（化学工程与技术专业论文）食品中抗真菌药物的残留检测技术.pdf

摘要 食品中抗真菌药物残留的检测技术 摘要 食品中的药物残留会给消费者带来潜在的危害。建立简单、快速、 准确的残留分析方法是对食品中的药物残留进行监管的基础。本文以 常用的抗真菌药物为目标，建立了它们在不同食品中的残留检测方 法。主要结果如下： 1 建立了鸡肝、鸡肉中1 0 种唑类抗真菌药物( 灰黄霉素、伏立康 唑、酮康唑、克霉唑、联苯苄唑、伊曲康唑、益康唑、咪康唑、特康 唑和氟康唑) 的液相色谱一质谱联用的检测方法。己均质的样品加入无 水硫酸钠后用乙腈提取，提取液氮吹至近干，用0 1 甲酸甲醇重新 定容，定溶液放入2 0 。c 的冰箱中冷冻过夜。上清液经a c q u i t y u p l c r mb e hc 1 8 色谱柱分离，同时串联电喷雾质谱检测。该方法3 个加标浓度的回收率集中为6 8 - 1 2 0 ，相对标准偏差为5 2 3 ( 刀= 6 ) 。 定量限为o 5 3 0l a g k g 一。 2 建立了6 种果酱中纳他霉素的液相色谱一质谱联用的检测方 法。样品加入氯化钠、经丙酮萃取，于b e hc 1 8 色谱柱分离，同时 串联质谱检测。该方法3 个加标浓度的回收率为8 0 11 3 ，相对标准 偏差小于2 0 ( 刀= 6 ) ，定量限为0 5 - 1 0p g k g 。 3 建立了面包、糕点、酸奶中3 种多烯类抗真菌药物( 两性霉素 b 、制菌霉素和纳他霉素) 的高效液相色谱紫外及质谱联用的检测方 i l l 北京化1 = 大学硕士学位论文 法。样品中加入n a 2 e d t a ( 酸奶样品再加o 1g 氯化钠) ，用甲醇提取， 提取液加水稀释后经c 1 8 固相萃取柱净化。目标物经b e hc 1 8 色谱 柱分离，串联紫外或质谱检测器检测。液相色谱紫外检测时，3 个加 标浓度的回收率为7 9 1 0 3 ，相对标准偏差为 7 6 ； p u r a n a j o t i 等【1 7 】用正己烷：异戊基乙醇9 8 5 ：1 5 为萃取溶剂，分离血清和皮肤中 的咪康唑，最终回收率到达9 0 以上；m i c h a e l ! ”】等用正己烷：乙酸乙酯= 3 ：l 为萃取溶剂，将血浆、口水中的伏立康唑提取出来，最终回收率为9 4 , - d 0 9 ； c h h u n 等【l l j 用正己烷：二氯甲烷= 7 0 ：3 0 ，分离了伏立康唑，最终回收率达到 9 8 ；k i m 等1 8 】用二氯甲烷将血清中的氟康唑分离，最终回收率在9 8 3 到 1 1 7 6 。 固相萃取( s p e ) 是另一种常用的净化方法。其净化机理与h p l c 相似，但填 料粒径较大，柱效远低于h p l c 柱。其优点是可以净化很小体积的样品，溶剂 用量小，选择性高，速度快，可实现自动化，不会发生乳化，引入的杂质少等。 固相萃取的色谱填料主要是硅胶基键合固定相，按保留机理不同，可以分为正 相固定相、反相固定相和离子交换固定相。固相萃取采用经典的柱色谱程序进 行操作，通常使待测组分保留在固定相上，洗涤杂质，改变条件将待测组分从 固定相上依次洗脱下来，达到净化兼富集的目的；也可使感兴趣的组分直接通 过固定相而使大部分干扰物质保留在固定相上，达到分离的目的。目前在检测 生物样品中抗真菌药物时利用s p e 技术进行前处理的报道比较少，这可能是由 于s p e 技术成本较高的原因。p e n n i c k 等【l6 】提取血清样品中的伏立康唑时，利 用了c 1 8 小柱对其进行富集净化，且最终回收率在8 9 3 到1 0 0 4 之间。 由于血清、血浆样品基质中有大量的代谢产物存在，且大多呈螯合状态， 处理该类样品时，一般需要在提取过程中调节p h 至7 - 9 ，该条件能将基质中的 北京化工大学硕士学位论文 螯合物水解，也可以使目标物变成游离态，以便于进行下一步分析。