（分析化学专业论文）化学修饰电极在毛细管电泳——安培检测中的应用研究.pdf

论文摘要 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 。c e ) 是以高压电场为驱动力，以毛细 管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度或和分配行为上的差异而实现分离 的一类新型液相分离技术。毛细管电泳具有高效、快速、经济、环保等优点，其 研究和应用广泛涉及了环境分析、药物分离、生化分析等几乎所有的分析领域。 毛细管电泳具有多种联用检测技术，如紫外检测、荧光检测、电化学检测和质谱 等。其中，电化学检测中的安培检测技术，相对而言具有较高的灵敏度，且仪器 简单、成本低廉、线性范围宽、操作简便，因而毛细管电泳一安培检测法在分析 化学领域得到了广泛的研究、应用和发展。本论文基于毛细管电泳一安培检测技 术高效、快速、灵敏、方便的优势，从化学修饰电极入手进行探索，以期提高毛 细管电泳一安培检测法的灵敏度，改善毛细管电泳的分离效果。本论文主要分以 下四个部分： 第一章为绪论。简要地综述了毛细管电泳的基本原理、分离模式、联用检测 技术，以及本论文研究的目的和意义。 第二章p e g c u 2 0 碳糊修饰电极在糖类物质和抗坏血酸的毛细管电泳一安 培检测中的应用研究 本章的工作是研究制作了一种新型的同时以聚乙二醇和氧化亚铜为修饰剂 的双修饰剂碳糊修饰电极( p e g c u = oc p m e ) ，并将其应用于对糖类物质和抗坏 血酸的毛细管区带电泳一安培检测。在研究中，通过实验考察各种实验参数对分 离检测的影响，最终实现了对葡萄糖、蔗糖、果糖和抗坏血酸的同时分离和检测。 与未经修饰的纯碳糊电极相比，p e g c u e 0 碳糊修饰电极在相对较低的检测电位 下( + o 3 vv s s c e ) 具有较好的催化氧化特性，灵敏度显著提高。在最优化的实 验条件下，以p e g c u ：o 碳糊修饰电极为工作电极，上述四种组分在2 2 r a i n 内可 以得到完全的分离检测。葡萄糖、蔗糖、果糖和抗坏血酸的线性范围均为 1 0 x 1 0 击5 o x l o 巧m o ll 1 ，检测限达到1 0 1 0 。7 m o ll 1 ( 信噪比为3 ) 。本法具有 分离效率高、分析操作简便、检测灵敏度高、结果重现性好等优点，对实际样品 的检测令人满意。 第三章m w c n t - c u 2 0 碳糊修饰电极在氨基酸的毛细管电泳一安培检测中的 应用研究 氨基酸是蛋白质的基本组成单位。一直以来将c e 用于对氨基酸进行分离分 析的主要问题是熔硅毛细管壁对正电荷氨基酸的吸附及氨基酸检测的困难。氨基 酸的检测，因其本身缺乏用于检测的物理性质，如光吸收、光发射和电化学活性， 所以常常需要各种衍生技术使其具有光活性或者电化学活性。本文检测氨基酸， 摒弃传统的衍生法，而是首次利用氧化亚铜和多壁碳纳米管同时做碳糊电极修饰 剂，用该碳糊修饰电极对六种氨基酸成功进行了毛细管区带电泳一安培检测。在 最佳实验条件下，以m w c n t c u 2 0 碳糊修饰电极为工作电极，精氨酸、色氨酸、 组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸六种物质可在2 0 r a i n 内达到基线分离，其检测 限达1 0 7 1 0 t o o ll 1 数量级( 信噪比为3 ) ，该方法简便易行，灵敏度高，检测 结果令人满意。 第四章菊花中黄酮类物质的毛细管电泳一安培检测 菊花是一种兼具食用、观赏和药用价值的草本植物，对菊花中药用成分的研 究对于人类健康具有很大实际意义。本文针对菊花中的黄酮类物质，通过实验测 试了多种缓冲添加剂对毛细管电泳一安培法检测结果的影响，最终确立了合适的 缓冲添加剂及其添加位置，实现了对菊花中黄酮类物质的分离检测。在最佳的实 验条件下，以碳圆盘电极为工作电极，六种黄酮类物质在2 0 r a i n 内达到基线分离， 检测限最低达到1 0 喝gm l 。实验结果表明，使用该经过优化的毛细管区带电泳 一安培检测法，分离检测具有较高的灵敏度和较好的重现性，用于对菊花实际样 品的检测，结果令人满意。 关键词：毛细管电泳，安培检测，碳糊修饰电极，糖，抗坏血酸，氨基酸，黄酮 类 a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) i sap o w e r f u ll i q u i dp h a s es e p a r a t i o nt e c h n i q u e t h es e p a r a t i o np r i n c i p l ei sb a s e do nt h ep h e n o m e n at h a ti o n i z e dm o l e c u l e so f d i f f e r e n tm a s sa n d c h a r g ew i l l 仃a v e lw i t hd i f f e r e n tv e l o c i t i e st h r o u g haf u s e ds i l i c a c a p i l l a r yu n d e rt h ei n f l u e n c eo