（应用化学专业论文）溶菌酶在液固界面吸附时置换吸附焓的微量热研究.pdf

摘要 本文利用精密微量热法和摇床法对2 5 * ( 2 不同硫酸铵( ( n h 4 ) 2 s 0 4 ) 浓度下天然及变性 溶菌酶( l y s ) 水溶液和适度疏水填料p e g 一6 0 0 混合时的吸附量和置换吸附热效应进行了 测定。将总置换吸附焓h i 分解为各个次级过程中的焓变分量：吸附亲和焓变h 。，去 水合焓变h d ，分子构象焓变h m 。通过对置换吸附焓变、熵变、自由能变的分量进 行分析，探讨了盐浓度的变化对总焓变h i 的影响，以及蛋白质在吸附折叠过程中各个 次级过程与热力学分量之间的关系。 通过量热测定的焓变和平衡吸附热力学的分析，我们得知：( 1 ) 利用摇床法测定的 天然溶菌酶在疏水表面的吸附量的结果表明，在低盐浓度下，天然溶菌酶的吸附表现为 负吸附，在高盐浓度下吸附量显著增加。( 2 ) 不同盐浓度条件下天然溶菌酶在液固界面 上的置换吸附焓a h i 的值都为正值，表现为吸热。说明天然溶菌酶在疏水表面吸附时， 失去了其有序天然结构，暴露了内部的疏水基团。( 3 ) 2 5 。c 不同硫酸铵浓度条件下，天 然l y s 在p e g 一6 0 0 表面上的吸附是一个熵驱动的过程，这是因为吸附过程中比起疏水作 用来说，由于蛋白分子构象发生改变所引起的分子构象作用占了优势，暗示了吸附过程 中熵增起了主要作用。( 4 ) 根据计量置换理论( s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r y ， s d t ) 理论，结合吸附等温线的数据，计算出各个次级过程中的热力学分量，首次揭示 了蛋白吸附过程中各个次级过程与热力学分量之间的关系；( 5 ) 测定的焓变h 和计算 得到的g 值说明了天然溶菌酶在表面上的吸附是一个自发的过程。 对相同条件下经1 8 m 0 1 l 。1 盐酸胍变性的变性溶菌酶的置换吸附焓同样进行了测 定，研究发现( 1 ) 变性溶菌酶在疏水表面的吸附量随着盐浓度和蛋白浓度的增加逐渐 增加。( 2 变性溶菌酶在疏水表面上再折叠和吸附时，由于疏水作用的影响，在低盐浓 度下，总置换吸附焓h i 表现为吸热，但在高盐浓度下h i 表现为放热。( 3 ) 变性溶菌 酶的吸附和再折叠过程是同时发生的，在高盐浓度时疏水作用强于去水合作用，是一个 主要由h 。和h m 的焓驱动过程促使了变性l y s 分子在p e g 6 0 0 表面的吸附和折叠。 ( 4 ) 高盐浓度时由液固吸附热力学计算所得的熵变的分析，与微量热测定焓变的分析 相一致，符合热力学焓一熵补偿理论，即高盐浓度时，在变性溶菌酶的吸附过程中，随 盐浓度增加熵值的减小可通过较大的放热焓变得以补偿。 在液固界面上蛋白吸附的微量热研究对于探讨蛋白的吸附及折叠的机理是非常重 要和可信的。本文应用直接测得的、可信的置换吸附焓的数据，结合s d t 理论将置换吸 附过程细分为两个热力学分量：溶质的净吸附和溶剂的净解吸附过程，能够很好的解释 蛋白吸附过程中的次级过程。 关键词：微量热，d s c ，溶菌酶，吸附，液固界面，置换吸附焓 m i c r o c a l o r i m e t r i cs t u d yo ft h ed i s p l a c e m e n ta d s o r p t i o n e n t h a l p i e so fl y s o z y m ea d s o r p t i o no nt h el i q u i d - s o l i d i n t e r f a c e a b s t r a c t i nt h i sa r t i c l ，t h em e c h a n i c a ls h a k e ra n dm i c r o d s c - i ic a l o r i m e t e ra r eu s e dt om e a s u r e d t h ea d s o r p t i o na m o u n ta n dt h ed i s p l a c e m e n ta d s o r p t i o ne n t h a l p y ( , i - 1 ) o fl y s o z y m e ( l y s ) w h i c ha r cn a t i v ea n dd e n a t u r e ds t a t e sm i x i n gw i t hm o d e r a t e l yh y d r o p h o b i cp e gp a c k i n g s p o w d e ri nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fa m m o n i u ms u l f a t e ( ( n a 4 ) 2 s 0 4 ) s o l u t i o n sa t2 5 t 1 l e t o t a la hw e r ed i v i d e di n t ot h r e ee n t h a l p yf r a c t i o n s ：a d s o r p t i o na f f i n i t ye n t h a l p y ( a h , ) ， d e h y d r a t i o ne n t h a l p y ( a h d ) a n dm o l e c u l a rc o n f o r m a t i o ne n t h a l p y ( a h m ) b ya n a l y z i n gt h e f r a c t i o n so fe n t h a l p y ，e n t r o p ya n dg i b b se n e r g yo ft h ed i s p l a c e m e n ta d s o r p t i o n ，w e d i s c u s s e dt h ee f f e c t so fs a l tc o n c e n t r a t i o n so nt h et h r e ef r a c t i o n so fe n t h a l p y , a n dt h e c o n n e c t i o nb e t w e e nt h e r m o d y n a m i cf r a c t i o n sa n ds u b p r o c e s s e so c c u r r i n gi na d s o r p t i o na n d r e f o l d i n go ft h ep r o t e i n s o m ec o n c l u s i o n sc a nb eo b t a i n e db yt h ea n a l y s i so f0 1 1e q u i l i b r i u ma d s o r p t i o nd a t aa n d t h em e a s u r e d e n t h a l p i e s ：0 ) t h ea d s o r p t i o na m o u n to fn a t i v el y s o z y m ea d s o r b e do n t o h y d r o p h o b i cs u r f a c e sw e r em e a s u r e db yu s i n gt h em e c h a n i c a ls h a k e r t h er e s u l ti st h a tu n d e r l o ws a l tc o n c e n t r a t i o n st h ea d s o r p t i o no fn a t i v el y s o z y m ea p p e a r sn e g a t i v ea d s o r p t i o n ，u n d e r h i g l ls a l tc o n c e n t r a t i o n st h ea d s o r p t i o na m o u n ti sc r e a s i n go b v i o u s l y ( 2 ) u n d e rd i f f e r e n ts a l t c o n c e n t r a t i o n s ，t h ed i s p l a c e m e n ta d s o r p t i o ne n t h a l p yo fn a t i v el y s o z y m ea d s o r b e