e c h e v a r r i a 等【1 2 1 和g r o l l 等1 1 3 】分别在测定血浆、动物肝脏中的两性霉素b 以及兔肉组织中 制菌霉素时用磷酸盐缓冲溶液将提取液的p h 值调至7 4 ，并使二者的最终回收 率达到7 0 至9 6 ；s r i v a t s a n 等【4 j 在测定血液中伊曲康唑时，同样使用磷酸盐 缓冲溶液调节提取液的p h 值。p e r m i c k 等【1 6 】和m i c h a e l 等【”】在检测血浆及漱 口水中伏立康唑时，均利用硼酸盐缓冲溶液将提取液的p h 调至9 0 ，且最终回 收率为8 9 1 0 1 ；c h e n 等【l o 】和k i m 等【8 】分别在测定血浆样品中的酮康唑和氟 康唑时，利用氨水及n a o h 调节提取液呈弱碱性，最终回收率在9 8 到1 1 8 。 1 4 2 抗真菌药物检测方法 按分离或检测原理不同，残留分析可分为理化分析方法，包括滴定法i i 叫； 波谱法；色谱法及其联用技术；免疫分析法，如放射免疫测定法、酶免疫测定 法、荧光免疫测定法等；生物测定法，如微生物学测定法、放射受体测定法等。 微生物学测定法原理和操作简单，目前在抗微生物药物残留的快速分析中 仍发挥作用f 1 9 忽】，但不能准确定量。免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆 性结合反应为基础的分析技术。该技术仅能提供待测物组成或结构方面的信息 ( 吸收度或计数) ，很难进行多残留物的分析，且操作过程复杂，影响因素多， 难以标准化，通常作为常规分析方法的补充。 色谱法分为气相色谱法( g c ) 、液相色谱法( h p l c ) 、薄层色谱法( t l c ) 毛细管 电泳( c e ) 。其中，h p l c 及其联用技术是分析检测抗真菌药物最常用的方法。 气相色谱法适合分离沸点比较低、热稳定性好的化合物；高效液相色谱法特别 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析；薄层色谱法适 用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质；毛细管 电泳法虽然具有操作简单、色谱柱不易受样品污染、分析速度快、分离效率高、 样品用量少、运行成本低等优点，但由于其毛细管电泳迁移重现性、进样准确 性和检测灵敏度方面的缺陷，使其在残留分析的应用中受到一定的限制。在多 组分残留分析中，h p l c 、g c 及其与质谱等检测器联用技术，已成为主流的分 析方法。 目前以高效液相色谱法( h p l c ) 为基础检测生物样本中抗真菌药物含量的报 道很多，包括高效液相色谱法与紫外检测器联用( h p l c u v ) t 8 ，1 1 1 3 ，1 6 , 1 7 ，2 3 琊】、高 效液相色谱法与荧光检测器联用f 4 ，l 习以及高效液相色谱法与质谱联用 ( h p l c m s ) 3 6 - 3 9 】。在现有的文献报道中，多数文献都能够对血清或血浆中含有 的l 、2 种抗真菌药物进行准确定量f 4 ，g ，1 1 , 1 5 - 1 7 , 3 0 ，3 3 1 。近年来，随着抗真菌药物 用量的增加，环境基质中也出现了抗真菌药物的踪迹【3 6 3 8 ，3 9 1 ，2 0 0 8 年，v a n 等 6 第一章文献综述 【3 9 1 分别利用h p l c m s 技术对环境基质中存在的9 种药物进行了定量分析，其 中3 种是抗真菌药物。在食品中抗真菌药物残留检测方面主要有，e c h e v a r r i a 等【1 2 】建立了鸡肝中两性霉素b 的h p l c u v 检测方法，g r o l l 等【1 3 j 和刘亚风等 4 0 】分别建立了肉类中制菌霉素和纳他霉素h p l c u v 检测方法，z h o u 等【3 7 l 兔眼 晶状体中的伏立康唑的h p l c m s 检测方法。 