fah i 曲v o l t a g ee l e c t r i cf i e l d o w i n gt ot h eh i g h s e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , r a p i da n a l y s i s ，m i n i m u mc o n s u m eo fs a m p l e sa n d e n v i r o n m e m a lf r i e n d l i n e s s ，i th a sf l o u r i s h e di nw i d ea r e a ss u c ha se n v i r o n m e n t a l a n a l y s i s ，p h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s ，b i o c h e m i c a la n a l y s i s ，a n df o o da n a l y s i se t c t h e r ea r em a n yd e t e c t i o nm e t h o d o l o g i e sc o u p l e d 衍t 1 1c e ，s u c ha su v s i b l e d e t e c t i o n ( u v - v i s ) ，l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ( l i f ) ，e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n ( e d ) a n dm a s ss p e c t r u m ( m s ) t h em a j o rb a r r i e r sf o rc es y s t e m i n t e g r a t i o n w i t hl i fa n dm se t c a r ef l u i d i c i n t e r f a c e ，s a m p l ep r e t r e a t m e n t ( f l u o r e s c e n c ed e r i v a t i z a t i o n o rl a b e l i n g ) ，e t e s i n c ee d ，e s p e c i a l l ya m p e r o m e t r i c d e t e c t i o n ( a d ) h a sm u c ha d v a n t a g eo v e ro t h e rw i d e l yu s e dt e c h n i q u e si nt h a ti ti s m u c hm o r ee c o n o m i c a l ，w i t h o u tc o m p l i c a t e dp r e t r e a t m e n tp r o c e d u r e ，a n di tp r o v i d e s g o o ds e l e c t i v i t ya sw e l la sh i g hs e n s i t i v i t y , i th a sf l o u r i s h e dt ov a r i o u sa r e a s f r o mt h e s t a n d p o i n to fb r o a d e n i n gi t sa p p l i c a t i o na r e a s ，w em a i n l yf o c u so nt h ed e v e l o p m e n to f n e wc h e m i c a l l ym o d i f i e de l e c t r o d e ( c m e ) a n dn e wm e t h o do fc e a d t h i sp a p e rb e g i n sw i t hab r i e fi n t r o d u c t i o no fc e ，i t ss e p a r a t i o nm o d e l sa sw e l la u s v a r i o u sd e t e c t i o nm e t h o d o l o g i e s c h a p t e r2i st h ed e t e r m i n a t i o no ft h r e ek i n d so fc a r b o h y d r a t et o g e t h e rw i t h a s c o r b i ca c i d b yc a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s w i t h a m p e r o m e t r i c d e t e c t i o n ( c z e - a d ) a tac a r b o np a s t em o d i f i e de l e c t r o d e i nt h i sp a p e r ，ak i n do fn o v e lc a r b o n