（水生生物学专业论文）萍乡红鲫胰蛋白酶提取纯化及酶原前体cdna克隆、序列分析.pdf

摘要 摘要 本研究运用亲和层析等方法对萍乡红鲫胰蛋白酶进行提取与纯化，并对酶的 性质进行了研究；运用分子克隆手段获得了胰蛋白酶原前体基因，并对其核苷酸 序列及推导的氨基酸序列以及预测的蛋白质高级结构进行了初步分析。主要研究 结果如下： l 、胰蛋白酶的提取纯化 利用硫酸铵分级沉淀、透析、以鸡卵粘蛋白为配基的s e p h a r o s e 4 b c l 亲和 层析等方法，得到一种萍乡红鲫胰蛋白酶，经s d s p a g e 分析，该酶的分子量 为2 4 k d a 。 2 、p h 和温度对胰蛋白酶活性的影响 以b a e e ( n 苯甲酰l 精氨酸乙酯) 为底物，研究得出酶的最适温度为5 0 、 最适p h 为7 5 。 3 、胰蛋白酶原前体基因全长c d n a 序列 利用分子克隆方法从萍乡红鲫中获得胰蛋白酶原前体全长c d n a 为8 6 6 b p ， 包括5 端非编码区21 b p ，3 非编码区1 0 7 b p 。 4 、酶原前体推导氨基酸序列的分析 萍乡红鲫胰蛋白酶原前体基因开放阅读框编码2 4 6 个氨基酸序列，包括1 5 个氨基酸的信号肽和8 个氨基酸的激活肽，含有保守的具有催化活性的三联体结 构( h i s 6 3 ，a s p l 0 7 和s e r 2 0 0 ) 和决定底物特异性的必不可少的天冬氨酸残基 ( a s p l 9 4 ) ；具有1 2 个半胱氨酸( c y s ，c ) 残基，可形成6 个二硫键。 5 、酶原前体基因的同源性分析 由系统进化树推断，萍乡红鲫与中华倒刺啬巴属于同一分支，两者同源性最高。 6 、酶原前体基因推导蛋白的分析及其结构预测。 对由胰蛋白酶原前体c d n a 推导的氨基酸序列进行分析，得到蛋白质的分子 量w m = 2 6 3 4 1 8 d a ，等电点p i - - - 6 4 8 ，其氨基酸组成中丝氨酸( s e r ) 含量最高， 占整个氨基酸数目的1 3 8 2 ，其次为甘氨酸( g l y ) 为9 7 6 ：二级结构预测表 明该蛋白质二级结构包含四种形式( a 螺旋、延伸链、p 转角、随机卷曲) 。 关键词：萍乡红鲫：胰蛋白酶：提取纯化；分子克隆 a b s t r a c t a b s t r ac t i nt h i sr e s e a r c h ，t h et r y p s i no fc a r a s s i u sa u r a t u sv a r p i n g x i a n 舒e n s i sw a s p u r i f i e db yg e lf i l t r a t i o na n dc h a r a c t e r i z e d ；p r e t r y p s i n o g e ng e n ew a sc l o n e d ，t h e d e d u c e da m i n oa c i d ss e q u e n c ea n dp r e d i c t e dp r o t e i ns t r u c t u r ew e r ea n a l y s e d m a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 、t h ei s o l a t i o no ft r y p s i n w eg o to n ek i n do ft r y p s i nf r o mc a r a s s i u sa u r a t u sv a t p i n g x i a n g n e n s i sb y a m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o n , d i a l y s i s a n d g e l f i l t r a t i o n t h r o u g h c h o m s e p h a r o s e 4 b c l t h em o l e c u l a rw e i g h tw a s a b o u t2 4k d ab ys d s p a g e 2 、t h ee f f e c to fa c t i v i t yo ft r y p s i nb yp ha n dt e m p e r a t u r e t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp ho ft h et r y p s i nf o rh y d r o l y s i so fb a e e ( n c 【- b e n z o y l l - a r g i n i n ee t h y le s t e r ) w e r e5 0 ca n d7 5 3 、t h ef u l ll e n g t hc d n as e q u e n c eo fp