（预防兽医学专业论文）斑点叉尾鮰干扰素α基因的克隆和原核表达及生物活性初探.pdf

中文摘要 本试验根据g e n b a n k 上己发表的斑点叉尾鲴干扰素( i f n q ) 基因序列 ( a y 2 6 ；5 3 8 ) 设计并合成了特异性引物，取新鲜斑点叉尾鲴外周淋巴血并分离淋巴 细胞，以草鱼出血病病毒( g c h v ) 诱导后的淋巴细胞提取其总r n a 为模板，用 r t - p c r 方法扩增出4 9 2 b p 的目的片段，将其克隆到p m d l 8 t 载体上，经酶切鉴定 和序列测定证明该序列是斑点叉尾鲴i f n q 。斑点又尾鲴i f n c i 开放阅读框由4 9 2 个核苷酸组成，推测其编码产物由1 6 4 个氨基酸组成。经核酸序列分析比对后发现， 斑点叉尾鲴i f n c i 与g e n b a n k 已发表的鲶鱼干扰素( i v y q ) 序列的同源性较高，为 9 6 5 ，氨基酸的同源性为9 2 6 。在n c b i 上的登录号为e u 7 8 3 9 1 9 。 将克隆的斑点叉尾婀i f n q 的成熟肽基因亚克隆到原核表达载体p e t - 3 2 ( a ) + 的 e c o ri ，y h oi 位点上，构建重组表达载体p e t - 3 2 ( a ) + c c i f n q 。将酶切鉴定正确 的重组质粒转化入大肠杆菌b l 2 1 感受态细胞，通过不同温度、时间诱导表达重组 i f n q 蛋白。s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t t i n g 分析表明，在相对分子质量约为3 9 k d ( 融合蛋白) 处有明显的蛋白质表达条带，在3 0 4 c 、5 h 表达产物最高，表达的融合 蛋白约占菌体总蛋白的4 8 4 左右，而未经诱导的p e t - 3 2 ( a ) + c c i f n q 在3 9k d 处 无条带产生。洗涤表达的i f n q 包涵体并用细胞病变抑制法检测其抗病毒活性法， 通过实验表明所获得的重组斑点叉尾鲴i f n q 具有抗病毒反应活性，具有一定的生 物学活性。 本实验克隆出斑点叉尾鲴i f n a 基因，并原核表达出斑点叉尾鲴i f n q 蛋白， 并首次引入国际标准方法用于检测斑点叉尾鲴干扰素的活性。为进一步研究斑点又 尾纲i f n a 在体内外的作用及将其作为目前国内斑点叉尾鲴的病毒病预防和控制 应用于临床提供了物质基础；与此同时，也为国内水产药品朝着无污染、无残留、 安全的方向发展提供了一定的方向指引。 关键词：斑点叉尾鲷；干扰素一q 基因；克隆；生物信息学分析；原核表达 s t u d y o nc l o n e p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o na n db i o l o g i c a la c t i v i t y 0 ti ct a l u r u sp u n ct at u s ( c h a n n e lc a t f i s h ) i n t e r f e r o na l p h a ( i f n q ) g e n e f e n gt i n g ( p r e v e n t i v ev e t e r i n a r ym e d i c i n e ) d i r e c t e d eb yv i c ep r o f e s s o ry a nq i g u i p r o f e s s o rg u ow a n g z h u ( a n i m a lb i o t e c h n o l o g yc e n t e r , s i c h u a na g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y , y a a n ，s i c h u a n ，c h i a n ， 6 2 5 0 1 4 ) a bs t r a c t t h ec d n a s e q u e n c ew h i c he n c o d i n gi n t e r f e r o n 一0 【( i f n 一0 l ) f o rc h a n n e lc a t f i s hw a s c l o n e df r o mt h ef r e s hc h a n n e lc a t f i s h sp e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t o t e sb ym e a n so f u s i n g t h e s p e c if i cp r i m e r sa c c o r d i n g t ot h e p u b l i s h e ds e q u e n c e i n g e n e b a n k ( a y 2 6 7 5 3 8 ) t h ec l o n e dc d n af r a g m e n tw a si n s e r t e di n t ot h ep m d l 8 一t p l a s m