p a s t ee l e c t r o d em o d i f i e dw i t hd o u b l em o d i f i e r s p o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g ) a n d c u 2 0 ( p e g c u 2 0c p m e ) i nc z e a dw a sa p p l i e dt os i m u l t a n e o u s l yd e t e r m i n e g l u c o s e ，s u c r o s e ，f r u c t o s ea n da s c o r b i ca c i d ( a a ) t h ec a t a l y t i ce l e c t r o c h e m i c a l p r o p e r t i e so fp e g c b 2 0c p m ec o u l de n h a n c es e n s i t i v i t yo b v i o u s l yc o m p a r e dw i t h c a r b o np a s t ee l e c t r o d em o d i f i e dw i t h o n l yp e go rc u 2 0a tar e l a t i v e l yl o w e r d e t e c t i o np o t e n t i a l ( + 0 3 vv s s c e ) t h ef o u ra n a l y t e sc o u l db ep e r f e c t l ys e p a r a t e d w i t h i n2 2m i n ，t h el i n e a rr a n g e sw e r ef r o m1 0 1 0 6t o5 0 x1 0 5m o ll 1 a n dt h e d e t e c t i o nl i m i t sw e r ea t10 叫m o ll - 1 m a g n i t u d e ( s n = 3 ) t h ep r e s e n tw o r k i n g e l e c t r o d ew a ss u c c e s s f u l l ye m p l o y e dt oa n a l y z eb e v e r a g es a m p l e sw i t hr e c o v e r i e si n t h er a n g e9 3 10 7 a n dr s d sl e s st h a n4 t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t c z e i i l c o u p l e d 、撕mt h ep e g c u 2 0c a r b o np a s t em o d i f i e d p r e p a r a t i o n ，h i g hs e n s i t i v i t y , g o o dr e p e a t a b i l i t ya n d d e t e r m i n a t i o no fp r a c t i c a ls a m p l e s e l e c t r o d ew a so fc o n v e n i e n t c o u l db e u s e di nt h er a p i d c h a p t e r3s t a t e st h ed e v e l o p m e n to fan o v e ld o u b l em o d i f i e rc a r b o np a s t e e l e c t r o d e am w c n c u 2 0c p m ea n di t sa p p l i c a t i o no ns e v e r a la m i n oa c i d s a m i n oa c i d sa r ee s s e n t i a lb u i l d i n gb l o c k so fb i o l o g i c a lm o l e c u l e s t h o u g ht h e ya l es o i m p o r t a n tt oh u m a nb e i n g s ，i ti s t os o m ee x t e n tv e r yd i f f i c u l tt os e p a r a t ea n d d e t e r m i n ea m i n oa c i d sb e c a u s eo ft h e i r a d s o r b a b i l i t y t os i l i c a c a p i l l a r ya n d n o n - o p t i c a la n dn o n e l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t yf o rd e t e c t i o n i nt h i sp a p e r ，ac a r b o n p a s t ee