r e y p s i n o g e ng e n e t h ef u l l l e n g t h c d n as e q u e n c ew a s8 6 6 b pw h i c hc l o n e df r o mp i n g x i a n g r e d t r a n s p a r e n tc r u c i a nc a r p ，i n c l u d i n ga5 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f2 1b pa n da3 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f10 7 b p 4 、d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ea n a l y s i sf r o mp r e t r y p s i n o g e n t h e o p e nr e a d i n g f r a m eo fc a r a s s i u sa u r a t u s v a r p i n g x i a n g n e n s i s p r e t r y p s i n o g e ng e n ee n c o d e d2 4 6a m i n oa c i dr e s i d u e s w h i c hc o m p o s e db yo n es i g n a l p e p t i d ew i t h 15a m i n oa c i dr e s i d u e sa n do n ea c t i v a t i o np e p t i d ew i t h8a m i n oa c i d r e s i d u e s i tc o n t a i n st h et y p i c a lc h a r a c t e rs t r u c t u r eo fc a t a l y t i ct r i a d ( h i s 6 3 ，a s pl0 7 a n ds e r 2 0 0 ) a n do b l i g a t o r ya m i n oa c i do fa s p l 9 4 ；6c o n s e r v e dc y s t i n eb r i d g e sw e r e f o u n d e db y12c y s t e i n er e s i d u e s 5 、t h es i m i l a r i t ya n a l y s i so fp r e t r y p i n o g e n c a r a s s i u sa u r a t u sv a t p i n g x i a n g n e n s i sa n ds p i n i b a r b u ss i n e n s i sw e r eo nt h e s a m ee m b r a n c h m e n td e d u c e db yp h y l o g e n e t i ct r e e ，t h e yh a v et h eh i g h e s ts i m i l a r i t y 6 、t h ea n a l y s i so fd e d u c e da m i n oa c i d ss e q u e n c eo fp r e t r y p s i n o g e na n dt h e p r o t e i ns t r u c t u r ep r e d i c t i o n w i t ha n y z i n go fd e d u c e da m i n o a c i d s s e q u e n c eo fp r e t r y p s i n o g e n ，t h e m o l e c u l a rw e i g h tw a s2 6 3 4 1 8 d a , a n dp 1w a s6 4 8 ，i nc o m p o s i t i o no fa m i n oa c i d s ， p r o p o r t i o n so fs e r i n ei sr e l a t i v i t yl a r g e ，a c c o u n t i n gf o r 13 8 2 ，s e c o n d l y , a s p a r a g m e w a s9 7 6 ；i tw a sp r e d i c t e dt h a tt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft h ep r o t e i nc o n t a i n e df o u r f o r m s ：q h e l i x ，e x t e n d e ds t r a n d ，1 3 - t u r na n dr a n d o mc o i l k e y w o r d s ：p i n g x i a n gr e d t r a n s p a r e n t c r u c i a nc a r p ；t r y p s i n ；i s o l a t i o n ；m o l e c u l a r c l o n i n g 1 ：1 1 1 ：2 ： 。