i d ，t h e n i d e n t i f i e dt h e f r a g m e n t w i t h e n z y m ed i g e s t i o n a n d s e q u e n c e i d e n t i f i c a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec l o n e dc d n af r a g m e n ti sc h a n n e lc a t f i s h s i f n a t h el e n g t ho ft h ec l o n e dc d n a f r a g m e n tw a s4 9 2 b pw i t ha no r f ，a n dd e d u c e di t e n c o d i n g16 4a m i n oa c i d s a f t e rn u c l e o t i d eb l a s t i n g ，i td i s p l a y e dt h a tt h e r ew e r eh i 曲 h o m o l o g yo f 9 6 5 a n dt h ei d e n t i t yo ft h ed e d u c e da m i n oa c i d sw a s9 2 6 b e t w e e n t h ei m p o r t e dc h a n n e lc a t f i s h si f n - a s e q u e n c ea n dt h ep u b l i s h e dc h a n n e lc a t f i s h s i f n - a s e q u e n c e t h eg e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ro fi f n - a g e n es e q u e n c eo fc h a n n e l c a t f i s hi se u 7 8 3 919 i no r d e rt oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 3 2 ( a ) + 一c c - i f n 一0 【t h e c l o n e di f n a c d n af r a g m e n tw a si n s e r t e db e t w e e nt h er e s t r i c t i o ns i t e se c o ria n d x h oio f p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d sp e t - 3 2 ( a ) + v e c t o r t r a n s f o r m e dt h ec o r r e c t r e c o m b i n a n tp l a s m i dw h i c hh a db e e ni d e n t i f i e db ye n z y m ed i g e s t i o ni n t ot h ee c o l i b l 21 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a si n d u c e dt oe x p r e s si f n - 0 【p r o t e i nw i t hd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e sa n dt i m e s t h eo u t c o m e so ft h es d s p a g ea n dw e s t e r nb l o t t i n gs h o w e d t h a tt h ee x p r e s s i o np r o d u c t sh a dt h em o l e c u l a rw e i g h ta b o u t3 9 k d i ta l s os h o w e dt h e 2 e x p r e s s i o np r o d u c t sr e a c h e dt h e i rp e a k si n5h o u r sw i t ht h et e m p r e t u r eo f3 0 。