l e c t r o d em o d i f i e dw i t hm u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e sa n dc o p p e r ( i ) o x i d e ( m w c n t - c u 2 0c p m e ) w a sf a b r i c a t e da n dt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so f n i n e t e e nk i n d so fn a t u r a la m i n oa c i d sa tt h i sm o d i f i e de l e c t r o d e 、e r es t u d i e d t h e m w c n t c u 2 0c p m ew a sa l s os u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ec z e a do fs i xk i n d so f a m i n oa c i d s u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h e s ea l t l j i l oa c i d sc o u l db e p e r f e c t l y s e p a r a t e dw i t h i n2 0r a i na n dt h e i rd e t e c t i o nl i m i t sw e r ea sl o wa s10 7o r10 8t o o ll 。1 m a g n i t u d e ( s n = 3 ) ，w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a tm w c n t - c u 2 0c p m ec o u l db e s u c c e s s f u l l ye m p l o y e da sa l le l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rf o ra m i n oa c i d sw i t hs o m e a d v a n t a g e so fc o n v e n i e n tp r e p a r a t i o n ，h i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o dr e p e a t a b i l i t y t h el a s tc h a p t e ri sf o c u so nt h eo p t i m i z a t i o no fc z ef o rac o m p l i c a t e ds y s t e m c h r y s a n t h e m u m i sah e r b a c e o u s p e r e n n i a lp l a n tp o s s e s s i n ga n t i m i c r o b i a l ， a n t i b a c t e r i a l ，a n t i f u n g a l ，a n t i v i r a la n da n t i - i n f l a m m a t o r ya c t i v i t i e s ，w h i c hm o s t l y o w i n gt o i t i n g r e d i e n t so ff l a v o n o i d s h e r ei nt 1 1 i sr e s e a r c hw ef o c u so nt h ec z e s e p a r a t i o no fs i xk i n d so ff l a v o n o i d si nc h r y s a n t h e m u m w i t ht h eh e l po fd i f f e r e n t a d d i t i v e si n t ob u f f e ra n ds a m p l e ，t h e yc o u l dg e tb a s e l i n es e p a r a t i o nw i t h i n2 0r a i na n d t h el o dc o u l dr e a c h10 - 8 9m l m a g n i t u d e t h es u c c e s s f u lp r a c t i c a la p p l i c a t i o no n t h ed e t e r m i n a t i o no fc h r y s a n t h e m u ms a m p l e sc o n f i r m e dt h ev a l i d i t ya n dp r a c t i c a b i l i t y o ft h i sm e t h o d k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ，c a r