：! 3 4 5 5 5 ( ； ( ； ( j 6 7 7 ； 9 1 0 1 0 1 ( ) 1 3 1 8 1 8 活性的影响1 9 2 0 2 0 活性的影响2 1 目录 第三章萍乡红鲫胰蛋白酶分子克隆及序列分析2 2 3 1 材料与方法2 2 3 1 1 材料2 4 3 1 2 实验方法2 4 3 2 结果与分析3 0 3 2 1 总r n a 的提取3 0 3 2 2中间片段的检测3 0 3 2 35 末端与3 末端检测3 0 3 2 4 萍乡红鲫胰蛋白酶基因c d n a 序列分析3 2 3 2 5 基因推导蛋白的氨基酸序列比对和系统发生树分析3 4 3 2 6 胰蛋白酶氨基酸序列分析3 9 3 2 7 胰蛋白酶原前体信号肽与激活肽分析4 0 3 2 8 萍乡红鲫胰蛋白酶二级结构预测4 l 3 3 讨论4 2 3 3 1 总r n a 提取4 2 3 3 2 胰蛋白酶原的信号肽和激活肽4 3 3 3 3 胰蛋白酶氨基酸序列分析及系统进化4 4 结论4 6 致谢4 7 参考文献4 8 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1萍乡红鲫简介 萍乡红鲫( p i n g x i a n gr e d t r a n s p a r e n tc r u c i a nc a r p ，c a r a s s i u sa u r a t u sv a t p i n g x i a n g n e n s i s ) 属鲤科鲫属，体型呈纺锤形，体侧扁，头部较小，口端位，无 须，是普通野生鲫的一个变种群，具有两性生殖和雌核发育两种生殖方式，主要 分布于江西萍乡地区，据记载已有1 0 0 多年的养殖历史。自1 9 9 7 年始对其进行 人工选育至今，获得的f 6 代遗传性状基本稳定【i 】。关于萍乡红鲫的研究报道较 少，主要集中在资源分布、人工选育、生殖方式、营养价值等方面。 随着生态环境的改变和人为的干预等，萍乡红鲫的资源分布发生了较大变 化，康升云等( 2 0 0 1 ) 【2 】在1 9 9 9 至2 0 0 0 年对萍乡红鲫的资源分布进行了调查， 发现与江西大学生物系( 1 9 7 6 年) 、江西水产科学研究所( 1 9 7 8 年) 、萍乡市水 产科学研究所等单位调查的结果相比较，部分地区萍乡红鲫的分布有较大变化， 主要集中在养殖业较发达的地区，如老关、下埠、排上、赤山、彭高等地。 在人工选育方面，洪一江( 2 0 0 4 ) 【lj 通过人工选育的手段，将萍乡红鲫的雌 雄比由2 0 ：l 上升到8 1 0 ：1 ：并且在体色变化上也明显改善，萍乡红鲫纯红透 明的个体数量占群体数量，由f 1 代的4 1 左右上升到f 5 代以后的9 0 以上。 表明萍乡红鲫的种质已经趋于稳定。 萍乡红鲫具有较高的营养价值，其味道鲜美，肌肉中氨基酸含量丰富，其中 人体必需氨基酸的含量占肌肉干重的3 5 左右，并且含有丰富的z n 、f e 、m g 等微量元素，而h b 、h g 、c d 、c r 、a s 等有害金属离子含量远远低于有害水平【) j 1 2 胰蛋白酶的研究 1 2 1胰蛋白酶的简介 胰蛋白酶是消化道中的一种主要的碱性蛋白酶，属于丝氨酸蛋白酶家族。同 时胰蛋白酶也是一种肽链内切酶，对于由碱性氨基酸( 精氨酸、赖氨酸) 的羧基 与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。 胰蛋白酶以胰蛋白酶原前体的形式从胰腺腺泡细胞中产生，去掉信号肽后变 成胰蛋白酶原释放到肠道中，被肠激酶激活去掉激活肽变成有活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶的主要生理功能有两个：一消化食物中的蛋白质，二激活胰腺分泌的其 他酶原，如胰凝乳蛋白酶酶原、弹性蛋白酶酶原和羧肽酶酶原，同时对自身的酶 原也有激活作用【4 j 。 第一章文献综述 1 2 2 胰蛋白酶分离纯化 、 根据国内外的报道，众多鱼类的胰蛋白酶都被分离纯化出来，其分离纯化的 材料一般选用胰腺、肠道和幽门盲囊等。b r a d f o r d ( 1 9 6 0 ) e 5 】从大鳞大马哈鱼 ( c h i n o o ks a l m o n ) 中分离出一种蛋白水解酶，该酶与哺乳动物的胰蛋白酶和糜 蛋白酶特性相似；r e e k 等( 1 9 7 0 ) 【6 】从非洲肺鱼( p r o t o p t e r u sa e t h i o p i c u s ) 中纯 化出三种胰蛋白酶，发现该酶的氨基酸序列与其他动物的胰蛋白酶序列相似。 