本科毕业论文-荔枝LcWDR1基因对烟草的遗传转化研究.doc

本科毕业论文荔枝LcWDR1基因对烟草的遗传转化研究指导教师 学院名称园 艺 学 院 专业名称种子科学与工程论文提交日期2012年5 月 21日 论文答辩日期 2012 年5 月5 日摘 要植物花色素苷的合成除了受结构基因的控制，还受到调控基因的影响，目前已鉴定出R2R3-MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白三类参与花色素苷合成调控的转录因子。本实验以模式植物烟草为材料，以构建好的LcWDR1的植物表达载体，采用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化，以期阐明LcWDR1基因的功能。经过一系列的筛选培养，得到56株抗性植株，PCR检测表明，有40株扩增出的特异条带与阳性对照扩增出的特异条带一致，且均无农杆菌污染，而非转基因的烟草植株则没有特异条带出现，PCR检测结果初步表明外源基因已经整合进烟草植株的基因组中，得到PCR阳性植株。LcWDR1阳性植株与对照相比暂无明显的表型差异，结果还有待进一步的观察分析。关键词：LcWDR1基因 遗传转化 烟草Transformation Analysis of the LcWDR1 Gene in Transgenic TobaccoCheng Lu（College of Horticulture, South China Agricultural University Guangzhou 510642,China）Abstract: Flower pigments synthesis in plant was controlled both structural genes and regulation gene. Currenly, three kinds of flower pigments synthesis i.e. R2R3-MYB, bHLH and WD40 protein has identified. In the present study, tobacco was used as materials to study the function of LcWDR1 gene driven by CaMV 35S promoter. After a series of screening culture, 56 resistant plantlets were obtained. Forty putative plants were achieved according to PCR analysis. The PCR results showed that the LcWDR1 genes had been successfully transferred into tobacco genomics. However, no difference was detected between transformed plants and wild types. Key words： LcWDR1 Gene Tobacco Genetic transformation 目 录1 前言11.1 研究综述11.1.1 荔枝果皮花色素苷生物合成转录调控的研究11.1.2 WD40调控花色素苷生物合成的研究11.1.3 植物转基因方法概述21.2 研究目的和意义22 材料与方法22.1 材料22.1.1 转化材料22.1.2 菌株和表达载体32.1.3 主要试剂和培养基配方32.2 方法32.2.1农杆菌的培养32.2.2遗传转化32.2.3 转化植株的PCR鉴定43 结果与分析53.1 导入烟草及候选转基因植株的获得53.2 烟草转化体的PCR检测分析结果74 讨论114.1实验原理114.2 LcWDR1在烟草中的异源表达114.3 假阳性问题的探讨11致 谢12参 考 文 献12本科专业毕业论文成绩评定表141 前言1.1 研究综述1.1.1 荔枝果皮花色素苷生物合成转录调控的研究 色彩是决定花卉和果蔬品质的一个重要方面，而色彩又取决于花色素苷含量积累的表现。花色素苷除了能给蔬菜、花卉、水果带来丰富鲜艳的颜色，还具有对生物和非生物的胁迫反应的响应，比如：紫外线照射、冷胁迫、干旱胁迫等反应（Ubi et al,2006；Castellarin et al,2007；Zhang et al,2011）。最近国内外的研究表明，花色素苷合成代谢的调控是在转录水平上，主要通过调控花色素苷合成代谢过程中结构基因的表达，从而使合成代谢过程中的酶的合成受到影响（Allan et al,2008)。目前已鉴定了三类参与花青素合成调控的转录因子，分别是R2R3-MYB、bHLH和WD40。 荔枝是我国南方重要的亚热带果树，种质资源丰富，色泽类型多种多样，但目前对其果实色泽发育过程和着色机理的研究尚不够系统和深入。1.1.2 WD40调控花色素苷生物合成的研究 WD40重复蛋白是目前已鉴定的三类参与花青素合成调控的转录因子之一，WD40重复蛋白发现于植物细胞质。该序列以甘氨酸-组氨酸(Gly-His)开始，以色氨酸-天冬氨酸(Trp-Asp, WD)结尾，因此称为WD40 基序，而含有此种基序的蛋白称作WD40蛋白（Smith et al,1999）。