（蔬菜学专业论文）番茄抗青枯病生理机制及分子标记的研究.pdf

分类号： udc ： 密级： 苴 编 y 7 3 2 9 二5 位代码：! q 墨曼墨 号： 研究生学号： 番茄抗青枯病生理机制及分子 标记的研究 论文评阅人： 至臣垡辛 丞煎 i 五殖鲣数擅 i 斡! 垄狃盈k 答辩委员会主席：筮丛渲友迤 答辩委员会成员： 苤垒红垒勉篮。 3 拯醉玉堑邀 论文答辩日期： 致谢 本文是在寿森炎教授的精心指导下完成的，论文的试验设计、实施和定稿无 不凝聚着导师辛勤的汗水。先生认真严谨的治学态度和自由宽松的科研作风，为 我留下了深刻印象；先生平易近人、和蔼可亲的性格，使我可以畅所欲言；先生 渊博的知识和丰富的经验，使我受益匪浅。在此谨向导师致以崇高的敬意和衷心 的感谢! 感谢浙江大学园艺系曹家树教授、朱祝军教授、汪俏梅教授、张明方教授、 郭得平教授、喻景权教授、卢钢副教授、汪炳良副教授、余小林老师、向甸老师、 叶纨芝老师、钱亚榕老师和农学系胡晋教授等在学业和试验上给予的指导和帮 助! 感谢师弟苗立祥、陈旭艇、胡银松、谭亮萍、师妹谭芸、殷一平、任彦、张 聂、菜圃朱宝荣师傅、波师傅等在田间和试验上所提供的帮助! 感谢师兄刘扣生、黄锡志、张仁宾、牛贞福、吕剑、张金锋、魏国强、史庆 华、刘永华、周生茂、王华新、帅琪峰、姚祥坦、杨景华、张波，师姐冯莉、王 克霞、王玲平、崔辉梅、孙保娟、虞会芳、张瞍、洪薇、陈新娟、李娟、叶素芬， 湖北农学院园艺系老师刘乐承副教授、江西农大老师吴才君副教授等在实验过程 中所给予的指导和帮助! 感谢学友孟秋峰、黄细松、赵普庆、李红彬、董德坤、应泉盛、李春顺、付 杰、宰文珊、黄鹂、王玉清、庄晓英、师恺、孔祥礼、任明星、肖劲平、王玉坤 等，在三年的学习期间所给予的鼓励、关心和帮助! 特别感谢我的家人，感谢父母对我多年的抚育培养和无私奉献，他们一如既 往地支持我、关心我、爱护我、相信我；感谢我的兄弟姊妹，感谢他们的理解、 拥护和支持。 感恩之，心，无语言表! 在此，向曾经帮过我的所有人员和组织表示最忠心地 感谢，向他们致意我一一最深情的祝福! 冯壮志 2 0 0 5 年5 月写于浙大华家池畔 缩略词 e p s p g e g l p s h r p a l p o d p p 0 s o d s a r q t l b i a s r a p d r f l p a f i 。p s c a r b s a t r c k c a p s c m i s s r s s r 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文名 e x t r a c e l1u l a rp o l y s a c c h a r i d e p o l y g a l a c t u r o n a s e e n d o g l u c a n a s e l i p i dp o l y s a c c h a r i d e s h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e p h e n y l a n i d ea m m o n i a1 y a s e p e r o x i d a s e p o l y p h e n o l o x i d a s e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e s y s t c m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s m a r k e r a s s i s t e ds e l e c t i o n r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i ed n a r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n b u l k e ds e g r e g a t i o na n a l y s is t r e a t c h e c k c l e a v e d a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e c e n t i m o r g a n i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e m s i m p l es e q u e n c er e p e a t 中文名 胞外多糖 多聚半乳糖醛酸酶 内切葡聚糖酶 脂多糖 过敏感反应 苯丙氨酸解氨酶 过氧化物酶 多酚氧化酶 超氧歧化酶 系统获得抗性 数量性状基因座 分子标记辅助选择 随机扩增多态性d n a 限制性片段长度多态性 扩增片段长度多态性 特异性序列扩增 分群法 处理 对照 酶解扩增多态性序列 厘摩尔 区域简单重复序列 简单重复序列 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) 摘要 番茄青枯病又称细菌性枯萎病( b a c t e r i a lw i i t ) 是由青枯雷尔氏菌 ( r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) 引起的一种毁灭性土传病害。