（植物病理学专业论文）稻瘟菌REMI突变体库的构建和突变体筛选.pdf

中国农业大学硕士学位论文摘要 摘要 由m a g n a p o t t h eg r j s e a 引起的稻瘟病是严重为害水稻的重要病害之一，稻瘟菌已成为研究 植物与植物病原真菌互作关系的模式菌。建立插入突变体库并筛选出突变体有助于研究稻瘟菌的 功能基因和致病机理。 本研究利用限制性内切酶介导的整合技术构建了含有1 0 3 3 4 个转化体的稻瘟菌插入突变体 库。其中用x h o i 线性化质粒p v 2 转化小种y 3 4 获得2 2 0 0 个转化体，用品d i 、a p a 、e c o r v 分 别线性化质粒p v 2 转化小种p 1 3 1 ，分别获得2 6 5 9 、2 5 1 7 、2 2 8 个转化体，用e c o r i 线性化质粒 p c b l 0 0 4 转化小种p 1 3 1 ，获得2 7 5 0 个转化体。转化过程中发现用劢d i 、a p a l 、e c o r l 转化效率 差别不大，平均每皿可获得3 5 - 5 0 个转化体，而e c o r v 酶切形成的是平末端，平均每皿获得7 个转化体，转化效率很低。 构建好突变体库后，作者通过洋葱表皮接种和水稻叶片活体接种的方法筛选突变体。筛选约 7 0 0 0 个转化体后，获得1 8 个突变体。其中突变体m 0 9 3 8 的产孢量减少，平均每皿产孢量是p 1 3 1 的5 左右突变体m 0 1 7 4 5 的分生孢子形状不规则，侵染钉减少。突变体m 0 2 4 2 4 、e 1 2 4 4 5 在洋 葱表皮上侵染钉形成率分别小于2 0 和1 。分别将这四个突变体接种水稻品种丽江黑谷叶片后， 发现m 0 1 7 4 5 、e 1 2 4 4 5 在叶片上不产生病斑，接有m 0 2 4 2 4 的叶片上的病斑数比接有p 1 3 1 的叶片 上的病斑数减少8 6 9 。 分别对m 0 9 3 8 、m 0 1 7 4 5 、m 0 2 4 2 4 和e 1 2 4 4 5 进行了共分离分析，结果发现m 0 1 7 4 5 、m 0 2 4 2 4 和e 1 2 4 4 5 为插入突变体，而m 0 9 3 8 的突变表型不是由于r e m i 转化过程中外源质粒的插入引起 的。进一步通过s o u t h e r nb l o t 分析质粒在m 0 1 7 4 5 的基因组中是单位点插入，但至少有两个拷贝， 在m 0 2 4 2 4 基因组中有两个插入位点，且每个位点都是单拷贝插入。与遗传分析结果一致。而通 过s o u t h e mb l o t 分析，质粒在e 1 2 4 4 5 基因组中为多位点插入，与遗传分析结果相矛盾。分析质 粒在突变体基因组中的插入位点数和拷贝数为获得侧端序列和克隆基因奠定了基础。 关键词：稻瘟菌，r e m i ，插入突变体库，突变体筛选，共分离分析 a b s t r a c t r i c eb l a s td i s e a s ec a u s e db ym a g n a p o r t h eg r 缸e ai so n eo ft h em o s ti m p o r t a n td i s e a s e so fr i c e r i c eb l a s tf u n g u sh a sb e c o m eam o d e lo r g a n i s mt oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e np l a n t sa n d p l a n t p a t h o g e n sf u n g i c o n s t r u c t i o no fi n s e r t i o nm u t a n tl i b r a r ya n ds c r e e n i n gm u t a n t s r e d o u n dt o s t u d y i n g f u n c t i o n a l g e n o m ea n d t h e m e c h a n i s m o f p a t h o g e n i c i t yo f m g r i s e a i n t h i ss t u d y , a ni n s e r t i o nm u t a n tl i b r a r yo fm g r i s e ap 1 3 1a n dy 3 4w h i c hc o n t a i n e d1 0 3 3 4 t r a n s f o r m a n t sw a sg e n e r a t e du s i n gt h ea p p r o a c ho fr e s t r i c t i o ne n z y m em e d i a t e di n t e g r a t i o n ( r e m i ) h t h c p r o c e s s o f l i b r a r y c o n s t r u c t i o n p v 2 , 8 t r a n s f o r m a t i