b o np a s t e m o d i f i e de l e c t r o d e ，s u g a r s ，a s c o r b i ca c i d ，a m i n oa c i d s ，f l a v o n o i d s i v 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 日期o 纱 学位论文授权使用声明 弘 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 学位论文作者签名：强时 怵埘年州7 日 导师签名：叫葡 啡啡嗍7 日 第一章概论 第一章概论 毛细管电泳原理概述 1 1 毛细管发展简史 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 又叫高效毛细管电泳( h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，h p c e ) ，是近年来发展最快的一种液相分离 分析技术，是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。毛细管电泳实际 上包含电泳、色谱及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱( h p l c ) 之后 的又一重大进展，因其可与气相色谱( c - c ) 以及高效液相色谱相媲美，被认为 是当代分析科学最具活力的前沿研究课题。毛细管电泳技术自八十年代以来得到 了迅速发展，在分析化学、生物医学及药物分析等几乎所有的分析领域得到了广 泛应用。 毛细管电泳这种分离分析方法虽新，但历史久远。c e 历史可上溯到1 9 世 纪6 0 年代中期。当时，瑞典科学家h j e r t e n 率先在高场强、内径3 m m 的管中 作自由溶液的区带电泳，但效果不佳 1 】。1 9 7 0 年，e v e r a e r t s 报道了在毛细管等 速电泳( c i t p ) 系统上得到c z e 结果，但柱效较低 2 】。1 9 7 4 年，芬兰的v i r t a n e n 提出用2 0 0 - - 5 0 0 p m 内径玻璃管进行c e 分离 3 】，后来为m i k k e r s 等人证实。 1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 使用了更细的毛细管( 内径7 5 i _ t m ) ，以荧光在线 检测进行试验，获得高效分离( 理论板数达4 x 1 0 5 ) 4 】4 ，这样高的柱效是以前 的分离方法所从未达到的，他们十分成功的实验和异常出色的理论工作，轰动 了分离科学界，成为毛细管电泳发展史上的一个里程碑。1 9 8 4 年，t e r a b e 又运 用含有十二烷基磺酸钠( s d s ) 的缓冲液成功分离了中性组分【5 】，建立了胶束 电动毛细管色谱( m i c e l l e re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e k c ) 。 1 9 8 7 年，h j e r t e n 又把传统的等电聚焦( i e f ) 过程转移到了毛细管内 6 】，提出 了毛细管等电聚焦( c l e f ) 。同年，c o h e n 和k a r g e n 等发表了所做的毛细管凝 胶电泳( c g e ) 工作 7 】。从2 0 世纪8 0 年代起，在短短几年内，由于c e 符合 化学和生物学领域不断发展的分离分析要求，得到了迅速的发展。随后，c e 技术开始蓬勃发展。 1 2 毛细管电泳基本原理及相关概念 1 2 1 基本原理 毛细管电泳是一类以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样 品中各组分之间淌度或和分配行为上的差异而实现分离的一类新型液相分离分 2 0 0 8 届华东师范大学硕士学位论文 第一章概论 析技术【8 】。其基本原理就是电泳和色谱。在毛细管电泳中，带电溶质在电场作 用下发生定向迁移，其表观迁移速度是溶质迁移速度与溶液电渗流速度的矢量 和，各组分的分离是电泳和电渗流共同作用的结果：在多数情况下电渗速度是电 泳速度的5 - - 7 倍，所以，强大的电渗流可以保证正负离子和中性分子一起向同一 方向流动，同时由于内部粒子电泳运动速度的差异，可以实现在一次c e 操作中 同时完成阴、阳离子和中性分子的分离分析。 1 2 2 相关概念 电泳 电泳( e l e c t r o p h o r e s i s ) 是指在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以 不同的速度向其所带电荷相反的方向迁移的现象。不同粒子因所带电荷的性质、 电荷多少以及微粒的形状、大小各异，电泳速度也各不相同。 电渗迁移 电渗迁移指在电场作用下溶液相对于带电管壁移动的现象。其成因可由界 面化学来解释：当固体与液体接触时，固体表面分子离解和或表面吸附溶液中 的离子，在固一液界面上形成双电层，且在水溶液中，大多数固体表面( 如石 英、玻璃、塑料管等) 带负电荷。对于熔硅毛细管，在碱性和微酸性( p h 3 ) 溶液中，管内熔硅表面的硅羟基( s i o h ) 会电离成s i o 。