目前在我国的广东、广 西、江西、湖南、四川、福建、浙江等地发病严重。青枯病造成减产，是严重威 胁番茄生产的主要病害之一。由于迄今尚未找到防治此病的有效方法，所以番茄 抗青枯病的研究越来越受到人们的关注。 l 、为了研究番茄抗青枯病育种的生理基础，对差异很大的两个品种接种青 枯病菌( r a s t o n i as o a n a c e a r u m ) ，分析其品种间与防卫系统相关的动态变化 结果表明，受青枯菌侵染后，抗病品种t 5 1 a 的苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 活性高于 对照，而感病品种t 9 2 3 0 的却与对照一致；抗病品种t 5 l a 的超氧化物歧化酶( s o d ) 活性高于对照，其峰值比对照高1 6 1 2 ，而感病品种t 9 2 3 0 的却低于对照，其 峰值低于对照2 5 1 4 ；抗病品种t 5 1 a 与感病品种t 9 2 3 0 的多酚氧化酶( p p o ) 、 过氧化物酶( p o d ) 活性变化无明显差异；抗病品种t s l a 抑制叶绿素含量下降的 能力及保持较高胡萝h 素含量的能力明显强于感病品种t 9 2 3 0 2 、为了探索防治番茄青枯病的有效途径，我们对接种青枯病菌后的番茄进 行4 0 m e d l 浓度壳聚糖的不同方式处理。结果表明，喷施壳聚糖可诱导番茄对青 枯病产生抗性，减轻青枯病病情，经二次喷施后再喷微量元素的处理相对防效达 到4 8 7 6 。体内与抗病反应有关的苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 、多酚氧化酶( p p o ) 、 过氧化物酶( p o d ) 和超氧化物歧化酶( s o d ) 的活性峰值分别比对照高4 6 2 4 、 5 1 7 7 、1 2 1 2 2 、3 6 4 9 。同时壳聚糖处理的番茄，叶片中叶绿素含量明显高 于正常接菌植株。 3 、用番茄高抗青枯病品种“t 5 1 a ”与高感青枯病品种“t 9 2 3 0 ”配制杂交组 合，接种鉴定其正反交f l 代及f 2 代分离群体的青枯病发生情况，结果表明，t 5 1 a 对青枯病的抗性属于细胞质遗传，受1 对杂合基因加性控制。用6 4 个e c o ri m s e i 引物组合对“t 5 1 a ”、“t 9 2 3 0 ”两个亲本及其f 2 代抗病和感病基因池进行a f l p 分析，共扩增出约4 2 0 0 条可分辨的带，其中2 条为稳定的差异。用“t 5 1 a ”和 “t 9 2 3 0 ”杂交产生的f 2 代分离群体对2 个特异条带与目的基因的遗传连锁性进 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) 行分析，发现特异条带a a g c a t 与暂定名为r r s - 3 4 2 的抗青枯病基因紧密连锁， 二者之间的遗传距离为6 7 c m 。将a a g c a t 片段回收、克隆和测序，成功地将其 转化为s c a r 标记，可以更加方便地用于对番茄青枯病基因的标记辅助选择。 关键词：番茄；青枯病；壳聚糖；酶；扩增片段长度多态性( a f l p ) ；抗性基因 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) a b s t r a c t t o m a t ob a c t e r i a lw i l t ，ad e s t r u c t i v ed i s e a s e ，i sc a u s e db yr a l s t o n i as o l a n a c e a r u m i n t r u d e d i ti s s p r e a d i n gf r o mg u a n g d o n gp r o v i n c et o a l m o s ts o u t h e r na r e ai no u r c o u n t r yn o w b yn o wa n e f f e c t v ea p p r o a c h ，p r e v e n t i n gt o m a t ob a c t e r i a l w ii t h a s n tb e e nf o u n ds ot h a tp e o p l ew i l lc o n c e mt h es t u d yo nt o m a t ob a c t e r i a lw i l t m o r ea n dm o r e 1 t or e s e a r c ht h eb a s i cp h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s mi nr e s i s t a n tt o m a t o b a c t e r i a lw il t ，w ei n o c u l a t e dr e s p e c t i v e l yt h er e s i s t a n ta n ds u s c e p t i b l e t o m a t oc u l t i v a rs ot h a tw ec o u l ds t u d yd i f f e