（野生动植物保护与利用专业论文）部分家兔品种微卫星dna遗传多样性研究.pdf

英文缩略表 英文缩写英文全称中文名称 a f l p a m p l i f i c a t i o nf r a g m e n tl e n g t hp 0 1 y m o 。p h i s m 扩增片段长度多态性 do e n e t i cd i s t a n c e 遗传距离 o s t c o e f f j c i c n to fg e n ed i f f c r e n t i a t i o n 遗传分化系数 h h e t e r o z y g o s i t y杂合度 h s a v c r r a g ch c t e r o z y g o s i t yw “h i ne a c hp o p u l a t i o n亚群体内杂古度 h t t o t a lg c n cd i v e r s i t y 总群体杂合度 m a sm a r k c ra s s i s t c ds c l c c t i o n 标记辆助选择 n j n c i g h b o r j o i n i n g邻近结台法 p a g e p o l y a c r y i a m i d eg e ic l c c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t j o n 聚合酶链式反应 p 】c p o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n f c n t多态信息含量 q t lq u a n t i t a t i v et r a i tl o c i数量性状座位 r f l pr e s ”i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制性片段长度多态性 s s c p s i n g i cs c q u c n c ec o n s t r u c t i o np o i y m o r p h is m单链构象多态性 s s r s i m p l cf e p e a ts c q u c c c简单率联重复序列 s t rs h o r tt a n d e mf o p e a t 短的串联重复序列 u p g m a u n w e i g h t e dp a i rg r o u pm e t h o dw i i ha r i t h m e t i cm e a n平均非加权成组配对法 v 产及改良均依赖于畜禽遗传多样性( 谢芳，2 0 0 4 ) 。遗传多样性的丧失必将限制未 来不可预见优良特性的选择机会，造成无法挽回的损失。 1 2 遗传多样性的研究方法 1 2 1 形态学标记 形态学标记( m o r p h o l o g i c a lm a f k e r s ) 主要是以形态性状、生理性状、杂交亲 和性，结合生态地理分布等特征为遗传标记进行的。家畜的毛色等形态特征是不 同的生态环境和文化背景下长期选择的结果。但是，形态学标记在划分物种中往 往是建立在个体性状描述和宏观观测水平上的可利用的形态标记性状较少，无 法随机代表生物群体遗传组成，且表型差异不一定能真实反映遗传差异，其结果 不尽完善容易引起争论。然而形态学标因其观察方便，故仍是许多生物起源分 化关系研究和物种分类的基本手段之一( 杨华南，2 0 0 4 ) 。 1 2 2 细胞学标记 细胞学标记( c y t o g i c a lm a r k e r s ) 从上世纪末第一次观察到染色体后兴起，生物 学研究逐渐进入细胞水平。本世纪5 0 年代起，世界各国对各种生物的染色体组型 进行了细致的研究。染色体组型( 也称染色体核型) 分析是研究高等生物遗传多样性 和分类的有效工具，有人称之为生物进化的档案库。通过比较特定细胞分裂时期( 以 有丝分裂中期最佳) 染色体的数目和形态参数( 着丝点位置、相对长度、臂长、臂比 等) ，将染色体按各自的特征区分开来，得到一定的染色体组型。染色体与物种都 具有连续性和稳定性，同时又具有可变性、物种内特异性和种间多样性，不同生 物种其染色体组型不相同，因此是进行生物分类和遗传进化研究的有力依据。然 而一些生物种类的染色体组型或染色体大小差别不十分明显( 罗鹏，1 9 9 3 ) ，给研 究工作带来很大的因难。 染色体组型和带型分析在动物分类学、动物遗传育种学和医学诊断等领域起 过重要的作用。染色体数目的不同使绵羊( 2 7 对) 和山羊( 3 0 对) 有了明确的界 限，利用y 染色体特征考察牛品种父系起源和进行品种分类( 李善如，l9 9 7 ) ；许 多研究揭示出染色体变异与繁殖、疾病的关系，如牛和绵羊的异卵异性双胎中的 间雌个体是由于性染色体畸变形成嵌台体所致( 姚世鸿，1 9 9 3 ) 。 1 2 3 生物化学标记 生化遗传标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 主要指血液生化标记，是对各种畜禽的血 液蛋白质( 包括同功酶) 多态性研究。