（发育生物学专业论文）成体组织干细胞来源依据的研究.pdf

山东大学博士学位论文 摘要 目的和背景 本论文力图验证 “ 骨髓是成体组织干细胞来源”的假设。近年来，成体 组织千细胞 ( a d u l t t i s s u e s t e m c e l l s , a t s c s ) 可塑性( p l a s t i c i ty ) 研究成为生物医 学领域研究的热点，但目前受到了质疑。不少阴性实验结果纷纷刊载出来， 包括在n a t u r e , s c i e n c e 上。 之所以如此受关注，除了a t s c s 的可塑性被视为 发育生物学理论的重大突破外，该特性还使得人们对今后应用a t s c s 进行细 胞再生治疗以替代因损伤或疾病导致的组织缺损寄予厚望。 目 前， 质疑a t s c s 可塑性的中心问题为a t s c s 的可塑性是自 然存在， 还是如同克隆动物 d o l l y 一样是人工现象。这一问题有两个重要方面有待阐明，一是陆续由各组织分 离得到的成体组织干细胞之间的关系，即表现出多能性的干细胞其确切身份 和来源;二是各组织干细胞是否可以在体内自主循环。众所周知，干细胞的 分化命运在很大程度上取决于所处的外部环境。某一组织干细胞要发生转分 化 ( t r a n s d i ff e r e n t i a t i o n )必须离开原有的组织环境而迁移至新环境中。a t s c s 可 塑性 研究多 数为体内实 验结 果， a t s c s 的 环境变迁是 人工所为。 d o l l y 及大 量克隆动物的诞生表明，即使是特化的体细胞，也可以被重新程序化，回归 至最原始的细胞分化状态，然后可以像受精卵一样从头发育，即核等价理论。 显然这在自然情况下是不会发生的。a t s c s可塑性研究较多的是骨髓来源的 干细胞， 特别是骨髓造血干细胞 ( h e m a t o p o ie t ic s te m c e ll s , h s c s ) 和间充质干细 胞 ( m e s e n c h y m a l s t e m c e ll s , m s c s )。h s c s 在体内可发育分化为各种血细胞和 免疫细胞，可在外周血中循环，近来发现它还具有造血以外的发育潜能，如 分化为肌肉、肝细胞、神经细胞等。ms c s 能否自 行在体内循环尚无定论，但 其体内外均表现出较强的可塑性，分化为包括神经细胞、肌肉、肾、肺等 9 种以上、三个胚层来源的组织细胞。再者，骨髓是机体组织损伤修复的参与 者，至少其中的炎症前体细胞会出现在所有的损伤部位。为此在本课题中提 出骨髓可能是a t s c s 来源的假设，并试图从多方面加以验证。 方法 分四部分实验，为验证该假设寻求相关证据。拟观察自然状况下，骨 髓干细胞 ( b o n e m a r r o w s t e m c e l l s , b ms c s )参与三个胚层来源组织器官的 生理更新和病理修复，以及b ms c s 在成体组织内的循环和分布情况。在此 山东大学博上学位论文 基础之上，观察移植 b ms c s 和利用药物进行自身b ms c s 动员对糖尿病和重 症坏死性胰腺炎的作用。 选择皮肤、心脏和胰腺分别作为外、中和内胚层来源的组织代表，每种 组织均设正常组和损伤组。 以新西兰白兔为实验对象， 从骼晴 骨髓腔采集骨髓， 密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞 ( m o n o c y t e o f b o n e m a r r o w , m b m ) ， 然 后根据体外生长贴壁行为的差异，分为悬浮生长的骨髓 h s c s和贴壁生长的 ms c s 。利用活细胞核荧光染料h o e c h s t 3 3 2 5 8 对三组b ms c s ( mb m, h s c s 和 ms c s ) 进行核标记， 是通过将染料与细胞在体外共同孵育 1 5 m i n ， 之后以p b s 充分洗涤细胞以除去未结合的染料。标记好的骨髓细胞分别回植于各自的骨 髓腔，3 d 后复制相应的组织损伤模型。 皮肤损伤是通过全皮肤层的剪切造成， 心脏损伤是i p 剂量为5 m g j k g 的盐 酸 异丙 肾 上腺素 ( i s o p e n a l i n e , i s o ) 诱发， 胰腺损伤是 采用i p 剂量为1 m g / k g 的 l - 精氨酸所致。在复制模型2 w后， 处死各动物，用冷p b s 进行心脏灌注后，采 集正常及损伤的皮肤、 心脏和胰腺， 进行冰冻切片， 荧光显微镜下观察组织中有 否荧光标记的骨髓来源干细胞。 选择有荧光的切片， 进行相应组织的免疫荧光染 色。 皮肤切片进行p a n c y t o k e r a t i n 免疫荧光染色，以 观察b m s c s 是否分化为表 皮细胞: 对心肌组织切片进行a - a c t i n免疫荧光染色，以 观察b ms c s 是否分化 为心肌细胞;对胰腺切片进行c k l 9 .胰岛素和胰高血糖素的免疫荧光染色，以 观察b ms c s 是否分化为胰腺干细胞、胰岛的0 和a 细胞。 b ms c s的体内组织分布。将产自 一窝的雄性和雌性小鼠分别作为 b ms c s 的供体和受体。将b ms c s 分为mb m. h s c s 和ms c s ，分别通过尾静脉注射移 植给受 体雌鼠 ， 每只 约1 0 ， 个 细胞。 在移植2 w后， 处 死受体 雌鼠 。 先用冷p b s 进行心脏灌注， 再采集心、肝、 脾、肺、肾、 脑、 小肠、胃、 胰腺、皮肤、 肌肉 共 1 1 种组织器官。利用苯酚/ 氯仿法抽提组织d n 人 以各组织d n a为模板， 采用p c r技术检测各组织中雄性染色体y基因的s r y条带。 移植 b m s c s对四氧啼睫致小鼠糖尿病的作用。雌性小鼠 i p剂量为 2 0 0 m 叭9 四 氧啼淀溶液复制糖尿病模型， 雄性小鼠 作为b m s c s 的 供体。 骨髓 由股骨骨髓腔中冲出， 利用密度梯度离心收集mb m。 