c ，a n dt h e e x p r e s s i o nq u a n t i t yo ff u s i o np r o t e i nw a s4 8 4 i nt h et o t a lt h a l l i np r o t e i n a tt h es a m e t i m e t h ee c o l ib l 21w i t h o u ti n d u c i n ge x p r e s sn oi f n - 0 cp r o t e i na ta 1 1 t h en o n - i n c l u s i o n b o d i e sw h i c he x p r e s si f n c cw e r ew a s h e d t h e nt e s tt h e i rb i o l o g i c a la c t i v i t yb yc y t o p a t h i c e f f e c t ( c p e ) t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h er e c o m b i n a n ti f n 一0 【p r o t e i nh a v et h ea b i l i t yt o p r o t e c tt h ec c o c e l l sa g a i n s tt h ev s v , t h a tm e a n st h ep r o t e i nd oh a v eb i o l o g i c a l a c t i v i t y t h ec h i n e s ec h a n n e lc a t f i s h si f n 伐w a sc l o n e d ，t h e nt h ei f n ap r o t e i n sw e r e o b t a i n e df r o m p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n i nt h i s e x p e r i m e n t a n d w ei n t r o d u c e d i n t e r n a t i o n a ls t a n d e r e dt ot e s tc h a n n e lc a t f i s h si f nf o rt h ef i r s tt i m e t h ee x p r e s s e d p r o t e i nc a ns u p p l ym a t e r i a lb a s ef o rf u r t h e rr e s e a r c hi nc h a n n e lc a t f i s h si f n - a a n dc a n a l s ot a k ep r e c a u t i o na g a i n s ta n dc o n t r o lc h a n n e lc a t f i s h sv i r u sd i s e a s e s m e a n w h i l e ，t h i s c a nb eag u i dt of u t u r ed o m e s t i ca q u a c u l t u r a ld r u g s sp r o d u c t i o n g ，m a k i n gt h e mn o p o l u u t i o n ，n or e m a i n sa n ds a f e k e yw o r d s ：c h a n n e lc a t f i s h ；i n t e r f e r o n q ；c l o n i n g ；b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ；p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n 3 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所 取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中 不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农 业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：滔么舌 关于论文使用授权的声明 k 毫其印b 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：泻多量 导师签名： 多殳芝 伽r2 ( b 沙留年 f c 只z6 b p q 川农、l p 大学硕l 。学伊论文2 0 0 8 第一章文献综述 干扰素( i n t e r f r o ni n f ) 是人和动物细胞在受到一定刺激下产生的微量且具有高 度生物活性的糖蛋白。随着基因工程技术的日益发展，干扰素已被广泛用于病毒性 疾病和恶性肿瘤的治疗以及增强机体自身的抵抗力。：随着水产养殖业的发展、高密 度养殖技术的普及、养殖产量激增的同时，水生养殖动物的疾病发生也愈发频繁和 猛烈，对水产养殖的损失也逐年递增，2 0 0 4 年水产养殖因病害造成的经济损失已达 1 4 0 1 5 0 亿元之巨。尤其是病毒性疾病，目前我们还没有有效的手段来控制。斑 点叉尾纲作为从上世纪八十年代从美国引进的品种，r 随着近年来目前国际和困内需 求量的激增，国内的斑点叉尾鲴养殖得到了长足的发展，2 0 0 6 年养殖产量达到1 0 万吨幢1 。由于国内鱼种引进后，大多采用近亲繁殖，使原本具有较强抗病能力的鱼 种抗病能力下降，造成目前国内的引进鱼种抗病能力低下；同时斑点叉尾鲴病毒 ( c c v ) 作为该鱼种特有的病原，引起的该鱼种的死亡率达9 0 甚至以上1 ，而目前 没有有效的手段来控制。