（分析化学专业论文）保健食品及中成药中违禁药物检测方法研究.pdf

摘要 随着人们生活水平的提高，食品的安全性日渐引起高度的重视。 保健食品作为一种特殊的食品，它的安全性也得到了越来越广泛的关 注。在了解保健食品的同时，传统中成药的安全性问题也成为关注的 焦点。由于保健食品和中成药中违禁添加药物的现象比较严重，这严 重的影响了人们的身体健康，建立有效、快速的监控手段则具有重要 的现实意义。本论文利用高效液相色谱质谱联用方法的灵敏度高、 专属性强、可信度高和样品前处理简单等优点，测定降血压保健食品 和中成药中违禁药物添加情况，并建立降血压、减肥、降糖、降血脂 等类违禁药物的质谱数据库，为更有效的监控违禁药物的添加提供详 细的信息和有效的监控手段。其主要内容如下： 1 综述保健食品和中成药中违禁药物的添加现状以及对消费者 造成的危害。通过与常用的违禁药物检测方法比较，研究高效液相色 谱质谱联用技术在违禁药物检测领域具有的优势。 2 高效液相色谱电喷雾质谱联用检测保健食品中常用高血压治 疗用药。通过优化目标物的液相色谱分离条件和质谱响应，使目标物 具有更好的分离效果和最佳的质谱响应。该方法具有检测限低、可信 度高，并能准确检测降血压保健食品中常用的违禁添加药物，为质量 监督部门提供有力依据。 3 高效液相色谱。质谱法测定降血压保健食品和中成药中多种违 禁添加成分。为了合理服用保健食品和中成药的安全，有必要建立一 种有效的筛选违禁药物添加的方法。通过优化质谱条件和液相色谱条 件，建立筛选保健食品和中成药其中多种类违禁西药添加的快速、准 确、应用范围广的方法。 4 违禁药物质谱数据库的建立。为了克服以往明确违禁药物检 测所带来的局限性，更安全有效的监测保健食品和中成药中违禁西药 添加情况，根据实验室现有条件，有必要建立一套标准、信息丰富的 违禁药物质谱数据库。该数据库变被动为主动手段，在没有对照品的 情况下，能更有效、准确的筛选违禁药物添加。 关键词：保健食品；违禁药物；液相色谱电喷雾质谱联用；质谱数 据库 i i a b s t r a c t f o o ds a f e t yh a sa t t r a c t e dh i g ha t t e n t i o na n dc o n c e r nw i t ht h e i m p r o v i n go fp e o p l e sl i v i n gs t a n d a r d s d i e t a r ys u p p l e m e n t ，a sas p e c i a l k i n do ff o o d ，t h es a f e t yo fw h i c hh a sb e e nm o r ea n dm o r ee x t e n s i v e l y f o c u s e do n ，s oa st h es a f e t yo ft r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s a d d e d m e d i c i n e st od i e t a r ys u p p l e m e n t sa n dt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n ei s v e r ys e r i o u s ，w h i c hc a na f f e c tp e o p l e sh e a l t hi m m e n s e l y i ti si m p o r t a n t a n ds i g n i f i c a n c et oe s t a b l i s ha ne f f e c t i v ea n dr a p i dm e t h o d st om o n i t o r t h e s a f e t y o ft h e p r o d u c t s i n t h i s t h e s i s ，h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - e l e c t r o s p r a y m a s s s p e c t r o m e t r y ( h p l c e s i m s ) m e t h o dw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yh a sb e e ne s t a b l i s h e dt o a n a l y s i so ff o r b i d d e nd r u g si na n t i - h y p e r t e n s i v ed i e t a r ys u p p l e m e n t sa n d t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s m a s ss p e c t r o m e t r yl i b r a r yh a sb e e n e s t a b l i