蛋白质作为生物基因表达的宣接产物，其变异 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 反映了基因的变异，基因突变及等位基因的广泛存在也就决定了蛋白质具有丰富 的多态性而且属于典型的孟德尔遗传。其多态性可以较明显地表现于电泳图谱 上或表现在酶活力上。蛋白质多态性分析主要根据群体内基因频率不同进行，对 畜禽进行进化分类研究。由于蛋白质在遗传过程中会发生重组和杂合，只能用于 群体水平的研究。群体之间血液蛋白位点上基因频率的差别基本是不同的种系起 源、隔离以及极为缓慢、悠长的自然选择与遗传漂变的体现( 常洪，1 9 9 9 ) 。 同功酶研究是蛋白质多态分析的一个重要组成。在生物的不同个体以及同 一个体的不同组织器官或生长发育的不同阶段都可以检测到一系列的功能相同、 结构有差异的同功酶。因同功酶变异丰富，不同谱带差异一般表现为同一基因位 点上等位基因的差异，能稳定遗传，而杂合体共显性对生物性状表现一般无壹接 效应( 顾志良，1 9 9 5 ) 。 总之，蛋白质多态性作为遗传标记的一个重要方面，其研究丰富和完善了群 体遗传学理论和方法，是多学科在育种学上交叉的产物。但是蛋白质( 包括同功酶) 是基因表达的产物，既受遗传基础制约。也受发育阶段、环境条件等因素的限制， 同时也因取样及分析方法所限，存在一定局限性。 1 2 4 分子遗传标记 分子遗传标记( m o l e c u i a rm a r k e r ) 是直接以遗传物质d n a 的多态性为标记进 行的遗传分析，具有存在范围普遍、遗传稳定、直观准确等优点。在遗传学和起 源进化咀及生物分类学等研究领域具有广泛的应用前景，目前最常用的分子遗传 标记有以下几种： 1 2 4 1 限制性片段长度多态性( r f l p ) 标记 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 标 记是指用限制性内切酶切割不同个体的基因组d n a 后，含同源序列的酶切片段在 长度上的差异，其核心是探测基因组中特异性d n a 序列。 r f l p 有两类，一类是点多态性，即由于限制性内切酶识别位点上发生了的一 个碱基替换( 转换或颠换) ，使原有切点消失或产生新的切点；另一类是结构重排型 多态性，是由于d n a 内部发生较大的顺序变化所引起的，即d n a 碱基序列发生了 突变( 缺失、倒位或插入) 或高变区的串联重复序列的拷贝数变化，以及限制性酶切 位点的相对位移引起。r f l p 标记普遍存在于生物界并能稳定遗传，丰富的变异也 就成为天然的遗传标记。r f l p 起源于生物基因组d n a 的自身变异在数量上几 乎不受限制，可根据研究目的随机选取足够数量的能代表整个基因组的r f l p 标 记，且每个标记变异较大，可获得的多态信息相对较多，适于物种分类和组建高 密度的遗传图谱。理论上，r f l p 位点普遍存在于整个基因组中，只要有足够多的 与其遗传特征相连锁的遗传标记，就可以找到足够多的r f l p 位点，用于构建r f l p 遗传图谱( 程罗根，1 9 9 4 ，b o t s t e i n ，1 9 8 0 ) 。 当然并非所有的d n a 克隆或c d n a 克隆都可以检测到r f l p 。r f l p 的取得 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 在很大程度上依赖于限制性内切酶识别位点上碱基的改变或识别位点的位置移动 ( 林兵，1 9 9 0 ) 。其遗传稳定性和变异性与所使用探针的来源和基因组的性质密切 相关，不受动植物发育时期和组织器官差异以及细胞生境的影响，因此在基因突 变分析、基因诊断、个体识别、亲子鉴定、基因定位、构建与q t l ( q u a n t i t a t i v et r a i t l o c u s ) 的连锁图，以及物种分类和进化关系研究、育种操作等方面都具有重要的实 用价值。 1 2 4 2m t 0 n 一r f l p 标记 线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 是高等动物唯一的核外遗传物质， 有着与核内遗传物质不同的遗传特征，具有分子量小、结构简单稳定、进化速度 快、母系遗传等特点。另外长度变化和序列重排也是造成m t d n a 多态性的原因， 因而可以用限制性内切酶技术( m t d n a r f l p ) 直接探测m t d n a 多态性。 m t d n a 的遗传多样性是揭示家畜品种起源和遗传分化关系的重要标记之一， 在动物遗传育种研究中具有重要作用。由于m t d n a 遵循母系遗传，子代m t d n a 来自父本的可能性小于0 0 0 4 7 ( 张亚平，1 9 9 2 ) 。因而m t d n a 不受外来公畜杂 交改良之影响，而且在世代传递过程中很少发生重组，家养动物一般能保持其野 生祖先的m t d n a 类型，其m t d n a 类型能反映当地畜禽品种的母系特征，故m t d n a 可作为可靠的遗传标记用于地方品种的遗传结构及起源分化研究，通过几只动物 个体样品就可以了解到一个群体的遗传结构( 陈宏，1 9 9 5 ) 。 