o nv e c t e r w a s l i n e a r l z e d w i t h x h o l a n du s e d t o t r a n s f o r mab l a s tf u n g u sr a c ey 3 4 ，t h et r a n s f o r m a t i o ng e n e r a t e d2 2 0 0t r a n s f o r m a n t s p v 2w a s l i n e a r i z e dw i t hx h o i ，a p a l ，e c o r vr e s p e c t i v e l ya n du s e dt ot r a n s f o r mp 1 3 1 ，t h et r a n s f o r m a t i o n s g e n e r a t e d2 6 5 9 ，2 5 1 7a n d2 2 8t t a n s f o r m a n t sr e s p e c t i v e l yb yt h et h r e ei n d i v i d u a le n z y m e m e d i a t e d i n s e f l i n n t h ep l a s m i dp c b l 0 0 4w a sl i n e a r i z e dw i 山e c o ria n du s e dt ot r a n s f o r mp 1 3 1 t h e t r a n s f o r m a t i o ng e n e r a t e d2 7 5 0t r a n s f o r m a n t s ，r e s u l t ss h o w e dt h a tt h et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c ya m o n g t h ec o h e s i v e - e n de n z y m e sx h o l ，a p a la n de c o r lh a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e , t h e yc a ng e n e r a t e3 5 - 5 0 t r a n s f o r m a n t sp e rc u l t u r ed i s h b u tt h eb l u n t - e n de n z y m ee c o r v g e n e r a t e d7t r a n s f o r m a n t sp e rc u l t u r e d i s h ，t h et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yw a gv e r yl o w t h em e t h o do fi n o c u l a t i n go n i o ne p i d e r m i sa n dr i c el e a v e sw a su s e dt os e r c e nm u t a n t sf r o mt h e i n s e r t i o nm u t a n tl i b r a r y , t h ea u t h o ro b m i n e d1 8m u t a n t sf r o ma b o u t7 0 0 0t r a n s f o r m a n t s a sc o m p a r e d w i t ht h ew i l dt y p ep 1 3 1 t h es p o r u l a t i o nd e f i c i e n c ym u t a n tm 0 9 3 8s h o w e d5 i nt h et o t a la m o u n to f s p o r e so np l a t e ，t h ec o n i d i u md i s t o r t i o nm u t a n tm 0 1 7 4 5s h o w e dt h a tc o n i d i aw e r ev a r i f o r ma n d p r o d u c e dl e s sp e n e t r a t i o np e g so no n i o ne p i d e r m i s ，t h em u t a n t sm 0 2 a 2 4 ，e l 2 4 4 5d e c r e a s e di n p e n e t r a t i o np e g sf o r m a t i o n0 no n i o ne p i d e r m i s , t h er a t e so fp e n e t r a t i o np e g sf o r m a t i o nw e r el e s st h a n 2 0 a n dl ，r e s p e c t i v e l y m 0 1 7 4 5 e 1 2 4 4 5d i