r e n tt o m a t oc u l t i v a r so ft h e d y n a m i cc h a n g e s i nt h ea c t i v i t i e so ff o u r e n z y m e s wjt hr e l a t e dt o r e s i s t a n c e t h er e s u l t st h a tt h ep h e n y l a n i n ea m m o n i al y a s e ( p a l ) a c t i v i t yo f t 5 1 a ，ar e s i s t a n tc u l t i v a r ，w e r es t r o n g e rt h a ni t sc o n t r o l ( c k ) w h il e t 9 2 3 0 ，as u s c e p t i b l eo n e ，i s t h es a m ea si t sc o n t r o l ( c k ) ，w h e nt h e yw e r ei n f e c t e db yr a s t o n f as o l a n a c e a r u m t h er e s i s t a n t c u l t i v a rh a sh i g h e ra c t i v i t yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) t h a ni t s c o n t r o l ( c k ) ，w h i c hp e a kv a l u ew a s i n c r e a s e db y1 6 1 2 b u tt h es u s c e p t i b l e o n ei si n f e r i o rt oi t sc k ，w h i c hp e a kv a l u ew a sd e c r e a s e db y2 5 1 4 t h a n c k t h ea c t i v i t yo fp e r o x i d a s e ( p o d ) a n dp o l y p h e n o l o x i d a s e ( p p o ) w e r e n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nr e s i s t a n tc u l t i v a ra n ds u s c e p t i b l e c u l t i v a t t h ec a p a c i t i e so fr e s i s t a n tc u l t i v a ri ni n h i b i t i n gc h l o r o p h y l l d e t e r i o r a t i o na n dm a i n t a i n i n g h ig h e rc a r o t e n o i dc o n t e n t w e r e s i g n i f i c a n t l ys t r o n g e rt h a nt h o s eo fs u s c e p t i b l ec u l t i v a r 2 t os e a r c ha ne f f e c t i v ea p p r o a c ht op r e v e n t i n gt o m a t ob a c t e r i a l w ii t ，c h i t o s a nw e r es p r a y e d i nt o m a t oi n o c u l a t e d w i t hr a l s t o n i a s o a n a c e a r u m , t os t u d ye f f e c to fc h i t o s a no nb a c t e r i a lw i l td i s e a s ea n d r e s i s t a n c em e c h a n i s m t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc h i t o s a ns p r a yi n d u c e d t o m a t or e s i s t a n c e t ob a c t e r i a lw ii ta n d r e d u c e dd i s e a s ei n d e x t h e r e l a t i v ec u r ee f f e c to ft h et r e a t m e n t3 ，i nw h i c hc h i t o s a nw a ss p r a y e d t w i c e 塑兰查堂堡主堡墨! ! ! 