s h e dt om o n i t o rt h ei l l i c i td r u g so fa n t i - h y p e r t e n s i v e ，w e i g h tl o s s ， h y p o g l y c e m i ca n db l o o dc h o l e s t e r o lm e d i c i n e sa n ds o o nt op r o v i d e d e t a i l e di n f o h n a t i o nf o rt h es u p e r v i s i o na n dd e t e c t i o no ft h ed r u g s t h e m a i nc o n t e n t sa r ei n c l u d e da sf o l l o w s ： 1 t h es t a t u sq u oo fa d d e di l l i c i td r u g si nd i e t a r ys u p p l e m e n t sa n d t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e sa sw e l la st h eh a r m f u lt oc o n s u m e r sw e r e r e v i e w e d t h em e t h o d st h a ta r ec o m m o n l yu s e dt od e t e c tt h ei l l e g a l i i i m e d i c i n e sw e r ei n t r o d u c e d ，a n dc o m p a r e dt h e a d v a n t a g e o fh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r yt e c h n o l o g yw i t h o t h e rm e t h o d si nd r u gt e s t i n gf i e l d 2 s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fs o m ec o m m o ns y n t h e t i cm e d i c i n e s f o rt r e a t m e n to f h y p e r t e n s i o n i n d i e t a r ys u p p l e m e n t sb yl i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r y t h el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o nc o n d i t i o n sa n dm sr e s p o n s eo ft h et a r g e t sh a sb e e no p t i m i z e d t h em e t h o dh a dl o w e rd e t e c t i o nl i m i t sa n dh i g hr e l i a b i l i t y , a n dc a n a c c u r a t e l yd e t e c tc o m m o n l yu s e da n t i h y p e r t e n s i o nd r u g si nd i e t a r y s u p p l e m e n t sa n dt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s i tc a np r o v i d eas t r o n g b a s i sf o rq u a l i t ys u p e r v i s i o nd e p a r t m e n t s 3 d e t e c t i o no fa d u l t e r a t i o no f a n t i h y p e a e n s i o nd i e t a r y s u p p l e m e n t sa n dt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e sw i t hs y n t h e t i cd r u g su s i n g l c m s i ti si m p o r t a n tt oe s t a b l i s ham e t h o dt h a tc a ns c r e e no ft h es a f e t y o fd i e t a r ys u p p l e m e n t sa n dt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s t h em e t h o d o p