dn o tf o r ml e s i o no nr i c el e a v e sa n dc o m p l e t e l yl o s tt h e i r p a t h o g e n i c i t y t h em u t a n tm 0 2 4 2 4f o r m e df e wl e s i o no nr i c el e a v e s , a n dt h ea m o u n tr e d u c e d8 6 9 t h a nt h ea m o u n to fp 1 3 1f o r m e dl e s i o n c o s e g r e g a t i o na n a l y s i sr e v e a l e dt h a tm 0 1 7 4 5 ，m 0 2 4 2 4 ，e 1 2 4 4 5w e r ei n s e r t i o n a lm u t a n t sa n d m 0 9 3 8w a sn o t ，i t sm u t a n tp h e n o t y p ew a sn o td u et ot h ep l a s m i di n s e r t i o n f u r t h e r m o r e ，t h eg e n o m i c s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sw a su s e dt ov e r i f yt h es i t e so fp l a s m i d si n s e r t i o ni nc o - s e g r e g a t e dm u t a n t s g e n o m e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep l a s m d si n s e r t e di nm 0 1 7 4 5w a ss i n g l e s i t ew t hm u l t i c o p i e s ，a n d t w os i t e si nm 0 2 4 2 4 ，t h e s er e s u l t sw e r ea c c o r d a n tw i t hc o s e g r e g a t i o na n a l y s i s b u ts o u t h e r nb l o t r e v e a l e dt h a tp l a s m i d si n s e r t e di ne 1 2 4 4 5w e r em u l t i s i t e sa n dd i f f e r e n tf r o mc o - s e g r e g a t i o na n a l y s i s t h e s es t u d i e sw e r et h eb a s eo fp l a s m i dr e s c u ea n dg e n ec l o n i n g k e yw o r d s ：m a g n a p o r t h eg r i s e a ，r e s t r i c t i o ne n z y m em e d i a t e di n t e g r a t i o n ，i n s e r t e dm u t a n tl i b r a r y m u t a n ts c r e e n i n g ，c o s e g r e g a t i o na n a l y s i s l l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 智哪 时间： 伽r 年月谚日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生虢印燃 帆沙箩年f 月日 导师签名： 声弓时间：讨年厶，尹日 叛 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 稻瘟病是世界各主要稻区最主要的水稻病害之一，每年都给水稻生产带来严重的经济损失【l j 。 据统计，在1 9 7 5 1 9 9 0 年的1 6 年间由稻瘟菌侵染引起的全球粮食损失高达1 5 7 亿吨，平均每年 超过1 0 0 0 万吨1 2 j 。目前，稻瘟病的控制主要依靠种植抗病品种和使用化学农药，但是由于化学农 药在防治稻瘟病的同时，还带来了许多副作用，比如说农药残留、环境污染、对环境中有益生物 的杀伤以及对人畜的毒害作用等，因而杀菌剂使用与许多其它化学农药一样受到了愈来愈多的限 制。近年来已经倾向于利用抗病品种来防治稻瘟病，因为稻瘟病菌群体数量大，遗传背景复杂 易发生变异，引起稻瘟菌群体中优势小种的改变以及新小种出现，导致原有的抗病品种抗性的“丧 失”，从而导致稻瘟病的大流行。因此，深入研究稻瘟菌的生物学特性，以及稻瘟菌的生物学特 点和致病性之间的关系，对于更好的把握稻瘟菌水稻之间的互作关系，培育更优良的抗稻瘟病栽 培品种、设计高效低毒对环境友好的新型杀菌剂等具有重要的意义。 