拟南芥中发现了269个蛋白含有这样的结构域，这些蛋白在细胞代谢过程中起着各种各样的作用，包括生长素的响应、光信号传导、植物开花、种子发育等（Nocker et al,2003）。目前参与花色素苷代谢的WD40类转录因子研究还很少，植物中第一个发现编码WD40蛋白参与花色素苷生物合成转录调控的基因是在矮牵牛中发现的PhAN11（Vetten et al,1997）。随后在拟南芥ttg1的突变体中发现，TTG1所编码的WD40蛋白具有调控花色素苷的合成和表皮毛发育的功能（Walker et al,1999）。从玉米白色糊粉粒pacl位点突变株中克隆到了参与花色素苷生物合成调控的PAC1（WD40）基因，PAC1的主要功能是调控花色素苷和原花色素苷的生物合成，而在拟南芥中过量表达PAC1能恢复拟南芥的ttg1突变体的所有性状（Carey et al,2004）。 到目前为止，只有少量关于调控花色素苷生物合成代谢转录调控的WD40蛋白被鉴定，包括紫苏（Perilla frutescens）PFWD（ Sompornpailin et al,2002），棉花（Matthiola incana）GhTTG1 和GhTTG3（ Humphries et al,2005），蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula) MtWD40-1（Pang et al,2009），苹果（Malusdomestica）MdTTG1（Brueggemann et al,2010），葡萄（Vitis vinifera L.）VvWDR1（Matus et al,2010），石榴（Punica granatum L.）PgWD40（Ben-Simhon et al,2011）。调控花色素苷生物合成代谢功能的WD40蛋白同时还具有其他功能，TTG1所编码的WD40蛋白具有调控叶表皮形成、花色素苷的合成、种子外表皮色素的积累等功能，PgWD40、MdTTG1和PAC1都可以恢复拟南芥ttg1突变体所丢失的所有功能（Walker et al,1999；Carey et al,2004；Brueggemann et al,2010；Ben-Simhon et al,2011）。蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula) MtWD40-1基因突变后植物粘液合成减少，酚类代谢过程受到抑制如原花色素、表儿茶酸、还有一些其他类黄酮，根部的异黄酮合成也减少（Pang et al,2009）。以上研究结果说明WD40蛋白的功能非常广泛，一个WD40蛋白可能参与到多个代谢过程中。1.1.3 植物转基因方法概述植物遗传转化，又称为植物转基因，是把不同来源的基因导入植物细胞，并整合到植物基因组中，获得转基因植株的一种技术手段。目前的转基因的方法和技术有载体转化，包括根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化，发根农杆菌Ri质粒介导基因转化及植物病毒载体介导基因转化。也有采用直接转化的方法，先构建T-DNA作为外源DNA，再用PEG转化或基因枪、点击穿孔、显微注射法等。另外，用种质系统，如通过花粉管通道导入外源基因的方法，也有报道（周光宇等，1988）。其中，利用根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化是目前应用较为广泛的方法。1.2 研究目的和意义 本实验在克隆可能参与荔枝果皮花色素苷生物合成相关调控基因的LcWDR1cDNA全长序列和的时空表达分析的基础上，以构建好的LcWDR1的植物表达载体，采用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化，以期阐明LcWDR1基因的功能。2 材料与方法2.1 材料2.1.转化材料 烟草种子先用0.1%HgCl消毒5-8min，无菌水洗5-7次，播于无激素的1/2MS培养基（含30g/L蔗糖，4.5g/L琼脂，pH值5.8）上于组培室中萌发至 5-6 片真叶时备用。2.1.2 菌株和表达载体含植物表达载体pBI121-LcWDR1农杆菌EHA105，本实验室保存。2.1.3 主要试剂和培养基配方（1）化学试剂药品试验用的Taq聚合酶、DL2000和dNTP购自TakaRa公司。琼脂粉（日本）、BA、NAA、卡那霉素(Kanamycin，Kan)、利福平（Rifampicin，Rif）、头孢霉素(Cefotaxime，Cef)、硫酸链霉素（Streptomycin Sulfate，Str）、琼脂糖（西班牙）等购自北京鼎国生物技术有限责任公司。（2）培养基YEP(农杆菌培养基)：10 g.L-1 蛋白胨, 10 g.L-1酵母粉, 5 g.L-1 NaCl。固体培养基加7%琼脂。种子萌发培养基：MSB（MS无机+B5有机）+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH5.8共培养培养基：MSB +30 g/L蔗糖+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA (0.5 mg/L IAA)+5 g/L琼脂+100 M As，pH5.4第一次筛选培养基：MSB +30 g/L蔗糖+2.