t i m i z e dt h el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n c o n d i t i o n sa n dm s r e s p o n s eo ft h et a r g e t st oe s t a b l i s haf a s tm e t h o dt os c r e e ns e v e r a lk i n d s o fi l l i c i ta n t i - h y p e r t e n s i o nm e d i c i n e s ，a n di tc a nb ew i d e l yu s e di n d e t e c t i o na r e a so fi l l i c i tm e d i c i n e s 4 t h em a s s s p e c t r o m e t r yl i b r a r y o fi l l e g a ld r u g sh a sb e e n e s t a b l i s h e d i no r d e rt oo v e r c o m et h el i m i t a t i o n so ft h ep a s tm e t h o d st h a t k n o w no ft h ei l l i c i t t a r g e td r u g s ，a n da s p e c tt h es a f e t y o fd i e t a r y s u p p l e m e n t sa n dt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e sm o r ee f f e c t i v e l y , i ti s e s s e n t i a lt oe s t a b l i s hac r i t e r i a ，m a s ss p e c t r o m e t r yi n f o r m a t i o nc o m p l e t e l y l i b r a r yb a s e do nt h ep r e s e n tc o n d i t i o no ft h el a b t h el i b r a r yt a k e st h e i n i t i a t i v eb u tn o tt h ep a s tp a s s i v eb e h a v i o ra n dc a ne f f e c t i v e l ys c r e e no f i l l i c i td r u g sa tt h ea b s e n c eo fr e f e r e n c es u b s t a n c e s k e yw o r d s ：d i e t a r ys u p p l e m e n t s ；t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s ；i l l e g a l d r u g s ；h p l c e s i m s ；m a s ss p e c t r o m e t r yl i b r a r y v 附录二： 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：参翌冷7 。年6 月土日 ； j 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 、 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密曰。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名： 产殛轸日期：歹f 年 ( 月2 日 导师签名：勺番，沁k日期：2 口。年 6 月2 日“ 保健食品及中成药中违禁药物检测方法研究 第一章绪论 食品是人类赖以生存的物质基础。在物资丰富的今天，人们对生 活质量的要求越来越高。而随着经济的快速发展，人们在食用食品时， 已不单纯为了摄取营养、维持生命，还要求它具有调节人体生理机能 的作用【1 1 。保健食品的出现，对食品提出了新的挑战，是人们追求高 质量生活的要求2 1 ，也是经济快速发展的产物。我国从1 9 9 6 年至今， 国家食品药品监督管理局和卫生部共批准保健食品达9 6 0 0 余种，市 场规模价值近千亿元，每年新增批准的保健食品有数百种之多3 1 。据 有关资料统计分析，今年，我国保健食品行业增速将会超过2 0 ，成 为近几年来增长速度最快的一年。保健食品的快速发展带来了巨大的 经济效益，同时也带来一系列的安全问题【4 】。尽管国家陆续颁布了一 系列的法律法规进行监管，但保健食品的良莠不齐，掺杂、掺假现象 、的问题时有发生【5 ，6 1 。这不但损害了消费者的利益，而且使人们对保 健食品逐渐丧失了信心，严重影响了保健食品的正常、快速发展。 