1 2 稻瘟菌的生物学特性 稻瘟菌( 有性世代：m a g n a p o r t h eg r 妇口：无性世代：p y r i c u l a r i ao r y z a e ) 是异宗配合的子囊 菌，菌丝体为单倍体，细胞单核，主要侵染水稻引起稻瘟病，另外还可以侵染大麦、小麦和一些 禾本科杂草。 1 2 1 稻瘟菌的生活史 在稻瘟菌的生活史中包括有性阶段和无性阶段。有性阶段由两个不同交配型的菌株交配后形 成，菌株的交配型是由单遗传位点m a t 控制，不同交配型的菌株( m a t j 和m a t 2 ) 交 配后产生子囊孢子完成有性生殖过程。目前，稻瘟菌的有性阶段只在实验条件下能够形成，在自 然界中尚未发现。 在自然界中稻瘟菌主要通过无性阶段来完成其生活史。稻瘟菌的菌丝长到一定阶段就可以分 化形成分生孢子梗，屈膝状的分生孢子梗上产生梨形的分生孢子，典型的分生孢子有三个细胞构 成。稻瘟病菌以菌丝体和分生孢子在病稻草和病谷上越冬，病稻草和病谷是翌年病害初次侵染的 主要来源。来年当气温回生到2 0 * c 左右时，若遇降雨，就能不断地产生孢子。分生孢子到处飘散， 接触到寄主表皮上，孢子顶端释放出一种复合碳水化合物，即孢子尖端牯液，又称胞外基质，把 孢子紧密地粘在寄主表面，分生孢子粘附到寄主表面被认为是其侵染过程的起始【3 1 从而开始其 侵染循环。见图1 - 1 ：g i 自l a u ，1 9 9 6 ，p h dd i s s e r t a t i o n ) 中国农业大学硕士学位论交 第一章文献综述 雹1 - 1 稻瘟菌生活虫 1 2 2 稻瘟菌的侵染过程 稻瘟菌通过分生孢子侵染致病并以分生孢子的形式随气流传播导致稻瘟病的流行。稻瘟菌的 侵染过程大致如下：分生孢子落在寄主表面并吸附在其表面，接着便萌发产生芽管，当芽管延伸 到一定的长度后其顶端膨大成圆形的附着胞，附着胞的形成是病菌侵入的关键。随着附着胞的成 熟，周围的黑色素不断积累并在附着胞的胞壁内侧形成黑色素层。待附着胞完全成熟后便分化 出侵染钉，在附着胞内形成的巨大膨压下，侵染钉刺破寄主表皮细胞，并且在寄主细胞内产生扩 展菌丝，如图l - 2 。阻断稻瘟菌侵染过程的任何一个发育阶段，其侵入过程就不能完成故不能 发病或发病程度减轻。稻瘟菌致病机制的研究已弓 起许多学者的重视。 i 。 。m h - ” ，“ 囊| ，| 霜n “n 黼 l i 坩e c n c y c k 嬲黩，。翩 p 尊- 矾d n f _ 柏n 、一 ，“”删 囊赫。赢二 p h i _ 固卜2 稻童蕾的侵染锤环示意圈 2 中国农业大学硕士学位论文第一章文献缘述 1 3 稻瘟菌是研究植物病原真菌的模式菌 稻瘟病因其在农业生产中所处的地位以及稻瘟菌的生物学特性，已成为研究植物与病原真菌 相互作用的模式系统 4 1 。 稻瘟菌具有作为一种模式菌的基本要求：1 、稻瘟茵的侵染方式符合一般的真菌侵染方式， 其分生孢子萌发产生芽管，芽管再分化形成附着胞，再产生侵染钉和侵染菌丝进入寄主。2 、稻 瘟菌有性世代的发现，使其在实验条件下较易产生有性世代，为稻瘟菌致病性的遗传分析及其变 异提供了难得的机会，有力地促进人们对稻瘟菌致病性的遗传学研究。3 、稻瘟菌群体内存在许 多小种，与水稻品种间存在特异性相互作用，这种相互作用已被证明符合经典的基因对基因互作 关系。4 、稻瘟菌的基因组较小，约为3 8 4 0 m b 。5 、稻瘟菌较易进行遗传转化，目前已建立了限 制性内切酶介导的整合( r e s t r i c t i o ne n z y m e ，m e d i a t e di n s e r t i o n ，r e m i ) 口1 和农杆菌介导的转化 ( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ，a t m t ) 等较为成熟的转化方法【6 】，大大促 进了其分子水平的研究。6 、稻瘟菌的具有一定饱和度的遗传图谱的建立n 以及2 0 0 3 年完成的 稻瘟菌全基因组序列的基本测定，为克隆和验证重要的基因，及进一步开展稻瘟菌的功能基因组 研究奠定了坚实基础。 此外，稻瘟菌的主要寄主一水稻的全基因组序列已在2 0 0 2 年完成，为研究稻瘟菌与水稻间 的互作提供了极好的条件。 总之，稻瘟菌作为重要作物的重要病原真菌，有关其研究的积累和条转是其它任何植物病原 真菌所无法比拟的，把它作为植物病原真菌的模式菌来研究是无可争议的，同时，稻瘟菌与水稻 之间的互作也已成为研究植物病原真菌与寄主之间互作的模式系统。 1 4 稻瘟菌致病相关基因的研究方法 随着基因组计划的深入开展，其研究的内容从基因组的作图和测序转向基因功能。目前。稻 瘟菌基因组全序列测序已经完成各个阶段的表达序列标签e s t 数据库也在建立之中。因此，稻 瘟菌功能基因组的研究将成为该领域研究的重点和热点。基因功能的研究主要采用从表型到基因 和从基因到表型两种策略， l 。4 。1 从表型到基因 该研究策略是应用多种方法创造并鉴定表型的变异再分析突变体的基因改变，从而了解基 因功能。在稻瘟菌中主要采用插入突变法和图谱克隆法。 