为了更好的为斑点叉尾鲴养殖服务，迫切需要有具有广普 抗病毒作用的生物制剂来达到控制和预防疾病的效果，并加强免疫。 1 i f n 和i f n 系统 2 0 世纪3 0 年代，有学者发现生物机体在感染某一种病毒后，会对另一种抗原性 毫无关系的病毒产生干扰现象，至此探索病毒干扰机制引起了病毒学家的极大兴 趣。但直到1 9 5 7 年，i s s a c s 和l i n d e n m a n n h l 在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒的 干扰现象时才发现感染病毒的细胞能分泌一种抗病毒蛋白，这种抗病毒蛋白能激活 邻近细胞抗病毒状态的产生，抑制多种同源和异源病毒的感染。他们把这种抗病毒 蛋白命名为i f n 。1 9 5 8 年，n a g a n o 和k o j i m a 嫡1 再次验证了i s s a c s _ 和l i n d e n m a n n 关 于病毒干扰实质的发现，从此开始了对脊椎动物i f n 系统近半个世纪的探索，i f n 也 逐渐从实验室的基础研究走向了临床应用。1 9 8 0 年，国际干扰素命名委员会正式将 干扰素定义为：在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的一类蛋白质，其活性受细胞基 因的调控，并涉及r n a 和蛋白质的合成等h 3 ，即i f n 是一种类似的多肽激素的细胞 因子。 那么，到底什么是i f n 系统昵? 目前一般认为，i f n 系统包括分泌合成i f n 的细胞 系统以及受i f n 作用的细胞系统，2 即指所有经病毒感染等外部刺激后能激活i f n 合 成的细胞，以及对i f n 的作用发生反应并建立抗病毒状态的细胞。i f n 系统是目前 所知的机体防御反应中出现最早的细胞功能调节系统，在病毒感染几小时之内就起 作用。 1 1if n 的分类以及基本性质 在未经诱导的细胞中，i f n 基因通常是沉默的。根据刺激条件、组织细胞来源、 p q 川农、l p 大学硕f 。掌1 守论史 2 0 0 8 理化性质以及受体等的不同，将哺乳动物的干扰素分为i 和i i 型。 现已发现i 型有6 个家族成员( qb ek ( ) 8 ) 阳1 ，其中已确认i f n a 、i f n 一1 3 、 i f n 一( i ) 、i f n - 8 均为多基因家族，分别存在不同亚型。当病毒、双链r n a 、多肽、 细菌脂多糖以及细胞因子的作用下，i 型i f n 可被诱导产生。 i i 型i f n 至i j 目前为止只发现了一个家族成员，即i f ny 。i i 型i f n 是在多种免疫刺 激下，如t 细胞特异性抗原、葡萄球菌内毒素a 、植物血凝素、佛波醇，有丝分裂原等 的刺激，由活化的t 细胞、n k 细胞与n kt 细胞产生，但其他细胞类型，如巨噬细胞、 树突细胞( d c ) 等在特定的条件下也能够表达i f n l 1 。i f ny 由抗原及p h a 等有丝分裂 原刺激t 细胞后产生，与i 型i f n 使用不同的细胞表面受体，主要对免疫系统起调节 作用，是哺乳动物主要的巨噬细胞活化因子旧3 。 2 0 0 3 年k o t e n k o n 等 s h e p p a r d 等1 几乎同时报道了一个新的干扰素家族i f n 一九， 其具有抗病毒和抗细胞增殖及免疫调节的功能，目前大多数学者倾向于认为这是一种 与ii f n 类似但却不同的i i i 型i f n ，但其具体的分子生物学机制还有待作进一步的研 究。 对于同一物种而言，i f n 在不同的亚型间同源性也存在较大的差异。对人i 型i f n 蛋白质序列的对比表明，不同的i f n - a 亚型间存在7 0 以上的同源性，i f n 一、p 分别 与i f n 一0 【存在6 0 及3 0 的同源性n2 1 ，i f n - k 与其他的i 型i f n 家族成员存在3 0 的同 源性1 3 。 只要进行合适的刺激，几乎所有细胞类型均能产生i 型i f n ，有研究发现人外 周血单核细胞( p b m c ) 中有少部分的淋巴细胞在体外感染不同的病毒时能产生较大 量的i f n a i f n d ，但近年来，这些i f n 产生细胞被认为是d c 前体n 4 1 。也有研究表 明，在不同的病毒感染中i f n - a i f n - 3 的主要产生细胞可能是不同的细胞，在体内 感染中，有多种细胞类型可能对于i f n - a i f n d 的产生都是重要的n 引。组织学研究 表明，成纤维细胞主要产生i f n d ，而淋巴细胞主要产生i f n 一0 【，浆细胞样d c ( p d c ) 产生的i f n 一0 【要多于i f n - 3 n 引。文献表明，i f n - a 主要来源于淋巴细胞，巨噬细胞 和n u l l 细胞也可以产生n 7 1 8 1 ；i f n b 主要来源于成纤维细胞和上皮细胞，部分来自 于巨噬细胞n 引；i f n - t 主要由t 细胞产生，在一定的条件下也可由自然杀伤细胞( n k ) 等产生嘲。 