相对保健食品而言，纯中药制剂或中成药毒副作用小，在国内具 有深远的历史。由于中药材成分的复杂，在未深入研究纯中药制剂与 西药之间的临床试验和毒理作用的情形下，任意在中成药中添加违禁 西药成分会给人们的身体带来巨大的损害1 7 , 8 。 因此，正确面对保健食品和中成药中违禁药物的添加，建立有效 的检测及监控方法和手段，保证合理、有利的维护消费者的权益，保 硕十学位论文 护消费者的身体健康，具有重要的现实意义。 1 1 保健食品和纯中药制剂概述 1 1 1 保健食品的定义 保健食品即具有特定保健功能或以补充维生素、矿物质为目的， 适宜于特定人群食用，具有调节人体机体功能的食品 9 , 1 0 1 。根据2 0 0 9 年6 月1 日开始施行的中华人民共和国食品安全法规定：声 称具有保健功能的食品不得涉及疾病预防、治疗功能，并且不得对人 体产生急性、亚急性或者慢性的危害1 1 】。保健食品主要包含特殊营养 食品，营养强化食品，功能食品1 2 1 ，新资源、新技术食品四大类。2 0 0 3 年卫生部调整了部分保健食品功能的名称，沿用至今【1 3 1 。保健食品功 能包括调节免疫、调节血脂、调节血压，调节血糖，减肥等功能1 4 , 1 5 1 。 1 1 2 保健食品的特点和适用范围 保健食品是具有与食品和药品不同特点和适用范围的一类特殊 的食品。与普通食品相比，保健食品应具有无毒害、一定的营养价值 和感官良好等普通食品的特征。但是，保健食品又具有一般食品无法 比拟的保健功能，即特定的功效成分，它适用于特定的人群6 1 。保健 食品的研究和开发主要倾向于针对特定的人群。 保健食品与药品相比，保健食品主要是适用于亚健康人群，药品 适用于患者，两者都具有某种程度的调节作用。由于保健食品是以调 节机体功能为主要目的，而不是以治疗为目的。因此所有保健食品均 不能宣传具有代替药物治疗的作用，在保健食品中也禁止加入任何药 物，这是保健食品与药品本质的区别【1 7 1 。 保健食品及中成药中违禁药物检测方法研究 1 1 3 中成药概述 纯中药制剂或中成药是指以中药材为原料，按照中医复方标准和 中药制剂的要求，经加工制成的携带方便、可以随时取用的现成药物 【1 8 】。般认为，中成药是纯天然的，不定对人体造成危害。而且由 于服用的方便和消除了异味的刺激，加上中药材的毒副性小，在国内 具有广阔的市场，有的中药材甚至可以作为保健食品的原料。但是如 果长期、大量、滥用中成药，会导致许多不良反应 1 9 , 2 0 1 。 在临床使用方面，常使用中西合药。中西用药的合理配伍，有利 于疾病的预防和治疗，是中西医结合的重要组成部分，往往能收到意 想不到的治疗效果。但是，不合理的配伍，不仅能使药效降低或消失， 甚至可能导致不良反应，乃至死亡【2 1 1 。 1 2 保健食品的安全性及发展面临的问题 保健食品的安全性主要考察原料质量成分的安全性。从某种程度 上来说，保证了原料的质量安全，保健食品的产品质量安全才能得到 基本的保证【2 2 】。一 近年来，我国陆续颁布了法律法规条列，规定和监管保健食品的 原料质量问题。我国保健食品原料在质量方面的安全问题主要包括农 残、重金属残留、微生物污染等问题。对于以传统食品为原料的保健 食品，其质量安全与普通食品大致相刚17 】：其中对于来源于植物源的 保健食品主要考虑农残、有机污染、植物生长激素等问题；对于来源 于动物源的保健食品主要考虑抗生素、微生物、抗菌类药物污染等问 题。 硕十学位论文 对于不以传统食品为原料的保健食品，则具有特殊的质量安全问 题，如以中草药为原料的必需考虑提取物的内源性毒性问题，另外还 需考虑新资源、新技术问题，伪劣保健食品问题等和非法添加违禁药 物的问题等。 1 3 保健食品和纯中药制剂中违禁药物添加情况 保健食品是一种特殊的食品，严禁在保健食品中加入任何治疗功 效的药物。然而，一些厂家为了追逐利益，达到吹嘘的广告效果，在 保健食品中非法添加一些违禁西药成分2 3 1 。而一些不法分子为了提高 纯中药制剂快速、见效的作用，在纯中药制剂或中成药中添加违禁药 物 2 4 , 2 5 1 。这些添加的药物本应该在医生的指导下适量服用，才不会对 人体造成生命威胁。据国内调查显示，一些如调节血糖、抗疲劳、减 肥类保健食品和中成药中添加违禁药物的现象非常严重。2 0 0 7 年， 太原市食品药品监督管理局共查获了1 4 种保健食品中非法添加化学 药物，包括降糖类、减肥类和壮阳类药物，总共检出含吡格列酮、苯 乙双胍、西布曲明以及枸橼酸西地那非等类化学药物2 6 1 。2 0 0 9 年， 杭州市食品药品监督管理局共采集1 9 批次保健食品样品进行安全性 监测评价，主要包括减肥、增强免疫力和缓解体力疲劳等几类，检测 结果有7 批次产品不合格，合格率仅为6 3 2 t 2 7 1 。其中，在一保健食 品中检出违禁添加氨基他达拉非和伐地那非，在另一保健食品中检出 违禁添加西布曲明，并且重金属砷含量超标。消费者若在不知情的情 况下，长期大量服用这些添加了西药的保健药品，最终会造成病人低 血糖或肾病，甚至导致死亡。 