1 4 1 ，1 插入突变法 通过合适的转化系统将质粒d n a 随机插入生物体的基因组中，筛选表型发生变化的突变体。 在突变表型与选择标记共分离的基础上，以插入载体为标记，利用p i a s m i dr e s c u c 或t a i l p c r 技 术获得与其相邻的基因组旁侧序列，最终克隆到导致表型突变的基因。在病原真菌中常用的插 入突变法主要有限制性内切酶介导的整合( r e m i ) 和农杆菌介导的转化( a t m t ) 技术。 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 限制性内切酶介导的整合技术最早是在研究酵母过程中发展出来的。其基本原理是线性化的 质粒与相应的内切酶同时存在时转化真菌原生质体，在聚乙二醇( p e g ) 作用下同时进入原生 质体，内切酶使真菌基因组d n a 上造成缺口，质粒则整合在相应的位嚣从而造成插入突变。目 前，r e m i 已经广泛应用于植物病原真菌及其他真菌的研究中，并成功克隆了许多基因。 进行r e m l 转化的前提是获得含有目的基因的原生质体，质粒上具有显性筛选标记和单一酶 切位点。根据不同真菌的细胞壁的不同，目前有多种细胞壁裂解酶可供选择，如n o v 2 3 4 ，d r i s l e a s e ， s n a f l a s e 等。转化过程中，多种因素可以影响转化效率：( 1 ) 载体构象：一般来说，应用线性化 的质粒进行转化效率远远高于环状质粒的转化效率，但也有不同的报道。m a w r 利用r e m i 转化 植物病原真菌两r e 唧 o r 口t e r 过程中发现利用环型载体也可获得较高的转化效率嗍，这可能与 真菌的特性有关。但是，即使亲缘关系很近的真菌种类应用不同构象的质粒其转化结果也存在很 大的差别。( 2 ) 内切酶的神类和浓度：不同的限制性内切酶识别不同的d n a 序列，产生不同的 末端和构象，从而造成不同的转化效率。内切酶对转化效率的影响不仅表现在种类的不同，而且 还与转化时所用浓度有关。转化时最适当的酶浓度可以在较小区间很快提高转化效率。与此不同 的是，有报道指出某些真菌转化过程中酶浓度的影响不大。m a i l e r 等发现转化时酶浓度在5 5 0 u 间原生质体的再生不受影响，s h i 等甚至将酶浓度增加到6 0 0 u 时也出现了相似的结果。尽管如此， 理论上酶浓度应该有其上限，此时原生质体的存活受到影响，这已经为b o m e 等的结果所证实【9 】， 当用过量的e c o ri 处理酵母后，酵母的存活量明显减少。( 3 ) 目标菌的种类：不同真菌接受外界 d n a 的能力不同，有时即使同一种真菌的不同株系间也存在很大的小差别，主要表现在真菌间 修复机制以及原生质体再生能力的不同。目前，解释r e m i 转化机制主要是“微同源机制”，认为 同一种内切酶切割质粒和基因组d n a 后在二者间产生微同源性，通过这种同源性质粒进入真菌 细胞核后二者进行重组。不同真菌细胞核的环境不同，导致重组效率的差异。b a l h a d e r e 等比较 三种r e m i 转化方法应用于 g r b e a 的情况，发现不同方法得到的转化体不同，除了表现为效率 的差异外还表现在单拷贝质粒整合的效率以及精确酶切位点的整合不同【“。表1 - 1 列举已报道 的不同真菌中的r e m i 转化效率。 4 表卜1 不同真菌中影响r 酬l 转化效率的因素 真菌种类 环形质粒获得r e m i 方法获得k e m i 转化时最适 参考文献 利用r e m i 技术产生插入突变已经广泛应用于植物病原真菌致病相关基因的鉴定和分离，u u 等应用r e m i 方法转化玉米小斑病菌( c h e t e r o t r o p h u s ) ，从获得的转化体中筛选出产t - 毒素缺陷 型突变体，进一步鉴定出一个t - 毒素生物合成途径中的个多肽合成酶基因。在此过程中，还鉴 定出许多交配缺陷型、产孢、颜色以及菌落形态变异等多种类型的突变体。利用r e m i 转化稻瘟 菌m g r i s e a 过程中，s h i 等筛选出加个产孢，致病性和营养缺陷型突变体，进一步研究表明， 所有突变表性均与显性标记共分离。s w e i g a r d 等从5 5 3 8 个m g r i s e a 转化体中筛选2 7 个稳定的致 病性突变体，根据不同的致病表型将其分为5 类并对一些基因进行了具体的研究。n n a l 【a 从日 本香梨黑斑病菌( a l t e r n a r i aa l t e r n a t a ) 的9 8 4 个r e m i 转化体中鉴定出了3 个不致病的并丧失产 生a k - 毒素的突变体，分离出了参与a k o 毒素生物合成途径的两个基因a k t l 和a k t 2 。此外， r e m i 转化也应用于c g r a m i n c o l a , u m a y d i s 等植物病原真菌，鉴定出多个致病相关基因。 与其他插入突变法相比，r e m i 具有适用范围广、相对高效的特点，但也有些不足之处。主 要表现在r e m i 在多数情况下只有破坏单拷见的基因，才能出现可见的表型改变。不易从多基因 家族中克隆基因以及克隆那些转录调控基因。