t i t a n i ( 1 9 7 5 ) o 】利用电泳技术从多刺猫鲨( s q u a l u sa c a n t h i a s ) 中纯化得到胰蛋白 酶，其氨基酸序列与牛和猪的胰蛋白酶序列相似。c o h e n 等( 1 9 8 1 ) 1 3 】从鲤鱼 ( c y p r i n u sc a r p i o ) 中纯化得到一种蛋白水解酶。m a r t i n e z 等( 1 9 8 8 ) 【3 i j 利用亲 和层析、离子交换层析从鲲鱼( e n g r a u l 西e n c r a s i c h o l u s ) 中纯化出两种胰蛋白酶 其特性与其他鱼类的胰蛋白酶特性相似。g u i z a l i 等( 1 9 9 1 ) 【i7 】从鲻鱼( m u g i l c e p h a l u s ) 函门盲囊中纯化得到一种胰蛋白酶，其稳定与大多数海产鱼类胰蛋白 酶类似。( ) u t z e n 等( 1 9 9 6 ) 0 9 j 从大西洋鲑鱼( s a l m os a l a r ) 中纯化出四种不同电 荷的胰蛋白酶。b e i r a o 等( 2 0 0 1 ) 【l l 】利用卵类粘蛋白为配基的s e p h a r o s e4 b 亲和 层析柱从鳕鱼幽门盲囊中纯化出一种胰蛋白酶，能被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制； 王进波等( 2 0 0 7 ) 【7 j 通过硫酸铵分级沉淀和s e p h a d e xg 5 0 凝胶层析的方法纯化 了大黄鱼幽门胰腺的胰蛋白酶，提取后的纯度为粗酶纯度的4 2 倍。陈荣昌等 ( 2 0 0 8 ) t s 乖l 用d e a e s e p h a m s e 离子交换层析和s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶过滤层析 得到青鱼胰蛋白酶，其纯化倍数为4 1 2 5 倍，要明显高于王进波的纯化倍数，但 是其回收率只有1 5 6 ，且过程较为繁琐。耿莉娜等( 2 0 0 8 ) 【9 】通过以鸡卵粘蛋 白为配基的亲和层析从草鱼肝胰脏中纯化胰蛋白酶，其纯化倍数为2 4 3 倍，产率 为3 0 3 ，要高于陈荣昌纯化青鱼胰蛋白酶的产率。 1 3 鱼类胰蛋白酶的性质研究 国内外关于鱼类胰蛋白酶的研究已有大量的报道，主要集中在酶的纯化以及 酶的特性的研究，如温度、p h 等对酶活性的影响以及关于胰蛋白酶分子量测定 等，如表1 3 所示。 1 3 1p h 对鱼类胰蛋白酶活性的影响 根据国内外众多学者的研究，鱼类胰蛋白酶的最适p h 在7 0 - 1 0 5 之间。海 水鱼类胰蛋白酶的最适p h 在8 0 1 0 5 之间，如f r a n c i s c oj a v i e rc a s t i l l o - y 6 f i e z ( 2 0 0 5 ) 2 0 j 从蒙特利沙丁鱼( s a r d i n o p ss a g a xc a e r u l e a ) 幽门盲肠段纯化出一种 胰蛋白酶，其最适p h = 8 0 。并且在p h 7 肛8 0 时该酶最为稳定，在p h 1 1 第一章文献综述 时，该酶的稳定明显下降；i k u r t o v i c ( 2 0 0 6 ) 【22 j 和g u i z a l i n ( 1 9 9 1 ) 【1 7 】分别从 大鳞鲑鱼( o n c o r h y n c h u st s h a w y t s c h a ) 和胭脂鱼( m u g i lc e p h a l u sl i m m a e u s ) 幽门盲肠内纯化出一种胰蛋白酶，最适p h 均为8 0 ；s a p p a s i t hk l o m k l a o ( 2 0 0 7 ) 弘卅 从金枪鱼( k a t s u w o n u sp e l a m i s ) 脾脏中纯化出三种胰蛋白酶，这三种酶的最适 p h - - - 8 5 ；m a g n u sm ( 1 9 9 2 ) 2 3 1 从虹鳟中纯化得到两种胰蛋白酶，最适p h 大约 为9 0 ，且当p h 小于5 0 时，酶的稳定性明显下降：o u t z e n ( 1 9 9 6 ) t 9 1 从大西洋 鲑鱼( s a l m os a l a r ) 中得到的胰蛋白酶，经研究，其最适p h 高达1 0 5 。 在淡水鱼类中，胰蛋白酶最适p h 在7 0 - - 9 0 之间。