1 2 4 3 扩增片段长度多态性( f l p ) 标记 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n t sl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 标记即对d n a 酶解后的限制性片段进行p c r 扩增的标记方法，是荷兰的v o s p i e t e r ( 1 9 9 3 ) 年发明的一种新的d n a 分子标记方法，是r f l p 和p c r 技术结合产 生的一种新技术( 郭雄明，2 0 0 3 ) 。其原理是d n a 经限制性内切酶酶切后，形成 分子量大小不等的随机片段，将特定的接头( a d a p t e r ) 连接在这些d n a 片段的两端， 形成带接头的特异片段。通过接头序列和p c r 引物3 末端的识别，特异性片段 经p c r 扩增，最终通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子筛作用将这些特异性片段分离 开来。a f l p 标记具备多态性丰富、共显性表达、无复等位效应、不受环境影响等 优点。经一些学者( b 1 a i r ；f a y e ；b e c k e r 等人) 应用和验证，都证实了a f l p 是一种 十分理想的、先进有效的分子标记( 罗鹏，l9 9 3 ) 。a f l p 在品种鉴定和遗传多样 性研究，构建遗传图谱和基因定位，以及指导育种工作实践中得到应用并取得良 好效果。 1 2 4 4 随机引物多态性( r a p d ) 标记 r a p d ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o p h i cd n a ) 标记从1 9 9 0 年做为一种新的分子生 物学技术出现。该技术是利用p c r 原理。在反应中只使用一种人工合成的短序列 ( 通常为10 b p ) 随机引物，在较低的退火温度下( 一般3 5 一3 7 ) 引物与基因组 d n a 中互补顺序配对，启动d n a 的合成，产生基因组特征产物的多态性，这种多 态性具有物种和个体特异性，可作为研究生物多样性的遗传标记( 杜立新，1 9 9 5 ) 。 比较而言，r a p d 有不同于常规p c r 的特点，无需专门设计r a p d 扩增反应 4 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 的引物，且每次反应只需一种引物；容易产生较为丰富的单引物扩增产物，构成 特异的电泳图谱，可获得大量的d n a 多态信息，检测范围几乎可以覆盖整个基因 组；而且d n a 样品用量极少( p g n g 级) ；引物具有通用性，使用范围广，宜于规 模化、商品化生产，r a p d 分析适合于自动化程序分析，结果较为准确可靠。 r a p d 标记属于显性遗传标记，具有许多独特的优越性。利用r a p d 标记可以 对整个基因组d n a 进行多态检测，对那些r f l p 难以区分的区域做出遗传连锁圈 ( 苟得明，19 9 5 ) 。而且r a p d 检测遗传变异的灵敏度高，品种间和品种内遗传变 异的丰富，因而是分析群体遗传结构的理想工具。然而r a p d 难以区分杂合子和 纯合子基因型，无法有效鉴别出杂合子，这一方面又不能与r f l p 相比( r f l p 是可 以区分杂合子的( 王慧，1 9 9 7 ) 。同时r a p d 检测受反应条件影响很大，重复性和 稳定性较差，易产生假带。尽管如此，r a p d 仍然不失为一种非常有用的遗传标记。 1 2 4 5d n 指纹( d f p ) 标记 d f p 标记( d n af i n g e rp r i n t s ，d f p ) 技术是d n a 多态性分析中一种准确度较 高、多态信息较丰富的分析方法。19 8 0 年w y m a n 等人首先在人类基因文库的d n a 随机片段中，分离出高度多态的重复顺序区域，l9 8 2 年，b e l l 等人又在人胰岛素 基因附近发现高度重复序列一高变区( 黎裕，1 9 9 9 ) 。进一步研究证明，真核生物 基因组中，除了编码蛋白质的单拷贝序列之外，在染色体上还有许多重复序列， 他们以较高的密度覆盖着整个基因组。这些数目可变的串联重复序列，在染色体 某位点上头尾串联，根据每个位点上重复单位的数量及序列变化所检测到的d n a 多态性被称为可变数目串联重复序列( v a r i a b l en u m b e rt a n d e nr e p e a t ，v n t r ) 。不 同的重复单位和数目构成了d n a 的高度多态性，表现出一定的d n a 序列差异， 不同数目的顺序重复“核心”d n a 序列则构成许多等位基因的高度多态性。根据 重复核心序列碱基对数的不同，v n t r 又可以分为小卫星和微卫星d n a 。( 邓务国- 1 9 9 4 ) 1 2 4 5 1 小卫星d n 标记 小卫星d n a ( m i n i s a t e l l i t e sd n a ) 的重复核心序列为1 0 b p 以上，总长由几百个 到几千个碱基组成的串联重复序列。它在不同个体间存在有串联数目的差异，表 现出高度个体特异性，也具有高度种属特异性，以孟德尔方式稳定地遗传和分离。 小卫星d n a 标记的多态信息含量在o 7 o 9 之间( 钱惠荣19 9 8 ) 。