通过尾静脉注射移植给 糖尿病模型小鼠， 每只移植约1 0 7 个细胞。 同 时设糖尿病模型对照组和正常对 山东大学博士学位论文 照组。于移植后7 d , 2 0 d 和5 0 d处死小鼠，测定血糖和尿糖，并取胰腺常规 固定化进行 h e染色观察，利用 p c r技术检测胰腺、骨髓、脾脏及肝脏中y 染色体的存在。 粒 细胞 集落刺 激因 子 ( g r a n u lo c y te - c o l o n y s t i m u l a t i n g f a c to r , g - c s f ) 动 员自 身和移植异体b ms c s 对重症坏死性胰腺炎( s e v e r e a c u t e p a n c r e a t i t i s , s a p ) 的保护作用。 以 雌性小鼠复制模型， i p l - 精氨酸溶液， 剂量为2 妙9 。 设g - c s f 预处理组、b ms c s 移植组、s a p 模型组和正常对照组。观察各组在复制s a p 后的7 2 h死亡率、血清淀粉酶活性、胰腺组织病理损伤， 并利用p c r检测受体 雌鼠胰腺中有否雄性供体 b ms c s 来源的 y染色体。 结果 三组b ms c s 均参与皮肤、 心脏和胰腺的组织更新。 实验发现， 三组b ms c s 均迁入正常和损伤的皮肤中，但状态有所不同，b ms c s 散在于正常皮肤而簇 集于损伤皮肤。 迁入正常皮肤中的b ms c s 对p a n c y t o k e r a t i n免疫荧光染色呈 阴性，而迁入损伤部位的b ms c s 有呈阳性染色的细胞，表明己分化为表皮细 胞。在正常心脏中，未见三组 b ms c s ，而它们都迁入损伤心肌组织中，但未 见对。 - a c t i n 免疫荧光染色呈阳性的细胞。在正常和损伤胰腺中，均见到有三组 b m s c s 迁入。但在正常组中，未见对 c k 1 9 , 胰岛素和胰高血糖素染色呈阳性 的细胞，胰腺损伤组中，三组b ms c s 都有对c k 1 9 染色呈阳性的细胞， 但未见 对胰岛素和胰高血糖素染色呈阳性的细胞，表明b ms c s 分化为胰腺干细胞，但 尚未分化为有功能的胰岛细胞。 p c r检测发现，所采集的1 1 种组织中均有y染色体，表明b ms c s 可以分 布于机体中的几乎所有组织器官，这是其分化为相应组织细胞的前提。 移植异体b ms c s 对四氧啼陡致小鼠 糖尿病有治疗作用， 血糖和尿糖水平恢 复至正常， 胰岛组织的损伤程度较模型组显著改善， 在损伤的胰腺中发现有雄性 的y染色体，表明移植的b ms c s 迁入胰腺中。 自 体动员 b ms c s 和移植异体b ms c s 对 s a p有显著的保护作用，表现在 g - c s f 组和b ms c s 移植组7 2 h 内的死亡率较 1 0 %和3 4 ，前两组的血清淀粉酶活性也较 s a p组大幅减低， 三者分别为8 0%, s a p 模型组显著降低。 光镜观察发 山东大学博士学位论文 现， 干细胞相关两组的胰腺出血、 坏死程度也较s a p 对照组减轻。 在移植b ms c s 组， p c r检测发现损伤的胰腺组织中有y染色体， 表明b ms c s 迁移至损伤的胰 腺组织中可能是发挥保护作用的机制。 结论与意义 本论文四部分的实验均支持骨髓是成体组织千细胞来源的假设。 首先， 自 然 情况下， b ms c s 参与了三个胚层来源组织的生理更新和病理修复， 第二， b m s c s 在正常机体中是循环的， 这使得骨髓作为成体组织干细胞来源有了广泛前提。 第 三， 移植b ms c s 能使糖尿病小鼠 血糖恢复和g - c s f 动员自 体b ms c s 能保护s a p 发生时胰腺组织的进行型损伤进一步表明， b ms c s 发挥了作为a t s c s 来源的作 用。由此可以认为，骨髓是成体组织干细胞来源。b ms c s随血液在体内循环， 遇有组织更新或再生的需求， 便停留下来， 本地化为组织干细胞，以补充或更新 内源组织干细胞库， 随后进入增殖和分化程序， 成为成熟的组织细胞， 表现出“ 横 向分化” 或可塑性， 这实际上是由组织取材分离干细胞时循环路过或定居于此的 b ms c s 所为。b ms c s 是成体中最原始的细胞，由其逐步分化为各组织干细胞， 再增殖和分化为特化的组织细胞。这符合经典的细胞分化概念，不属于 “ 横向” 的分化。不同组织有不同的自 我修复能力，在本实验中，心脏的修复能力最弱， 而皮肤最强。补充 b ms c s ，无论是自 体动员，还是异体移植，对组织损伤的修 复和保护均具有积极作用。 需要指出的是， 本实验对骨髓中哪种干细胞亚群在组织修复中起作用还不能 作出回答， 今后应在单细胞水平上开展更长期的研究， 并努力阐明组织微环境对 a t s c s 增殖和分化的调控机制，以放大机体组织修复的生理功能，为临床应用 奠定理论基础。 关键词骨髓 成体 组织干 细 胞 来 源 横向 分 化 山东大学博士学位论文 s tudy on evi de nce of ori gi n of adult s t em cel l abs tract b a c k g r o u n d a n d p u r p o s e t h i s t h e s i s a i m s a t t e s t i n g t h e h y p o t h e s i s th a t b o n e m a r r o w i s t h e s o u r c e o f a d u l t t i s s u e s t e m c e l l s . i n t h e p a s t f e w y e a r s , t h e p l a s t i c it y o f a d u l t s t e m c e l l s ( a t s c s ) h a s b e c o m e t h e h o t p o i n t i n b i o m e