黄峰等( 1 9 9 6 ) 2 4 1 研究 鲢的胰蛋白酶，在肠粘膜、肝胰脏、脾脏和胆汁等组织中，均以肝胰脏胰蛋白酶 活性最大，最适p h = 8 3 ：沈文英等( 2 0 0 2 ) 【2 5 】研究银鲫消化酶与p h 的关系时 发现，在肝胰脏、前肠、中肠、后肠中，胰蛋白酶的最适p h 以中肠最高，分别 为7 5 、7 5 、8 5 、8 o ：阮国良等( 2 0 0 4 ) 2 6 1 澳4 出月鳢( c h a n n aa s i a t i c a ) 胃粘膜 组织、前肠粘膜组织和肝胰脏的胰蛋白酶的适宜p h 值分别为7 4 、7 4 和7 0 ： 卢宝驹( 2 0 0 8 ) 【1 6 】从鳜鱼( s i n i p e r c ac h u a t s i ) 中纯化得到两种胰蛋白酶，以 b o c p h e s e r - a r g m c a 为底物，测得最适p h 均为8 5 ：陈荣昌等( 2 0 0 8 ) 瞄j 分离 纯化了青鱼胰蛋白酶并对其进行研究，其最适p h = 9 o ；陈珊珊( 2 0 0 5 ) 睇7 j 以 b o c p h e s e r - a r g m c a 为底物对草鱼的胰蛋白酶进行研究，结果发现其最适p h 为9 0 ，而耿莉娜( 2 0 0 8 ) 1 9 1b a n p a 为底物对草鱼胰蛋白酶进行研究，最适 p h = 8 0 ，两者的差异可能与底物的不同有关。 由此可见，淡水鱼类和海水鱼类( 除了个别种类的鱼，如大西洋鲑鱼胰蛋白 酶最适p h 为l o 5 ) 胰蛋白酶最适p h 差异不大，都呈现弱碱性，表明可能鱼类 的生活环境对其消化酶中的胰蛋白酶活性的影响不明显。 1 3 2 温度对鱼类胰蛋白酶活性的影响 温度对鱼类胰蛋白酶活性有较大的影响，在过高或过低温度时，酶的活力较 低，只有在最适温度时，酶才具有较高的活力，同时也保证了酶的稳定性。根据 目前的研究报道，鱼类胰蛋白酶的最适温度一般在3 0 , 6 0 c 左右，海洋鱼类和淡 水鱼类的最适温度相差不大。沙丁鱼( s a r d i n o p ss a g a xc a e r u l e a ) 【2 、金枪鱼 ( k a t s w , v o t l u sp e l a m i s ) 【2 2 1 、大西洋鳕鱼( g a d u sm o r h u a ) 2 8 1 胰蛋白酶的最适温度为 5 0 6 0 ，草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 【l 酬、青鱼( m y l o p h a r y n g o d o n p i c e u s ) s l 等胰蛋白酶的最适温度为5 0 6 0 c ，鲶鱼( c a t f i s h ) f 2 叫与鳜鱼( s i n i p e r c ac h u a 膳i ) 1 6 1 胰蛋白酶的最适温度相近，在3 0 4 0 之间。 第一章文献综述 1 3 3 鱼类胰蛋白酶分子量的研究 胰蛋白酶分子量的测定主要采用s d s p a g e 方法，根据目前的报道，鱼类 胰蛋白酶分子量在2 0 2 9 k d a 之间。k e i l 3 0 】曾报道鱼类胰蛋白酶的分子量为 2 0 2 4 k d a ；卢宝驹【1 6 】测得鳜鱼胰蛋白酶分子量为21 k d a ：m 叭i n e z 【3 l 】等测得凤尾 鱼( p o e c i l i ar e t i c u l a t a ) 的胰蛋白酶的分子量为2 5 6 k d a ；o u t z e n u 9 】等得出大西洋 鲑( s a l m os a l a r l ) 的胰蛋白酶分子量为2 5 k d a ；鲤鱼( c y p r i n u s c a r p i o ) 【1 ) j 则为 2 5 k d a ：胭脂鱼( m u g i ，c e p h a l u s ) i t 7 l 、金枪鱼( k a t s u w o n u s p e l a m i s ) 2 2 】、乌贼( s e p i a o f f i c i n a l i s ) d 2 l 、杜父鱼( s e b a s t e ss c h l e g e l i i ) 、许氏平鳓( a l c i c h t h y sa l c i c o r n i s ) 【3 3 1 的胰蛋白酶分子量为2 4 k d a ；而虹鳟【2 3 l 的胰蛋白酶分子量高达2 8 8 k d a 。 表i 3 国内外部分鱼类胰蛋白酶性质的研究概况 t a b l e1 3t h eo v e r v i e w so r lp a r t so f f i s h e s t r y p s i np r o p e r t i e sb e t w e e nd o m e s t i ca n do v e r s e a s 种类最适温度最适p h 分子量k d a文献 胭脂鱼 虹鳟 大西洋鲑鱼 沙丁鱼 大西洋鳕鱼 金枪鱼 杜父鱼 许氏平鲇 鲶鱼 大鳞大马哈鱼 鲢鱼 银鲫 月鳢 黄鳝 鲤鱼 鳜鱼 草鱼 5 58 0 5 59 0 1 0 5 5 0 8 0 5 3 4 6 0 5 0 6 0 3 0 。