因在每个染色 体座位上的串联重复序列中，有重复出现的限制性内切酶靶序位，其鉴别仍可采 用r f l p 方法。检测用的探针可在基因组文库中筛选也可以人工合成。小卫星d n a 在个体鉴定、连锁分析及基因定位中十分有用。 2 4 5 2 微卫星d n 标记 微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t e sd n a ) 又称短串联重复序列( s h o r tt a n d e m r e p e a t s 。s t r ) 或简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a ts s r ) ，以由侧翼序列和串鞋重 复核心序列组成，其串联重复的核心序列长度一般为l 6 b p ，其中最常见的是双核 苷酸重复，即( c a ) n 和( t g ) n ( h j t ej ，1 9 9 6 ) 。每个微卫星d n a 的核心序列结构相 同，重复单位数目1 0 6 0 个。因重复数和重复的单位的不同，造成基因座位上丰 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 富的多态性，其多态信息含量高。微卫星d n a 标记广泛均匀地分布在整个基因组 中但这种标记一般不能直接作为探针，需将其两侧的序列作为引物，经p c r 扩 增后用其片段再作分析，且一般只能探测一个基因座位，是进行基因定位的理想标 记之一( 贾艳梅，2 0 0 4 ) 。 d n a 指纹在群体亲缘关系分析、遗传距离测算和动物起源分化研究、基因定 位、遗传作图和隐性遗传病诊断，以及动物品系分析、配合力测定和杂种优势预 测上都有独特的优越性。从理论上讲，通过d n a 指纹分析可以找到与任一经济 性状主基因连锁的d n a 指纹，因而可利用d n a 指纹分析进行数量性状的标记辅 助选择。 d n a 指纹虽然有高分辨率和多态信息丰富之优点，且确定性好，但由于需要 进行d n a 的提取纯化和酶切，经电泳和转移，选择合适的探针并标记检测费用 较昂贵，设各条件和技术水平要求较高，这在一定程度上限制了d f p 标记的应用 范围。 1 2 4 6 单链构象多态性( s s c p ) 标记 单链构象多态性标记( s i n g l es e q u e n c ec o n s t r u c t i o np o l y m o r p h i s ms s c p ) 技术的 基本原理是根据双链d n a 经变性处理后，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，由于 d n a 分子在凝胶中的迁移率与其分子量和空间的构型有关，在非变性的胶中，单 链d n a 可形成一级结构，而这种单链d n a 所形成的一级结构与单链d n a 的序列 有关，并且单链d n a 的迁移率受到其一级结构的影响。因此通过电泳。不同的单 链d n a 被分离，单链d n a 在胶中的位置差异反映了d n a 序列的的差异，所以 s s c p 可以检测到点突变和多态性位点( 许云华，2 0 0 3 ) 。 1 2 4 7 单核苷酸多态性( s n p ) 标记 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此从分 子水平上对单个核苷酸的差异进行检测具有重要意义。过去检测d n a 片段的序列 变化，只能逐个克隆进行序列分析，费时费力。随着计算机和d n a 芯片技术引入 分子生物学领域，研究者可同时对成千上万个克隆测序，用计算机分析数据和显 示最终结果。1 9 9 8 年科学家建立了s n p 技术，目的是检测人类基因组中的单个核 苷酸的改变，利用s n p 制作的人类遗传图被称为人的第三代遗传图，s n p 作为一 种新的遗传标记，几乎完全建立在d n a 芯片技术的基础上( 杜玮南，2 0 0 0 ， b o t s t e i n 1 9 9 9 ) 。 总之比较几种遗传标记方法。都各有其优缺点和适用范围，在研究中应根 据需要选用恰当的标记方法。每种遗传标记都能反映生物遗传特性的某些方面。 在实际应用中相互结合、相互补充，才能从各个角度揭示生物的遗传本质，更深 入全面地了解与我们的生存密切相关的生物世界，以便更好地保护生物保存人 类赖以生存的生物资源。可以预测，在畜禽遗传育种中分子遗传标记将会起越来 越重要的作用。采用分子遗传学手段可以提高育种值估计的准确度，大大缩短 育种年限。 6 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 其中4 2 的扩增产物表现多态性，而在马和人中则未扩增出多态产物。龚明川 ( 2 0 0 4 ) 用1 6 对鼠微卫星位点的引物，以家兔的基因组为模版进行扩增有5 对 引物扩增出产物，并呈现出一定多态性。 从目前的资料看，可以确定微卫星位点在紧密相关的物种间具有位置保守性， 但在多大程度上具有保守性，以及这种保守性或保守位点的多态性在不同的目、 科、属间是否存在差异有待进一步研究( 杜立新1 9 9 5 ) 。