为解决这方面的不足，可以采取增强子和启动子捕 5 捉的方法。c h a n g 等将缺乏启动子的报告基因和r e m i 诱变结合起来， 火d d i s c o i d e u m 中标记出 了多个发育调节基因【”。植物病原真菌中，将r e m i 和绿色荧光蛋白( g f p ) 以及需要增强子元 件的基本启动子结合起来，所有获得的转化体中约有4 0 具有g f p 活性，1 的转化体感染植物盾 显示荧光。r e m ! 诱变的另一个不足之处是容易产生一定比例的非标记性突变【i 】h ”4 “，这往往 是由于转化过程中质粒的异位整合和重组过程中d n a 缺失、重排所造成的，因此会出现一些突 变体的突变表型不是由于外源质粒的插入引起的。 a t m t 提供了真菌插入突变的另一个有效途径，而且在一定程度上可克服r e m i 的缺蒯”。 它具有操作简单、转化高效等优点，在植物转基因研究中已经得到广泛的应用，也可作为插入突 变的有效工具而广泛应用于拟南界( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 等植物和丝状真菌的基因突变、功能 基因的分离、鉴定和外源基园的表达等研究领域。a t m t 转化原理：a t u m e f a c i e n s 在致瘤或转化 过程中将其环状质粒中的t - d n a 随机插入植物、真菌、放线菌【”1 及动物的基因组中。” ( t u m o r i n d u c i n g ) 质粒上的t - d n a 和v i r ( v i r u l c n c e ) 区是农杆菌侵染植物所必需的。t - d n a 的 转化依赖于t i 质粒上一系列v i ，基因表达，而这些y 驴基因的表达受小分子酚类和糖类物质的双 重调节。在众多的酚类信号物质中，以乙酰丁香酮、乙酰阿魏酰胺和乙基芥子酰胺诱导“r 区基 因表达的能力较强，其中，在转化中最常用的是乙酰丁香酮( a c e t o s y i n g o n e ，a s ) 。许多实验往 往通过构建t 质粒，在t - d n a 中插入抗性基因以作标记并嵌入其他质粒，扶面可用质粒拯救等 方法克隆突变基因。 a t m t 的转化受体可以是多种类型，尽管某些转化方法可以直接转化完整的真菌细胞，如： d h a w a l e 等用醋酸锂( l i a c ) 处理萌发真菌孢子可直接进行转化f z o ，但很多真菌在d n a 转化时 仍然需要制各原生质体。不同真菌原生质体制各的条件差异很大，因此往往碰到原生质体产量或 再生率低等问题。而a n f r 转化的受体材料可以是多种类型的，既可以用原生质体也可以用分 生孢子、菌丝体、甚至真菌组织体【2 。2 2 1 。因此，利用a t m t 转化可以省略制备原生质体的繁琐 步骤。有些丝状真菌的a t m t 转化效率比c a c l 2 - p e g 介导的原生质体常规转化方法有明显提高。 据报道一a w a m o r i 的原生质体或分生孢子的a t m t 转化频率均比常规的原生质体p e g 转化方法 提高6 0 0 倍o “。 对于缺乏有性阶段的真菌，外源基因的单拷贝转化是十分重要的田j ，同时也方便于标记基因的 分离。a t m t 的非同源转化，大部分转化子为单拷贝的t - d n a 插入。d e - g r o o t 等证实4 口w a r a o r i 的a t m t 转化子为t - d n a 单拷贝整合插入阱j ；另有实验结果也表明6 0 懦自q mg r & e a 的a t m t 转化子都为单拷贝整合插入1 6 j ；从c a l o n e c t r i am o r g a n 豇的a t m t 转化子中随机抽查4 个转化子均 为单拷贝插入研j 。对于存在有性阶段的真菌，通过有性杂交分析后代的突变表型与质粒上的抗性 标记分离情况，可以鉴别非标记性突变；然而，对于缺乏有性阶段的真菌，若要证实是否标记突 变，就会遇到困难。有时，如果是多拷贝的插入，那么这一克隆和验证过程将会更为复杂和费时。 在真菌中，a t m t 突变的非标记性突变比例尚有待进一步确定。如果这种比例很低，a t m t 将 十分适合各种真菌突变体库的建立，特别是对未发现有性阶段的一些真菌更为适合。 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 4 1 2 图谱克隆法 图谱克隆法是近年来发展起来的种有效方法。首先利用r f l p 、r a p d 和s c a r 等技术， 找到与目标基因紧密连锁的分子标记，确定标记与目标基因间的遗传和物理距离，然后通过染色 体步移法获得目标基因。在稻瘟菌中，已获得了一些调控附着胞形成的基因的分子标记 z s , 2 6 1 。有 望通图谱克隆法得到调控附着胞形成的基因。 1 _ 4 2 从基因到表型 该策略是通过使特定基因发生定向突变、缺失、失活和敲除后的表型变异来推澳4 在生物体内 基因的作用。常用的方法是异源基因克隆法。