（生药学专业论文）黄檗果皮水溶性化感物质的初步研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：锹晓兹 签字日期： 仞加年月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解三量塞进塑医堂堕有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权j 竖立坯塑医堂院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 弓饫晓旋 签字日期：_ 咖年多月7 上日 导师签名：芗纭嵋 签字日期：夕f 口年6 月 目录 目录 前言l 摘要3 a b s t r a c t ：5 第一章糖类成分对植物活性作用研究简介7 一、糖的分类及定义7 二、低聚糖素及其对植物活性作用8 第二章黄檗果皮水溶性组分中活性成分的分离及检测1 4 第一节水浸液中蛋白质类成分活性研究1 4 l 材料与仪器1 4 2 方法1 4 3 结果与分析15 3 1 加热处理对种子萌发及幼苗生长的影响1 5 3 1 1 加热处理水浸液对种子萌发的影响15 3 1 2 加热处理水浸液对幼苗生长的影响17 3 1 3 加热处理水浸液对种子活力的影响2 2 3 2 乙醇处理水浸膏对种子萌发及幼苗生长的影响2 3 3 2 1 乙醇处理水浸膏对种子萌发的影响2 3 3 2 2 乙醇处理水浸膏对幼苗生长的影响一2 5 3 2 3 乙醇处理水浸膏对种子活力的影响2 9 4以、结3 0 第二节水浸液中多糖类大分子活性研究3 3 l 材料与仪器一3 3 2 方法3 3 3 结果与分析3 4 3 1 乙醇沉淀处理各部分对种子萌发的影响3 4 3 2 乙醇沉淀处理各部分对幼苗生长的影响3 6 3 3 乙醇沉淀处理各部分对种子活力的影响。4 0 4j 、结4l 第三节黄檗果皮水浸液小分子类物质的分离及化感活性检测4 3 一、黄檗果皮水浸液小分子类物质硅胶柱分离4 3 l 材料与仪器4 3 2方法4 3 3 结果与分析4 4 3 1 硅胶柱分离各部分对种子萌发的影响4 4 3 2 硅胶柱分离各部分对幼苗生长的影响4 6 4 ，j 、结5l 二、活性部分d ( 1 5 1 3 5 4 ) 硅胶柱分离一5 l 1 材料与仪器5 1 2 方法5 2 3 结果与分析5 2 3 1d 部分硅胶柱分离各部分对种子萌发的影响5 2 3 2d 部分硅胶柱分离各部分对幼苗生长的影响5 4 目录 3 3d 部分硅胶柱分离各部分对种子活力的影响5 8 4 ，j 、节5 9 三、活性部分d 3 ( 1 3 7 2 5 4 ) 的分离6 0 l 材料与仪器6 0 2 方法6 0 3 结果与分析6 l 3 1 各组分对种子萌发的影响6 l 3 2 各组分对幼苗生长的影响：6 2 3 3 各组分对种子活力的影响6 5 4 d 、结6 6 第四节活性组分d 3 2 ( 1 1 4 7 ) 成分鉴定7 0 l 材料与仪器7 0 2 方法7 0 3结果7l 3 1 结构鉴定7 1 3 2h p l c e l s d 检钡4 结果7 l 4，j 、结7 l 第三章果糖和葡萄糖对种子萌发及生长影响的初步研究7 8 第一节葡萄糖和果糖对种子萌发及生长的影响7 8 l 材料与仪器一7 8 2 实验方法7 9 3 结果与分析8 0 3 1 对小麦的影响8 0 3 2 对油菜的影响8 9 3 3 对黄檗的影响9 5 4 结论1 0 3 第二节黄檗种子萌发过程中种子的霉变1 0 6 1 实验材料及仪器1 0 6 2方法10 6 3 结果与分析1 0 6 第三节葡萄糖、果糖抑制黄檗种子萌发和生长的原因初探1 0 9 l 材料与仪器1 0 9 2 实验方法l0 9 3 结果与分析1l o 3 1 黄檗种子萌发实验前后培养液中p h 值的变化“o 3 2 黄檗种子萌发实验前后培养液中葡萄糖和果糖的含量分析1 ll 3 3 溶液渗透压对种子萌发及幼苗生长的影响11 2 3 4 小麦种子培养过程中根的外观表现1 1 3 4 结论11 3 第四章不同产地黄檗果皮中葡萄糖和果糖的含量测定1 1 6 l 实验仪器及材料l1 7 2 实验方法1 l7 3 结果与分析1 1 8 4 讨论1 2 0 1 1 目录 第五章本文主要研究结果与结论1 2 3 一、黄檗果皮中抑制种子萌发和幼苗生长的物质分离鉴定1 2 3 二、葡萄糖和果糖对种子萌发及幼苗生k 影响的研究1 2 3 三、葡萄糖和果糖对种子萌发和幼苗生长抑制冈素的初步研究1 2 3 l 溶液渗透压对种子萌发及幼苗生长的影响1 2 3 2 黄檗种子萌发实验前后培养液中葡萄糖和果糖的含量分析1 2 3 3 黄檗种子萌发实验前后培养液中p h 值的变化。