塑! a n dj i d u o j i n go n c e ，r e a c h e d4 8 7 6 t h e p e a kv a l u eo fa c t i v i t i e so ff o u r e n z y m e s ，i e ，p h e n y l a n i n ea m m o n i al y a s e ( p a l ) ，p o l y p h e n o l o x i d a s e ( p p o ) p e r o x i d a s e ( p o d ) a n ds u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，r e l a t e dt or e s i s t a n c ei n t r e a t m e n t3i n c r e a s e dr e s p e c t i v e l yb y4 6 2 4 ，5 1 7 7 ，1 2 1 2 2 ，3 6 4 9 t h e c o n t e n t so fc h l o r o p h y l li nl e a v e so ft o m a t oa f t e re h i t o s a n s p r a yw e r e s f g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo fn o r m a li n o c u l a t i o nt o m a t o 3 ac r o s sb e t w e e nb a c t e r i a lw ii tr e s is t a n tt o m a t ov a r i e t y “t 5 i a a n d s u s c e p t i b l ev a r i e t y “t 9 2 3 0 ”w a sm a d ef o r m a p p i n g b a c t e r i a lw i l t r e s i s t a n c eg e n e ( s ) t h r o u g hi n o c u l a t i o nt e s to fi t sf la n df 2 p r o g e n y ，i t i sp r o v e dt h a tt h er e s i s t a n c eo f “t 5 1 a ”t ob a c t e r i a lw i l ti sc o n t r o l l e d b y o n e h e t e r o z y g o u sg e n e a n d c y t o p l a s m w i t h6 4e c o ri v i s e i p r i m e r c o m b i n a t i o n s ，a f l pa n a l y s i sw a sp e r f o r m e do nt w op a r e n t sa n dt h e i rf 2 r e s i s t a n ta n ds u s c e p t i b l eb u l k s ht o t a lo fa b o u t4 2 0 0d i s t i n g u i s h a b l e b a n d sw e r ea m p l i f i e d ，o fw h i c ht w ow e r es t a b l e g e n e t i c1 i n k a g ea n a l y s is o f t h et w o p o l y m o r p h i cd n af r a g m e n t sw i t ht h er e s i s t a n c eg e n e ( s ) w a s t e s t e di nt h e f 2s e g r e g a t i n gp o p u l a t i o nd e r i v e df r o mt h ec r o s sb e t w e e n “t 5 1 a ”a n d “t 9 2 3 0 ”t h ed n af r a g m e n ta a g c a tw a sf o u n dc l o s e l y1 i n k e d t oo n eo ft h eb a c t e r i a lw i l tr e s i s t a n tg e n e s ，w i t hag e n e t i cd i s t a n c eo f 6 7 c m ，t h a tw a st e n t a t i v e l yn a m e dr r s - 3 4 zt h ec l o n e df r a g m e n ta a g c a t w a ss e q u e n c e da n dt h e ns u c c e s s f u l l yc o n v e r t e dt oas c a rm a r k e r ，w h i c hc a n b eu s e dm o r e c o n v e n i e n t l y i nm a r k e ra s s i s t e ds e l e c t i o nf o rt o m a t o r e s is t a n c et ob a c t e r i a lw i l t g e n e k e yw o r d s ：t o m a t o ；b a c t e r i a lw i l t ；c h i t o s a n ；e n z y m ea m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ( a f l p ) ；r e s i s t a n c eg e n e 6 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) 第一章文献综述 1 番茄青枯病菌的研究进展 番茄青枯病又称细菌性枯萎病( b a c t e r i a lw i l t ) 是由青枯雷尔氏菌 ( r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) 引起的一种毁灭性土传病害。