在真核生物中，从不同种生物中已克隆的具有保守 序列和相同功能的基因为探针来克隆基因的技术也很常见，根据已知基因的保守序列设计简并引 物，借助p c r 技术已从稻瘟菌中克隆了调控侵染性菌丝生长的转录因子基因m s t l 2 ” 。 随着稻瘟菌基因组全序列测序完成，各个发育和侵染阶段的e s t 库的构建，使得大规模功能 基因组学项目启动，从单个基因克隆角度已经开始转向从整个基因组学来探索和揭示生命现象， 通过差异表达来分析某个阶段特异表达的所有基因，如利用s a g e ( s e r i a la n a l y s i so fg e n e e x p r e s s i o n ) 成簇、成套的批量克隆基因，利用比较基因组学手段，克隆生命过程中相似功能的基 因，在更宽更广的范围内探索生物物种的进化。 1 5 稻瘟菌致病性的分子遗传学研究 分子生物学方法的导入使稻瘟菌致病性及其变异机制得到了较为深入的研究。目前人们已经 建立了稻瘟菌的遗传转化体系与遗传图谱，并克隆了多个致病性必需和相关的基因。稻瘟菌基因 组全序列已经公布。e s t 测序亦在进行之中，对稻瘟菌功能基因组的进一步研究，将有助于揭示 其致病的分子机理，从而为稻瘟病的有效防治提供新的思路和手段。 1 5 1 稻瘟菌致病基因的研究进展 真菌致病基因是决定病原菌与寄主建立亲和互作关系，并进而影响植物正常生理功能的基 因。通常认为病原真菌致病因子包括毒素、各种酶( 角质酶、纤维素酶等) 及其它毒性因子。稻 瘟菌成功侵染寄主是一个复杂的过程，该过程中的每环节被破坏均会导致致病性的减弱或丧 失a 稻瘟菌的致病性主要由几个密切相连的阶段构成，即分生孢子产生与萌发：分生孢子的形态 建成；附着胞的形成与着色；侵入钉的产生；菌落的生长与侵染菌丝的形成和扩展。在这些不同 阶段特异表达的与致病性有关的基因得到了遗传定位或克隆。 1 5 1 1 角质酶基因及其致病性 植物体表的角质层是病原真菌侵入必须突破的第一层障碍，目前已从几种真菌中克隆到角质 酶基因，来自f u s a r i u ms o l a n if s p p 耐的报道最多，研究表明，角质酶在决定病原菌致病性方面 有重要作用，但还没有统一的确定认识。f u s a r i u ms o l a n if s p p i s i 角质酶缺陷突变体毒性减弱， 7 若加入外源角质，则毒性恢复。 根据f u s a r i u m 和c d f f e 幻l ，配 “s p p 角质酶基因的同源序列，s w e i g a r d 等克隆了稻瘟菌的 角质酶基因c u t l ，但稻瘟菌角质酶缺陷突变体仍然致病，而且有残存的角质酶活性刚，由此推 断，稻瘟菌致病并非绝对需要角质酶参与，稻瘟菌基因组内可能存在多个序列与c u t l 相似的角 质酶基因。稻瘟菌也能分泌其它降解酶，如纤维素酶和木聚糖酶，但它们的作用还有待研究。稻 瘟菌入侵主要是机械作用例，但酶的加入也可能辅助和加速这一进程。 1 5 1 2 分生孢子的形成 分生孢子是稻瘟菌病流行的主要传播体，在稻瘟菌的再次侵染和病害流行过程中起着重要作 用，因此有效控制分生孢子的形成能防治稻瘟病。某一些情况下，影响分生孢子产生或分生孢子 形态的基因也影响附着胞的形成和功能，这方面的基因大多是从筛选致病性减弱表型突变体来鉴 定的。 稻瘟菌中s m 0 1 位点控制分生孢子的形态s m o 。突变体形成形态异常的分生孢子、附着胞和 子囊，但这种突变并不影响其产孢能力，突变体也能进行正常的营养生长及对寄主植物的侵染 3 0 l 。l a u 和h a m e r 研究发现，稻瘟菌中a c r l 位点的突变导致分生孢子头尾相接的排列方式，这 是因为分生孢子顶端细胞的非决定性生长所致【3 1 】。克隆到的a c r l 编码孢子特异性转录体。a c r l 一 不能抑制休眠孢子中编码疏水蛋白的m p g l 的表达，也不能进行与侵染有关的形态建成井丧失致 病性初步推测a c r l 是孢子形成时所必需的合轴模式的负调控因子。 通过化学诱变和插入方法，控制产孢过程不同阶段的6 个基因c o n l ，c o n 2 ，c o n 3 ，c o n 4 ， c o n 5 c o n 6 和c o n 7 得以鉴定t 3 2 1 。l e u n g 等【3 3 】对稻瘟菌分生孢予产生的遗传调控进行了研究， 获得了两性菌株g u y 1 1 的两个突变体c o n l 和c o n 2 。s h i 和l e u n g 通过化学诱变和插入突变的方 法获得了5 个与分生孢子形成有关的突变体( c o n 3 - c o n 7 - ) ，并对其遗传特征和表型进行了描述【3 2 】。 c o n l 和c o n 2 产孢量减少约9 0 ，c o n 4 和c o n 7 - 产孢量约减少了3 5 。c o n l 、c o n 2 和c o n t 的分 生孢子形态异常，c o n l 。和c o n t 不能形成附着胞。稻叶伤口接种也不致病，丧失了对水稻的致病 性。c o n 2 - 和c o n 4 一附着胞形成率明显减少，因而致病性明显减弱。c o n y 突变体不能形成分生孢子 梗，c o n 6 一产生分生孢子梗，但不产分生孢子。