纵观现有报道，大部分能够对血浆、血清以及组织中含有的- n 两种抗真 菌药物进行准确的定量，但是在食品中进行多组分残留同时检测方面尚处于空 白状态，这就是本文研究的意义所在。 1 5 本论文的研究内容及意义 抗真菌药物种类繁多，本文仅选择兽医、临床及食品添加剂中常用的几种 抗真菌药物为研究对象，分别为：多稀类的制霉菌素、两性霉素b 、纳他霉素， 唑类的克霉唑、咪康唑、益康唑、酮康唑、特康唑、氟康唑、伊曲康唑、伏立 康唑、联苯苄唑，以及灰黄霉素。 由于抗真菌药物残留的毒副作用，建立食品中抗真菌药物残留的快速准确 的检测方法对保障我国人民的身体健康、提高我国出口食品的竞争力方面都具 有十分重要的意义。目前我国尚未建立食品中抗真菌药物检测的国标方法，对 该类药物检测技术的研究十分有限。本论文以多稀类和唑类抗真菌药物主要为 研究对象，建立食品中这两类药物残留的快速、准确检测方法，为国标方法的 建立提供参考和依据。 本文研究目标如下： 1 研究建立鸡肝、鸡肉中l o 种抗真菌药物和灰黄霉素的液相色谱一质谱联用 的检测方法； 2 研究建立果酱中纳他霉素的液相色谱一质谱联用的检测方法； 3 研究建立面包、糕点、酸奶中3 种多烯类抗真菌药物的高效液相色谱检 测方法以及液相色谱一质谱联用的检测方法。 7 北京化工大学硕士学位论文 第二章超高效液相色谱一质谱联用法测定鸡肝、鸡肉中 1 0 种抗真菌药物的残留 2 1 引言 灰黄霉素和唑类抗真菌药物已经广泛用于治疗禽类真菌病【4 。克霉唑、咪 康唑和灰黄霉素是中国兽药手册中允许使用的临床兽药【4 2 。在禽类饲养和治疗 的过程中，非法或不适当的使用抗真菌药物将会导致可食组织中残留，严重时 残留的抗真菌药物将直接影响消费者的身体健康。本文旨在建立鸡肝、鸡肉中 包括唑类和灰黄霉素在内的1 0 种抗真菌药物的同时检测方法，为市场监管和动 物源性食品中抗真菌药物残留对人体的健康影响评估提供方法依据。 2 2 试剂与溶液 2 2 i 试剂 l ，目标化合物及同位素内标 伏立康唑及其同位素内标、灰黄霉素、硝基益康唑、特康唑、氟康唑及其 内标、伊曲康唑同位素内标、酮康唑同位素内标和克霉唑同位素内标标准品均 购自s i g m a 公司；克霉唑、联苯苄唑、酮康唑、伊曲康唑和硝基咪康唑标准品 均购自中国药品生物制品检定所，其结构和理化性质见图2 1 。 2 甲醇( 色谱纯，美国d i k m at e c h n o l o g y n c 1 3 乙腈( 色谱纯，美国d i k m at e c h n o l o g yi n c ) 4 丙酮( 色谱纯，美国d i k m at e c h n o l o g yi n c ) 5 甲酸( 纯度 9 8 ，美国a c r o so r g a n i c s ) 6 无水硫酸钠( 优级纯，国药集团化学试剂有限公司) 使用前在6 0 0o c 马弗炉 里烘烤3h 7 水( 美国m i l l i p o r e 公司超纯水器制备) 8 固相萃取柱 o a s i sh l b ( 2 0 0m g ，3m l ) 币t ls e p p a kc 1 8 ( 2 0 0m g ，3m l ) 固相萃取柱( 美国 w a t e r s 公司) ：b o n de l u t ep l e x a ( 2 0 0m g ，6 m l ) 固相萃取柱( 美国v a r i a n 公司) 。 8 第二章超高效液相色谱质谱联用法测定鸡肝、鸡肉中l o 种抗真菌药物的残留 卜3 。舶2 8 3 。； 十l _ - 卜_ _ 1 _ 一t - r _ _ t _ - _ k 1 _ 叶1 _ t 1 t _ 严t 叶广_ 一o l _ 呷t f _ _ r 甲1 _ r 广广_ 呷干 k 1 1 1 _ r 广广- 1 ，呷1 _ 卜_ t 呷t 下中t _ 一- _ r t r 几一 1 0 02 0 03 0 05 1 2 d o3 0 04 0 0 5 1 萼：= 二，一一k 一二型羔钆一一一一成芝墨翌 o 丽r f 而丽i r 一叶冒五r 嚣岬淼卜飞i 一 ，訇k c t o c 。