微卫星标记位置保守性 的发现对微卫星的研究有十分积极的意义，我们可以避免直接从基因文库中筛选 微卫星位点的烦琐性，在一个物种微卫星研究中利用另一个物种的研究结果，从 而更快、更准确地找到该物种中更多的微卫星位点，以便用于遗传作图及其他用 途。 1 3 2 4 共显性遗传 许多研究表明微卫星位点遵循孟得尔遗传规律，等位基因间呈共显性遗传特 点，容易区分出纯合型和杂合型。而且微卫星位点的突变率低，因而有较高的遗 传稳定性这使其在物种起源、遗传作图、连锁分析以及基因定位等研究中具有 更高的精确性和可靠性。 1 3 2 5 微卫星d n 容易检测 由于微卫星长度短( 一般2 0 0 b p ) 通过两侧翼序列上互补的寡核苷酸( 约2 0 b p ) 做 为引物，用p c r 扩增，再用测序凝胶分离检测其结果，十分方便，且可同时进行 多位点 x 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 和2 2 8 6 2 c m ，微卫星标记在其中起了重要的作用( 樊斌，1 9 9 9 ，陈红菊，2 0 0 3 ，闫 景娟。2 0 0 4 ) 。 1 3 3 2 个体及亲缘关系鉴定 由于微卫星位点具有高度的个体专一性和多态性，已代替了人们最早使用的 血型，血液蛋白多态性进行的血缘鉴定和血缘控制，这就使它在亲仔鉴定、胚胎 移植、混合受精、亲缘关系分析和品种遗传纯度分析上十分重要。利用微卫星位 点的多态性，以及多个微卫星位点在一定群体中各等位基因的频率为基础来计算 排除率，进行个体及亲缘关系鉴定研究表明，组合5 个多态性微卫星位点( 每个 位点6 个以上等位基因) ，徽卫星成功地解决了以前血型鉴定法无法判定的3 5 头牛 的血缘控制问题( 涂正超，19 9 6 ) 。 1 3 3 3 用徽卫星制作d n 指纹 微卫星在真核生物基因组中数量多、分布均匀，基因组中各微卫星位点除重 复数不同外。其碱基组成及结构是相似的，因此可以用微卫星的核心序列如( a c ) n 或( t g ) n ，作为多位点探针，在基因组中可以同时检测多个位点( 一般多于1 0 个位 点) 获得更多的信息含量。由于不同个体、品种( 系) 或群体在被检测位点上存在一 定的差异，通过电泳及杂交，这些差异将表现为各杂交带的有无，即产生d n a 指 纹图。微卫星d n a 指纹图可进行个体、品种( 系) 鉴定及群体遗传变异分析等。微 卫星指纹图的分析过程与小卫星一样，只是使用的探针不同。徽卫星探针较短， 可直接合成另外，微卫星在基因组中随机分布在基因内的间隔区、内含子、外 显子和调控区中，因此用微卫星所作的指纹图具有一定的代表性，能够代表基因 组的特征( 顾志良，1 9 9 5 ) 。 1 3 3 4 定位功能基因和0 t l 利用徽卫星位点和某些功能基因位点或q t l 间的连锁关系，可将一些功能基 因定位在染色体上或连锁群中这方面的研究在家畜( 禽) 中已有很多报道。樊斌 ( 1 9 9 9 ) 研究猪的几个微卫星标记与部分生产性状的关系，结果表明：出生重、 2 0 日龄重、4 5 日龄重及出生至4 5 日龄平均日增重在位点s w l 35 0 的不同基因型 间差异显著。刘伟敏等( 2 0 0 0 ) 采用f 2 代建立中国梅山猪和大白猪杂交组成的资 源家系。分析了7 号染色体上的9 个微卫星标记的多态性，将它们作为性状与标 记间连锁分析的侯选遗传标记。 1 3 3 5 群体遗传结构及遗传关系的分析 微卫星多态性分析在畜禽遗传多样性评估、品种资源的分类、保存和利用方面 发挥着重要作用( b a r k e r1 9 9 3 ) 。自然界中，生物个体表现出来的各种遗传变异， 在本质上是d n a 的差异，因此通过研究d n a 的变异来分析群体的遗传结构及遗 传多样性更为直接。吴信生( 2 0 0 4 ) 用微卫星位点多态性研究鸡品种问的遗传关系和 遗传结构时发现，微卫星位点的基因频率能反应品种间的特异性。 b a r k e r 等( 1 9 9 3 ) 采用微卫星位点分析了牛群体间的遗传变异，并与多态性蛋白 质位点相比较。由微卫星分析得到的系统树与这些牛群的地理分布相同，而由蛋 白质位点得到的系统树却与之相异，结果表明微卫星在遗传多样性的研究上是准 9 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 确可靠的，用微卫星位点估计品种间或品种内遗传结构和变异是非常有效的。 1 4 家兔微卫星标记研究进展 全世界共有家兔品种6 0 多个，遗传多样性相当丰富，这无疑将是今后兔育种 的宝贵遗传资源。随着分子生物学技术的迅猛发展，对家兔d n a 多态性的研究技 术也不断涌现，从而为家兔的育种提供科学的理论依据。 1 4 1 国外研究进展 r i c o 等( 1 9 9 4 ) 开始，通过克隆筛选找到4 个位点，s 0 1 0 3 、s 0 1 0 8 、s o l 2 8 、s o l3 0 ； 随后m o u g e l 等( 1 9 9 7 ) 使用6 对寡核苷酸作为探针，与s a t 3a i 消化片段构建的基 因组文库杂交，检测到6 个微卫星位点：s a t 5 、s a t 7 、s a t 8 、s a t l 2 、s a t l3 和s a t l 6 ， 并将这6 个位点进行序列分析设计出扩增这些位点的引物，而且从g e n b a n k 数据 库中钓出另外3 个位点：s a t 2 、s a t 3 和s a t 4 。