d i c a l r e s e a r c h . h o w e v e r , i t r a i s e s d o u b t n o w . a l o t o f n e g a t i v e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s w e re p u b l i s h e d i n s u c c e s s io n , e v e n i n n a t u re a n d s c i e n c e . t h e r e a s o n t h a t t h e r e m a r k a b l e p l a s t i c i t y o f a d u l t s t e m c e l l s h a s d r a w n s o m u c h a tt e n t i o n i s t h a t n o t o n l y i t i s re g a r d e d a s a s i g n i f i c a n t b re a k t h r o u g h i n d e v e l o p m e n t a l b i o l o g y b u t a l s o o ff e r s t h e p o t e n t i a l f o r m e d i c a l u s e o f a t s c s f o r t h e r e c o n s t i t u t i o n o f i n j u r e d t i s s u e s i n t r a u m a a n d d i s e a s e s . t h e k e y i s s u e a b o u t p l a s t i c i t y i s w h e t h e r it i s n a t u r a l o r j u s t a rt i f i c i a l l i k e d o l l y , t h e c lo n e d s h e e p . t w o i m p o r t a n t a s p e c t s r e m a i n t o b e c l a r i f i e d a b o u t t h e q u e ry , o n e i s t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n v a r i o u s a d u l t t i s s u e s t e m c e l l s , o r t h e i r r e a l i d e n t it y a n d o r i g i n , t h e o t h e r i s w h e t h e r t h e y a r e c a p a b l e o f c i r c u l a t i n g i n t h e b l o o d . i t h as b e e n w e l l k n o w n t h a t t h e f a t e s o f s t e m c e l l s l a r g e l y d e p e n d o n t h e ir t i s s u e e n v ir o n m e n t t r a n s d i f f e r e n t i a t i o n w i l l n o t o c c u r u n t i l t i s s u e s t e m c e l l s l e a v e t h e i r o r i g i n a l t i s s u e e n v i r o n m e n t a n d m i g r a t e t o a n e w l o c a t i o n . m o s t o f t h e r e p o rt s a b o u t t h e p l as t i c i t y o f a t s c s w e r e t h e r e s u l t s o f i n v i v o e x p e r i m e n t s i n w h i c h c h a n g e s o f t h e i r e n v i r o n m e n t w e r e m a n - m a d e . t h e s u c c e s s o f c l o n e d a n i m a l s l i k e d o l l y i n d i c a t e d t h a t e v e n s p e c i a l i z e d s o m a t i c c e l l s c o u l d a l s o b e r e p r o g r a m m e d t o t h e p r i m i t i v e c o n d i t i o n a n d t h e n f o l l o w a n o t h e r d e v e l o p m e n t fr o m t h e b e g i n n i n g l i k e z y g o t e . b u t o b v i o u s l y , t h i s w o n t o c c u r n a t u r a l l y . b o n e m a r r o w d e r i v e d s t e m c e l l s a r e a m o n g t h e m o s t c e l l s ( h s c s ) a n d w i d e l y s t u d i e d a t s c s f o r p l as t i c i t y , e s p e c i a l l y h e m a t o p o i e t i c s t e m m e s e n c