n a z o l e - d -3 7 ：5匏8 一 ，。1 。1 9 。；t 匀3 6 e e 口l t f 1 甲r 1 呷甲广一r 广叫_ _ r o k _ t 甲r 1 岬r 、t r o 土1 t 呷_ 一f r r 广_ 1 1 1 甲甲丁r f r 广 x - t 一 10 02 0 03 肿4 0 05 0 01 2 3 0 04 0 0 1 0 0 1c l o t r i m a z o i ei o h 4 2 7 77 1 6 6 3 1 - 窝j i 2 8 7c 5 0 j ，r r - t 叩r r r t ，t ，- 1 ，l 卜_ ，t ， 、1 ，一 1 2 3 0 05 5 3 8 8 1 1 9 i l9 3 c 5 5 轧，一，一五正龇嶂：= 芝恕一一也止拙。岫一一! 1 0 0 2 3 0 0 4 0 0 5 0 0 筠曲t r i m a z o l e - d s3 萨 2 8 2 7 ，m 1 6 9 ；，钧3 铲 2 8 2 一 ，1 。6 9 。； 0 1 1 一r r r r 1 r r r r r r r 一卜1 t r 1 一o i r r r r r r r r r r r r r r r p ，r ，上 f r r r 一1 1 ，2 0 03 0 0，0 05 0 0 0 02 ，3 0 04 5 0 0 1 萼：= = = ，一，一n ，：型，一一舢成竹：型 2 3 4 0 0 s 1 2 ，3 0 04 5 0 0 1 0 捌0 1 i 咖k 1 0 4 粥f 3 2 3 8 l e 9 2 ； 蚓f ” o j 1 ，1 ，、1 ，1 1 ，叫k r r r ，一t 一1 2 0 03 0 04 0 05 警，懈一嵫4 6 0 4 7 1 0 9 ， 3 9 7 0 ，罱4 6 0 4 7 1 0 9 ， 3 9 7 , 0 肚1 f f 丽r 焉卜丽r 止f 面丽_ 扣、f 一 1 翟跏一7 7 3 8 1 3 。舶1 2 5 拍1 ，钧t 智38 1 一 j s 1 2 嘲5 1 出飞f 强r 丽_ 而蜱丽一再、f 丽丽砀十铲山“ 1 拦：忑，z _ ，算轧，一，一一一一，蛳止弑o k 丽_ r 磊飞f 扣丽一江丽厂丽_ 而孑钳芈嫩 警t c r c o m o t c4 八4 e5 3 1 9 i 裂翟，警i j 6 1 _ 3 9 c 3 舯2 3 4 脚5 1 2 d o 3 4 5 ， f 峨 - ? e f l u e , o n a z o l c 以 3 0 8 ，8 1 9 4 0 一n 2 6 0 0 5 o i _ ，t ，上k 1 ，叩r r r 1 ，r ，1 ，r ，t ，一 0 02 d o3 4 肿5 2 3 4 5 d o 钆，一五一一一，一一，二兰兰， 1 2 0 0 3 4 5 图2 - 2 目标物的加标样品和空白样品的u p l c m s m s 色谱图 f i g2 - 2l c - m s m sc h r o m a t o g r a m so fa n a l y t e si nas p i k e ds a m p l ea n db l a n ks a m p l e 砖 一 8 一 k 絮 一 第= 章超高技液相色苷质谱联用法涮定鸡肝鸡肉中1 0 种抗真菌药枋的残留 妻宜1 菖营1 首宜1 营1 旨宜1 曹 圉2 - $ 加标量为f 0 l g k 9 4 时不周提取在鸡肝基质中的回收率 f i 9 2 - 3 r e c o v e r i e so f a n a i y t e s i n d i f f e r e n t e x t r a c t so f c h i c k e n l i v e rs p i k e da t l 0 i t g 蟮1 1 萋阁幅门门11 憎嚯幅门 梦拶妒移爹喾节 图2 一加标量为t o 雌k f l 时，不同提取欢散时目标化合物在鸡肝基质中的回收率 f i 9 2 - 4 r o v e d 器o f a n a l y t e * i nd i f f e r e n te x t r a c t i o nc y c l e s o f c h i c k e n l i v e rs p i k e da t l 0 旧k g 。