保健食品及中成药中违禁药物枪测方法研究 1 4 常用检测方法在违禁药物检测中的应用 1 4 1 薄层色谱法( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t l c ) 薄层色谱法是近年来发展起来的二种微量、快速而简单的色谱 法，灵敏度及分辨率高、分离快速、操作方便【2 8 ，2 9 1 。但是，薄层色谱 影响重现性和精密度的因素较多，由于保健食品和纯中药制剂成分复 杂，在对其进行分析时，可能导致出现假阳性结果，因此，一般用作 有关物质的检查或定性筛选【3 0 ，3 1 1 。 1 4 2 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ， h p l c ) 高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析 技术，主要包括分配色谱、吸附色谱、排阻色谱、离子交换色谱四种 基本类型。高效液相色谱法由于具有分析速度快、分离效能高、灵敏 度好，可分析分子量大、难气化、不易挥发的化合物及离子型、高聚 物等特点而被广泛应用。在液相色谱中有两种类型的检测器：一种是 总体检测器，它对试样和洗脱液总的物化性质有响应，常见的有示差 折光检测器( r i d ) ，对于那些无紫外吸收的有机物如高分子化合物、 糖类、脂肪烷烃比较适合；一种是溶质型检测器，它仅对被分离组分 的物理或物化特性有响应，常见的有紫外( u v ) ，荧光( f l ) ，电化 学检测器( e c d ) 等。 目前，使用高效液相色谱紫外或荧光检测保健食品和中成药中违 禁药物添加的方法有不少报道 3 2 - 3 5 】，它能检测对紫外有吸收或衍生后 对紫外有吸收，及本身或衍生后能发射荧光的物质。但由于保健食品 硕十学位论文 和纯中药制剂中样品成分复杂的影响，在达到各成分较好分离的前提 下，容易出现假阳性的结果。因此，一般辅以光谱法或质谱法进行进 一步的确i i - f 3 6 , 3 7 1 。在今后的应用和发展中，尤其是保健食品中违禁药 物检测方面，液相色谱一质谱联用技术将占据重要地位。 1 4 3 毛细管电泳法( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 毛细管电泳( c e ) 常称高效毛细管电泳( h p c e ) ，或毛细管分 离法( c e s m ) ，具有高压电泳和高效液相色谱等优点，是近年来发 展迅速的新型分离分析技术【3 8 1 。毛细管电泳以毛细管为分离通道，以 高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配能力 上的差异而实现样品的分离。目前，多种灵敏度高的检测器如紫外 ( u v ) 、二极管阵列( d a d ) 、激光诱导荧光( l i f ) 以及电化学( e c d ) 等检测器为毛细管电泳提供质量保证。毛细管电泳技术发展迅速，分 离模式和检测模式也多方面发展。近年来，新型分离模式如亲和毛细 管电泳( a c e ) ，阵列毛细管电泳( c a e ) ，非水毛细管电泳( n a c e ) ， 芯片毛细管电泳( c c e ) 也取得了不小的进展。由于c e 因具有装置 简单、操作方便、分析时间短、分离效率高、样品用量少、前处理简 单、成本低廉等优点，在分析领域的各个方面都有广泛的应用 3 9 - 4 1 】。 有文献报道用毛细管电泳测定保健食品中的违禁添加成分【4 2 1 。但是， 毛细管电泳定性和高效液相色谱一致，需要依靠标准品进行对照，因 此，也常与质谱联用，将c e 的高效分离与质谱的高鉴定能力相结合， 为微量样品的分离分析提供强有力的保证。由于毛细管的内径窄，适 合分析微量样品，并要求具有很高的重复性，而加上国内各地区的发 保健食品及中成药中违禁药物检测方法研究 展不平衡，毛细管电泳普及率不高，阻碍了它的广泛应用。 1 4 4 色谱一质谱联用法 气相色谱质谱联用( g c m s ) 和液相色谱质谱( l c m s ) 联用 是应用最广泛的色谱质谱联用技术。色谱具有良好的分离能力，能 分离复杂混合物，适用于进行定量分析。质谱拥有高灵敏度和低检测 限，对复杂混合物分离比较困难，但能提供化合物结构信息，适合于 进行定性分析。色谱质谱的在线联用，既发挥了色谱的高分离能力， 又发挥了质谱的高鉴别能力，能实现对复杂混合物的更准确的定量和 定性分析。由于简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便，在违 禁药物检测中应用十分广泛。 气相色谱一质谱联用仪是开发较早的色谱质谱联用仪。经过发 展，气相色谱一质谱联用技术已经是一个非常成熟、完善的定性、定 量工具，它在分离、检测和数据采集处理等方面的整体性能都有很大 程度的提高。只要待测组分适合g c 分离，g c m s 则成为联用技术 中首选的分析分离方法【4 3 1 。由于样品成分的复杂性，以及难于挥发等 特点，限制了g c m s 在保健食品和中成药违禁药物检测中的广泛应 用。 液相色谱一质谱联用仪始于二十世纪7 0 年代，由于液相色谱拓宽 了分离范围，与高选择性、高灵敏度的质谱联用后，可对复杂样品进 行实时分析，应用十分广泛，在保健食品和中成药中违禁药物的检测 方面也具有强大的优势1 4 4 , 4 5 1 。 