使用特定引物对这9 个位点进行扩增， 发现每个位点有3 7 个等位基因，而且呈孟德尔遗传。后来s u r r i d g e 等，l9 9 7 又 从欧洲野兔基因组文库中克隆出2 个微卫星位点( s 0 13 3 、s o l 4 4 ) ，结合r i c o 等( 19 9 4 ) 报道的4 个位点在2 0 种兔形目动物中进行扩增，大部分位点在绝大多数动物中得 到扩增产物，等位基因数从l 到l5 不等。 v a nl t h 等( 19 9 6 ) 对g e n b a n k 中所有的家兔序列进行微卫星位点的搜索，其 中包含长度为2 0 b p 左右的各种类型的单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸 重复单位。总共发现1 3 1 个微卫星位点，估计在家兔基因组，每2 3 k bd n a 中存 在1 个微卫星位点，其中二核苷酸重复序列最普遍。接着是三核苷酸、单核苷酸、 四核苷酸重复单位。微卫星的平均长度为2 3 、2 3 、2 6 、2 2 b p 最常见的重复单位 为a g ，接着是a 、a c 、a g g 、c g g ，这几种占所有微卫星标记的7 0 。各微卫 星位点等位基因及其频率分布在不同的品种、品系闯存在多态性。 v a nh a e r i n g e n 等人( 19 9 6 1 9 9 7 ) 使用1 3 对微卫星引物对不同家兔品种进行扩 增。发现平均每个位点有4 个等位基因( 变化范围为2 一1 1 ) ，同时发现核基因组上 重复序列单位的长度与等位基因数存在正相关。合成了8 对微卫星引物。并在 a b l 3 7 7 上对1o o 个家兔样本的两对引物c a 2 r e 2 f 、c a 2 r e 2 r 和s a t l 2 f 、s a t l 2 r 进行 了0 e n e s c a n 分析，用g e n o t y p e r 软件读取数据，发现了一些多态位点。 a n n a c a r i na n d e r s s o n 等( 1 9 9 9 ) 用5 对应用于欧洲野兔的微卫星引物扩增瑞 典的两个野兔品种的微卫星位点，结果表明使用相同的微卫星引物可以在相近的 品种中进行徽卫星位点的p c r 扩增。， g u i l l a n u m e 等( 2 0 0 1 ) 通过微卫星标记，来估计欧洲野兔的历史进化过程以 及它们早期生活区域的地理分布情况。 r k o r s t a n i e 等( 2 0 0 1 ) 对人工饲养的家兔1 号染色体上的2 5 个微卫星位点 0 中田农业科学院硕士学位论文第一章绪论 进行了分析，其中在1 2 个位点上具有多态性每个微卫星位点的平均等位基因数 为4 个。 c o l eb u r t o n( 2 0 0 2 ) 引用欧洲野兔微卫星位点( s o l 0 3 、s o l 3 3 、s a t 2 、s a t 5 、 s a t l 2 、s a t l3 、s a t l 6 、s a t 3 ) 的8 对引物研究了雪兔2 4 个父代个体，12 个母代个 体。以及6 5 个子代个体间的群体遗传结构，以此来判断评估雪兔的多重父权关系 以及公兔的繁殖成功率。 k o r s t a n j e 。g i l l i s s e n ( 2 0 0 3 ) 通过对富含微卫星的染色体组数据库的标记扫描， 在3 、5 、6 、7 、1 2 和1 9 号染色体上发现了5 0 多个具有多态性的微卫星位点。 1 4 2 国内研究进展 李庚航( 2 0 0 s ) 选用9 对微卫星标记引物分析微卫星标记的多态性及其与体重、 产毛量的相关性。结果表明：有7 对扩增出产物并呈现出多态性，平均检测到4 1 4 个等位基因；其中6 个微卫星标记的平均多态信息含量为o 6 0 9 ，平均杂合度为 0 6 9 1 0 。分析表明微卫星标记d l m i t 3 0 和标记s a t l 2 可作为长毛兔体重、产毛量 性状连锁分析的侯选遗传标记，为进一步的长毛兔体重性状、产毛量性状的q t l 定位以及分子标记辅助选择等研究提供理论依据。 李鹰用( 2 0 0 3 ) 6 个微卫星标记对7 个肉兔品种和一个杂交群体进行了遗传检 测。结果表明，6 个微卫星位点均表现出了较好的多态性，平均检测到1 3 个等位 基因，平均多态信息含量为0 5 3 0 0 遗传距离的计算表明，哈白兔和天府肉兔与加 洲兔、比利时白兔、花巨兔的遗传距离接近。 朱玉峰、张嘉保( 2 0 0 4 ) 选用欧洲野生穴兔的5 个微卫星座位，分析了5 个品 种( 系) 家兔群体的遗传变异。发现在5 个品种( 系) 家兔中，新西兰兔群体内变异较 小，相对较纯：vc i l 系獭兔群体内变异较大，纯度相对较小。而平均多态信息含 量和平均杂合度数据说明v c 獭兔在遗传性能上己接近其他优良品种兔。聚类结果 表明：v c 1 系獭兔与v c i i 系獭兔亲缘关系最近，与日本大耳兔、青紫蓝兔亲缘关 系较近，与新西兰兔亲缘关系最远。在s a t 4 和s a t 8 座位分别检测出了一条v c 獭 兔所特有的条带。 