干扰素属于糖蛋白( 也有少数不属于糖蛋白) ，不能透析，以1 0 0 0 0 0 9 离心4 小时仍不能将干扰素沉淀，但能被蛋白分解酶分解。i 型i f n 具有耐酸性，在p h 2 时稳定的特点。i i 型i f n 则不耐酸，不耐热，在p h 2 时不稳定，5 6 3 0 m i n 会被破 坏。在4 c 以下可以保存几个月，一7 0 c 可长期保存的特点乜0 2 。 1 2if n 的生物活性 干扰素在最初发现时，曾认为抗病毒活性是其唯一特点。随后的研究发现干扰 素除具有抗病毒增殖的作用外，还能抑制其它微生物的繁殖；抑制肿瘤和其它细胞 2 p q 农q k 大学自口! 十学1 懂论义 2 0 0 8 的生长；并且具有免疫活性，其中包括增强巨噬细胞活性，增强n k 细胞和细胞t 活性，促进组织相容性抗原( m h c ) 表达，激活补体系统的功能。i 型i f n 抗病毒的 活性较i i 型i f n 强，但i i 型i f n 在免疫调节和抗细胞增殖方面作用较强，故有免疫 干扰素之称，能直接作用于t 和b 淋巴细胞，促进分化产生各种淋巴因子，增强m h c i 类分子和m h ci i 类分子的表达乜引。 1 2 1 抗病毒作用 目前观点认为i f n 具有广普抗病毒的作用，既可抑制多种r n a 病毒，又可抑制 多种d n a 病毒。但病毒不同对i f n 的敏感性也不同，其中对有囊膜的病毒最敏感。 一般认为，i f n 的活性有严格的种属特异性，但也有研究证明这种特异性不是绝对 韵，猴细胞产生的i f n 除了对猴有保护作用外，对人和兔的细胞也有保护作用幢3 j 。 干扰素的抗病毒作用表现早在病毒感染的几个小时就开始作用，并几乎作用于病毒 复制的每一阶段心4 l 。通过减少病毒繁殖量以及减轻细胞损伤的方式发挥作用。 1 2 2 抗肿瘤作用 t f n 有抑制细胞分裂的活性，并且对生长快的细胞的抑制作用远强于生长慢的 细胞但引。因此i f n 可以选择性的抑制迅速分裂的肿瘤细胞，但这需要连续使用，才 能显示抑制肿瘤的效果晗引。i f n 能改变肿瘤细胞的表面的性能，诱发新的抗原，从 而易被免疫监视细胞识别并加以排斥乜 ，提高巨噬细胞、n k 细胞和c t l 的杀伤水平 瞳8 j ，以及免疫调节来增强机体抵抗肿瘤的能力乜9 | 。 1 2 3 晚疫调节作用 i f n 尤其是i f n l 是很重要的免疫调节因子。i f n 可增加免疫球蛋白i g g 的受 体表达，有利于巨噬细胞对抗原的吞噬和k 、n k 细胞对靶细胞的杀伤以及t 、b 淋 巴细胞的激活，从而增强机体的免疫应答。当i f n l 用作血吸虫疫苗佐剂n 0 1 ，可增 强血吸虫攻击的保护作用，增强抗体产生的同时诱导d t h b 。i f n l 增强了i l 1 的释放和m h ci i 类抗原在a p c s 上的表达，提高了抗原呈递的效率引。目前对高等 脊椎动物的干扰素的免疫调节已经有了比较完整的认识，但鱼类的干扰素研究确处 于初始阶段。 1 2 4 其它特性 当用小量的i f n 处理细胞后，细胞对随后的病毒以及或者干扰素诱生剂的反应 性增加了，神经细胞的应激性也得到加强口引。i f n 能改变细胞膜的生物学特性，增 加胸腺细胞，脾淋巴细胞的表面相容性抗原。同时对衣原体、原虫、立克次氏体和 以及在细胞内增殖的细菌都有抑制作用m 1 。 1 3if n 的分子结构 人和鼠的i f n a 和i f n p 分别位于9 号染色体和4 号染色体上，并且连锁在一起口6 1 。 p q 川农q k 大学帧f ：掌化论文2 0 0 8 从其空间结构来看，i 型i f n 由a 、b 、c 、d 、e 五个a 一螺旋组成，经a b 、b c 、c d s n d e 四个环连接而成，不同的i 型i f n 亚型呈现出类似的a 一螺旋，但其a b 环、b c 环和b 螺 旋的c 一末端却表现出惊人的差异，而a b 环是决定i 型i f n 与i 型i f n 受体亲和力的关键 m 1 ，所以不同i 型i f n 亚型在该区域的差异可能会导致他们生物学活性的差别。 其中，o t 干扰素分子的不同亚型由1 6 6 - 1 7 2 个氨基酸组成，无糖基。分子量约为 1 9 k d ，同种类i f n - a 不同基因产物的氨基酸同源性大于7 0 。a 干扰素含有4 个半胱氨 酸，在第9 9 位和1 9 9 位之间形成2 个分子内二硫键。p 干扰素分子中，如人的p 干扰素分 子含有1 6 6 个氨基酸，有糖基，分子量为2 3 k d ，含3 个半胱氨酸，分别出现在第1 7 、3 1 和1 4 1 位。其中，第3 1 位和1 4 1 位半胱氨酸之间形成二硫键，此二硫键对d 干扰素的生 物学活性极其重要。而其他动物，以小鼠为例，6 干扰素分子中只有1 个半胱氨酸，位 于1 7 位上，分子内不能形成二硫键。对于鱼类，项黎新等口7 1 用糖的特异性p a s 显色反 应处理病毒诱生的草鱼血清a 及d 干扰素，结果显示，其含有糖链修饰；再用n a i o 。或 糖苷酶裂解糖基，则干扰素的活性显著下降，说明草鱼干扰素具有糖蛋白的性质。人 的i f n y 的2 个亚单位是以一种反向平行的方式相互作用的。每个单体含有6 个0 【螺旋， 其中4 个装配成短链螺旋细胞因子，不含d 折叠。 