硕士学位论文 1 5 液相色谱质谱联用( l c m s ) 在保健食品和中成药违禁药物 分析中的优势 l c m s 的关键技术是高压液相与高真空质谱的匹配，即接口技 术，最常用是大气压电离源( a p i ) 技术。a p i 常用的有电喷雾电离 ( e s i ) ，大气压化学电离( a p c i ) 和大气压光电离( a p p i ) 三种电 离模式。a p c i 是在大气压下，利用电晕放电使气相样品与流动相电 离的离子化技术，它要求样品具有一定的挥发性，适用于分析非极性 或低、中极性的化合物。a p p i 用紫外灯取代a p c i 的电晕放电，利 用光化作用将气相中的样品电离，适用于分析非极性化合物。e s i 属 于最软的电离模式，适用于分析极性化合物或容易在溶液中形成离子 的化合物，既可用于小分子分析，又可用于大分子的蛋白质、核苷酸 的分析，也常用于合成药物的分析，因而，在检测保健食品和中成药 中的违禁药物添加上应用极其广泛。 由于保健食品和中成药中一般含有较多的复杂中草药功效成分， 干扰较多，这要求检测技术具有较高的灵敏度。而一般的u v ，d a d ， f l 检测器，难以达到要求。l c m s 技术将应用范围极广的液相色谱 分离方法与灵敏度高、专属性强、能提供分子量和结构信息的质谱法 相结合，增强了对复杂混合物的分离能力，已成为保健食品和中成药 中违禁药物检测的常用手副4 7 1 。采用选择离子模式监控( s i m ) 时， 可以有效的降低检测限，增加灵敏度。 质谱仪中的质量分析器也具有非常重要的作用，其将带电离子根 据质荷比大小进行分离，纪录各种离子的质量数和丰度。l c m s 技 保健食品及中成药中违禁药物检测方法研究 术常见的有四极杆质量分析器和离子阱质量分析器。一些高分辨率质 谱和串联质谱也被采用，如飞行时间质谱仪、三重四极质谱仪、以及 四极杆一飞行时间质谱仪。另外，还有扇形磁场质谱，离子回旋共振质 谱也有不少应用【4 6 1 。而四极杆质谱由于操作简单，价格便宜，普及应 用非常广泛。 1 6 建立质谱数据库的重要性 保健食品和纯中药制剂中违禁药物添加的现象愈演愈烈，如何有 效、快速、准确的筛选大量样品中数量繁多的违禁药物，是一项艰巨、 长期的工作。色谱一质谱的联用，为此提供了可靠的保证。 尽管人们对获得信息和化合物之间相关联的知识在不断深入和 扩展，而由于色谱一质谱联用分析在单位时间内产生的大量信息，不 是仅靠人工所能处理的。因而，在对大量实验数据进行分析时，若没 有快速、有效的手段和方法去获得正确、可靠的结果，可能导致许多 宝贵信息的丢失。谱库检索作为定性分析的辅助手段，应用最为广泛。 一般地，g c m s 的数据系统软件都配备有不同的质谱数据库及 谱库检索程序。g c m s 质谱数据库里收集的质谱图，是在正常( 7 0e v ) 的电离轰击离子源( e i ) 电离方式及低分辨单级四极质谱仪条件下， 获得纯化合物的质谱图以及和此化合物相关的一些信息。利用已经建 立的化合物质谱数据库如n b s ，w i l e y 和n i s t 等，对化合物进行鉴 定，这就是常说的“标准数据库 4 8 - 5 0 1 。这些谱图库收集的质谱图有 几十万张。此外，还有一些专业质谱库，如药物、药代、农残，环境 污染物等。电子轰击质谱中包含有分子量信息和结构信息。通常用“概 9 硕十学位论文 率匹配”( p b m ) 进行程序检测，匹配率愈高( 最高为1 0 0 ) ，待测物 质的鉴定愈可靠。 而液相色谱一质谱联用时，为了得到结构信息，可采用c i d 和 m s m s 技术，由于同一化合物在不同仪器下，所得的c i d 谱不尽相 同，难于标准化。因此，没有商品化的“标准质谱库”。这就有必要 建立实验室自己的特有仪器的e s i c i d m s 数据库，获得丰富的谱图 信息和结构信息。 由于离子阱质谱仪的内部离子总是在做复杂运动，在这些复杂运 动中，包含了与质量有关的特征信息，可以拓宽离子阱质量分析器的 质量范围，改善质量分辨率。而且离子阱质谱仪能方便地进行级联质 谱测量，能够承受较高压力，加上这种质量分析器价格相对低廉，体 积较小，与色谱联用十分广泛。 因此，建立实验室违禁药物离子阱质谱数据库是一项可行的实 验，并具有十分重要的意义。这不但能提供丰富的违禁药物的各级质 谱图，还可以根据这些特征谱图，在缺乏对照品的情况下，准确、有 效的筛选样品中的违禁药物添加。 1 7 本课题研究的意义 目前，保健食品行业面临着许多问题，其中违禁添加药物是一项 严重损坏消费者利益和身体健康的最严重的问题。高血压是临床最常 见的心血管疾病之一。据最新有关统计资料，我国内地成人高血压的 患病率目前己上升至1 8 8 ，特别是高血压继发的心、脑、肾等靶器 官损害，这严重地影响了患者的生活质量，已成为严重威胁人类健康 保健食品及中成药中违禁药物检测方法研究 和生命的疾病5 1 1 。具有降血压功效的各类保健食品和中成药则具有强 大的市场潜力。 本论文以几类常见的降血压类药物为目标，检测和筛选降血压保 健食品和中成药中违禁药物添加情况。