h y m a l s t e m c e l l ( ms c s ) . h s c s c a n d i ff e r e n ti a t e i n t o b l o o d c e l l s a n di m m unec e l l s a n d c i r c u l a t e i n p e r i p h e r a l b l o o d . r e c e n t f in d i n g s s u g g e s t t h a t h s c s h a v e t h e p o t e n t i a l t o d i ff e r e n t i a t e i n t o n o n - h e m a t o p o i e t i c t i s s u e c e l l s , s u c h a s m u s c l e f i b e r s , h e p a t o c y t e s , m i c r o g l i a as t r o g l i a a n d n e u r o n a l t i s s u e . 淤 山东大学博士学位论文 wh e t h e r m s c s c i r c u l a t e i n t h e b l o o d i s i n c o n c l u s i v e , b u t t h e y e x h i b i t r e m a r k a b l e p l a s t i c i t y b o t h i n v i t r o a n d i n v i v o , w i t h t h e p o t e n t i a l t o d i f f e r e n t i a t e i n t o a l l t h r e e g e r m l a y e r d e r i v e d d i f f e r e n t i a t e d c e l l s , i n c l u d i n g n e u r o n , m u s c l e , k i d n e y a n d l u n g , e t c . b e s i d e s , i t h a s l o n g b e e n k n o w n t h a t b o n e m a r r o w d e r iv e d c e l l s p l a y a c r i t i c a l r o l e i n w o u n d h e a l i n g a s w o u n d s e n r o l l m a n y m a t u re i n f l a m m a t o r y c e l l s w h i c h p r o v i d e c y t o k i n e s t h a t o r c h e s t r a t e t h e h e a l i n g p r o c e s s . t h u s t h e h y p o t h e s i s i s p u t f o r w a r d , a n d w i l l b e t e s t e d i n m a n y a s p e c t s . me t h o d s e x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d t o c h a r a c t e r i z e t h e r o l e o f b o n e m a r r o w s t e rn c e l l s ( b ms c s ) i n t i s s u e p h y s i o l o g i c a l r e n e w a l a n d p a t h o l o g i c a l r e p a i r o f t h r e e g e r m l a y e r s d e r i v e d o r g a n s a n d t h e c i r c u l a t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f b ms c s i n a d u l t t i s s u e s u n d e r n a t u r a l c o n d it i o n . t h e n , t h e e f f e c t s o f t r a n s p l a n t a t i o n o f b ms c s o n d i a b e t e s a n d m o b i l i z a t i o n o f a u t o l o g o u s b ms c s b y g - c s f o n s e v e r e a c u t e p a n c r e a t i t i s ( s a p ) w e re i n v e s t i g a t e d s k i n , h e a r t a n d p a n c r e a s w e r e s e l e c t e d a s e x a m p l e s f o r e c t o d e r m , m e s o d e r m a n d e n d o d e r m d e r i v e d t i s s u e s , r e s p e c t i v e l y . e a c h t i s s u e h a d n o r m a l a n d i n j u r e d g r o u p s . n e w z e a l a n d r a b b i t s w e r e u s e d a s e x p e r i m e n t a l a n i m a l s . t h e i r b o n e m a r r o w w e re