1 2 4 4 小麦种子培养过程中根的外观表现1 2 4 四、不同地区黄檗果皮中葡萄糖和果糖含量测定1 2 4 参考文献12 5 j $ 【谢13 0 作者简介1 3 1 i h 舌 1 上j l 刖舌 黄檗( 砌p 肋沈”加刀口聊甜阳珊pi 沁p r ) 是第三纪古热带植物区系的孑遗植物， 主要分布在我国东北及华北地区【l 】，作为伴生树种散生在阔叶红松林中，是我国东 北阔叶红松林的重要伴生树种，其韧皮部入药，即传统中药关黄柏1 2 j 。黄檗储存量 少，由于其药用价值和工业利用价值【3 】，黄檗资源的破坏十分严重，处于衰竭状态， 已被列为重点保护野生药材和国家二级保护物种【4 j 。 导致黄檗濒危的主要原因是超越限度的不合理利用，同时黄檗野生种群自我更 新障碍也阻碍了其资源的更新。黄檗为阳性树种，在林冠下更新不良【4 】，在林业上， 人们普遍认为黄檗的母树下没有幼苗，天然更新的幼苗均出现在远离母树的地方。 据文献记载【5 】及课题组前期对长白山地区不同生境的黑桦、紫椴、槭树群落；槭树、 黄檗群落；黄檗、槭树群落；黄檗、黑桦群落中黄檗种群的调查l 引，发现在各群落 中都少有黄檗幼年个体存在，种群的年龄结构极不合理，黄檗种群均为中、老龄个 体组成的成年型或衰退型，无自然更新能力或更新能力极差，种群呈衰退态势。但 在林缘、路边、村头、野山参种植场地等人为干预较多的地方，有幼年黄檗成片或 零散分布，并曾在已伐去乔灌木但未及时造林的山地上，发现高密度黄檗幼林。另 据对北京云蒙山、辽宁清原、辽宁仙人台国家森林公园、辽宁桓仁县老秃顶子国家 自然保护区、黑龙江尚至市帽儿山、黑龙江铁力市桃山的野外踏查，情况也与长白 山区相似。 化感作用最早由德国科学家m o l i s c h 在1 9 3 7 年提出，1 9 8 4 年砌c e 将其定义为： 植物或微生物的次生代谓! 分泌物对环境中其它植物、微生物或自身有利或不利的作 用。化感物质是指植物所产生的影响其它生物生长、行为和种群生物学的化学物质， 通过挥发、根分泌、淋溶、腐解等途径释放到环境i 7 1 6 1 。化感作用是影响植被天然 更新的重要因子，一些树种的更新失败与化感作用密切相判1 。m o j 。化感作用可通过 影响种子萌发而影响种群的建立和更新1 2 卜2 6 。 课题组多年的研究表明【6 j ，黄檗野生种群自我更新障碍是由黄檗的化感作用、 种子萌发特性和生境状况等因素共同作用的结果。黄檗野生种群土壤种子库各土层 中，均存在具有活性的黄檗种子。原生态种子萌发模拟实验证实，果皮和落叶的存 在是影响黄檗种子萌发的重要因素。室内实验亦证实，黄檗果皮中存在化感物质， 可抑制黄檗种子及其它种子的萌发。黄檗果皮的低温水浸液、热水提取液和乙醇粗 提物中，均存在抑制种子萌发和幼苗生长的物质。对黄檗果皮中具有抑制种子萌发 和幼苗生长的物质进行分离鉴定，对阐明黄檗野生种群更新障碍中的分子化学基 础、生理生态基础、基因调控模式、自我更新障碍的解除方法、遗传多样性的有效 刖茜 保护等具有重要的理论意义和现实意义，对稀有濒危植物的研究及保护具有重要的 指导意义。 本实验对黄檗果皮水溶性化感活性成分进行研究，借鉴天然药物化学的研究方 法和手段，对黄檗果皮低温水浸液中的成分进行提取和分离，并对每一步骤中的组 分进行化感活性生物检测【2 7 4 4 】，对有活性的组分进一步分离和活性筛选，最终确定 对种子萌发和幼苗生长具有抑制作用的化合物。就化合物对不同种子的萌发及幼苗 生长的影响进行研究。最后利用高效液相色谱仪蒸发光检测器建立黄檗果皮中葡萄 糖和果糖的分析方法，并对不同地区黄檗果皮中d 果糖和d 葡萄糖含量进行测定。 2 1 1 1 下存在自 群土壤种 子库各土层中，均存在具有活性的黄檗种子。原生态种子萌发模拟实验证实，果皮 和落叶的存在是影响黄檗种子萌发的重要因素。进一步的实验证实，黄檗果皮的低 温水浸液、热水提取液和乙醇提取物中存在抑制种子萌发和幼苗生长的化感物质， 可抑制黄檗种子及其它种子的萌发。 本实验对黄檗果皮水溶性物质进行系统研究，分离其中对种子萌发及生长有抑 制作用的化合物，确定其结构，并研究化合物对小麦、油菜、黄檗种子萌发及生长 的影响。最后对不同地区的黄檗果皮中化合物含量进行测定。 实验首先对黄檗果皮水浸液中蛋白质、多糖等大分子物质活性进行研究，经活 性检测，该两类物质对种子萌发和生长的抑制作用不明显，水浸液中小分子类物质 抑制作用极为显著。