侧重于优化目标物的高效液相 色谱分离分析条件和质谱响应，建立了快速、灵敏、有效的分析方法。 该方法能实际应用于保健食品和中成药中降血压类药物的违禁检测， 对保健食品的市场监控起到一定的调谐作用，为有关部门的安全监控 提供有利的依据和参考价值，具有重大的现实意义。 针对市场上保健食品和中成药中频繁出现的违禁添加各种类别 化学合成药物的现状，为了更有效的维护消费者权利和身体健康，更 全面的筛选保健食品和纯中药制剂中的违禁药物添加情况，研究建立 了信息丰富的违禁药物质谱数据库。通过分析各目标物的多级质谱响 应和结构特征，更全面的筛选违禁添加。该数据库化被动为主动，在 缺乏对照品的情况下能更准确、全面、有效地筛选保健食品和中成药 中违禁药物的添加，为有关部门有效的监控保健食品的安全提供参考 依据。 硕十学位论文 第二章高效液相色谱电喷雾质谱联用检测保健食品中常用 高血压治疗用药 2 1 前言 高血压是最常见的心血管疾病，是引发冠心病的主要危险因素和 中风最重要的原因，是全球范围内的重大公共卫生问题5 2 1 。利尿剂药 物如氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米以及氨苯喋啶等在高血压治疗中一 直占有重要的基础地位【5 3 1 。由于长期服用利尿剂会产生低血钾、低血 钠、低血镁、增高血尿酸、减低糖耐量、增高血清胆固醇和甘油三酯 等危害，进而通过不同的途径损害肾脏5 4 ，5 5 1 。因此，在治疗高血压时， 需要合理、慎重的服用降血压药物。面对市场上出现的形形色色的降 血压保健食品，其安全性也引起了广泛的关注。 目前，国内外关于保健食品中违禁药物的检测有不少报道【5 6 1 。在 检测降血压类保健食品时，有采用薄层色谱检测降血压非法添加成分 【5 7 】，色谱质谱联用法检测保健食品中的降血压成分 s s , s 9 ，这些方法 都侧重于定性筛选。为了加强市场监管，维护消费者的合法权益，有 必要建立一种有效、简便、应用范围广的检测方法来监督保健食品中 的违禁成分。因此，本研究以西力士为内标，建立了高效液相色谱 电喷雾质谱联用( 玎) l c e s i m s ) 法测定降血压保健食品中的可乐定、 氢氯噻嗪、美托洛尔、氨苯喋啶、酚妥拉明、氯噻酮、呋塞米、缬沙 坦共8 种违禁添加成分( 结构见图2 1 ) 的方法，并利用质谱定性定量。 保健食品及中成药中违禁药物检测方法研究 可乐定 n h 2 n 、人n n 人n 人毗 氨苯喋啶 酚妥拉明 j oh n o = = s = = o n h 2 呋塞米 氢氯噻嗪 兮o _ h 。 夕 氯噻酮 矿 i n h 2 缬沙坦 图2 1 各目标物结构图 f i g 2 - 1t h e s t r u c t u r e so f8i l l e g a ld r u g s 此八种化学合成药物是常用的高血压治疗用药，部分药物容易市场获 得，价格便宜。建立的方法与常用的高效液相色谱一紫外( h p l c u v ) 法进行了比较，结果表明h p l c e s i m s 方法学上比较完善，且快速、 1 3 硕十学位论文 专一、灵敏度和准确度高，抗干扰能力强。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 高效液相色谱- 质谱联用仪( w a t e r sa l l i a n c e2 6 9 5 z q2 0 0 0 ) ： f l 了w a t e r s2 6 9 5 分离单元，w a t e r s2 4 8 7 双波长紫外检测器，z q2 0 0 0 质谱检测器组成( w a t e r s ，美国) 。m e t t l e rt o l e d o 型电子分析 天平( 梅特勒一托利多仪器上海有限公司) ；k q3 2 0 0b 型超声波清洗 仪( 昆山市超声仪器有限公司) ；g l 2 0 b 高速离心冷冻机( 上海安 亭科学仪器厂，中国) 。 对照品盐酸可乐定、氢氯噻嗪、酒石酸美托洛尔、氨苯喋啶、甲 磺酸酚妥拉明、氯噻酮( 9 8 9 ) 、呋塞米、缬沙坦( 9 8 8 ) 和西力 士均购自于中国药品生物制品检定所( 北京，中国) ，水为m i l l i p o r e 超纯水( m i l l i p o r e ，美国) ，甲醇、乙腈为色谱纯( 湖南化工研究院 精细化工研究所) ，甲酸铵( 上海新华化工厂) ，甲酸( 8 5 ，上海 实验试剂有限公司) 均为分析纯。所测样品为市场上购得的降血压胶 囊状保健食品，其主要成分为总黄酮。 2 2 2 储备溶液和内标溶液的配制 分别准确称取盐酸可乐定、氢氯噻嗪、酒石酸美托洛尔、氨苯喋 啶、甲磺酸酚妥拉明、氯噻酮、呋塞米、缬沙坦对照品o 0 0 3g 于刻度 试管中，3 n 5 0 甲醇一水超声提取1 0m i n ，定容至1 0m l 容量瓶中，其 浓度约为3 0 0i _ t g m l 。 准确称取内标西力士粉末0 0 3 2 3g ，用5 0 甲醇一乙酸乙酯超声3 0 保健食品及中成药中违禁药物检测方法研究 m i n 溶解，稀释定容至2 5m l ，过0 2 2j a m 有机膜。