a s p i r a t e d fr o m i l i a c c re s t , a n d m o n o c y t e o f b o n e m a r r o w ( mb m) w e r e f r a c t i o n a t e d 妙 d e ns i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n , t h e n m b m w e re d i v i d e d i n t o t w o g r o u p s o f s t e m c e l l s , o n e g r o u p w a s h s c s w h i c h s u s p e n d i n m e d i a w h i l e c u l t u r e d i n v i t r o , t h e o t h e r w a s m s c s w h i c h a r e a d h e r e n t t o p l a s t i c d i s h e s . t h e t h r e e g r o u p s o f b ms c s , mb m , h s c s a n d ms c s , w e r e s t a i n e d w i t h h o e c h s t 3 3 2 5 8 , a f l u o r o c h r o m e , w h ic h is c a p a b le o f b in d in g w it h n u c le i . t h e n u c l e i la b e l in g w a s fu l f il le d 妙c u l t u r in g b m s c s t o g e t h e r w it h t h e d y e f o r 1 5 m in i n v it r o , t h e n w a s h in g t h o r o u g h l y w i t h p b s t o r e m o v e t h e e x t r a fr e e d y e . t h e l a b e l e d b m s c s w e r e th e n t r a n s p l a n t e d i n t o t h e i r o r i g i n a l m e d u l l a r y c a v i t y . t h r e e d a y s l a t e r , t h r e e k i n d s o f t i s s u e i n j u re d m o d e l s w e r e i n d u c e d . e x c i s i o n a l w o u n d s o f s k i n w e r e m a d e b y l i f t i n g t h e s k i n w i t h f o r c e p s a n d 幼 i 山东大学博士学位论文 r e m o v in g a f u l l t h i c k n e s s p o r t i o n o f s k i n ( t o t h e s u b c u t a n e o u s 甸 u s i n g a c u r v e d s c i s s o r s . h e a rt in j u ry w a s i n d u c e d 场i p 5 m g / k g o f i s o p e n a l i n e ( i s o ) . p a n c r e a t i c i nj u r y w a s i n d u c e d 妙娜1 m g / k g o f l - a r g i n i n e . t w o w e e k s a ft e r t h e i n j u r y w a s i n d u c e d , a l l t h e r a b b it s w e r e s a c r i f i c e d , a n d w e r e i n t r a c a r d ia l p e r f u s i o n o f c o l d p h o s p h a t e - b u ff e re d s a l t s o lu t io n ( p b s ) t o a v o i d b l o o d c e l l c o n t a m i n a t io n . t h e n w o u n d e d a n d n o r m a l t i s s u e s w e r e h a r v e s t e d . s a m p l e s w e r e s n a p - fr o z e n a n d s e c t i o n e d o n a c ry o s t a t . t h e p r e s e n c e o f l a b e l e d b m s c s i n t h e c r y o s t a t p r e p a r e d s e c t i o n s w a s e x a m i n e d d i r e c t ly 勿fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . t h e p o s i t i v e s e c t i o n s w e r e c h o s e n f o r f u rt h e r i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y . a n t i - p a n c y to k e r a t i n i nm u n o fl u o re s c e n c e s t a i n i n g w a s p