在世界范围内，青枯菌 可侵染4 0 多个科2 0 0 多种植物，其寄主范围之广仅次于农杆菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) 。青枯菌弓l 起的青枯病是番茄、马铃薯、花生、烟草、辣椒、茄子、 生姜、香蕉等许多重要农作物的生产限制因素，世界各地均有分布【1 1 。多数农作 物旦受青枯菌侵染就表现枯萎症状，即基本失去产量或经济价值，造成很大经 济损失。而且青枯病作为土传性病害，至今仍无有效的防治途径，所以它越来越 成为世界关注的难题。 1 1 青枯病菌的分类 青枯病从发现至今已有1 3 0 余年的历史，1 8 6 4 年印度尼西亚首先报道在烟草 上引起毁灭性的损失。随后，美国、澳大利亚也分别报道了马铃薯和番茄的青枯 病。1 8 9 6 年美国e r w i ns m i t h 将其病原物定名为青枯假单胞杆菌( p s e u d o m o n a s s o l a n a c e a r u m ) ，1 9 9 2 年，y a b u u c h i 等根据d n a - - d n a 、d n a - - r n a 分子杂交， 以同源性分析为基础，建议将其列入：b e r k h o l d e r i as o l a n a c e a r u m ( s m i t h ， 1 8 9 6 ) c o m b n o v 。通过大量工作，对1 6 sr r n a 基因组的序列测定和聚类分析， 1 9 9 5 年建议列入：r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ( s m i t h ，1 8 9 6 ) c o m b c o v ，与b u r k h o l d e r p i c k e t t i i 和a l c a l i g e n e se u t e r o p h u s 同一属。 r s o l a n a c e a r u m 下又可分为许多个复杂的菌系目前已形成两个国际公认的 亚分类系统。一是根据寄主范围将其划分为4 个生理d , 种( r a c e ) 。r a c el 危害多 数茄科植物，包括番茄、马铃薯、茄子、烟草等，还危害其它科植物；r a c e2 能侵染香蕉、海里康( h e l i c o n a i s ) 和大蕉：r a c e3 主要危害马铃薯，也可弱侵染烟 草和番茄；r a c e4 侵染姜以及弱侵染马铃薯等其他植物2 3 】。另有人将从我国南 方桑树上分离到的菌株列为r a c e5 【4 】，我国番茄青枯菌主要为r a c el 。二是根据 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) 不同菌株对3 种双糖和3 种己醇氧化产酸能力的差异，将青枯菌划分为5 个生化 变干中( b i o v a r ) 2 1 5 】。番茄青枯菌属b i o v a r3 和4 。生理小种与生化变种之间无绝对 关系，但r a c e3 只含b i o v a r 2 【6 】。 b u d d e n h a g e n e 等( 1 9 6 2 ) 茅1 l o g a n o ( 1 9 7 0 ) 根据寄主反应的差异将青枯病菌分 为3 个生理小种，番茄为生理小种i 、i l l ( 生理小种i i i 侵染能力 l 毛) ；h a y w a r d ( 1 9 6 4 ) 则根据青枯病菌对3 种糖( g l 糖、麦芽糖、纤维二糖) 三种酸( 甘露酸、山梨酸、甜 酸) 6 种碳水化合物的利用情况将其分为4 个生化型。1 9 8 3 年何礼远等在在我国 又发现了生理小种4 和生化型v ，我国番茄青枯病生化型以i i i 为主，其次为i v ， 极少数为2 ，生理小种大多数属生理小种1 ，少数为生理小种3 ( 吕善勇1 9 9 3 ，林 美琛1 9 9 3 ，康耀卫1 9 9 5 ，徐世典1 9 9 1 ) 。广东省农科院霍超斌等( 1 9 8 5 ) 将番茄 青枯病菌分为9 个致病型。 1 2 青枯病菌的致病机理 对r s o l a n a c e a r u m 的致病因子研究，国内外已有许多报道。主要涉及到胞外 多糖( e p s ，e x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e ) ，果糖酶( 主要是多聚半乳糖醛酸酶， p o l y g a l a c t u r o n a s ep g ) 以及纤维素酶( 主要是内切葡聚糖酶，e n d o g l u c a n a s e ，e g ) 在致病中的作用。