4 0 6 0 3 5 4 0 6 0 8 o 8 5 8 o 8 0 9 o 8 0 8 3 7 5 7 o 8 5 9 0 8 5 8 0 2 4g u i z a l i1 9 9 l 2 8 2 、2 8 8 2 5 2 5 2 3 9 2 4 2 4 2 4 2 8 - 2 5 2 l 2 7 m a g n u sm 1 9 9 2 o u t z e n1 9 9 6 f r a n c i s c oj a v i e r c a s t i l l o - y a f i e z 2 0 0 5 b j a r k is t e f a n s s o n 2 0 10 s a p p a s i t hk l o m k l a 0 2 0 0 7 h i d e k ik i s h i m u r a 2 0 0 7 h i d e k ik i s h i m u r a 2 0 0 7 u y s 、h e c h t1 9 8 7 i k u r t o v i c2 0 0 6 黄峰1 9 9 6 沈文英2 0 0 2 阮国良2 0 0 4 杨代勤2 0 0 5 t c o h e n l 9 8 i 卢宝驹2 0 0 8 耿莉娜2 0 0 8 青鱼 5 0 9 04 4 陈荣吕2 0 0 8 4 第一章文献综述 1 4 胰蛋白酶( 原) 基因研究 基因克隆为研究胰蛋白酶酶学特性提供了分子生物学基础，目前有许多物种 的胰蛋白酶基因被克隆并进行深入研究，为工业、农业、医药等众多行业做出了 贡献。 目前克隆基因的全长一般采用r a c e 法，即c d n a 末端快速扩增技术( r a p i d a m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ，r a c e ) ，1 9 8 8 年由f r o h m a n 发明，该技术是一种基 于m r n a 反转录和p c r 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点扩增基 因的未知区域，从而获得m r n a ( c d n a ) 完整序列的方法。 胰蛋白酶基因在许多物种中都被克隆并研究，研究得相对比较充分的有真菌 类、鱼类、昆虫类、甲壳类和哺乳类，关于鸟类和两栖类的研究较少，只有少数 几个物种。 1 4 1真菌类 真菌主要从寄主中获取营养来满足自身的需要，真菌分泌的胰蛋白酶属于胞 外酶，主要用来水解寄主蛋白。关于真菌类的胰蛋白酶基因的研究主要有灰色链 霉菌( s t r e p t o m y c e sg r i s e u s ) 【3 4 】、红霉素链霉菌( s t r e p t o m y c e se r y 砌r a e u s ) 3 5 1 、 黑僵菌( m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e ) 3 6 】、小龙虾真菌( a p h a n o m y c e sa s t a c i ) d 7 】等。 k i mj c 等( 1 9 9 1 年) 利用寡聚核苷酸探针从灰色链霉菌( s t r e p t o m y c e s g r i s e u s ) 基因文库中筛选出种胰蛋白酶基因，该基因编码2 2 3 个氨基酸序列， 包括3 2 个氨基酸的前导肽和4 个氨基酸的激活肽，且在断裂位点上是由脯氨酸 构成，导致该酶不能自我活化。 s m i t h s o ns l 等( 1 9 9 5 年) 从黑僵菌( m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e ) 中克隆得到 一种丝氨酸蛋白酶基因，该基因包含2 个内含子( 分别9 4 b p 和4 0 b p ) ，编码2 5 4 个氨基酸序列，包含穿越内质网的信号肽和一段激活肽。 b a n g y e e k h u ne 等( 2 0 0 1 年) 在小龙虾真菌( a p h a n o m y c e sa s t a c i ) 中获得的 胰蛋白酶基因编码2 7 6 个氨基酸序列，包括1 7 个氨基酸序列的信号肽和2 1 个氨 基酸序列的前导肽。 1 4 2圆口类 r o a c hj c 从海产七鳃鳗( p e t r o m y z o nm a r i n u s ) 【3 8 】中得到编码胰蛋白酶的四 条c d n a ，长度都约为8 6 0 b p ，包含了完整的丌放阅读框，分别编码2 4 7 、2 4 7 、 2 4 5 、2 4 4 个氨基酸序列。 第一章文献综述 1 4 3 两栖类 s h i ，y b 从非洲爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ) 【3 9 】牛：获得胰蛋白酶e d n a ，编码2 4 3 个氨基酸序列，包含1 5 个氨基酸的信号肽和5 个氨基酸的激活肽。 1 4 4 鸟类 在鸟类中研究胰蛋白酶基因较少，目前报道的只有鸡和鸵鸟。w a n gk ( 1 9 9 5 ) 【4 0 】对鸡胰蛋白酶基因家族进行了分离和性质分析研究，鸡胰蛋白酶基因家族可 分为2 个次级家族：编码阳离子同工酶的t r y p s i n o g e n i 和编码阴离子同工酶的 t r y p s i n o g e n i i ，两者核酸序列的相似度约为7 0 。