龚明川( 2 0 0 4 ) 采用l6 对小鼠微卫星引物在家兔基因组上扩增其结果为所选 的引物中有5 对扩增出产物并呈现一定多态性，平均多态信息含量为0 5 4 4 8 ，平 均杂合度为0 6 0 5 1 。经过相关分析，得出其中4 对微卫星标记与肉兔体重性状相 关。 总之，目前对家兔的分子研究较少，为了向高产、优质、抗病、高效的畜牧 业靠近，保护人类赖以生存的生物多样性，应该努力在家兔上寻找到更多的分子 标记。使家兔的基因图谱的构建、基因定位、标记辅助选择和遗传多样性分析等 能够得到更深入、更全面的研究，从而提高家兔的各项生产性能指标- 创造更大 的畜牧业经济效益。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 1 。5 研究的目的和意义 1 5 1 目的 家兔业是畜牧业中的重要产业之一，是目前新兴的规模化养殖行业。与其他 畜禽如猪、鸡等相比较，对家兔的研究较少，尤其是有关分子遗传的研究更少。 为此。本试验利用微卫星标记对我国部分家兔品种进行检测，从d n a 分子水平来 揭示家兔的遗传多样性，以期估计品种内的遗传多样性，揭示每个品种内的近交 和杂交程度以及多态信息含量：估计品种间的遗传距离，构建反映品种间关系的系统进化树。1 5 2 意义 本试验从d n a 分子水平来揭示家兔的遗传多样性。为我国家兔的起源分化提供新的资料，加快家兔基因图谱的制作；并且通过分析微卫星多态性位点与生 产性状的关系，为进一步寻找qtl位点打下基础，进行分子标记辅助选种，提高 育种的效率和选种的准确性，为家兔育种提供新方法，从而提高我国家兔育种的 水平；同时也为我国家兔品种的合理保护及科学利用提供依据。1 2 中国农业科学院硕士学位论文第二章材料与方法 2 1 2 试验动物 采样设计参照常洪( 1 9 9 9 ) 、b a r k e r ( 1 9 9 3 ) 等关于样本含量和采样方式的建议 其中公母比例为l ：l ，6 个家兔品种的编号、名称、数量及采样地点见表2 2 。 表2 2 六个家兔品种的编号、 t a b ie 2 2n a m e ，q u a n t i t y ， a n dc o ll e c t 名称、数量和采样地点 onlo c a t io no f6r a b b i t b r e e d 8 2 1 3 主要试剂及配制 ( 1 ) a c d ：准确称取柠檬酸4 8 9 ，柠檬酸三钠1 3 2 9 ，葡萄糖1 4 7 2 9 ，加8 0 0 m l 蒸馏水，溶解后定容至10 0 0 m l 。灭菌，室温贮存。 ( 2 ) 1 m o i ，lt r i s ：蒸馏水1 6 0 ，t r i s2 4 2 2 9 ，加浓盐酸调p h 为8 o 最后定容至 2 0 0 m l 。 ( 3 ) 5 m o l ，le d t a ：蒸馏水8 0 0 m l 。e d t a l8 6 1 9 ，加n a o h 调p h 为8 o ，最后定 容至1 0 0 0 m l 。 ( 4 ) 1 0 s d s ( 过硫酸铵) ：称取l o g s d s 容于1 0 0 m l 蒸馏水中。 ( 5 ) 血液抽提b u f f e r ：1m o l ，lt r i s4 m l ，o 5 m 0 1 ，le d t a8 0 m l ，10 s d s 2 0 m l ， 三者混匀后加水定容至4 0 0 m 1 。 ( 6 ) p b s ：蒸馏水8 0 0 mj ，n a c i8 9 ，k c lo 2 9 ，n a 2 h p 0 4 l2 h 2 03 6 2 8 9 ，k h2 p 0 4 0 2 4 9 加浓盐酸调p h 为7 4 ，定容至l0 0 0 m 1 。 ( 7 ) 5 0 t a e ：2 4 2 9t r i s 溶于7 0 0 m l 蒸馏水中，加入5 7 1 m 1 冰乙酸，加入1 0 0 m l 0 5 m o l ，le d t a ，最后定容至l o o o m l 。 ( 8 ) l o t b e ：t r i s1 0 8 9 ，硼酸5 5 9 ，o 5m o l 几e d t a4 0 m l ，双蒸水1 0 0 0 m l 。 ( 9 ) 3 0 p a g e ：1 4 5 9 丙烯酰胺，5 9 亚甲双丙烯酰胺，加水定容至5 0 0 m i 。 ( 1 0 ) 变性上样缓冲液：去离子甲酰胺9 8 m l ，o 5 m o l ，le d t a2 m l ，0 0 2 5 9 溴酚 蓝，0 0 2 5 9 二甲苯箐。 ( 1 1 ) 琼脂糖上样缓冲液：1 m l 水中加o 2 5 m g 溴酚蓝和4 0 m g 蔗糖。 l4 中国农业科学院硕士学位论文 第二章材料与方法 ( 12 ) 染色液( 每块胶所需) ：3 6 n a o h4 2 m l ，2 0 a g n 0 33 6 m i ，氨水2 m 1 ，蒸 馏水1 9 0 m i ( 13 ) 显色液( 每块胶所需) ：1 柠檬酸钠1 m l ，甲醛10 0 u l ，蒸馏水2 0 0 m l ( 14 ) 蛋白酶k ( 1 0 m g ，m 1 ) ：1 0 m g 蛋白酶k 溶于l m l 双蒸水，分装后2 0 保存。 ( 1 5 ) 0 8 琼脂糖：o 2 4 9 的琼脂糖溶解于3 0 m i l t a e 中。 