青枯病的毒性成分中含葡萄糖、甘露醇和多肽，另外根线虫的 侵染能加剧青枯病的发病速度和程度，可能线虫改变了寄主的组织结构利于青枯 病菌的繁殖。尽管报道结论不尽相同，但较为一致的观点是：e p s 是致病的重 要因子，但不是唯一的。其能阻塞导管，特别易于对叶柄结和小叶处较小孔径的 导管穿孔板造成堵塞，影响和阻碍体内水分运输，从而引起植株萎蔫【7 】。另有人 认为e p s 主要通过影响病菌在植株体内的系统定殖，而对青枯菌的致病性起间 接作用，此外e p s 还可阻止青枯菌菌毛和植物细胞壁结合。从而不能激发寄主 的防卫反应【钔。然而也有人对e p s 的致病重要性持相反观点。p g 和e g 这两 种酶在青枯菌致病中有一定作用1 2 】。已经清楚的是e g 能影响病害发展速度【4 l ， 而p g 是青枯菌迅速侵入植物根系和体内定殖所必须的【8 】 但它们在致病中的真 正作用还未完全弄清。 青枯假单胞菌产生的胞外多糖e p s 与其他植物病原细菌不同，是由非常复杂 的多糖所组成的混合物，两种主要成分分别占4 0 ：一种酸性异聚糖和一种亚组 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) 分，亚组分中葡萄糖和甘露糖按l ：4 组成。青枯假单胞菌中e p 8 既可以被分别 调控，也可以作为致病性调节因子部分由致病相关的胞外酶调控；p h c a 是更为 复杂的调控系统并与其他e p s 合成基因发生关联。 青枯病症状主要表现为植株脱水萎蔫，其中胞外多糖能使植株产生典型的 萎蔫症状。早在2 0 世纪6 0 年代i b u d d e n h a g e n 就注意到培养基上e p s 产量与细 菌的致病性强弱呈正相关，并且发现e p s 粗提液能使番茄枝条萎蔫。t p d e n n y 等利用转座子诱变得到e p s 一突变体，对此突变体的研究表明，e p s 是引起萎蔫的 重要因素，大量的e p s 阻塞了导管从而影响了寄主水分输送。对寄主导管组织的 显微观察也表明了这一点。e p s 产量降低则细菌的致病性也减弱，也有人曾发现 一些突变体e p s 产量降低但仍具有很强的毒性。c c k a o 等解释这主要有两个原 因：1 接种浓度过高，从而掩盖了突变体与野生型之间的差异；2 培养基上e p s 产量不一定与植物体内完全一致。e l k e l 认为青枯假单胞的e p s 在细菌的侵入和 定殖过程中起重要作用，e p s 产量低的突变体对番茄幼苗的侵入能力也降低且定 殖慢，而且在寄主内扩展面积远低于野生型。 2 番茄抗青枯病的作用机制 2 1 寄主与病原菌的识别 寄主植物识别细菌的主要组分是脂多糖( 1 i p i dp o l y s a c c h a r i d e s ，l p s ) ， 丰富的胞外多糖对寄主的识别作用有遮掩作用。另外是e p s 由于阻止了被植物组 分的固定而有助于细菌在植物中的系统运动。ls e q u e i r a 研究青枯假单胞不同 小种与烟草的相互作用以及e p s 和l p s 对细菌激发烟草过敏反应中的关系。1 9 8 8 年他与杨等证明e p s - 突变体可以被植物细胞壁组分快速凝集，而e p s 会阻止这 种凝集作用。 青枯病菌通过附着在番茄根表面，后侵入根的皮层和维管束薄壁组织，逐渐 向木质部蔓延、扩展。其后，病原细菌产生蛋白质( 酶) ，使木质部水分输导功能 减弱，引起寄主发生萎蔫症状。 青枯病菌对寄主的抗性反应，一般通过烟草能观察到过敏感反应 f h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，h r ) 。但是，抗性番茄品种的青枯病原细菌侵入植 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) 物体内，不表现病症。这种情况表示h r 以外的抗性反应发生在病原细菌存在的 抗性番茄品种的本质部。 中保等把抗性砧木品种在无病症表现情况下，植物体内青枯病菌的发生动态 与感病性品种进行了比较分析，病原细菌的检出率与增殖量，抗性砧木品种从感 染部位向主根上移至茎部逐渐降低，并且这种现象随苗龄越大、栽培温度及接种 细菌浓度越低则越显著。通过高浓度钙处理也可提高其抗性。利用抗性砧木嫁接 番茄，由于砧木具有这样的抑制能力，抑制青枯病菌从砧木向接穗转移而不发病。 在植物体内青枯病菌的转移与增殖受至q 抑制，在抗病的烟草、马铃薯、茄子、辣 椒上也能看到，这些茄科植物对青枯病均有共同的抗性反应。 2 。2 组织结构抗性 结构性抗病因子：主要指植物表面角质层和细胞壁的厚度和组分。其功能是 限制和阻碍病菌侵入。由病菌诱导合成的凝胶、侵填体和栓质可以使植物体的大 部分免受其害；胼胝质、富含羟脯氨酸的蛋白质和木质素的沉积有减慢病菌繁殖 速度的作用。但也有例外，有些感病植物也产生凝胶、侵填体等。有人认为这是 病菌降解植物组织而产生的病症，与抗病无关。然而，多数人认为这些变化是植 物阻止病菌和分生孢子进一步扩展、传播而产生的，尤其是维管束病害( 张元恩， 1 9 9 1 ) 。因此，目前仍在深入研究。 番茄青枯病的抗性材料的主根具有多筛孔板结构，能减缓菌体的繁殖及扩 展，根部组织与病菌有粘连现象。入侵的青枯病则被幼根细胞壁周围的浓密的物 质所包围而阻止病菌的活动，对菌体繁殖与扩展起着缓解作用。而病菌则可入侵 感病品种的细胞间隙并降解细胞壁破坏原生质膜。