e r f o r m e d i n s k i n s e c t i o n t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e i n c o r p o r a t e d b m s c s d i ff e r e n t i a t e d i n t o e p i d e r m a l c e l l s . a n t i - a - a c t in i nm u n o fl u o re s c e n c e s ta i n i n g w as p e r f o r m e d i n h e a rt s e c t i o n t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e m ebms c s d i ff e re n t i a t e d i n t o m y o c a r d i a l c e l l . a n d a n t i - c k1 9 , a n t i - i n s u l i n a n d a n t i - i m m u n o fl u o re s c e n c e s t a i n i n g w e res e c t i o n t o b ms c s d i ff e ren t i a t e i n t o ma t u r ec e l l s t h e d i s t r i b u t i o n o f b ms c s i n a d u l t t i s s u e s . t h em i cefr o m s a me mo t h e r we r e u s e d a s e x p e r i m e n t a l a n i m a l s , t h e m a l e s w e r e t a k e n a s d o n o r o f b ms c s a n d t h e f e m a l e s a s re c i p i e n t . b o n e m a r r o w w a s o b t a i n e d b y fl u s h i n g t h e f e m u r s o f m a l e d o n o r m i c e , a n d m b m w a s i s o l a t e d 妙d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n , t h e n h s c s a n d ms c s w e re s e p a r a t e d a s d e s c r i b e d a b o v e . t h r e e g r o u p s o f b ms c s , mb m, h s c s a n d m s c s , w e r e t h e n t r a n s p l a n t e d t o f e m a l e r e c i p i e n t v i a t a i l v e i n s i n j e c t i o n a t a d o s e o f 1 0 7 c e l ls p e r m o u s e . t w o w e e k s l a t e r , r e c ip ie n t m ic e w e r e s a c r i f i c e d . t h e y w e r e g i v e n a p e r f u s i o n o f 2 0 m l c o l d p b s a t a fl o w r a t e o f 4p e r f u s a t e wa s p u m p e d in t o t h e l e ft v e n t r i c l e o f t h e h e a r t a n d a n d t h e n 1 i o r g a n s w e r e t a k e n o u t , i n c l u d i n g b y m e a n s o f t h e r i g h t a tr i u m . h e a r t , l iv e r ; s p l e e n ; s u n g , k id n e y , b r a i n , s k i n .a i t d mu scl e . t i s s u e dna wa s p h e n o l - c h l o r o f o r m e x t r a c t i o n , a n d p c r w a s p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e t h e p r e s e s te e o f s r y r e g i o n o f y c h r o m o s o m e f r o m m a l e d o n o r 恤a b o v e t i s s u e s : t h e e ffe c t o f t r a n n o f b ms c s o n d i a b e t e s i n d u c e d衍 a l l o x a n i n nr 1 ce-d i a b e t e s w a s i n d u c e d 妙 i p 2 0 0 m g / k g o f a l l o x a n i n f e m a l e m i c e . ma l e m i c e vn 山东大学博士学位论文 we r e u s e d a s b ms c s d o n o r s . t h e b o n e ma r r o w we r e o b t a i n e d fr o m f e mu r s a n d t i b i a s a n d f r a c t i o n a t e d b y d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n a n d mb m w e re c o l l e c t e d f r o m t h e i n t e r f a c e . mb m fr o m m a l e d o n o r s w e r e t r a n s p l a n t e d t o f e m a l e v i a t a i l v e i n i n j e c t i o n a t a d o s e o f 1 0 7 c e l l s p e r m o u s e . 