对小分子类物质利用硅胶柱色谱，氯仿、甲醇梯度洗脱进一步 分离，并进行生物活性跟踪，在具有抑制活性组分中分离得到单体化合物，经u c 核磁图谱、快原子轰击质谱( f a b m s ) 解析及高效液相色谱法( h p l c e l s d ) 检 测，确定化合物为：d 果糖和d 葡萄糖。 采用高效液相色谱法( h p l c e l s d ) 测定黄檗果皮水浸液中d 一果糖和d - 葡萄 糖的含量，分别为2 5 5 8 和2 1 8 1 ，利用d 果糖和d 葡萄糖对照品配置与水浸液 中含量相同的溶液：d 果糖处理液、d 一葡萄糖处理液、d 果糖和d 葡萄糖合并组 处理液，考察其对小麦、油菜及黄檗种子萌发及生长的影响作用，并对抑制原因进 行初步研究。结果表明：d 果糖和d 葡萄糖合并组处理液在相当于每毫升含果皮 5 0 m g 以上时，对种子活力产生显著抑制作用；对三种种子的发芽率和发芽指数产 生显著的抑制作用，对苗高、根长、苗重、根重也有显著的抑制作用，且随着浓度 的增加，抑制强度增加。在7 5 1 2 5 m 幽n l 浓度范围内，d 果糖和d 葡萄糖合并组 处理液能够完全抑制黄檗种子的萌发和幼苗生长。经培养后的处理液，d 果糖和 d 葡萄糖合并组对d 葡萄糖的利用率较高，同时处理液的p h 值达到2 0 3 5 的较 强酸性范围内。对d 果糖和d 葡萄糖合并组处理液、水浸液培养过程中根的变化 进行微观观察发现，随培养时间增加，根尖的透光性逐渐减弱，看似细胞壁加厚并 出现皱缩现象，荧光强度逐渐减弱。 为考察渗透压对种子萌发和幼苗生长的影响：分别用d 一果糖和d 葡萄糖配置 与d 果糖和d 葡萄糖合并组处理液相同渗透压的处理液。小麦种子萌发及生长结 果显示：d 果糖和d 葡萄糖合并组处理液对种子萌发及生长的抑制与渗透压无明显 摘 要 关系，可排除渗透压的影响。 上述实验说明，黄檗果皮中的d 果糖和d 葡萄糖同时存在时，对种子萌发和 幼苗生长有抑制作用，并且d 果糖和d 葡萄糖在果皮中含量较高，为考察高含量 糖是否为普遍现象，对黄檗主产区8 个来源的黄檗果皮中两种糖的含量进行了检测， 结果d 果糖含量在1 4 4 4 2 7 0 1 之间，d 葡萄糖含量在l o 1 4 2 2 7 8 之间。 两者含量均普遍较高。 关键词：黄檗，种子，化感作用，水溶性成分，化学分离 4 摘要 a b s t r a c t ： 砌p z ，d 沈门d 幻刀口，行讹瑚pr u p r i sc o m m o n l yu s e dc h i r l e s em e d i c i n eo fc o r t e x ，w h i c h i sar a j ea j l de n d a l l g e r e ds p e c i e se x i s ti 1 1t h ew i l ds t a t eb a 砸e r st os e l f r e n e w a l ，r e s u l t i n g i n 也ed e c l i n eo fw i l dp o p u l a t i o n s p r e l i m i n a 巧咖d yb yo u rg r o u pc o n f i 姗e dt h a ts o i l s e e db a i l l ( o f w i l ds p e c i e si nd i 虢r e n td e p mo fs o i la l le x i s t a c t i v i 锣s e e d so f 砌p 肋幽以加以绷“陀瑚p r u p r o r i g i n a ls e e dg e 肋i 彻t i o ns i m u l a t i o ne x p e r i m e n t s c o i l | ；l 姗e dt h ee x i s t e n c eo fp e e la n dd e c i d u o u sw e r ea ni m p o r t a n tf a c t o ri ns e e d g e m l 证a t i o n f u r m e re x p e r i m e n t sc o 西衄e dt h a ta l l e l o c h e m i c a l s p r e s e n t i nm e l o w 妃r n p e r a t u r ea q u e o u se x n 娜t s，w a