11工程酶与蛋白质工程实验报告.doc

实验一实验题目：大蒜SOD的分离纯化及活力测定实验目的及要求：1. 通过学习超氧化物歧化酶的提取分离方法，掌握有机溶剂沉淀蛋白质原理2. 掌握测定超氧化物歧化酶活性方法实验仪器及材料：1.试剂：50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液，冷丙酮，氯仿-乙醇，pH8.2 50mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L HCl, 50mmol/L 邻苯三酚2.器材：恒温水浴槽、紫外分光光度计、试管、离心机、移液器（1mL，50L，25L）一、实验原理：超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶，它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢2O2-+2H+H2O2+O2,大蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取，SOD金属蛋白酶对pH、热和蛋白质水解等反应比一般酶稳定，且SOD不溶于丙酮，可用丙酮沉淀和热击结合法提取和纯化SOD。二、实验步骤1.SOD提取液：称取20g左右大蒜蒜瓣，清水洗净，再用蒸馏水冲洗，用滤纸吸干，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎，然后加入2-3倍体积的0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000r/min下，离心15min，弃沉淀得提取液2.粗酶液制备：提取液加入0.25倍体积的氯仿-乙醇（3:5）混合溶剂搅拌15min 5000r/min离心15min去杂蛋白沉淀，得粗酶液3.SOD的沉淀分离：用盐酸调节SOD粗提液pH值5.0，加入0.6冷丙酮，搅拌15min 5000r/min离心15min得SOD沉淀4.精酶液制备：将SOD沉淀溶于0.05mol/L pH7.8的缓冲液中于55热处理15min，离心弃沉淀，得到SOD酶液5.SOD活力测定：（1）邻苯三酚自氧化速率测定：取两只试管，按下表加入25预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长测定光吸收值，每隔30S读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化，要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07试剂空白管（mL）自氧化管（mL）50mmol/L Tris-HCl pH8.22.982.9810 mmol/L HCl0.020.0150 mmol/L 邻苯三酚0.01（2）SOD样液活性测定：样品取代自氧化管，样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚，其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定试剂空白管（mL）样品管（mL）50mmol/L Tris-HCl pH8.22.982.9810 mmol/L HCl0.02SOD样液0.0150 mmol/L 邻苯三酚0.01（3）计算：酶活力单位定义：在25恒温条件下，每毫升反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化率达50%酶量定义为1个酶活力单位。 0.070样液速率 100% 0.070 样液稀释倍数酶活性（U/mL）=反应液总体积 50% 样液体积实验二实验题目：SDS-PAGE法测定酶蛋白分子量实验目的及要求：1. 掌握蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的基本原理。2. 学习SDS-PAGE在蛋白检测中应用，包括制胶、加样、电泳、剥胶、染色及脱色等。实验仪器及材料：1.试剂：30的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺贮存液，10%的十二烷基硫酸钠，氯仿-乙醇，1.5M pH8.8/1.0M pH 6.8 Tris-HCl缓冲液, N,N,N,N-四甲基乙二胺, 10的过硫酸氨，Tris-Gly电极缓冲液，蛋白质分子量Marker，2SDS凝胶上样缓冲液，甲醇:乙酸溶液（脱色液），考马斯亮蓝染色液2.器材：水浴锅，电泳仪，垂直板电泳槽，离心机，移液器（1mL，50L，25L）一、实验原理：在一定条件下，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使蛋白质的多肽亚基相互分离，并尽可能减少这些亚基之间的聚集。变性的多肽链因结合强阴离子去垢剂SDS带上负电荷，上样前与蛋白质样品一起加热使蛋白质解离。由于SDS的结合量总是与多肽链的分子量成比例而与肽链的序列几乎没有任何关系，因此SDS-多肽链复合体在聚丙烯酰胺凝胶中的移动就与肽链的大小一致。借助已知分子量的蛋白质参照，就可以估测样品多肽链的分子大小。在电泳槽的两级通电后，样品中的SDS-多肽复合物随着凝胶中的移动界面向前推进。样品通过浓缩胶后，在分离胶与浓缩胶的交界面聚集成一条很细的区带，使得SDS-PAGE的分辨率大大提高。考马斯亮蓝染色法是一种相对快速且直接的染色方法，它可以非特异性地与蛋白质结合而并不与凝胶结合，经过脱色液将凝胶中过量的染料脱去，即可在透明的凝胶基质上形成可见的被分离蛋白质的蓝色条带。二、实验步骤1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备：按照厂商说明书安装玻璃板，依照表1中给出的数值配制10的分离胶溶液，灌胶，留足灌浓缩胶的空间，小心在分离胶上覆盖的水层，聚合完成后倾出水层，依照表2中给出的数值配制5的浓缩胶溶液，灌胶后立即插入清洁的梳子，注意不要带入气泡等待胶聚合。2. 样品准备与凝胶电泳：2SDS凝胶上样缓冲液与样品混匀，沸水煮样5min后得样品蛋白Marker同样煮沸后备用。将Tris-Gly电极缓冲液注入电泳槽，小心拔出梳子，并排净上样孔中的气泡。用微量注射器按预先确定的顺序将样品与Marker注入浓缩胶上加样孔中，接通电源，在凝胶上加8V/cm的电压，等染料前沿移动到分离胶后，将电压增加至15V/cm，电泳至溴酚蓝移动至分离胶底部时停止供电。电泳结束后从电泳仪上移走玻璃板，小心剥下凝胶，转移到大培养皿中，用水冲洗数次。用考马斯亮蓝对聚丙烯酰胺凝胶进行染色1小时左右，倾出染色液，将凝胶浸泡在甲醇:乙酸溶液（不含染料）中脱色，每隔20分钟更换一次脱色液，直到蛋白质在透明的凝胶背景上显示为蓝色条带。表1 Tris-Gly SDS-PAGE 10分离胶（10ml）成分H2O30%丙烯酰胺混合溶液1.5MTris （pH 8.8）10% SDS10%过硫酸氨溶液TEMED体积（ml）4.03.32.50.10.10.004表2 Tris-Gly SDS-PAGE5浓缩胶（