g r j m a u l t ( 1 9 9 4 ) 发现，当青枯 菌入侵抗性材料，多筛孔板结构迅速形成侵填体，堵塞病菌定殖导管，限制或减 缓病菌的繁殖与扩展。中保等9 1 研究也表明，青枯病抗性番茄品种，在病原细菌 存在的导管及毗连的导管内，能形成非特异的物理障害侵填体，阻碍病原菌的转 移；而感病品种病原细菌则侵入整个木质部。感病性品种，病原细菌存在的导管 周围薄壁细胞发生坏死，壁孔膜破坏、消失，病原细菌通过破坏的壁孔扩展至整 个木质部。而抗性砧木品种病原细菌分布导管周围薄壁细胞坏死少，薄壁细胞及 其周围的细胞壁电子密度提高，沿着薄壁细胞与部分导管的壁孔胶及其周围的细 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) 胞壁，看到高电子密度的物质集积。还有，壁孔胶近旁的部分菌体遭破坏了。在 抗性砧木品种的木质部，通过壁孑l 导管向其他导管或薄壁细胞转移的病原细菌被 抑制。 王卉等【1 田报道，番茄品种的抗感性与病原菌在植株体内的存在方式有关，在 感病品种中，病原菌能以游离形式存在于根部的细胞间隙中而抗病品种中，病 原菌被寄主细胞壁周围的浓密物质所包围。乐素菊等”1 显微观察表明，青枯病菌 在番茄抗病试验材料与感病试验材料植株根内的扩展差异显著；青枯病菌可存在 于感病试验材料皮层薄壁细胞间隙，瓦解细胞壁，形成溶生腔在抗病试验材料 维管组织中青枯病菌则被细胞壁所吸附，抗病试验材料的导管分子比感病试验材 料短。 2 3 生理生化抗性 由于目前最有效以及最广泛传播的控制措施是抗病品种的潜伏感染l l ”，因 此研究青枯病抗性生化机制越来越引起人们的重视【1 3 1 钔。对番茄抗青枯病的生 化机制的研究，是当今植物病理学、植物生理学及生物化学等学科中十分活跃的 一个领域，也越来越引起人们的重视。植物受到病原物的侵染后其体内发生一系 列生理生化变化，植物体内的一些酶如苯丙氨酸解氨酶( p h e n y l a n i n ea m m o n i a l y a s e ，p a l ) ，过氧化物酶( p o d ，p e r o x i d a s e ) ，多酚氧化酶( p p o ， p 0 1 y p h e n o l o x i d a s e ) 及超氧歧化酶( s o d ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) 与抗病反应有 着重要的关系。苯丙氨酸解氨酶是莽草酸途径的关键酶和限速酶，在木质素积累、 植保素、酚类物质等物质合成过程中起重要作用。过氧化物酶在酚类物质、木质 素合成和酚类物质氧化过程中起重要作用；多酚氧化酶的主要功能是将酚类物质 氧化成对病原菌毒性更强的酮类物质，s o d 主要的作用是消除细胞内的自由基， 因此这些酶活性的增强对植物抗病非常有利。番茄早疫病【1 5 1 、番茄枯萎病【1 6 】、 烟草黑胫病【1 7 】、油菜菌核病、西瓜枯萎病9 1 、黄瓜黑星病1 20 1 、番茄青枯病 2 2 】等研究证实一些酶特别是苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 、过氧化物酶( p o d ) 、多酚 氧化酶( p p o ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 等活性的变化，与植物的抗( 耐) 病有 关。 另外，谢贻格等2 3 1 研究发现番茄品种对青枯病的抗病性是通过番茄品种植 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) 株体内对菌体产生的抗性反应从而抑制菌体的进一步繁殖与扩展来实现的，其中 浓密物质包围菌体是抗性反应的具体表现。 在各种抗病因素中，主动抗病因素的表达涉及到一系列生化反应。同样，植 物的感病性变化是病原物克服寄主被动障碍和主动防卫的结果。主动抗病反应涉 及到膜的变化及有关基因的活化、转录和翻译，直至与抗病直接相关的次生代谢 物产生。在防卫反应中次生代谢物首先活化的基因是控制苯丙烷类和类黄酮代谢 前期反应的酶，如苯丙氨酸解氨酶和查尔酮合成酶，稍后活化的基因才与植物保 卫素的积累有关。在代谢水平上，首先看到的是细胞壁有酚类化合物积累，随后 是异黄酮偶合体的水解及植物保卫素的积累。植物病程的这些变化，包括分子、 细胞、代谢水平和宏观症状表现都是按预订时序出现的，与植物中许多由遗传控 制的生理过程一样是有序活化，并在一定阶段得到表达的。 植物抗病性是植物细胞中复杂机制协调作用的结果，可以看成是多种因子的 函数。植物对侵染维管束的病原菌会产生一系列防卫反应，如凝胶、侵填体、植 物保卫素、单宁、形成新导管以及导管末端对病菌的捕获作用等。这些富裕在病 程中发生充分效应不仅有一定的时序性，而且也表现出协同作用。凝胶和侵填体 的产生有助于植物保卫素和单宁的积累，而植物保卫素和单宁则具有保护凝胶和 侵填体不受病原物破坏的作用。在植物保卫素合成中，植物细胞是在需要时合成 并及时向适当靶点输送以保证反应细胞本身不受毒害。另外，植物对病菌侵染的 防卫反应还与其他胁迫反应相协调，如富含羟脯氨酸的糖蛋白可以由不同胁迫因 素诱导，但在不同情况下被转录的基因显然不同，这表明富含羟脯氨酸的糖蛋白 是由很多基因控制的，在不同胁迫环境中可选择性活化。这样，同一套反应装置 由于信号传递系统不同就可以在不同胁迫反应中起作用。