1 实验发现，在用有机溶剂提取前，加入一定量的无水硫酸钠有助于提高大 多数药物的回收率。分析原因，是由于无水硫酸钠结合了样品中游离的水分形 成了水合硫酸钠，降低了样品中的水分含量，改变了体系的极性，从而影响了 药物的提取回收率。为了完全去除基质中的水分，鸡肝基质中加入约1 lg 无水 硫酸钠、鸡肉基质中加入4g 左右的无水硫酸钠，确保样品处于粉末状之后， 再用提取液进行提取。 此外，还比较了2 2 0 0r p m 涡旋1m i n 与超声1 5m i n 的回收率，发现两者结 果相当。所以当样品份数少时，采用涡旋比较节省时间，但是当样品量较大时， 超声是更佳的选择。 北京化工大学硕上学位论文 2 4 3 样品富集、净化条件的优化 为了最大程度的减小基质中杂质( 如油脂等) 对实验的影响，本实验分别考察 了液液萃取和固相萃取( s p e ) 两种净化方式。首先，我们选择的是最常用的去除 生物样品中油脂的溶剂之一_ - 正己烷为液液萃取的熔剂。步骤如下：取1m l 目标化合物含量为2 0 “g l 0 的乙腈标准溶液，加入同体积的正己烷，充分混匀 之后于80 0 0r p m 的离心机离心lm i n ，静置分层。分别将乙腈层和正己烷层在 微弱的氮气流下吹至近干，并用lm l0 1 甲酸一甲醇( 体积比) 定容，于 u p l c m s m s 分析。结果表明，超过半数的目标物( 如伊曲康唑、克霉唑和咪 康唑等) 分配到了正己烷层，导致7 种物质在乙腈层的回收率 4 ) 更易溶于正己烷的缘故。同时本实 验也在鸡肝基质中重复了上述实验，其结果与纯标实验基本一致，可以看出， 正己烷不适合用于本实验的脱脂净化。 固相萃取技术是处理生物样品和环境样品常用的富集、纯化手段。本实验 考察了两种反相s p e 小柱一一c 1 8 柱、h l b 柱，和正相柱n h 2 柱对鸡肝基质的 回收率和基质效应。3 种s p e 小柱的活化、上样和洗脱方式如下：( 1 ) c 1 8 柱和 h l b 柱。1 0m l 乙腈萃取液加入4 0m l 水，充分混匀后分别上预先用3m l 甲 醇、3m l 水活化好的c 1 8 柱或h l b 柱，弃上样液。s p e 小柱经负压抽干之后， 用3m l 甲醇洗脱，收集洗脱液；( 2 ) n h 2 柱。乙腈的萃取液直接上预先用3m l 甲醇活化好的n h 2 柱，n h 2 柱用3m l 丙酮洗脱，收集上样液和洗脱液。所有 收集的洗脱液都在微弱的氮气流下吹干，1m l 初始流动相定容后上机分析。经 过s p e 净化的定溶液看起来要干净得多，但是氟康唑和特康唑在反相柱( c 18 柱 和h l b 柱) 上的回收很低。氟康唑的回收率为4 7 左右，可能是因为氟康唑在 反相柱上保留弱的缘故；特康唑的回收率约为3 0 ，其原因可能是特康唑强保 留，3m l 的洗脱液并未将全部的特康唑洗脱下来( 见表2 3 ) 。尽管所有目标化 合物在n h 2 柱净化之后都有较好的回收率( 7 0 1 2 1 ) ，但是n h 2 柱对某些目标 物( 如伊曲康唑、益康唑和咪康唑) 的基质抑制率还是非常高的( 7 0 ，见表2 4 ) 。 在动物组织中，脂类是最主要的组成之一，其中又以甘油三酯和磷脂居多。 根据以往的文献报道，冷冻能有效的去除组织中的甘油三酯和磷脂1 4 6 1 。该过程 是利用了温度降低时目标物与脂类在有机溶剂中的溶解度变化差异。在冷冻 ( 2 0o c ) 的情况下，脂类由于凝固点较高，首先从提取液( 乙腈) 中凝固析出，而 目标物由于凝固点较低仍然溶解在提取液中，从而达到了分离净化的目的。