t a ) 的隐藻纲( c r y p t o p h y c e a e ) s _ 8 个种、针孢藻纲( r a p h i d o p h y c e a e ) 7 巧个种、金藻纲( c h r y s o p b y c e a e ) 6 个种、硅鞭藻( d i c t y o c h o p h y c e a e ) 2 种、定 鞭藻金藻纲( p r y m # e m o p h y c e a e ) g - 9 个种；绿藻门( c h l o r o p h y t a ) 中的绿藻纲 ( c h l o r o p h y c e a e ) 5 “个种、裸藻纲( e u g l e n o p h y c e a e ) 6 _ 8 个种、青绿藻纲 ( p r a s i n o p h y c e a e ) 5 个种。原生动物门( p r o t o z o a ) 中仅纤毛虫纲( c i l i a t e a ) 的红色 中缢虫( m e s o d n i u mr u b r u mk a h l ) 上海海洋大学硕士学位论文 为赤潮生物。赤潮藻的分类问题是海洋生物学和海洋生态学中研究赤潮的 基础，而赤潮藻的快速定量检测问题是防治赤潮方面的重点，也是目前研究的热 点之一。 1 2 赤潮藻类传统的分类方法概述 研究赤潮，进而预防和控制赤潮，最根本的问题是要明确引发赤潮的物种。 目前国际上公认的微藻鉴定的标准主要是依靠细胞的形态特征和生活史。传统的 赤潮生物样品检测分析方法，主要是借助光学显微镜观察。这种检测是以形态学 特征为基础进行识别，同时采用细胞计数板进行赤潮密度计数。这种方法在赤潮 生物的辨别和定量方面，一直发挥着重要的作用【1 】。光学显微镜方法明显的不足 在于，它要求经验丰富的赤潮藻分类学专家，因其观察范围涉及到整个赤潮生物 的种类，对大样品量的观察过程耗时费力，单调乏味，且显微镜观察不能区分赤 潮生物中形态相似的种类以及有毒和无毒的种类，也难以辨别不同生理状态的赤 潮细胞如死细胞和活细胞等。 扫描电镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，s e m ) 和透射电镜( t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p e ，t e m ) 是研究藻类的系统分类、形态学和生态学的重要工具。 其能够显示藻类细胞表面形态和内部结构的精细特征，成为赤潮种类鉴定的重要 手段，已成功地应用于海洋单细胞甲藻的研究和鉴定，包括那些能产生赤潮的种 类 7 - 8 。藻类样品含水量高，导电性差，必须经过脱水、干燥和导电处理后才能 在常规s e m 下的高真空条件下进行观察。生物样品经上述处理后，不可避免地 会产生一些人为变化，如样品收缩变形、出现结构假象等，这就使得观察到的往 往不一定是生物样品的本来面貌。电镜样品制备过程过于复杂，所需药品价格昂 贵且多数是剧毒和管制药品，并且其操作和识别速度较长，需要高级专门技术， 因此无法用于对大量赤潮样品进行监测。这些缺点限制了其在现场赤潮生物样品 检测中的实际应用。 1 3 赤潮藻类分子生物学的分类方法 1 3 1 藻类分子鉴定的基本原理 分子生物学方法由于其操作容易和结果直接可靠被广泛用在环境微生物群 体的测定和鉴别上，其工作原理如图1 所示。实际上，这种方法不单单适用于水 生环境，在许多的研究领域，如土壤、冰、蓝藻结皮，生物膜甚至于血液中都可 以应用【9 】。 2 上海海洋大学硕士学位论文 图1 - 1 通用分子鉴定方法流程图【9 】 f i g 1 - 1c o m m o np r o g r a mf o rt h em o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n 1 3 2r d n a 及i t s 序列在藻类分类方面的应用 核糖体r d n a 一般由转录区和非转录区构成真核生物转录区包括5 s 、5 8 s 、 18 s 和2 8 sr d n a 。其中18 s 、5 8 s 和2 8 sr d n a 基因组成一个转录单元，产生一 个前体r n a 。