t e re x t 锹a l l de t h a n o le x n 犹ta b o u tp e e lc 肌 i 1 1 1 1 i b i tt h es e e dg e m i n a t i o n 觚ds e e d i n gg r 0 吼h ，w t l i c hc a l li i l l l i b “e dg e 衄i n a t i o n ， i n c l u d i n gm es e e d so fj 协p ，幻沈刀西d 刀册“彤珊pr u p r a n do m e r s t h ee x p e r i m e n t so nwa _ t e r - s o l u b l es u b s 觚e so fp e e l ，s 印删i o no fw h i c ho ns e e d g e m l i 董1 a t i o na 1 1 dg r o w t hi 枷b i t o 巧c o m p o u n d s ，d e t e n l l i n et h e i rs m l c t u r e ，a i l dt 0 咖d yt h e c o m p o u n d so nw h e a t ，r a p e ，s e e do f 鼢p z ，d 沈刀d 而拧删讹珊pr u p r g e m l i n a t i o n 锄d 筝o w t l l f i n a l l y ，c o m p o u i l d sc o n t e n to fp e e li i ld i 丘e r e n tr e g i o n s 、e r ed e t e n 】a i n e d e x p e r i m e n tf i r s tp e e la q u e o u se x t r a c t s o fp r o t e 札 p o l y s a c c h a r i d e s a i l do t h e r m a c r o m o l e c u l e st os m d ya c t i v i 移b ya c t i v i 锣a 1 1 a l y s i s ，t l l et w os u bs j t a n c e so ns e e d g e m l i m l t i o na n d 黟o w t hi n h i b i t i o nw a sn o to b v i o u s ，b u tt h es m a l lm o l e c u l a rf r o mw a t e r e x t r a c ts u b s t a i l c e s 、r es i g i l i f i c a n t l yi n 王l i b i t e d s m a l lm o l e c u l a rs u b a t a n c e so ns i l i c ag e l c o l u i 】【l i lc h r o m a t o 聊h y ，c h l o r o f o r m ，m e t h 锄o lg r a d i e n te l u t i o nf o r 如r t h e ri s o l a t i o na i l d b i o l o g i c a la c t i v 时t r a c k i n g ，i i l h i b i tt h ea c t i v ec o m p o n e n ti nt h ei s o l a t e dc o m p o m l d sb y u c _ n m r ，f a b m sa 1 1 dh p l c e l s dt od e t e m l i n en l ec o m p o u n d s ：d f l m c t o s ea n d d - 西u c o s e t h ec o n t e n to fd 一6 m c t o s ea n d d g l u c o s e w e r em e a s u r e db y h p l c e l s d ， r e s p e c t i v e l y2 5 5 8 a i l d2 1 8 1 u s eo fd 一矗1 j c t o s ea n dd g l u c o s er e f e r e n c es t a i l d a r d c o i l f i g u r a