经 过一夜2 0o c 的低温冷冻，目标化合物的回收率几乎没有受到影响，而基质抑 制情况却大大降低了( 见表2 4 ) 。比较以上几种净化方案，从确保回收率、减少 基质抑制以及节省成本、操作简便的角度考虑，最终选择了操作更简单、更经 1 6 第二章超高效液相色谱质谱联用法测定鸡肝、鸡肉中1 0 种抗真菌药物的残留 济的冷冻的净化方式。图2 5 为最终确定的样品前处理流程。 表2 - 3 不同净化方式的回收率 t a b l e2 - 3r e c o v e r i e so fa n a l y t e sa f t e rd i f f e r e n tc l e a n - u ps t e p s 表2 - 4 不同的前处理过程的基质效益 t a b l e2 - 4m a t r i xe f f e c to fa n a l y t e si nc h i c k e nl i v e re x t r a c t su s i n gd i f f e r e n tt r e a t i n gp r o c e d u r e 1 7 北京化工大学硕上学位论文 2 4 4 方法确证 鸡肝、鸡肉匀浆，取2 0 0g i 加入适量无水n a l s 0 4 r 乙腈1 0 0m l ，超声提取 土 离心，取上清液 上 残渣重复上述步骤，合并上清液 上 取6m l 上清液，氮吹 工 残渣3 0 0g l0 1 甲酸一m e o h 定容 工 转移至1 。5m l e p 管 上 2 0o c 冰箱冷冻过夜 上 1 30 0 0r p m 离心机离心2 5m i n 上 上清液于l c m s m s 分析 图2 5 最终确定的样品处理流程图 f i g2 - 5s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h es a m p l ep r e p a r a t i o n 同位素内标法可以很好的弥补目标物在样品前处理和仪器检测时离子抑制 和前处理过程的损失，所以对于复杂基质中痕量残留物的l c m s m s 检测最理 想的方法是同位素稀释法。但是在多残留分析中，很难获得所有目标药物一 对应的同位素内标。这种情况下，可以尝试使用性质相近的物质进行内标法校 正。依据内标物的确定原则：结构相似、极性相近且能与目标物完全分开，本 文中，对没有同位素标记的几种物质，选择保留时间相近的其他氘代物进行内 标法回归，比较了目标物在甲醇溶剂中的内标校正曲线斜率和在不同样品基质 中的曲线斜率来考察所选内标物是否合适( 表2 5 ) 。通过比较目标物在不同样品 中的斜率的相对标准偏差( r s d ) ，可以看出有7 种目标物经过内标校正之后的 1 8 第二章超高效液相色谱质谱联用法测定鸡肝、鸡肉中l o 种抗真菌药物的残留 r 妨 3 0 ，说明所选内标不能补偿目 标药物在不同基质中的差异，也就是说本实验中没有合适的内标能校正这3 种 物质，所以用外标法一一基质匹配曲线对其进行定量分析。最终确定的内标见 表2 2 。 表2 5 纯标曲线的斜率和基质加标曲线的斜率比较 t a b l e2 - 5s l o p e so f n e a ts t a n d a r dc a l i b r a t i o na n dd i f f e r e n tm a t r i x - f o r t i f i e dc a l i b r a t i o n 4 s 1 、s 2 和s 3 代表了不同样品。 4 s1 s 2a n ds 3i n d i c a t e dd i f f e r e n ts a m p l e 2 4 4 1 线性范围及最低定量限和最低检测线 分别称鸡肝和鸡肉各2 0g ，加入适量的混合标准溶液，使得样品中的加标 质量浓度为0 1 、o 2 5 、0 5 、1 o 、2 5 、5 0 、1 0 0 、2 5 0 、5 0 0t a g k g - 1 ，并使内标 加入量为1 0 “g k g 。