2 鱼类lf n 的发现与鉴定 1 9 6 5 年，g r a v e l l m l 等首次发现传染性胰腺坏死病毒( i p n v ) 在2 3 。c 能诱导黑头 软头鲦的鳍传代细胞f h m 后能够分泌一种类似哺乳类i f n 的抗病毒的活性物质。之 后，研究人员陆续在许多种类的鱼体内检测到干扰素“0 4 1 l ，如鲦鱼、虹鳟、舌齿 鲈、大麻哈鱼、鲤、草鱼、金鱼等；另外。在一些鱼的机体细胞中也诱导检测出i f n ， 包括虹鳟白细胞，g f 细胞系、性腺细胞系r t g - 2 ，胖头鱼岁鳍传代细胞系f h m ，红 大麻哈鱼胚胎细胞系s s e - 5 ，斑点叉尾鲴卵巢细胞系c c o ，草鱼细胞系g c f 、c o ， 鲤科鱼类细胞系c a b 、g c b 、g r e 、c i k 、f h m ，牙鲆永久白细胞系h l 一2 8 等9 饥4 。 对这些检测到的i f n 的诱导特性、生物学特性和理化特性的研究还发现鱼类i f n 和 高等的脊椎动物一样不止一种。 国内对鱼类i f n 的研究最早见于江育林n 2 1 等的工作，是针对引起草鱼鱼种大量 死亡的草鱼出血病病毒( g c h v ) 的研究。随后，邵建忠“3 “引等对用病毒和p h a 等诱导 剂诱导的草鱼和草鱼细胞i f n 活性物质进行了特性研究，与哺乳动物的i f n 的性质 比较，认为用病毒诱生的i f n 可能为i 型干扰素，而p h a 诱生的则为i i 型干扰素( i f n y ) ；同时对鱼类i f n 的免疫调节功能进行了初步探索。 2 1 鱼类if n 系统的研究历程 对鱼类i f n 系统的研究报道不多但起步较早。有人推测，鱼类与人干扰素( h u i f n ) 的基因存在同源性。1 9 8 3 年，w i l s o n 等n 朝报道用人h u i f n be d n a 探针与鸟类和雅罗 鱼、条鳅、河鲈等的基因组d n a 杂交后检测杂交信号，证实了这一推测。但是用h u i f n 4 p q 农q k 大学帧t j 掌何论义 2 0 0 8 一qe d n a 探针却不能。这表明在4 亿年前鱼类和两栖类开始分化时，鱼类就有与t t u l f n 1 3 同源的基因。 作为鱼类i f n 系统第一个直接的分子证据是m x 基因的分离鉴定，暗示鱼类i f n 系统 的抗病毒免疫机制与哺乳动物相似_ 6 | 。在哺乳类，m x 作为机体细胞产生i f n 的主要标 志和抗病毒蛋白得到了广泛而深入的研究。同样使用分子杂交的方法，s t a e h e l i 川 等用小鼠m x lc d n a 为探针，从限制性内切酶e c 冰i 消化的河鲈基因组d n a 中克隆出一 个2 3 5 k b 的d n a 片段，基因结构与小鼠m x l 相应片段比较极其保守并有很高的同源性， 证实是鱼类m x 基因。后来从虹鳟、大西洋鲑、牙鲆等也相继克隆出m x 基因，：同时的研 究也表明，鱼类与哺乳类m x 的基因同源性很高，蛋白结构具有很高的保守性n 9 4 0 4 1 1 。 但是在此后的十来年里，鱼类i f n 系统的分子研究一直没有大的突破，而且整个 鱼类免疫系统的分子研究与哺乳类相比也相当落后。这一方面是因为对此投入的研究 经费不足，使得研究的力度不够等的限制：但更重要的原因可能一直没能找到好的技 术方法。由于鱼类免疫机制的多样性和复杂性，以及鱼类低等的进化地位，鱼类免疫 相关基因与哺乳类相比可能有较大程度的差异。有人也采用了表达序列标签( e s t ) 测 序和抑制性差减杂交技术( s u p p r e s s i v es u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) ，试图通 过大量分析免疫细胞的基因转录信息，来获取重要的鱼类免疫相关基因。但遗憾的 是，取得的效果依然很不明显。除了技术方面的原因，鱼类没有自身特色的研究模型 系统可能也是一个重要原因。虽然国内外学者都已意识到建立研究鱼类免疫反应的 体外培养细胞系统的重要性和迫切性，但是所见的相关研究的报道还是多利用鱼类主 要的免疫细胞从感染鱼体分离的白细胞或人工感染短期培养的自细胞作为研究 材料。而采用培养细胞系研究，最大的优点在于培养细胞系是在体外长期传代以及生 长环境的变化，正常表达的基因量减少，而且不受机体调控途径如激素、内分泌以及 外界其他因素的影响，在受到病毒感染后，导致的基因表达改变可能与细胞抗病毒免 疫更为直接相关。这样在筛选抗病毒免疫基因时能最大限度地减少其他基因的干扰。 与此分析结果相呼应的是，在用s s h 技术筛选病毒诱导鱼类机体后自细胞的基因表达 谱时，发现筛选到的因子多为补体、抗体、趋化因子以及急性反应蛋白等，但却缺少 代表i f n 系统基因的重要的免疫因子。 国内学者张义兵5 等在利用紫外线灭活的草鱼出血病病毒( g c h v ) 诱导鲫囊胚 细胞系( c a b ) 细胞产生i f n 的基础上，结合s s h 等基因克隆技术，建立了病毒诱导的c a b 细胞和未诱导细胞间差异表达基因的差减c d n a 文库，由此成功建立了一个研究鱼类抗 病毒免疫相关基因的细胞模型系统。在该细胞系统中，同时鉴定和克隆了十多个在哺 乳类i f n 系统中已经认知功能的鱼类同源基因以及一批受病毒和i f n 诱导表达的新基 因。 ? 2 2 鱼类lf n 及i f n 基因 就目前的研究表明，鱼类i f n 至少有两类：( 1 ) 耐酸( p h2 稳定) ，耐热。由病毒 5 p q 农、f p _ 人学硕十掌伸论文2 0 0 8 或d s r n a 等诱导，性质与哺乳类i 型i f n 相似。如由v h s v 和p 0 1 yi ：c 诱导的鲑类i f n 都有酸稳定性； ( 2 ) 不耐酸，不耐热。由白细胞、t 细胞或巨噬细胞产生，有丝分裂 素等诱导，与哺乳类i i 型i f n 相似。但是鱼类i f n 对酸的稳定性也有差异。从牙鲆永久 白细胞系h l 一8 诱导的i f n 活性仅在p h4 8 稳定，p t t 2 处n 2 0 分钟即全部失活。山鳟 ( 现c j a 础d 病毒c t v 、i h n v 诱导虹鳟白细胞产生的i f n 活性物质在p h2 处理后，抗病毒 滴度略有降低但不完全消失。表明诱导的抗病毒物质不止1 种，有耐酸或不耐酸的旧乳 s 3 。同一种病毒经不同处理后诱导的i f n 种类或组成成分也不一致。如有活性的i i i n v 和c m a i h n v ( 即i h n v 感染细胞单层后用戊二醛等处理) 诱导的虹鳟白细胞i f n 对酸的 耐受性有显著差别。p h2 整夜处理，前者保持( 7 6 6 3 0 ) 的活性，而后者只有( 5 5 7 3 4 ) 的活性阳3 。由于目前缺乏深入的分子生物学研究，鱼类i f n 的种类尚无最终 定论，但可以肯定有许多种。 鱼类i f n 是一种蛋白质，因为其能抗r n a s e 和d n a s e ，对胰蛋白酶敏感。邵建忠m 叫 等用葡萄糖苷酶s t l n a l o 。裂解草鱼i f n 糖基，i f n 活性显著下降。证明鱼类i f n 具有糖蛋 白的性质。 鱼类i f n 分子量也有报道。诱导产生的干扰素耐酸、耐热，分子量在2 6 - - 一9 4 k d a 、 等电点在5 4 7 1 之间嘲、5 副牙鲆i f n 为分子量为1 60 0 0 的糖蛋白。分离纯化草鱼血清i f n 证实该i f n 是种分子量为3 80 0 0 的糖蛋白h 5 1 ，有关分子生物学的研究正在进行之中。 病毒和p o l y i ：c 诱导的鱼类i f n 一般有较高热稳定性( 5 6 。c ) ，耐酸( p h2 ) ，1 0 5 离心不沉降。而由促细胞分裂剂c o n a p m a 诱导的虹鳟自细胞i f n 对酸( p h2 ) 敏感，不 耐热( 6 0 ) 。 i f n 抗病毒机制研究表明，病毒特异性抗体不能中和鱼类i f n 活性，i f n 无直接杀 灭病毒作用。在i f n 诱导细胞抗病毒状态之前加入微量抗环肽放线菌素( a c t d ) 可使 i f n 的抗病毒作用消失，表明鱼类i f n 对病毒的抑制作用是通过对细胞内转录和转译水 平的调控来完成的，依赖于细胞内r n a 和蛋白质的合成。 在同种细胞上，鱼类i f n 具有广谱抗病毒活性，对鱼类和非鱼类病毒、r n a 和d n a 病毒都有抑制作用。 2 0 0 3 年，a l t m a n n 嘲1 等率先从斑马鱼e s t 数据库中鉴定了一个与鸡i f n 基因同 源性较高的斑马鱼e s t ，从而克隆出斑马鱼i f n 基因( d r i f n a y l 3 5 7 3 6 ，1 8 5 a a ) ，体 外表达证明其培养物能诱导激活抗病毒基因m x 的启动子，并诱导细胞的抗病毒状 态。利用d r i f n 序列从河鲍全基因组中也鉴定找到了河鲍i f n 基因。2 0 0 5 年有报道 j u nz o u 嵋7 1 等成功克隆了虹鳟( o n c o rh y n c h u sm y k i s s ) 的i f ny 基因，在此之i j f 报道 的克隆鱼类i f n 基因都是i 型i n f 。同时，由i f ny 诱导的硬骨鱼的n o s 2 蛋白和吞 噬细胞氧化酶亚单位也被克隆出来8 5 9 “们。然而，表达、纯化鱼类干扰素的研究还 未见报道。 对鱼类i f n 基因的研究发现：与典型的鸟类和哺乳类不同没有内含子不同，目 前发现的鱼类的i f n 都有5 个外显子和4 个内含子阳“6 2 1 。但对鱼的基因和其他高等 6 叫农业大学坝十学伊论文 2 0 0 8 动物的基因序列进行比对发现，有些氨基酸的位置是不变的，可能是保持i f n 活性 和稳定的重要原因。斑马鱼i f n 仅含有两个c y s ，c y s 2 5 1 2 0 形成以个二硫键，无 糖基化位点。鲫鱼i f n 基因与斑马鱼i f n 基因推导的氨基酸序列同源性达7 0 ，但 同样也没有糖基化位点哺3 “4 65 。这些结果反映了低等脊椎动物鱼类i f n 的产生可能 存在其特殊机制。 2 3 鱼类i f n 系统的其他相关基因 鱼类i f n 的信号通路基因：除了细胞膜上的i f n 受体，i f n 信号的传导主要由 j a n u s 激酶家族和信号转导及转录活化蛋白( s t a t ) 家族两类蛋白参与。