t i o na n dc o m e n to fa q u e o u se x 仃a c t so ft h es a m es o l u t i o n ：d - m l c t 0 s ep r o c e s s i n g s o l u t i o i l ，d g l u c o s es o l u t i o n ，d - f n l c t o s ea i l dd - 弭u c o s es o l u t i o nc o m b i n e d 晚a t m e n t 印u p ，s t u d yw h e a t r a p ea n ds e e do fj 协p z 如( 把刀加”口聊z f 陀瑚pr u p r g e m i n a t i o na n d g r o w t l l ，a i l dp r e l i m i n a r ) ，a i l a l y s i so ft h er e a s o n sf o rs u p p r e s s i o n t h er e s u l t ss h o 、e dm a t t l l ea c t i v i 够o fs e e d ，t h em r e es e e dg e n n i n a t i o nr a t ea i lg e 姗i n a t i o ni n d e x ，t h es e e d d e v e l o p n l e n ti 1 1 c l u d i n gh e i g h t ，r o o tl e n g m ，s h o o tw e i g h t ，r o o tw e i g h t 、张r es i g m f i c a n t l y i 出b i t e db yd f m c t o s ea 1 1 dd 9 1 u c o s ec o m b i n e dg r o u po f 船a n n e n ts o l u t i o nc o n t a i n i n g 摘要 t h ee q u i v a l e n to fp e e l5 0 m m lo rr n o r e ，a n di n l l i b i t i o ni n c r e a s e dw i t t lt l l ec o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d i n t h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f7 5 t o12 5 m 咖l ，d - f m c t o s ea n dd g l u c o s e c o m b i n e dg r o u pc a nc o m p l e t ei i t h i b i ts e e dg e m l i n a t i o na n ds e e dg r o w t h a r e rt h ec u l t u r e m e d i u mu s e d ，d 一向t o s ea r l dd - g l u c o s ec o m b i n e dg r o u po nt h ed - g l u c o s eu t i l i z a t i o n r a t ei s h i 曲e r ，w h i l e t h e t 1 e a t i n g s o l u t i o no fp hr e a c h e d2 0 t 0 3 5 m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o no fc h a n g e si nr o o tb yc u l t u r eo nd - 加c t o s e 锄dd g l u c o s ec o m b i n e dg r o u p ， a q u e o u se x t r a c t s ，w i mi n c r e a s i n gt i m e ，t i po ft h el i g h tt r a n s m i s s i o nd e c r e a s e s ，l o o l 【sl i k e c e nw a l lt h i c k e i l i n g ，a n da p p e a r ss l l r i m k ，f l u o