遗传分析表明c o n l 和c o n 2 连锁( 相距1 9 c m ) ， c o n 5 和c o n 6 连锁，c o n 2 上位于c o n i 和c o n 7 ，c o n 5 上位于c o n 6 。c o n 6 上位于c o n 7 。 1 5 1 3 附着胞的形成与基因表达 ( 1 ) 寄主表面是诱发附着胞形成的主要刺激因素之一 附着胞是许多植物病原真菌的重要侵染结构，稻瘟菌功能性附着胞的形成在对水稻致病性中 起着决定性作用。分生孢子仅靠自身孢子内源营养物质就能发芽，但能否形成附着胞则需外源环 境因子刺激及本身遗传特性。环境中的物理和化学因素诱导附着胞的产生。附着胞的形成依赖于 其所接触表面的理化性质如疏水性、表面硬度、角质单体、蜡质和极性脂类【”。亲水表面如玻璃 或一种叫g e l b o n d 的( f m cb i o p r o d u c t s ，m a i n e ) 亲水面，芽管呈典型营养生长。h a m e r 等也同样 报道与水稻叶表具有相似结构的表面可诱发稻瘟病菌附着胞形成。x i a o 等采用多种不同硬度及不 同疏水强度的疏水性膜和载玻片。测定一稻瘟菌p 2 菌株附着胞形成，指出基物表面的物理形态 8 与附着胞形成没有相关性p 2 附着胞形成只与固体基物硬度有关。h o w a r d 等采用一系列菌株利 用一组不同疏水性的基物表面，测定附着胞形成，发现不同菌株之间差别很大，几乎看不出基物 表面疏水性与附着胞形成有关系只与固体表面硬度有关p ”。但是，u n c h i y a m a 等早在1 9 7 9 年 报道，水稻某些部位的蜡质组分能刺激附着胞的形成，而某些部位能抑制附着胞的形成。尽管之 后的分子水平上证明了分生孢子分泌的疏水蛋白对附着胞的诱导作用，接触基物的疏水性在形成 附着胞中起的作用有待深入研究。 ( 2 ) 附着胞的分化与形成 水稻表面的角质层和蜡质层在水稻体表形成了疏水表面，稻瘟病菌可以感知疏水信号，并将 疏水信号传导至细胞内，诱导附着胞的分化。m p g l 是通过差异表达法从稻瘟菌中克隆出来的第 一个致病相关基因。该基因编码的疏水蛋白属于i 型真菌疏水蛋白，参与菌丝与水稻叶表的互作。 稻瘟菌芽管形成时向胞外分泌m p g i p 蛋白单体，m p g l p 蛋白单体在体外可自动组装，形成一层 两性薄膜，亲水面面对正在生长的芽管，疏水表面向外与水稻表面接触，增加亲和力，使菌体牢 固附着于水稻表面，可以作为附着胞形成的感应器p 6 】。m p g l 基因的缺失突变体的附着胞形成率 降低了8 0 以上，侵染能力大大降低，但并非完全不致病，说明m p g l 并非是稻瘟菌致病绝对必 须的。此外m p g l 基因的缺失突变体的产孢率明显下降。外源c a m p 可以恢复m p g l 基因的缺 失突变体的表型，形成正常的附着胞，表明m p g l 基因在c a m p 途径的上游起作用1 37 1 。更进一 步的研究表明，m p g l 基因对附着胞的诱导作用是非特异的。m p g l 基因的启动子于真菌疏水蛋 白i 型的其它疏水蛋白基因连接，转化m p g l 缺失突变体，可以恢复附着胞形成能力和致病性p q 遗传研究也表明，尽管不同真菌疏水蛋白的氨基酸序列有所不同，但它们组成了功能上紧密相关 的形态建成蛋白。 m p g l 编码的疏水蛋白与疏水性表面识别互作，作为附着胞形成的感应器。将信号传递给 m a g b 编码的异源三聚体g 蛋白的a 亚基。在稻瘟菌中。编码g 蛋白a 亚基的三个基因已被克隆： m a g a ，m a g b 和m a g c 【。m a g a 缺失并不影响营养生长、产孢和附着胞形成；m a g c 缺失产 孢下降，但不影响营养生长和附着胞形成，即m a g a 和m a g c 不影响致病性；m a g b 缺失其营 养生长、产孢和附着胞形成下降，侵染和定殖于感病水稻的能力下降。 多胺( p o l y a m i n e s ) ( 腐胺、亚精胺和精胺) 参与多种微生物的细胞生长和分化。c h o l 等研 究测定了稻瘟菌细胞内多胺对附着胞分化的影响，以及抑制多胺和多胺生物合成物质对孢子发芽 和附着胞形成的影响 3 9 j 。新收集的分生孢子中可以检测到高水平的多胺，而发芽阶段多胺水平下 降。其中以精胺为主要成分，多胺和多胺生物合成抑制物质不影响孢子发芽，但多胺特异地降低 附着胞形成。被多胺抑制的附着胞的形成能被外源c a m p 恢复。因而，多胺可以降低稻瘟菌细胞 内c a m p 的水平，从而抑制附着胞的形成。 由删j 编码的p t h l l p 有9 个跨膜域( t r a n s m c m b r a n ed o m a i n s ) 和个长的亲水性胞质结 构域，该蛋白定位在膜上，推断具有接收外界信号功能( 删。p t h l l 突变体在疏水表面不能有效地 形成附着胞，外源c a m p 能恢复其附着胞形成能力，说明p t h 在c a m p 途径的上游起作用。p t h l l p 可能刺激细胞内脂类的降解，释放二酰甘油以刺激附着胞的形态建成。 9 ( 3 ) 黑色素的合成 稻瘟菌侵染水稻依靠的是附着胞内产生的膨压驱动侵染钉穿透寄主表厩的角质层。黑色素的 沉积和膨压的产生直接相