依2 3 3 方法处理，并在2 3 2 仪器条件下进行测定。对于 外标法离子，以m r m 定量离子峰面积y 为纵坐标、待测组分的质量浓度 x ( t a g k g 。) 7 、勺，曦坐a ，i q - - i ，绘制工作曲线，经线性回归后求得相关系数；对于内标法 离子，以m r m 目标物的定量离子峰面积与对应内标的离子峰面积比y 为纵坐 标、待测组分的质量浓度与对应内标的质量浓度比x ( t a g k g 以) 为横坐标，绘制 工作曲线，经线性回归后求得相关系数。最低定量限( l o q ) 和最低检测线( l o d ) 依2 3 4 所述方法确定。 目标化合物在两种基质中的线性范围为0 2 5 5 0 0t a g k g ，相关系数( 舻) 均 大于0 9 9 ，鸡肝、鸡肉基质中的l o d 、l o q 分别为1 o 3 0u g k g 1 和0 5 3 0 “g k g 1 ( 见表2 - 6 、表2 7 ) 。在以往关于生物样本中唑类抗真菌药物检测的报道 1 9 北京化工大学硕士学位论文 中，l o q 从5p g l 。1 到o 8 9m g l 1 不等【4 ，8 l l , 1 5 - 1 7 ，3 5 ，3 6 1 ，与其相比，该方法具有 更好的灵敏度和更低的定量限。 表2 - 6 目标化合物在鸡肝基质中的线性回归参数及l o d 、l o q t a b l e2 - 6c a l i b r a t i o nc u r v e s ，l i n e a rr a n g e ，l o da n dl o qo fa n a l y s i si nc h i c k e nl i v e r 表2 7 目标化合物在鸡肉基质中的线性回归参数及l o d 、l o q t a b l e2 - 7c a l i b r a t i o nc h i v e s ，l i n e a rr a n g e ，l o da n dl o qo f a n a l y s i si nc h i c k e nm u s c l e 2 4 4 2 回收率和精密度 分别称取鸡肝、鸡肉各2 0g ，加入适量的混合标准溶液，使得样品中的加 标浓度如表2 8 所示，并使内标加入量为1 0 岭k g 。每个浓度6 个平行，依2 3 3 方法处理并上机测定。计算平均回收率及r s d 。如表2 - 8 所示，目标物的平均 回收率为6 8 1 2 0 ，相对标准偏差 5 0 3 0 和6 6 6 0 6 4 8 0 作为m r m 离子，前者为定量离子，后者为定性离 子。相应的最佳碰撞能量分别为l le v 和8e v 。 4 8 5 f 咿 4 4 0 ： o i 竺! ：；11 墼! ? 警曼z 燃唑竺算止j 蛆概 图3 - 2 纳他霉素质谱裂解图 f i g3 - 2d i s s o c i a t i o nm a po fn a t a m y c i n 2 5 北京化1 = 大学硕士学位论文 3 4 2 色谱条件的优化 采用3 4 1 部分确定的质谱参数，对色谱条件进行了优化。本实验考察了反 相色谱常用的流动相：甲醇一水、乙腈一水、甲醇一0 0 1 甲酸水、乙腈一0 0 1 甲 酸水( 图3 3 ) 。结果表明流动相中加酸时灵敏度较低，可能是酸的存在抑制了目 标化合物的电离；对比甲醇水和乙腈水的体系，甲醇水为流动相时的响应值 要比乙腈水高两倍左右，所以最终选择了甲醇水为流动相。 s t d2 0i j g l l 1 0 0 , a2 霄3 3 o 翟 a 匙 “。 1 0 嬉0 = ! b2 斧名4 蛮 。罨u ” 毒2 毳等 篓，唑c2 曩2 罂 督 奢卜耳- z 勺e 勺 1 0 0 ：- d2 斧1 3 焉 g 屯 “。 