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA(0.5 mg/L IAA)+50 mg/L Km +500 mg/L Cef+5g/L琼脂, pH5.8第二次及以后的筛选培养基：MSB +30 g/L蔗糖+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA(0.5 mg/L IAA)+50 mg/L Km +200 mg/L Cef+5 g/L琼脂, pH5.8生根培养基：MSB+30 g/L蔗糖+50 mg/L Km +200 mg/L Cef +5 g/L琼脂，pH5.82.2 方法2.2.1农杆菌的培养挑取pBI121-LcWDR1的EHA105菌株的新鲜单菌落，接种到20 ml含100 mg/L Kan、75 mg/L Rif和75 mg/L Str的YEP液体培养基中，在恒温摇床上，于28，180 rpm，培养至OD600=0.6-0.8，然后按52%的比例转入新配制的附加相应抗生素的YEP培养液中，在相同的条件下培养过夜，转入无菌离心管中，3000 rpm离心5 min，去掉上清液。用3倍体积原离心时菌液体积的MSB液体培养基重悬菌2.2.2遗传转化（1） 农杆菌侵染 将烟草叶片切成0.5cm2的小块，置于用MSB液体培养基重悬的农杆菌菌液中，浸泡510 min后倒掉菌液，用无菌滤纸吸去外植体上多余的菌液。将浸染过的外植体接入表面铺有一层无菌滤纸的共培养基上,黑暗条件下，28 共培养3 d。（2） 选择培养 共培养3 d后将外植体转入第一次筛选培养基上进行选择培养，3周后继代到第二次筛选培养基上培养，每3-4周继代一次。（3） 生根培养 筛选培养基上诱导出的不定芽生长至12 cm时，将抗性芽切下转入生根培养基中，诱导根的形成。长出根后，先将生根后的植株在室温下锻炼7 d，将植株根部的培养基洗净，室温下保湿7-10 d，打开瓶盖移到蛭石中进行炼苗，两周后，经过炼苗的小植株移入土壤中，在温室自然光照条件下生长。2.2.3 转化植株的PCR鉴定1）烟草植株总DNA的快速提取（改良CTAB法）（1） 从抗性苗上取0.1 g左右的幼叶，放入1.5 ml离心管中，在液氮中用玻璃棒研碎；（2） 加入预热的CTAB提取液（65），振荡混匀，加热30 min，期间不时摇动；（3） 冷至室温，加入等体积的酚/氯仿，混匀，12000 rpm，离心5 min；（4） 取上清液，加入2/3体积的异丙醇和1/10体积的NaAc（3 M，pH5.2）混匀后，室温静置15 min；（5） 用枪头将沉淀挑出，用70酒精洗涤沉淀2次；（6） 37晾干，加入100 ml的RNase/TE，处理1 h后-20保存备用。2）PCR检测以抗卡那霉素烟草植株的基因组DNA（约100 ng）为模板，进行PCR扩增。同时设重组质粒pBI121-LcWDR1为阳性对照，以非转基因普通烟草基因组DNA为阴性对照。（1）PCR反应体系 取一0.5 ml PCR管，依次加入以下试剂： 组分 体积模板DNA0.5 L10buffer（含Mg2+）2.5 LdNTP（10 mM）0.5 L引物1（10 mM）1.0 L引物2（10 mM）1.0 LTaq DNA聚合酶（5U/L）0.25 L灭菌双蒸水19.25 L总体积25.0 L(2) PCR扩增参数PCR扩增体系为25.0 l，所检测的基因、引物序列和扩增程序见表1，同时设重组质粒pBI121-LcWDR1为阳性对照，以非转基因叶片基因组DNA为阴性对照。用1.2琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。表1 抗性植株的PCR鉴定时所检测的基因、引物序列、目的片段长度及扩增程序检测的基因引物序列扩增程序npt IIF：GTTCTTTTTGTCAAGACCGACC94 5 min(94 40 s52 40 s72 1 min)3072 10 minR：CAAGCTCTTCAGCAATATCACG35SF：GAGGACCTAACAGAACTCG94 5 min(94 40 s53 40 s72 1 min)3072 10 minR：GTCTTGCGAAGGATAGTGGLcWDRF：ATGGAAAACTCGACCCAAGAATC94 5 min(94 45 s55 1 min72 1 min)3072 10 min R：GCCTCAAACTTTCAAAAACTGCChvAF：TCCATCAGCAACGTGTCGGTGCT94 5 min(94 40 s63 40 s72 1 min)3072 10 min R：GTGGAAAGGCGGTGAGCGATGAT3 结果与分析3.1 烟草转LcWDR1基因抗性植株的获得 农杆菌介导的遗传转化是外源DNA进入植物细胞最成功和应用最广泛的方法之一。本研究所采用的农杆菌EHA105菌株具有侵染能力强，转化率高等特点。经过农杆菌侵染、共培养、筛选培养和生根筛选后，得到转LcWDR1基因的56株抗性植株（图1）。将所获得的再生植株炼苗后移栽到试验地种植（图2），表型观察发现转LcWDR1基因的56个抗性植株与野生型烟草相同，都能正常生长发育，无明显的表型差异。AE图1 烟草转LcWDR1基因抗性植株的获得图2 田间试验表型观察3.2 烟草转化体的PCR检测分析结果以基因组DNA为模板进行PCR扩增检测35S启动子、目的基因LcWDR1和NPT II，同时检测EHA105菌中ChvA基因的存在与否，以避免因植株可能存在的除菌不净而带来的假阳性影响。