这是植物在进化过程中 发展起来的细胞反应体系的高度节约性和协调性。羟脯氨酸作为植物细胞壁结构 的一种重要组成部分，其含量可达胞壁氨基酸残基的2 0 。富含羟脯氨酸的糖蛋 白在受病菌侵染的植物细胞壁中有富集现象。 2 4 诱导抗性 当有些病菌侵染某些植物时，植物会产生类似于动物的“免疫性”反应，产 生物理的和化学的障碍，以抵抗病原菌的再次侵染( c h e s t e r ，1 9 9 3 ) 。这种反应 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) 可以局部的，也可以是系统的。后者称为“系统获得抗性”( s y s t e m i ca c q u i r e d r e s i s t a n c e ，s a r ) ，也称为诱导抗病性( i n d u c e dr e s i s t a n c e ) 。弱致病菌、致病 菌的分泌物和其它的物理及化学物质都能诱导植物产生这种抗病性反应( 张元 恩，1 9 8 7 ；o u c h i ，1 9 8 3 ) 。植物诱导抗病性的重要性不仅为防治植物病害，而且 更重要的是可以以此为系统来研究抗病性的机理、抗病性基因的诱导表达、病原 菌与寄主植物的识别、信号传导等。这些都是近年来植物病理学研究的热点之一。 因为许多诱导菌( 非致病菌、弱致病菌) 所产生的抗性反应，实际上是它分 泌的外源激发子与植物的抗性反应受体结合而引起植物防卫反应的结果。化学性 诱导剂的作用可能就类似于这些激发子( 如c h i t o s a n 的结构就相当于真菌孢壁激 发子) 。这些受体再把诱导剂传来的信息通过信号分子传导给基因表达，而引起 一系列抗性反应。因此研究诱导抗性的机理，对了解植物病原物之间的关系、 植物的抗性机理、分子植物病理学是非常有帮助的，十分有意义。即使诱导后增 加了感病性，这对研究植物的感病反应也是很有参考价值的。 另一方面，植物诱导抗病性作为防治病害的新方法、手段，也是很有前途的。 因它不对环境产生污染等有害影响，它利用弱致病菌、病菌的分泌物、孢壁或天 然有机物质( 如几丁质) 作诱抗剂，效果较好，又易于被微生物分解。它充分利 用了农艺性状优良的感病品种，可望解决高产与感病的矛盾。它不直接杀死病原 菌，不会打破病原菌各小种间的自然平衡状态，不会造成病菌新小种( 突变) 的 产生。因此，诱导抗性研究在植物病理学中具有重要的地位和价值。 陈庆河( 2 0 0 2 ) 等人通过实验发现，用紫外诱变法获得的青枯病无致病力菌 株诱导番茄，植株产生了对青枯病的抗性反应，体内与抗病反应相关的苯丙氨酸 解氨酶( p a l ) ，过氧化物酶( p o d ) 及多酚氧化酶( p p o ) 活性显著增强；酚 类物质和木质素含量也显著提高。刘亚君 2 4 】等通过施用不同浓度的几丁质寡糖 液( c o s ) 可以减轻小麦白粉病的发生。随着c o s 浓度的增加，其诱导小麦产生抗 白粉病的效果越好。这表明小麦的抗性是由于植株吸收c o s 后，引发体内系统诱 导抗性而表达的。廖春燕1 5 等在番茄四叶期用l m g m l 的壳聚糖进行诱导接种， 可诱导番茄植株产生对早疫病的抗病性。经壳聚糖诱导后，3 个番茄品种：合作 9 0 8 ( 高抗) 、合作9 0 3 ( 中抗) 、早丰( 敏感) 的病叶率和病情指数均显著低于接种 对照，相对防效分别为3 9 8 、4 9 9 和5 6 4 ：壳聚糖诱导番茄的叶片过氧化物酶 浙江大学硕士论文( 2 0 0 5 ) ( p o d ) 、多酚氧化酶( p p o ) 、苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 、几丁质酶、b 一1 ，3 - 葡聚糖酶 活性提高 3 番茄青枯病抗性遗传研究 番茄抗青枯病育种需时间长，难度大，抗性不易固定。番茄的经济性状也多 属于数量性状，与抗青枯病性状较好地结合需较长时间，往往抗性好则品质差， 这势必增加繁殖代数，扩大群体、以便选出理想的株系。在以往的研究报道中多 数认为，番茄青枯病的抗性与果实大小成负相关。 青枯病的遗传机理比较复杂，大多数研究认为抗性由多基因控制，胞质基因 对其影响不大( s i n g h l 9 9 6 ，a n a i w l 9 8 6 ，o p e n a l 9 9 2 ，f e r r e r l 9 8 4 ，乐素菊1 9 9 5 ) ，而 李乐华( 1 9 9 0 ) 认为抗性可能受到细胞质影响和环境影响。乐素菊( 1 9 9 5 ) 【2 5 】认为抗 性基因3 对以上，a n a t s ( 1 9 8 6 ) 用当地小果c r a 6 6 2 0 试验认为，抗性由4 5 对不 完全显性基因控制，w i n s t e a d 和k e l m a n ( 1 9 5 2 ) 及s i n g h ( 1 9 6 1 ) 认为青枯病的 抗性遗传可能受多基因控制。g o w h a 等【2 6 ( 1 9 9 0 ) 认为是单个显性基因； g r i m a u l t ( 1 9 9 5 ) 用抗青枯病品系h a w a i i 7 9 9 6 作试材试验认为，抗性由单显性基因 控制。t i k o o ( 1 9 8 9 ) 用b w r l 作试验得到同样的结果。李海涛( 2 0 0 0 ) 认为l s 8 9 番 茄青枯病的抗