图3 - 3 不同流动相条件下纳他霉素的总离子流色谱图 f i g3 - 3t o t a li o nc h r o m a t o g r a m so fn a t a m y c i nw h e nu s i n gd i f f e r e n tm o b i l ep h a s e 3 4 3 前处理条件的选择 纳他霉素的p k a 为1 1 o ，辛醇水分配系数l o gk o w 为1 1 ，说明该物质具 有较强的碱性和亲水性。以往的报道中，果酱中纳他霉素的萃取液多使用乙酸 水溶液，以提高回收率【2 m 酬。本实验分别考察了纯水、乙酸水( p h 为2 ) ，以及 常用有机溶剂甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯对目标物质的回收效果和基质效应 ( 图3 4 ) 。从图中可以看出，丙酮的回收率为8 2 ，明显高于其他体系：纯水为 6 2 ，而乙酸水、乙腈、甲醇、乙酸乙酯的回收率均在5 0 以下；另一方面， 水和酸水提取液含有大量糖等水溶性化合物，直接进样将会造成色谱系统的污 染、降低色谱柱的使用寿命，且提取液浓缩耗时较长。 本文同时考察了几种提取液的基质效应( 图3 3 ) ，可以看出，甲醇提取液具 有较高的基质抑制( 6 4 ) ，而丙酮、乙酸乙酯、乙腈、纯水提取液和酸水提取液 有一些基质增强。 2 6 第三章超高效液相色谱质谱联用测定果酱中纳他霉素的残留 1 5 0 , r 1 2 0 , l 9 0 * , r 6 0 3 0 * , j 0 o 口基质效应口回收率 冀 宙 冀鼠h “随 纯水乙酸水乙酸乙酯内酮乙腈甲酹 图3 - 46 种不同萃取液对蓝莓果酱中纳他霉素的回收率及基质效应 f i g3 - 4r e c o v e r i e sa n dm a t r i xe f f e c t so fn a t a m y c i ni n6d i f f e r e n te x t r a c t so fb l u e b e r r yj a m s 由于果酱中含有大量的糖，而纳他霉素具有较强的水溶性，容易与糖同时 提取出来，为了减弱糖份等亲水性杂质的影响，提高有机溶剂的提取效率，利 用盐析的原理加入一定量的氯化钠。本实验考察了氯化钠加入量为o 、0 5 、1 o 、 2 0g 时的回收率，所得结果分别为8 2 、9 7 、8 9 和9 0 ，可见，加入少量 的氯化钠能够改善回收率，所以最终在萃取液中加入0 5g 氯化钠。 固相萃取技术是复杂样品前处理的常用技术手段【4 0 1 。为了去除样品中杂质 的影响，本文分别对三种固相萃取小柱( s e p p a kc 1 8 柱、o a s i sh l b 柱及b o n d e l u t ep l e x a 柱) 进行了考察。果酱样品的萃取液用水稀释至丙酮含量小于2 0 后，以1 2m l m i n 以的流速通过预先用3m l 甲醇、3m l 水活化的3 种小柱， 后用3m l 甲醇洗脱，在微弱氮气流下吹干，初始流动相定容至lm l 上机分析 ( 图3 5 ) 。从图3 5 中可以看出，经过固相萃取小柱净化的样品，基质效应并没 有明显变化，但回收率却降至7 6 以下。 4 0 o 瞳基质效应口回收率 c 1 8 桂h l b 柱p 1 e x a 柱 图3 - 5c 1 8 柱、h l b 柱和p l e x a 柱对蓝莓果酱中纳他霉素的回收率和基质效应 f i g3 - 5r e c o v e r i e sa n dm a t r i xe f f e c t so fn a t a m y c i nu p o nc18 ，h l ba n dp l e x ac a r t r i d g e 综合以上的结果，我们最终选择丙酮作为提取溶剂浓缩后直接分析。最终 确定的样品处理流程如图3 - 6 所示。图3 - 7 给出了标准样品、加标样品( 1 0i - t g k 分1 ) 和空白样品( 依3 3 4 方法处理