b o d l e y m d ( 1 9 9 5 ) j 对鸵鸟 的胰蛋白酶基因进行研究，其n 端包含9 个氨基酸序列的激括肽； s z e n t h e b ( 2 0 0 5 ) t 4 2 】从鸵鸟中克隆到一种胰蛋白酶，该酶的激活速度比人的胰蛋 白酶原i 更快。 1 4 5 昆虫类 国外关于昆虫类胰蛋白酶基因的研究较多，主要是想利用基因手段来防治一 些害虫，如麻蝇( n e o b e l l i e r i ab u l l a t e ) 阳】、嗜血性厩蜇蝇( s t o m o x y sc a l c i t r a n s ) 1 、沙蝗( s c h i s t o c e r c ag r e g a r i a ) 【4 5 1 、柑桔象鼻虫( d i a p r e p e sa b b r e v i a t u s ) 4 6 】、 芥子气甲壳虫( p h a e d o nc o c h l e a r a e ) 4 7 1 、印度肉蛾( p l o d i ai n t e r p u n c t e l l a ) 4 8 】、 美国牧草盲蝽( l y g u sl i n e o l a r i s ) 1 4 9 】等。昆虫的胰蛋白酶基因由信号肽、激活肽 和活性基因组成，信号肽一般由1 8 2 3 个氨基酸组成，两端都由疏水性氨基酸构 成，活性基因部分由2 3 2 个氨基酸组成。 1 4 6 甲壳类 关于甲壳动物胰蛋白酶基因的研究，目前已报道的包括太平洋白虾( p e n a e u s v a n n a m e i ) 5 0 1 【5 i 】、中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 、日本对虾( p e n a e u s j a p o n i c u s ) 、 中华齿米虾( n e o c a r i d i n a d e n t i c u l a t es i n e n s i s ) 、克氏原螯虾( p r o c a m b a r u sc l a i k i i ) 、口 虾蛄( o r a t o s q u i l l ad r a t o ，i a ) 5 2 】、淡水螯虾( p a c i f a s t a c u sl e n i u s c u l u s ) 1 7 5 j 、欧洲小 龙虾( a s t a c u sl e p t o d a c t y l u s ) 1 7 6 j 、勘察加蟹( p a r a l i t h o d e sc a m t s c h a t i c u s ) 7 7 j 、东 方扁虾( t h e n u so r i e n t a l i s ) 1 7 8 j 等。 。 1 9 9 2 年d s e l l o s 从太平洋白虾( p e n a e u sv a n n a m e i ) 中克隆得到两条胰蛋白 酶基因序列，其中一条编码2 7 0 个氨基酸序列的酶原前体，包括一个由1 4 个氨 基酸序列组成的信号且太【5 0 】。1 9 9 6 年b k l e i n 对太平洋白虾( p e n a e u sv a n n a m e i ) 第一章文献综述 研究发现，太平洋白虾胰蛋白酶有三种同工酶形式，在其消化腺c d n a 文库中 筛选出了编码5 种胰蛋白酶序列，编码2 5 6 个氨基酸序列，包含了1 4 个氨基酸 序列的信号肽和1 4 个氨基酸序列的前导肽，分子量约为2 2 5 k d a t 5 t 】。 王宁( 2 0 0 4 ) 5 2 1 对中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 、日本对虾( p e n a e u s j a p o n i c u s ) 、 中华齿米虾( n e o c a r i d i n a d e n t i c u l a t es i n e n s i s ) 、克氏原螯虾( p r o c a m b a r u sc l a i k i i ) 、口 虾蛄( o r a t o s q u i l l ao r a t o r i a ) 5 中甲壳动物的胰蛋白酶基因d n a 片段进行克隆与分 析，序列中包含一个内含子和两个不完整的外显子，与太平洋白虾( l i t o p e n a e u s v a n n a m e i ) 胰蛋白酶基因的相似度在5 6 以上，与哺乳动物相似度为4 0 左右， 与昆虫类的相似度最低，为2 5 左右。由此体现了甲壳动物在生物进化过程中的 地位。 1 4 7 晡乳类 哺乳动物胰蛋白酶基因的研究相对较早且研究的种类也较少，仅在几种模式 生物中有相关的研究报道。