r e s c e n c ei m e n s i t ) ，g r a d u a l l l yd e c r e a s e d p r e p a r et h et r i ：a t i n gs o l u t i o n s 晰t hd f m c t o s e 觚dd g l u c o s er e s p e c t i v e l y ，w t l i c hh a s t l l es 锄eo s m o t i cp r e s s u r ew i t ht h ed - f m c t o s ea i l dd - g l u c o s ec o m b i n e dg r o u po f t r e a t m e n ts o l u t i o n ，t oi r l v e s t i g a t et h eo s m o t i cp r c s s u r eo ns e e dg e m i n a t i o na i l ds e e d g r o w m s e e dg e 姗i n a t i o na n dg r o w li n l l i b i t i o na 1 1 dn os i g i l i f i c a mr e l a t i o n s t l i pb e t w e e n o s m o t i c ，o s m o t i cp f e s s u r ee 虢c t sc a nb er u l e do u t a r e rt h ee x p e r i m e n t ，s e e dg e m l i n a t i o na n ds e e d 孕d w 吐1w e r ei i l l l i b i t e dw h e nt h e r e 、e r ed - f i m c t o s e 锄dd g l u c o s ei i lt h ep e e l ，a n dt l l ec o n t e n to fd - f i m c t o s ea n dd g l u c o s c w e r eh i 曲e ri nt h ep e e l t bd e t e m i n et w ok m so fs u g a rc o n t e n ti n4m a i np r o d u c i n g a r e 勰，b o t hc o n t e n t sa r eg e n e r 越l yh i g e r d f m c t o s ec o n t e mo fl4 4 4 2 7 0l ， d 酉u c o s ec o n t e n to fl0 14 2 2 7 8 k e yw o r d s ：用，p 肋比刀加以 绷“肥瑚pr u 弘， s e e d ， a l l e l o p a t h y ，w a t e r - s o l u b l e c o m p o n e n t s ，c h e m i c a ls 印踟t i o n 6 第一章糖类成分对植物活性作用研究简介 第一章糖类成分对植物活性作用研究简介 糖在植物的生命周期中具有重要作用，它不仅是一种能量来源和结构物质，同时 还是一种信号分子，可对植物的生长发育和基因表达进行调控。糖类物质根据结构可 分为单糖、低聚糖和多糖。单糖和多糖对人体及动物体的活性作用研究较多，但对 植物的活性作用未见报道。低聚糖作为一种新型的植物调节剂，研究工作较多。本 文将就低聚糖对植物活性的研究进行介绍。 一、糖的分类及定义 糖类( s a c c h a r i d e ) 亦称碳水化合物，一般分为单糖、低聚糖和多糖，将单一分 子结构的糖称为单糖( m o n o s a c c h 撕d e ) ；由2 1 0 个单糖通过苷键结合而成的直链或 支链聚糖称之为低聚糖( o l i 9 0 s a c c h 撕d e ) ，亦称寡糖；l o 个以上单糖通过苷键链接而 成的糖称为多聚糖( m e g a r o s a c c h 撕d e ) ；1 0 0 个以上单糖分子构成的糖苷为多糖 ( p o l y s a c c h 撕d e ) 。构成低聚糖的单糖结构单元主要是五碳糖和六碳糖，基本上由六 种单糖所组成，即葡萄糖( g l u c o s e ) 、果糖( f l m c t o s e ) 、木糖( x y l o s e ) 、阿拉伯糖 ( 觚凼i n o s e ) 、半乳糖( g a l a c t o s e ) 、和甘露糖( m 黜0 s e ) 等。