结果表明，得到56株抗性植株，有40株扩增出的特异条带与阳性对照扩增出的特异条带一致，且均无农杆菌污染，而非转基因的烟草植株则没有特异性条带出现（图3）。PCR检测结果初步表明外源基因已经整合进烟草植株的基因组中。12 13 14 15 16 17M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 500bp2000bp图3 npt II检测结果M, DL2000 marker; 1, 阳性对照; 2, 未转基因烟草对照; 3-17, 样品500bp1000bp2000bp12 13 14 15 16 17图4 35S启动子检测结果 M, DL2000 marker; 1, 阳性对照; 2, 未转基因烟草对照; 3-17, 样品12 13 14 15 16 172000bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1000bp500bp图5部分烟草抗性植株ChvA检测结果 M, DL2000 marker; 1, 阳性对照; 2, 未转基因烟草对照; 3-17, 样品M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 172000bp图1000bp500bp6图6 LcWDR1检测结果 M, DL2000 marker; 1, 阳性对照; 2, 未转基因烟草对照; 3-17, 样品4 讨论4.1实验原理1. 遗传转化原理本实验采用农杆菌Ti质粒介导转化方法。Ti质粒为从农杆菌中分离出来的染色体外遗传物质，为环状DNA结构，其中T-DNA区是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并整合到植物的核基因组上的一段DNA。植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质，当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物又到Ti质粒上毒性基因（vir）表达，并使T-DNA整合到植物细胞的染色体中。对野生型Ti质粒进行改造，使其具有选择标记基因，本实验使用的Ti质粒含有新霉素磷酸转移酶基因（npt II），它能使转化植物细胞获得卡那霉素抗性。因此实验过程中一直使用卡那霉素来筛选转化子。2. 组织培养原理根据植物细胞的全能性，提供无菌环境及适合的光温湿条件，充足的营养下，外植体会分化形成根或芽，或先出现愈伤组织，再由愈伤组织分化为根或芽。因此组织培养为遗传转化所广泛利用以获得转化植株。4.2 LcWDR1基因在烟草中的异源表达 在烟草中超表达LcWDR1从愈伤组织到植株再生与对照相比显著无差异。矮牵牛an11（编码WD40蛋白）突变体其花瓣的花色素苷的积累明显受到了抑制，将分离得到的基因在拟南芥中超表达，3周大小的拟南芥幼苗积累花色素苷（De Vetten et al,1997）。在拟南芥中超表达苹果MdTTG1和石榴PgWD40，拟南芥幼苗时期花色素苷合成，种子原花色素苷合成，根毛发生，即能恢复拟南芥的ttg1突变体表型（Ben-Simhon et al,2011；Brueggemann et al,2010）。目前WD40蛋白在调控果实花色素苷生物合成的研究较少，而对于LcWDR1的功能还需进一步的观察研究。4.3 假阳性问题的探讨假阳性是分子生物学实验中经常出现的问题，这些都与样品纯度不够，实验中操作不规范，样品污染等有关。假阳性问题是实验结果的真实性遭到质疑，因此可以采取一定的措施避免：提高引物和PCR的特异性；保证提取的DNA样品的纯度；取样过程中避免交叉污染；采用多样有效的检测方法。本实验采用PCR对目的基因的表达量进行检测，但是目前未进行southern杂交检测。PCR是转基因植物检测的重要手段，能够在DNA水平上对外源基因进行灵敏、有效的检测。PCR反应的最大特点是样品量小、成本低，适用于转基因植株的早期检测和大规模检测，但是容易产生假阳性，同时由于试剂或模板质量等偶然因素的影响也会出现假阳性。所以本实验在进行PCR检测时，严格设置了阳性、阴性和对照。 致 谢本实验从2011年开始进行，历时一年左右，实验期间感谢秦永华老师的细心教导和耐心解疑。老师勤奋不懈的工作作风，严谨求实的科研精神，平易近人的待人态度，除了使我学习到许多与专业相关的知识之外，我也学会了对事业的投入精神，让我在以后的工作学习中有了精神动力！同时要感谢在实验过程中给予我很大帮助的苗红霞师姐、张春阳师姐、赖彪师兄。以及同一个实验室中的苏纯兰师姐、李加强师兄、杨转英师姐，感谢他们耐心为我解答许多实验上遇到的问题。他们认真刻苦，专心实验，积极进取的精神也影响鼓舞了我。此外还要感谢陈健宜、刘艳华、梁瑞伟、胡丹丹、王露五位同学的大力帮助，也向他们学习到了不少的东西！在实验室的这一年，我收获的不仅是实验成果，还有老师和师兄师姐的无形的影响和教导，以及和各位08级同学的友谊。再次深深感谢他们！参 考 文 献Allan AC, Hellens RP, Laing WA. 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