7 , 2 0 a n d 5 0 d a y a f t e r m b m t r a n s p l a n t a t i o n , f e m a l e m i c e w e r e s a c r i fi c e d . b l o o d a n d : u r i n e g l u c o s e l e v e l w e r e d e t e r m i n e d , h e s t a in i n g w a s p e r f o r m e d i n p a n c r e a s , a n d t h e p r e s e n c e o f y c h r o m o s o m e i n l i v e r , b o n e m a r r o w , s p l e e n a n d p a n c r e a s w a s d e t e r m i n e d b y p c r . p r o t e c t i v e e f f e c t o f a u t o l o g o u s b ms c s m o b i l i z e d b y g - c s f i n s a p m i c e s a p w a s i n d u c e d b y i p 2 g / k g o f l - a r g i n i n e i n f e m a l e s a s d e s c r i b e d a b o v e . m i c e w e r e d i v i d e d i n t o f o u r g r o u p s , g - c s f p i e - t r e a t m e n t , b ms c s t r a n s p l a n t a t i o n , s a p , a n d n o r m a l c o n t r o l g ro u p . t h e d e a t h r a t e w i t h i n 7 2 h p o s t i n d u c t i o n o f s a p , s e r u m a m y l a s e l e v e l a n d p a n c re a t i c p a t h o l o g i c i n j u r y w e r e e x a m i n e d . m e a n w h i le , t h e p r e s e n c e o f y c h r o m o s o m e fr o m m a l e d o n o r s in f e m a le p a n c r e a s w a s d e t e r m i n e d b y p cr. re s u l t s a l l t h r e e g r o u p s o f b m s c s p a r t i c i p a t e i n re p o p u l a t i o n o f s k i n , h e a r t a n d p a n c r e a s . t h e y w e r e a l l p re s e n t i n b o t h n o r m a l a n d w o u n d e d d e r m i s , s c a t e r r e d i n n o r m a l t i s s u e , b u t c l u s t e r e d i n w o u n d e d a r e a s . b ms c s p re s e n t in n o r m a l s k i n d e m o n s t r a t e d b y n e g a t i v e s t a i n in g f o r a n ti - p a n c y t o k c r a t i n , w h i l e t h e r e w e r e s o m e p o s i t i v e c e l l s f o r t h i s i m m u n o fl u o r e s c e nce a s s a y i n 坷u r e d d e r m i s , w h i c h in d i c a t e d t h a t t h e y m i g h t t ra n s d i ff e r e n ti a t e i n t o e p i d e rm a l c e l l s . n o b ms c s w e re p r e s e n t i n i n t a c t h e a r ts ; b u t t h e y a ll a p p e a r e d i n i n j u re d c a r d i a c t i s s u e s w i t h o u t p o s i t iv e c e l l s f o r a n t i - a a c t i n 面m u n o fl u o r e s e e n c e s t a i n i n g . a l l t h r e e g r o u