各储备液和内标溶 液放于4o c 冰箱中，使用前恢复至室温。 2 2 3 样品处理 分别称取粉末样品o 5g 于烧杯中，j j d 2 0m l5 0 的甲醇一水超声3 0 m i n ，再以8 0 0 0r m p 的速度离心1 0m i n ，上清液转移至5 0m l 容量瓶中， 定容，过0 2 2 “m 有机膜，备用。 2 2 4 实验条件 液相条件：分离色谱柱为江申s p h e r i g e lc 1 8 色谱柱( 2 0 0m m x 4 6 m m ，5 岬) ，流动相：甲醇乙腈一0 0 0 5m o l l 酸铵甲酸缓冲盐( p h = 3 o ) ，梯度洗脱。进样量：1 0 皿，流速：1 0m l m i n ，以0 2m l m i n 的流速分流进质谱。紫外检测波长：2 7 2n l n 。表2 1 为梯度洗脱程 序。 表2 1 梯度洗脱程序 t a b l e2 - 1c o n d i t i o no fg r a d i e n te l u t i o n a ：甲醇；b - 乙腈；c - 甲酸铵一甲酸缓冲盐( p h = 3 ) 质谱条件：电喷雾离子化采集模式( e s i ) ，扫描范围：( 1 5 0 5 0 0 ) a m u ，萃取电压：4v ，射频电压：o 5v ，源温度：1 0 8o c ，脱 溶剂气温度：3 0 0 。c ，脱溶剂气流：3 0 0l h r ，锥孔反吹气：1 0l h r ， 1 5 硕十学位论文 e s i 正离子模式毛细管电压：3 5k v ，锥孔电压：2 5v ；e s i 负离子模 式毛细管电压：4k v ，锥孔电压：3 0v 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 分离条件优化 2 3 1 1 色谱条件优化 流动相的酸性影响分析的灵敏度、目标物的分离度和保留大小。 实验通过比较甲酸甲酸铵的p h ，分析p h 分别为2 8 ，3 0 ，3 2 ，3 4 条 件下时，目标物的分离程度和峰型。结果发现p h 为3 0 时各物质的分 离度好、分析时间短，重现性好，峰型良好。 2 3 1 2 质谱条件的优化 比较e s i 正负离子模式下的质谱响应，发现甲磺酸酚妥拉明的正 离子响应优于其负离子模式下的质谱响应，氯噻酮，缬沙坦的负离子 响应优于其正离子模式下的质谱响应。因此以e s i 负离子模式分析氢 氯噻嗪( 选择离子s i r = 2 9 6 ) ，氯噻酮( s i r = 3 1 9 ) ，呋塞米( s i r = 3 2 9 ) 和缬沙坦( s i r = 4 3 4 ) ；以e s i 正离子模式分析可乐定( 选择离子 s i r = 2 3 0 ) ，氨苯喋啶( s i r = 2 5 4 ) ，美托洛尔( s i r = 2 6 8 ) 和酚妥拉 明( s i r = 2 8 2 ) 。 比较不同毛细管电压的影响，e s i 正离子模式下，目标物在3 5k v 质谱峰响应最好，在e s i 负离子模式下，目标物在4 0k v 响应最好。 比较不同锥孔电压的选择，分别考察目标物在+ 1 0v ，士1 5v ，+ 2 0v ， + 2 5v ，+ 3 0v ，- 4 - 3 5v ，+ 4 0v ，+ 4 5v ，- 4 - 5 0v ，+ 6 0v ，士7 0v 锥孔 电压下的质谱响应，发现e s i 正离子模式下，可乐定，氨苯喋啶，美 保健食品及中成药中违禁药物检测方法研究 托洛尔，甲磺酸酚妥拉明的最佳锥孔电压分别为：1 5v ，2 5v ，1 5v ， 1 0v ，e s i 负离子模式下，氢氯噻嗪，氯噻酮，呋塞米，缬沙坦的最 佳锥孔电压分别为：4 5v ，3 0v ，3 0v ，3 0v 。由于较高的锥孔 电压产生较多的碎片离子，故正离子模式下选取2 5v 作为分析锥孔电 压；负离子模式下选取一3 0v 作为分析锥孔电压。 2 3 2h p l c u v 分析 由于各目标物在2 7 2n r l l 具有较好的吸光度，图2 2 为在该波长下 和优化的色谱条件下得到的8 种对照品和内标的色谱图。由图2 2 可 见，8 种成分和内标在1 9m i n 内得到了快速分离。 图2 2 目标物在2 7 2n n l 处的紫外图 f i g 2 - 2t h eu vc h r o m a t o g r a mo f8d r u g su n d e r2 7 2n n l 1 可乐定：2 氢氯噻嗪；3 氨苯喋啶；4 美托洛尔；5 酚妥拉明； 6 氯噻酮；7 呋塞米；8 缬沙坦；9 西力士 2 3 3h p l c e s i m s 分析 在优化的色谱和质谱条件下，各目标物都有很好的分离。从图2 3 的分子离子质谱图可见，在e s i + 离子模式下：可压定形成分子离子峰 ( m + ) m z2 3 0 ；氨苯喋啶形成准分子离子m z2 5 4 ( m + h + ) ；美 托洛尔形成准分子离子m z2 6 8 ( m + 蜘+ ) ；酚妥拉明形成准分子离 1 7 1 0 硕士学位论文 9 0 1 0 5 0 01 0 0 01 5 o o 2 0 0 0 5 t i m