m a c d o n a l d sa l 于1 9 8 2 年在大鼠中首先报道了胰蛋白 酶c d n a 序列；1 9 8 4 年，h o n e y 5 3 1 等利用大鼠c d n a 探针首先精确定位了人类 胰蛋白酶基因i 位置；l eh u e r o ui 等( 1 9 9 0 ) 5 4 1 研究牛( b o st a u r u s ) 胰蛋白酶 基因发现，编码胰蛋白酶阴阳离子同工酶之间的相似度为6 5 ，而编码阴离子同 工酶的基因与其他哺乳动物胰蛋白酶基因之间的相似度为7 3 - - - 8 5 ：p i n s k y , s d ( 1 9 8 5 ) 5 5 】等从狗( d o g ) 胰腺中克隆得到编码2 种带不同电荷的胰蛋白酶基因， 这两种胰蛋白酶基因分别编码2 4 6 和2 4 7 个氨基酸序列，两者的相似度为7 4 9 ， 包括1 5 个信号肽和8 个激活肽。 1 4 8鱼类 胰蛋白酶基因在鱼类中研究较多，大多数都集中在硬骨鱼类，如大西洋鳕鱼 ( a d u sm o r h u a ) 7 4 l 、大西洋鲑鱼( s a l m os a l a r ) 1 9 】、虹鳟( o n c o r c h y n c h u sm y k i s s ) 【1 2 1 、风尾鱼( e n g r a u l i se n c r a n s i c h o l u s ) 【7 5 7 9 1 、中华倒刺鳃( s p i n i b a r b u ss i n e n s i s ) 【5 6 l 、鳗鲡( a n g u i l l aj a p o n i c a ) 5 7 】、罗非鱼( t i l a p i a ) s s 】、鲶鱼( p a r a s i l i r u sa s o t u s ) 5 9 1 笙 寸o 大多数脊椎动物胰蛋白酶氨基酸序列都很保守，包括信号肽和激活肽，以及 具有催化活性的三联体结构和底物专一性的结合位点。如郑凯迪( 2 0 0 7 ) 6 0 1 利 用r a c e 技术从胭脂鱼( m y x o c y p r i n u sa s i a t i c u s ) 中克隆得到胰蛋白酶原前体的 基因全长，该基因编码2 4 7 个氨基酸，包括1 5 个氨基酸序列的信号肽和8 个氨 基酸序列的激活肽，与斑马鱼( z e b r a f i s h ) 胰蛋白酶的氨基酸序列相似度最高， 第一章文献综述 达到8 4 ，而与哺乳动物胰蛋白酶氨基酸序列的相似度在6 5 7 5 之间；中华倒 刺缶巴( s p i n i b a r b u s s m e m 括) 5 6 j 胰蛋白酶c d n a 编码2 4 6 个氨基酸，包括由1 4 个 氨基酸组成的信号肽和由8 个氨基酸组成的激活肽，激活肽中含有四个阴离子残 基：3 个天冬氨酸( a s p ，d ) 和一个谷氨酸( g l u ，e ) ，与大西洋鳕鱼相差很大， 而与哺乳动物相似，哺乳动物的激活肽有4 个天冬氨酸( a s p ，d ) 残基组成， 且末端都是赖氨酸( l y s ，k ) ，而中华倒刺鳃的末端为天冬氨酸。 胰蛋白酶的信号肽一般由1 5 个左右的氨基酸组成，信号肽两端都是由疏水 性氨基酸( m e t 、a l a 、t y r 和v a l ) 构成，以便能跨过疏水性的内质网。如人 ( b a a 0 8 2 5 7 、a a a 6 1 2 3 2 、a a c 8 0 2 0 7 ) 、牛( n p0 0 1 1 0 7 1 9 9 ) 、鼠( p 0 0 7 6 2 、 p 0 0 7 6 3 ) 、非洲爪蟾( p 1 9 7 9 9 ) 、草鱼( f j 4 1 6 5 9 8 ) 、胭脂鱼( a b p 9 3 6 9 5 ) 等，而 大西洋鲑鱼i 、i i 、i i i ( p 3 5 0 3 l 、p 3 5 0 3 2 、p 3 5 0 3 3 ) 的信号肽分别由1 3 、4 、7 个 氨基酸组成，可能是在进化过程中会发生信号肽的缩短或丢失。 胰蛋白酶的激活肽由5 8 个氨基酸序列组成，c 末端都是碱性氨基酸构成， 最为常见的是赖氨酸( l y s ，k ) ，如人胰蛋白酶( a a a 6 1 2 3 2 ) 的激活肽为 a pfd d d d k ，牛( n p0 0 1 1 0 7 1 9 9 ) 的胰蛋白酶激活肽为f p v - d ddd k ， 非洲爪蟾( p 1 9 7 9 9 ) 为f ddd k ，胭脂鱼( a b p 9 3 6 9 5 ) 为a pld edd k ， 大西洋鲑鱼i ( p 3 5 0 3 1 ) 为f a t e d d k ，连接在激活肽末端之前的氨基酸 ( a s p ，d ) 可以抑制酶原的自我活化【6 0 l ，从高等动物到低等动物，末端之前的几 个a s p 数目逐渐减少，显示出了不同物种的进化地位。 二硫键属于共价键，由一条或两条肽键上的半胱氨酸残基上的巯基经脱氢氧 化生成，其作用是进一步加强蛋白质在构象和生理功能上的稳定性。可以根据丝 氨酸蛋白水解酶中二硫键的增加和缺失来判断脊椎动物的进化