这些单糖以直链或分枝 结构形成众多低聚糖。根据构成低聚糖的单糖的种类又可将低聚糖分为同源性低聚 糖( h o m o o l i 9 0 s a c c h a r i d e ) 即由同一种单糖在不同的位置反复成苷结合而构成的低聚 糖；异源性低聚糖( h e t e r 0 o l i 9 0 s a c c h a r i d e ) 即由两种或两种以上单糖构成的低聚糖； 低聚糖的衍生物，即在低聚糖的侧链上修饰不同的化学基，包括羧基、胺基、磷酸 基、磺酸基等。如脱氧糖、胺基糖、糖醛酸等；在还原末端加上氢离子构成的糖醇 类低聚糖。 周晓丽沿用蛋白质、核酸结构的分析方法，认为低聚糖及多糖是由单糖( 糖基) 问以糖苷键连接而成糖链，并在此基础上再卷曲、回旋、折叠而成二级、三级结构， 并认为低聚糖的三级结构对于了解它在生物体内的功能有着重要意义【4 5 】。 低聚糖具有低热、水溶性好、稳定、安全无毒、对人畜无害、能迅速降解、无 残留、不污染环境等良好的理化特性m 4 7 1 。自然界中存在大量的低聚糖类化合物， 这为人们研究和了解低聚糖提供了丰富的资源。同时，依据天然低聚糖结构进行改 造得到众多低聚糖类衍生物，不同种类的低聚糖或不同来源的低聚糖，对人、动物、 植物具有特定的生物学活性【4 8 】。 7 第一章糖类成分对植物活性作用研究简介 二、低聚糖素及其对植物活性作用 1 低聚糖素 低聚糖作为信号分子最早是在植物中发现的，1 9 7 4 年，a l b e r s h e i m 和v a l e n t 首次 发现跏y f 印乃砌d r 口聊删p 朋口v 札s o j a e ( 大豆疫霉) 细胞壁降解物可作为信号分子 激发大豆中大豆植保素的合成【4 9 】。具有生物活性的低聚糖被称为低聚糖素。低聚糖 素是一类生物活性分子，具有调控植物生长、发育、繁殖、防病和抗病等方面的功 能，是除人们熟知的五种植物激素：生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯 以外的，被发现的新型植物激素( 或称植物调节分子) 1 5 。 不同结构的低聚糖具有特定的生物活性。已报到的低聚糖的生物活性包括：启 动植物的防病抗病机制、调节植物的生理过程、调控植物代谢及诱导植物抗毒素的 产生，其中，低聚糖作为激发子，诱导植物抗病的研究最为深入。另外，低聚糖在 组织培养、细胞培养及悬浮培养中亦有着广泛应用。 2 低聚糖诱导植物抗病作用的研究 2 1 低聚糖激发子的种类 低聚糖是最早发现且研究得最深入的能诱导植物植保素合成的激发子，曾被认 为是植物细胞有别于动物细胞的特有的信号分子【5 1 1 。已鉴定低聚糖类激发子主要 有：葡聚寡糖、半乳糖醛酸寡糖、木葡聚寡糖、几丁质寡糖及壳寡糖等。 2 1 1 葡聚寡糖 葡聚寡糖主要是由植物的酶作用于病原菌的细胞壁而产生，聚合度大于7 的特 定异构体具有激发子活性。第一个被发现的葡聚糖激发子是从大雄疫霉大豆专化型 ( 川础砌卯朋9 翻印p 朋口却g l y c i n e a ) 的培养滤液中检测出来的，发现能诱导大 豆植保素积累和对病毒粒子增殖有抑制作用，后在商用酵母浸出物中也纯化到。经 确定它的结构是由p 1 ，6 和b 1 ，3 连接组成的葡聚七糖，这是迄今为止发现的最 具有活性的物质，其用量在l o i l m 即可达到活性浓度。热水浸提和部分水解真菌细 胞壁都可得到寡聚葡萄糖素【5 2 1 ，只有具有一定聚合度的寡聚糖素才有诱导活性，但 即使聚合度相同，也有很多构型没有活性。热水浸提或酸水解得到大雄疫霉的菌丝 细胞壁寡聚糖片段中，发现在聚合度p d 6 的0 葡聚糖片段中有激发子活性。进一 步分离，对七聚体结构测定证明，其中4 种有活性异构体( 1 、4 、7 、8 ) 都具有相 同的分支类型，即都是1 6 主链上带有1 3 葡糖基侧链的葡聚糖。改变糖苷键的性 质或支链的长度或位置都将引起活性的极大下降。改变或修饰末端糖链上的基团， 也会引起活性很大下降【5 3 1 。这些表明，低聚糖激发子必须有特定的结构特征。经证 8 第一章糖类成分对植物活性作用研究简介 明m 5 5 1 ，这种b 庚葡聚糖苷激发子结构如下： b g l c _ 1 6 一b g l c l 一6 一b 川l c 一1 6 _ b g 1 r 1 6 一b g l c fl 一3f1 - 3 b g l c8 g l c 是一种l ，6 或1 ，3 糖苷键的，带两个相间单糖支链的低聚糖。 