2 2 试验方法 2 2 1 血样的采集 吸取0 5 m l 抗凝剂于已灭菌的一次性注射器中，从耳缘静脉采集血样】mj ，转 移至己灭菌的1 5 m le p p e n d o r f 管中，立即用冷藏箱( 4 ) 运回实验室。一7 0 保存。 2 2 2 基因组d n a 提取 ( 1 ) 在试验之前，要提前把无水乙醇放入冰箱中冷冻，酚及酚和氯仿混合物放入 4 冰箱中冷藏。 ( 2 ) 取7 5 0 u l 血样于1 5 m 1 e p p e n d o r f 管中，加入等体积的p b s ，充分混匀10 m i n ， 1 2 0 0 0 转m i n 离心l o m i n ，弃上清。 ( 3 ) 如果沉淀颜色发红，继续重复上述操作，直至无红色为止。 ( 4 ) 在沉淀中加入4 5 0 u lb u f f e r 和l o m g ，m l 蛋白酶k 1 0 u l ，放入水浴锅中5 5 消 化2 4 3 6 h 。 ( 5 ) 在上面体系中加入等体积酚，充分混匀后，12 0 0 0 转，m i n 离心7 m i n ，吸上清 于1 5 m le p p e n d o r f 。 ( 6 ) 重复上述操作一遍 ( 7 ) 加等体积酚仿混合物，充分混匀后，1 2 0 0 0 转，m i n 离心5 m i n ，吸上清于1 5 m l e p p e n d o r f 。 ( 8 ) 重复上述操作一遍 ( 9 ) 加等体积氯仿，充分混匀后。12 0 0 0 转，m i n 离心5 m i n ，吸上清于1 5 m l e p p e n d o r f 。 ( 10 ) 加二倍体积的冰乙醇，轻轻混匀后，1 2 0 0 0 转，m i n 离心l o m i n ，弃上清。 ( 11 ) 加5 0 0 u l7 0 乙醇洗涤沉淀两遍，放入干燥箱中3 7 烘干，加l o o u l 无菌水， 4 或18 保存待用。 ( 1 2 ) 用o 8 的琼脂糖凝胶检测总d n a ，并使用d n a 定量仪( g e n eq u a n tl i ) 定 i5 量其浓度及纯度。要求d n a 纯度( 0 d 值) 在1 3 0 0 以上，蛋白质含量在0 3 0 0 u g ，u l 以下。 2 2 3p c r 扩增 2 2 3 1 引物及扩增条件： 本试验所用的引物是在n c b i 中查到，由上海生工生物公司合成，从3 0 对微 卫星引物中，挑选多态丰富的1 0 对进行扩增，扩增条件在原报道的基础上根据本 实验室条件进行优化，确定了微卫星位点的适宜扩增反应体系和等位基因检测技 术( 见表2 3 ) 。 衰2 31 0 种徽卫曩d n 引物殛其p c r 反应条件 t a b ie2 3t h e d a tao fm i c r 0 8 a t o iii toa n dc o n d i t iono fp c r 位点序号位点重复单位 引物序列 m g ” 退火温 l o c u sl o c u s r e p e a tp r i m c rs c q u c n c c 浓厦 度 竺竺竺! ! ：! 竺竺! 璺【曼2 ，s - o 【c a 】1 6 g o ，：鼎搿鬻；：翟器毛 ：oe 4 s 8 9 1 0 1 1 l3 1 6l 7 c 1 l ( c a ) l l c a a a t g a a a t g a g g a g g g a g a t a c a t t o a o o a c a t t t g a g t a g t o a g t t g o c a g g a a g a a a a g o a a g a t t t t t c t c a t a a g c a t t t g g g a a g t g a g o g g c c t c c a t c c t c t a c a a t t a t g t g t c a o g c a 0 0 c t g t o t c a g t g g t a g c g c t t t g g t c t g g c t c c t t g 0 0 g c a t t t 0 g c t a a t t a c c c a a a g g a a c a t a c a c a g t g c a a a t t t g g a a g g t c t g g t g t g a a c c a c t a o a t a o a a c a a a a t t a g g t c c c t t g t a g t a g t t g c t c c c a c c c g a t t t t a t o c t o t t 0 0 0 a o t a g a l t o a c c a t g g c a c c a a t a a t g t c t t t g g c a a t a g a t g a g g lo 2o lo 1 5 20 2 0 4 o 2 0 6 1 6 4 6 7 6 6 6 2 55 6 4 5 4 2 2 3 2p c r 反应体系 裹2 4p c r 反应组分和体积 ! 苎竺! ! ! ：! ! 璺! 1 2 竺2 2 1 1 2 11 1 壁：21 竺竺12 ：! 旦墨 组分 c o m p o n c n t 体积( u 1 ) v o l u m e l o b u