，使表面带负电。这 些牢固地结合在管壁上、在电场作用下不能迁移的离子或带电基因，称为定域 电荷。由于静电力的作用，定域电荷将吸附溶液中的相反电荷离子( 在石英毛 细管中，吸附阳离子) ，使其聚集在定域离子周围，形成了所谓的吸附双电层。 当外加电场时，双电层中溶剂化的阳离子带动毛细管中的体相溶液整体朝阴极 迁移，形成电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w , e o f ) 9 】。 + e l e c t r o o s m o t i c 同o w h y d r o d l m a m i cf l o w p u m p 意咿 。? 嘲k 叩一 f i g 1 f l o wp r o f i l e so fe o fa n dh y d r o d y n a m i cf l o w 2 0 0 8 届华东师范大学硕士学位论文2 第一章概论 特别需要指出的是：e o f 的流型属于扁平流型( f l a tf l o w ) 或称“塞流”， 而h p l c 的流型则是抛物线状的层流( p a r a b o l i cf l o w l a m i n m f l o w ) 示意图见 f i g1 。扁平流型不会引起样品区带的增宽，这是c e 可以获得高分离度的一个 重要原因。 1 3 毛细管电泳仪器的组成 1 0 1 如f i g2 所示，毛细管电泳仪主要有以下几个组成部分：高压电源、样品 缓冲液贮池、毛细管、样品检测器。商品化的仪器还包括自动冲洗、自动进样、 温度控制、数据采集和处理等部件。 f i g2d i a g r a mo f ae a p i ll a r yel e c u - o p h o r e s i ss y s t e m c e 一般采用0 3 0 k v 连续可调的高压直流电源，高压电源的电极通常是直径 05 l m m 的铂丝，需要使用专门的高压导线。电泳所用毛细管通常为内径i o b 1 0 0 b t m 、长1 0 1 0 0 c m 的弹性聚酰亚胺涂层熔硅毛细管。毛细管两端分别浸入两 分开的缓冲液中，同时两缓冲液池中分别插入连有高压电源的电极，该电压使得 分析样品沿毛细管迁移，当分离样品通过检测器时，可对样品进行分析处理。 1 4 毛细管电泳的特点 c e 是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。c e 和h p l c 相比其 相同之处在于都是高效分离技术，仪器操作均可自动化，且二者均有多种不同 的分离模式。 c e 兼有高压电泳及高效液相色谱的优点，其优点可概括为三高二少。高灵 敏度：可采用灵敏的检测手段提高灵敏度，检测限可达1 0 。3 1 0 “5 m o t 使用 激光诱导荧光法检测，可达1 0 。9 l o 引t o o l ；高分辨章：由于采用毛细管和高电 压所以分离效率很高，理论塔板数达到每米几十万至几百万，最高可达1 0 7 ，m 的数量级；高速度：是快可在数秒内完成在2 5 0 s i 匈分离1 0 种蛋自质，1 7 r a i n 分 2 0 0 e t 届毕东师范凡学硬士学位论支 3 第一章概论 离1 9 种阳离子，3 m i n 内分离3 0 种阴离子；样品少：进样体积仅为纳升级，由于试 剂、溶液用量都很少，又通常使用水溶液，所以操作简便，洁净，环境污染小： 成本低：只需少量( 几几十毫升) 流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点 以及分离生物大分子的能力，使c e 成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。 当然，c e 还是一种正在发展中的技术，有些理论研究和实际应用正在进行与开 发。 2 毛细管电泳的进样和分离模式 2 1 毛细管电泳的进样模式 毛细管电泳的常规进样方式按照原理的不同大致可以分为流体力学进样、电 动力学进样( 又叫电迁移进样) 。流体力学进样指在进样端加压或在检测端抽压 利用压力差将样品压入管内，或者使毛细管两端产生位差，利用虹吸原理进样， 后者又称为重力进样。电动进样则是指利用电场作为驱动力，依靠电渗流和样品 离子自身的电迁移将样品注入。 流体力学进样没有偏向问题，但选择性差；它存在局限性，尤其对于粘度高 的样品和电泳缓冲液；另外，流体力学进样所用的装置较为复杂，设备体积重量 大，成本较高。而电动力学进样的动力来源于电泳介质本身，因此可用于高粘度 样品的分析，从而扩展了分析样品类型的范围，且所需要的进样装置较简单，因 为采用电压控制，操作灵敏度得以提高；但电动进样方式本身存在由于组分表观 淌度的差异而产生进样歧视的缺点。 以上常规进样方法都需要注意避免样品超载，否则就会引起区带的扩散。但 是这样就限制了c e 对低浓度样品的检测能力。为适应低浓度样品检测的要求， 提高检测灵敏度，还发展了多种预浓缩进样方法，如：i t p c z e 耦合进样、场放 大样品堆积、色谱富集进样( l c c z e 在线耦合) 。对样品的在柱浓缩是毛细管电 泳的一大特色，使其在许多低浓度检测中显示出越来越多的优势。