内转录间隔区i t s ( i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e ) 位于1 8 s 和5 8 s r d n a ( i t s l ) 之间以及5 8 s 和2 8 sr d n a 之间( i t s 2 ) ( 见图1 。2 ) 。目前，核糖 体d n a 的转录间隔区i t s 区、大亚基片断l s ur d n a ( 臣p 2 8 sr u q a ) 以及小亚基片断 s s ur d n a ( 耳i j l 8 s 对妊) 等基因在藻类研究中得到了广泛、有效地应用【l o 】。 核糖体r n a 及相关基因( i t s ) 广泛地适用于生物进化和生物分子标记等领 域。其具备如下优点：在生物细胞中大量存在，对蛋白质合成是必需的，其生 物合成量正比于细胞生长速度；这些基因容易分离和鉴定；在初级结构和次 级结构中同时具备高度保守区和可变区域；目前已建立了大量r r n a 的基因序 列数据库，这对基因序列的比较分析十分有用；与已发现的其它基因不会表现 出水平基因的转移现象【1 1 1 2 】。 图1 - 218 s 2 8 sr d n a 的基本结构，箭头示p c r 扩增所用引物【1 0 】 f i g 1 - 2s t r u c t u r eo f18 s 2 8 sr d n a , a l t o w sd e n o t et h ep r i m e r su s e df o rp c ra m p l i f i c a t i o n 1 3 3 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 技术是细胞学方 法与分子杂交技术相结合的产物，就是利用已标记的探针，在固定好的细胞或组 上海海洋大学硕士学位论文 织中定位及检测目的核酸序列的一种方法，探针是与目的序列互补的某段序列。 f i s h 技术是细胞生物学和分子生物学技术( 主要是分子杂交技术) 相结合的 产物，它主要是选择一个已知序列中特异的d n a 片段，用荧光材料标记后作为 探针与中期细胞的染色体或细胞核的d n a 杂交( 结合) ，在染色体上或细胞中显示 与荧光探针同源的d n a 片段的位置，从而将这个已知序列的d n a 片段定位在细 胞中。f i s h 技术不仅准确、快速、灵敏，而且简单方便，目前已经广泛应用于 细胞遗传学、产前诊断及肿瘤生物学等方面【1 3 】，最近人们又尝试将其应用在海洋 微型浮游植物及赤潮藻的定性、定量鉴定方面，也显示了良好的应用前景 1 4 q 5 1 。 f i s h 技术的基本实验流程见下图： 图l - 3f i s h 技术的基本实验流程 1 3 1 f i g 1 - 3t h eb a s i ce x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e o ff i s ht e c h n o l o g y 荧光原位杂交的特点在于，结合阳性和阴性对照，可以很容易地准确区分、 识别现场样品中的目标赤潮生物，也能对整个群落进行研究，同时样品的全细胞 形态学特征也是对探针检测结果进行验证的重要补充。但弱点在于其易受不同赤 潮生物形态和生理状态等因素的影响，如骨条藻、拟菱形藻和赤潮异湾藻等的链 状形态和聚生特性，导致细胞准确计数和杂交识别困难；裸甲藻等无甲板赤潮生 物全细胞形态完整固定和保存较为困难，且固定方法、脱色条件、低温保存和 r n a 降解等问题也制约着荧光原位杂交的应用效果【1 6 - 1 8 】。 1 3 4 三明治杂技术 三明治( s a n d w i c h ) 杂交法的理论依据是：把赤潮样品利用化学试剂进行裂解， 释放出细胞内容物，把前述特异性寡核苷酸探针和这些裂解释放出来的d n a 或 r n a 进行杂交结合，通过标记的探针和这些目标核酸分子发生结合而产生特异 性的检测信号从而对目标赤潮生物进行识别和定量。当然这种定量的前提是建立 4 上海海洋大学硕士学位论文 在赤潮藻细胞数量和裂解释放物质产生的荧光信号强度之间的定量基础之上 1 9 - 2 0 】。 s a n d