研究鱼类的 j a n u s 激酶家族和s t a t 家族成员基因结构的结果显示，鱼类这两个蛋白家族成员的 结构与哺乳类的有很高的保守性，暗示鱼类干扰素诱导基因转录激活的信号传递也 必须借助于胞质中与其连接的酪氨酸激酶，才能完成信号传递，干扰素通过其受体 和相应的酪氨酸激酶( j a n u s 激酶家族) 作用，使特定的胞质蛋白s t a t 的酪氨酸 磷酸化而活化，位移至细胞核，同干扰素诱导基因的顺式作用序列结合，继而启动 该基因的转录。即鱼类i f n 的信号放大也依赖于j a k s t a t 信号途径h 9 5 0 1 。 调控鱼类t f n 表达的基因：研究表明，鱼类也存在干扰素调节因子( i r f ) 。牙 鲆i r f 是鱼类最早被克隆的i f n 系统基因之一，其编码蛋白具有保守的五个色氨酸 组成的特征性n 端d n a 结合区。此外，河纯和虹鳟也分别鉴定出i r f 基因，分子进 化树分析证实都属于i r f l 亚家族，它包含i r f l 和i r f 2 两个成员。其中虹鳟i r f 2 是鱼类第一个被鉴定出来的i r f 2 基因。最新的报道称，张义兵m 引等在鲫鱼中成功 的鉴定出了c a i r f 7 基因，它不仅是鱼类而且是整个低等脊椎动物鉴定的第一个i r f 7 基因，组织特异性表达和诱导表达分析发现c a i r f 7 与哺乳类有相同的特性。这表 明鱼类i f n 的诱导表达以及i s g 的表达调控机制可能与哺乳类具有相同的机制，同 时也同样能够解释诱导鱼类培养细胞i f n 埘的启动现象，而且也意味着在鱼类也存 在i r f 3 的直向同源基因。现在的研究表明，i r f 3 和i r f 7 在对抗病毒对细胞的感染 中作用尤为重要。 鱼类i f n 系统的抗病毒基因：病毒诱导的鱼类i f n 的生物学特性研究表明，鱼 类i f n 的抗病毒机制也与哺乳类一致，- 即自身无杀灭或中和病毒的作用，必须通过 受体介导的i f n 信号通路激活抗病毒基因的表达，诱导细胞的抗病毒状态。随着鱼 类i f n 基因、i f n 信号通路基因的揭示，鱼类i f n 系统的抗病毒基因也相继被成功 鉴定。m x 基因是最先得到鉴定的鱼类i f n 系统基因。张义兵1 等在利用紫外线灭活 的g c h v 诱导的c a b 细胞系统中，不仅成功克隆了鲫鱼i f n 基因，i f n 信号传导基因， i f n 表达的调控基因，同样也鉴定和克隆了在哺乳类i f n 系统中已经被证明发挥抗 病毒作用的重要基因，包括m x l 、m x 3 、p k r 、v i p e r i n ，i f l 5 6 、i f l 5 8 、i s g l 5 等。 由于这些基因是在病毒诱导的、能够产生i f n 的c a b 细胞中被同时鉴定，因此可以 推测这些基因的表达与病毒感染和细胞i f n 的表达直接关系。事实上，张义兵呖等 7 p q 川农、f p 火学硕十学付论史2 0 0 8 人进一步的研究也表明这些基因不仅受病毒诱导表达，而且用c a bi f n 诱导也能够 快速表达，证实了它们就是鱼类i f n 诱导的基因。虽然还没有最终在体外证实这些 基因表达产物的抗病毒功能，但是这些基因都在病毒感染后的细胞中增量表达，而 且根据哺乳类的研究进展，表明它们可能的功能包括识别病毒信号、启动i f n 合成、 传递放大i f n 信号到最终激活宿主细胞抗病毒状态形成等等。因此，可以合理推测 鱼类i f n 系统也利用与哺乳类相似的抗病毒蛋白来抑制病毒的复制、维持细胞的正 常生理功能。 2 4 鱼类if n 系统和鱼类病毒病 包括鱼类病毒在内的几乎所有病毒都发展了一套免疫逃避机制。病毒性疾病不 仅在鱼类而且在人类也是一个至今无法有效控制的世界性难题。长期以来，对鱼类 病毒病的防治主要是使用病毒疫苗。近年来，第四代的核酸疫苗虽开辟了疫苗学的 一个崭新领域，但是由于免疫效果不稳定，以及免疫机制、安全性问题在理论上还 没有解决，因此大大限制了核酸疫苗的推广应用；此外，疫苗免疫还不适于大面积 水面养殖9 抗病育种可能是解决鱼类病毒性疾病的最彻底的策略。然而通过种群内、 问的抗病遗传力的差异性杂交的常规育种、主要基于细胞核移植技术的细胞工程育 种都没有取得良好的效果。利用抗病毒基因进行抗病毒育种可能是又一种有效的尝 试途径，然而由于缺乏可用的抗病基因，因此还很少有相关报道。 由于i f n 具有广谱的抗病毒活性，不只对一种或几种病毒有作用，因此，早在 2 0 世纪6 0 年代就有利用鱼类粗制i f n 和诱导剂( 如p o l y i ：c ) 延滞或抑制病毒在鱼 体内的复制、防治鱼类病毒病的报道。邵建忠h 3 1 等和贾方钧6 1 等也证明草鱼和鲫鱼 粗制干扰素能有效抑制g c h v 在草鱼苗种中的繁殖和草鱼出血病的发生。另外，国 内还有运用人i f nq 蛋白防治草鱼出血病的报告，发现在培养细胞和鱼体对g c h v 都 有一定的抑制作用7 1 。同时还制备了相应的转人i f nq 基因草鱼，并证明i f na 在 鱼体内的表达随着发育时期的不同而有所变化嵋引。 目前的研究表明阳引，i f n 系统的某些抗病毒蛋白能特异性抵抗某种病毒的感染， 如m x 蛋白主要抗粘病毒的感染，而且有时不需要其他抗病毒蛋白的参与就能建立 起细胞和机体对某些病毒的抗病毒状态。因此，以草鱼出血病为例，如果能鉴定某 种很有效的抗g c h