y o o n - b os h i m 小组在2 0 0 6 、2 0 0 7 年分别发表了他们将场放大样品堆积( f a s s ) 和场放大进样 ( f a s i ) 应用于毛细管芯片电泳的研究，最终他们对酚类物质的最低检测限达 p m o ll q 的数量级 1 l 】，这种预富集进样方法结合a u 纳米颗粒修饰电极和缓冲液， 对d n a ( 2 0 0 0 b p ) 的检测灵敏度较之常规c g e e d 的灵敏度提高 2 5 5 0 0 倍【1 2 】。 2 2 分离模式 实际应用中有很多不同的毛细管电泳形式，详细列表如下： 2 0 0 8 届华东师范大学硕士学位论文 4 第一章概论 类型 缩写 说明 单根毛细管 1 空管 毛细管区带电泳 c z e 毛细管和电极槽灌有相同的缓冲液 毛细管等速电泳 c i t f 使用两种不同的c z e 缓冲液 毛细管等电聚焦c i e f 管内装p h 梯度介质，相当于p h 梯度c z e 胶束电动毛细管色谱m e k c 在c z e 缓冲液中加入一种或多种胶束 微乳液毛细管电动色谱m e e k c 在c z e 缓冲液中加入水包油微乳液 高分子离子交换毛细管电动色谱p i c e c 在c z e 缓冲液中加入可微观分相的高分子离子 开管毛细管电色谱 p t c e c 使用固定相涂层毛细管，分正、反相与离子交换等 亲和毛细管电泳a c e 在c z e 缓冲液或管内加入亲和作用试剂 非胶毛细管电泳n g c e 在c z e 缓冲液中加入高分子构成筛分网络 2 填充管 毛细管凝胶电泳c g e 管内填充凝胶介质，用c z e 缓冲液 聚丙烯酰胺毛细管凝胶电泳p a c g e 管内填充聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖毛细管凝胶电泳 a g a r - c g e管内填充琼脂糖凝胶 填充毛细管电色谱p c c e c 毛细管内填充色谱填料，分正、反相与离子交换等 阵列毛细管电泳c a e 利用一根以上的毛细管进行c e 操作 芯片毛细管电泳i c e c 利用刻制在载玻片上的毛细通道进行电泳 虽然c e 形式众多，但根据分离介质、原理以及分离对象的不同，基本可 将c e 归为以下几种模式： 2 2 1 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳( c z e ) 为c e 的基本操作模式，一般采用磷酸盐或硼酸 盐缓冲液，实验条件包括缓冲液p h 值、浓度、分离电压、进样时间、温度等， 该模式只能用于对带电物质的分离分析，对于中性物质无法实现分离。毛细管 中除电解液外，无需填充任何物质，操作简单，自动化程度高。 在实际使用c z e 过程中，常常通过一些管壁修饰技术或者添加功能性添加剂 等来减少管壁的吸附，提高分离效率，扩大应用范围。然而，相对于管壁修饰甚 至填充等手段来说，使用添加剂无需对毛细管内壁进行处理，操作简单易行。而 且加入的添加剂量微价廉。目前，主要使用的添加剂有以下几类： ( 1 ) 无机电解质及两性电解质：较高浓度的电解质通过与蛋白质等竞争 吸附位点，可以改变双电层的z e t a 电位，从而达到减少甚至抑制蛋白 质等在管壁的吸附的作斥j 1 3 】。而且，用两性电解质代替无机电解 2 0 0 8 届华东师范大学硕士学位论文 第一章概论 质可以克服由于毛细管内电流过大而产生的过热问题。 ( 2 ) 非电解质高分子添加剂：如多糖、聚乙烯醇、纤维素、t r i t o nx 1 0 0 等 1 4 】。它们可以形成分子团或特殊的局部结构，影响样品的迁移， 改善分离，可用于构建各种电动色谱。 ( 3 ) 荷电表面活性剂：如十二烷基磺酸钠( s d s ) 、十六烷基三甲基溴化 铵( c t a b ) 等。表面活性剂具有吸附、增溶等功能，其浓度低于临 界胶束浓度时，可辅助用于c z e 来控制电渗或抑制蛋白质在管壁的 吸附 1 5 。 ( 4 ) 功能性添加剂：如环糊精、手性冠醚、胆酸盐、蛋白质、抗生素等 用于毛细管电泳中，通过与待测物相互作用形成包合物、络合物等， 改善不同组分的分离度，提高分离的选择性，在手性拆分中应用广 泛 1 6 2 0 。 ( 5 ) 小分子有机溶剂：如甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃等。有机溶剂的 加入，不仅可以明显降低电泳电流 2 1 1 ，还能增加疏水性物质在水 溶液中的溶解度和背景电解质的粘度，改善分离度，提高分离选择 性，防止电泳受到极端p h 值的影响，从而拓宽c e 的应用范围 2 2 ，2 3 】。 2 2 2 毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳( c g e ) 是将平板电泳的凝胶转移到毛细管中作支持物进 行电泳，凝胶在其中起“分子筛”的作用，不同尺寸和大小的待测组分在凝胶 中得以分离的毛细管电泳技术。由于凝胶具有粘度大、抗对流的特点，能减少 溶质的扩散，所得峰形尖锐，柱效极高，是毛细管电泳的理想介质，常用于蛋 白质、寡聚核苷酸、核糖核酸( r n a ) 、d n a 片段分离和d n a 测序及聚合酶 链反应( p c r ) 产物分析。c g e 对d n a 的分析无论在分析速度、分辨率还是 分离效率方面都要远远高于传统的平板凝胶电泳。