a y e r 等用这种葡聚糖激发子处理大豆幼苗的子叶或下胚轴后，发现每个子叶或 下胚轴只需0 2ug 或o 1ug 即可促进合成并积累大豆植保素。在处理后1 0 1 2 h 就能 检测到大豆植保素的积累，此后至少l o h 内积累量持续升高，到最高后缓慢下降【5 0 j 。 j u r g e n 等向大豆悬浮培养细胞中加入相同激发子，发现3 h 后苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 活性开始上升，1 5 2 0 h 达到最高，然后缓慢下降【5 3 1 。 2 1 2 半乳糖醛酸寡糖苷 多聚半乳糖醛酸苷是植物细胞壁重要结构成分。当病原菌侵染植物时可通过分 泌聚半乳糖醛酸酶降解植物细胞壁产生大量寡聚半乳糖醛酸苷寡糖片段。经结构鉴 定，这种激发子分子结构是a 1 ，4 连接的半乳糖醛酸残基的线状寡聚体。一般聚 合度( d p ) 在4 1 5 时都有诱导活性，而以d p 在l o 1 5 通常诱导效果最好1 5 5 j 。 该类低聚糖的诱导活性最早是在用冻融的菜豆茎片段接种健康茎片段后，发现 健康茎片段植保素积累而发现的。后来在菜豆和大豆组织沸水抽提液和分离的大豆 细胞壁中也观察到同类的物质存在【5 3 l 。部分降解均一的多聚半乳糖醛酸和具有不同 甲酯化程度的植物细胞壁所得到的寡聚糖都能诱导植物抗病性反应。 2 1 3 木葡聚寡糖 木聚糖是高等植物的初生细胞壁主要构成成分之一，用内切b 1 ，4 葡聚糖酶 降解木葡聚寡糖可得到不同聚合度的低聚木糖。研究发现它们能抑制2 ，4 d 和赤 霉素引起的细胞伸长，能刺激葡聚糖酶及几丁质酶的活性两5 7 1 。末端的岩藻糖对其 抑制生长的活性至关重要，带有岩藻糖一半乳糖支链的寡聚木糖的活性较高。 2 1 4 几丁质寡糖( 寡乙酰葡萄糖氨) 和壳寡糖( 寡聚葡萄糖氨) 几丁质( c l l i t i n ) 又名甲壳质、壳多糖等，学名为0 一( 1 ，4 ) 2 一乙酰氨基一2 一脱氧 一d 葡聚糖，是真菌细胞壁的主要组分。壳聚糖是几丁质脱乙酰化的产物。几丁质 寡糖和壳寡聚糖的结构分别为8 1 ，4 连接的乙酞氨基葡萄糖或b 1 ，4 连接的氨基 葡萄糖。可通过降解几丁质和壳聚糖或从真菌的孢子和细胞壁得到。 几丁质寡糖和脱乙酰几丁质寡糖对许多植物都有激发防卫反应的作用f 5 3 1 ，如诱 导小麦木质素合成，诱导水稻悬浮培养细胞植保素合成、膜去极化等多种抗性响应。 对于不同的实验材料，几丁质起作用的片段大小及结构不同。聚合度大于4 的脱乙 9 第一章糖类成分对植物活性作用研究简介 酰和部分n 乙酰化寡聚葡糖胺对番茄和马铃薯叶片都是有效的激发子。在水稻和小 麦中聚合度为7 或8 的片段在州浓度水平就可起到激发子活性。 2 2 低聚糖诱导植物抗病作用机制 目前认为诱导物参与寄主一病原相互作用的主要方式为诱导物与寄主受体分 子识别模式。这个信息传递过程可能涉及以下几个步骤：首先，低聚糖分子与植物 细胞膜上受体结合，相互作用产生信号；之后，细胞内信号传导途径被激活并将信 号传导和放大；最后，信息被翻译，即激活与防御反应有关的特定的基因，以激发 一系列生化防御反应来限制病原物的入侵1 5 引。 2 2 1 低聚糖诱导植物物理屏障的产生 据单家林报道，橡皮树在喷洒低聚糖后，叶片的角质层厚度明显增厚，上表皮 细胞外壁厚度也增加，表皮细胞原生质体积缩小。细胞壁及角质层增厚均加快，可 以加快叶片老化速度，大大增强橡胶树叶片抗侵染、抗扩展的能力，而原生质体积 小，使得提供病原菌的营养减少，就能抑制病原菌的生长繁殖而起到抗病作用【5 w 。 胡景江用低聚糖诱导杨树愈伤组织的抗病性发现，诱导处理后木质素的合成加 速，含羟脯氨酸糖蛋白( h r g p ) 积累，这些能增强细胞壁的抗穿透能力，阻止病 原真菌的穿透入侵过程。结果表明：经过低聚糖诱导后，叶片的组织结构会发生变 化，形成一个物理屏障，机械阻碍病原物的入侵唧】。 2 2 2 低聚糖对植物体内与抗逆活性有关酶的作用 苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 、过氧化物酶( p o d ) 、多酚氧化酶( p p o ) 、过氧化氢 酶( c a t ) 及超氧化物岐化酶( s o d ) 是植物体内与抗逆活性有关的酶系，各种酶 类活性的增强，可提高植物的抗病性。研究表明，诱导抗病性的物质如木质素、植 保素，以及酚类化合物大都沿着苯丙烷类代谢途径合成。苯丙氨