但在c g e 中也存在常规凝胶 制备困难，寿命偏短，重现性不好，使用时易产生气泡，且紫外吸收背景很高 等问题。针对这些缺点，国际上近年来逐渐发展出许多新的筛分介质，主要是 二些亲水线性或枝状高分子，如葡聚糖( d e x t r a n ) 、聚乙二醇( p e g ) 、聚乙烯 醇( p v p ) 、甲基纤维素( m c ) 2 4 ，2 5 等，能克服以上缺点，并且由于潜在的 水溶性高分子很多，具有广阔的发展空间；而且筛分介质也可以随时更换，提 高实验结果的重现性；但是分离效率不如普通凝胶电泳。 2 2 3 胶束电动毛细管色谱 1 9 8 4 年，t e r a b e 用含十二烷基磺酸钠( s d s ) 的胶柬溶液分离了中性分子， 建立了毛细管电泳的一个重要分支胶束电动毛细管色谱( m e k c ) 。胶束电 动毛细管色谱是一种基于胶束增溶和电动迁移的新型液体色谱。它通过在缓冲液 2 0 0 8 届华东师范大学硕士学位论文6 第一章概论 中加入超过临界胶束浓度( c m c ) 的离子型表面活性剂，使之形成胶束，然后 利用溶质分子在水相和胶束相( 准固定相) 之间分配行为的差异进行分离。m e k c 拓宽了c e 的应用范围；适用于中性化合物的分离，亦可区别手性化合物，可用 于氨基酸、肽类、小分子物质、手性物质、药物样品及体液样品的分析。m e k c 是以电渗流为驱动力的一种电动色谱，如分别用环糊精及其衍生物、高聚物离子、 微乳胶代替胶束作为假固定相，则分别为环糊精电动色谱、离子交换电动色谱和 微乳胶电动色谱。 2 2 4 毛细管等电聚焦 毛细管等电聚焦( c l e f ) 最早由n j e r t e n 等人根据平板等电聚焦电泳( i e f ) 的原理建立。它是将带有两性基团的样品、载体两性电解质、缓冲剂和辅助添 加剂的混合物注入毛细管内，当在毛细管两端加上直流电压时，载体两性电解 质可以在管内形成一定范围的p h 梯度，样品组分依据其所带电荷性质向阴极 或阳极泳动，柱内p h 值与该组分的等电点( p d 相同时，溶质分子的净电荷 为零，宏观上该组分将聚集在该点不再进一步迁移，形成窄的聚焦区带，达到 使复杂样品中各组分分离的目的。由于其分离机理显著不同于高效液相色谱， 对两性离子化合物提供了独特的选择性，尤其是在分离结构相近的蛋白质方面 显示出较大的优越性。该分离模式可以用来测定蛋白质的等电点，分离异构体 或其它方法难以分离的蛋白质：而且由于该模式分辨率极高，可以用来获取适 量的蛋白质纯品【2 6 】。但该技术的缺点一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐 溶液中蛋白质可能发生沉淀，二是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用 在等电点不溶或发生变性的蛋白质。 2 2 5 毛细管等速电泳 毛细管等速电泳( c i t p ) 是基于试样中各组分电泳迁移率的差异而进行分 离的。在等速电泳中试样是引入在两种不同的电解质之间，其中一种是迁移率 较高的前导电解质( 1 e a d i n ge l e c t r o l y t e ，l ) ；另一种是迁移率较低的尾随电解质 ( t e r m i n a t i n ge l e c t r o l y t e ，t ) 。经过电泳分离达到稳定后，不同组分将按迁移率的 大小顺序排列成相互紧邻的区带，这些头尾相连的区带会以相同速度向终点池 迁移。c i t p 最大特点是能将分离后的组分压缩为一个个很窄的区带，达到富集 目的，并且通过改变尾随电解质的成分来改善、提高其预富集作用。由于i t p 进样体积可以比毛细管区带电泳( c z e ) 大得多，且具有很强的谱带压缩和分离 能力，因此，c i t p 现在常作为待测组分的预浓缩和净化手段与其它电泳分离模 式联用2 7 1 。 2 2 6 毛细管电色谱 毛细管电色谱( c e c ) 是综合了c e 和h p l c 的优势而发展起来的高效电 2 0 0 8 届华东师范大学硕士学位论文7 第一章概论 分离微柱液相色谱技术( 如f i g 3 ) 。c e c 一般采用在柱内填充或在柱壁键合 固定相的熔融石英毛细管，以电渗流为流动相驱动力( 有时再加辅助压力) ， 各组分依据它们在流动相与固定相中的分配系数的不同和自身电泳淌度的差异 得到分离 2 8 】。因此，可将它定义为“一种溶质与固定相间的相互作用占主导 地位的电泳过程”。c e c 兼具c e 的高效性和h p l c 的高选择性：因c e c 只需 通过电渗流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相，故而明显地简化了输 送体系；能够像h p l c 一样分离不带电荷的物质：而且，电渗泵产生的是塞子 式流动轮廓，而不是流体动力学轮廓，因此c e c 的分离柱效比h p l c 高。可以 说c e c 开辟了高效微分离技术的新途径，是一种很有前景的分离模式。目前已 有多成功应用c e c 的例子 2 9 ，3 0 。 m i c r o - h p l c | h l 嗽孑锚_ c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c a p i l l