do n t o h y d r o p h o b i cs u r f a c e sa r ep o s t i v e ，r e p r e s e n t i n ge n d o t h e r m i c t h er e s u l t ss h o wt h a tn a t i v e l y s o z y m el o s si t so r d e r e ds t r u c t u r ea n de x p o s u r ei t s i n t e r i o rh y d r o p h o b i cg r o u pd u r i n g a d s o r p t i o n ( 3 ) t h ea d s o r p t i o n o fn a t i v e l y so n t o t h ep e g - 6 0 0s u r f a c ei nd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f ( n h 4 ) 2 s 0 4s o l u t i o n sa t2 5 ci sa l le n t r o p y d r i v i n gp r o c e s s t h i si sb e c a u s e t h em o l e c u l a rc o n f o r m a t i o ni n t e r a c t i o nw h i c hd u et oc h a n g eo fc o n f o r m a t i o no fn a t i v e l y s o z y m ei sp r e d o m i n e n tc o m p a r e dw i t hh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n ，s u g g e s t i n gt h a ti n c r e a s eo f e n t r o p ya c t sm a i nf u n c t i o n ( 4 ) b a s e do nt h et h e o r yo fs d ta n dc o m b i n i n gw i t ha d s o r p t i o n i s o t h e r m ，w ec a l c u l a t eo u tt h e r m o d y n a m i cf r a c t i o n so fe a c hs u b p r o c e s sa n df i r s t l yi n t e r p r e t t h ec o n t r i b u t i o no fe a c hs u b p r o c e s so ne n t r o p y , e n t h a l p ya n df r e ee n e r g y ( 5 ) t h ev a l u e so fa hm e a s u r e da n d gc a l c u l a t e dc a nb eu s e dt oe x p l a i nt h a tt h ea d s o r p t i o no fn a t i v e l y s o z y m e o n t os u r f a c ei ss p o n t a n e o u sp r o c e s s s u r v e y i n gt h ed i s p l a c e m e n ta d s o r p t i o ne n t h a l p yo fl y s o z y m ew h i c ho r i g i n a l l yh a db e e n d e n a t u r e db y1 8 m o l lg u a n i d i n eh y d r o c h l o r i d e ( g u h c i ) u n d e rs a m ec o n d i t i o n ，t h es t u d y s h o wt h a t ( 1 ) t h ea d s o r p t i o na m o u n to fd e n a t u r e dl y s o z y m ea d s o r b e do n t oh y d r o p h o b i c s u r f a c ei n c r e a s ew i t hi n c r e m e n to fs a l tc o n c e n t r a t i o na n dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n s ( 2 ) w h e n d e n a t u r e dl y s o z y m ea d s o r b e da n dr e f o l d e do n t oh y d r o p h o b i cs u r f a c e ，t o t a ld i s p l a c e m e n t a d s o r p t i o ne n t h a l p yi se n d o t h e r m i ca tl o ws a l tc o n c e n t r a t i o n ，w h e r e a si ti se x o t h e r m i ca th i g h s a l tc o n c e n t r a t i o n ( 3 ) t h ea d s o r p t i o na n dr e f o l d i n go fd e n a t u r e dl y s o z y m ea r es i m u l t a n e o u s p r o c e s s e sd r i v e nb ye n t h a l p yw h i c hc o n s i s to fa d s o r p t i o na f f i n i t ye n t h a l p y ( ah a ) a n d m o l e c u l a rc o n f o r m a t i o ne n t h a l p y ( h m ) a th i g l ls a l t c o n c e n t r a t i o n ，t h eh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o ni s s t r o n g e r t h a n d e h y d r a t i o n ( 4 ) t h ea n a l y s i s o f e n t r o p i e se v a l u a t e db y e q u i l i b r i u ma d s o r p t i o n a m o u n tc o i n c i d e sw e l lw i t ht h a to f e n t h a l p i e s m e a s u r e d b y m i c r o c a l o r i m e t r i c ，w h i c ha c c o r d sw i t ht h ec o n c e p to fe n t h a l p y e n t r o p yc o m p e n s a t i o n t h a t i st h ed e c r e a s eo fe n t r o p yw i t hs a l tc o n c e n t r a t i o ni n c r e m e n tc a nb cc o m p e n s a t e db yt h em o r e e x o t h e r m i ce n t h a l p y m i c r o c a l o r i m e t r i cs t u d yo fa d s o r p t i o no fp r o t e i no n t ol i q u i d s o l i di n t e r f a c ei si m p o r t a n t a n db e l i e v a b l ef o rs u r v e y i n gp r i n c i p l eo fa d s o r p t i o na n dr e f o l d i n go fp r o t e i n u s i n gd a t ao f d i s p l a c e m e n ta d s o r p t i o ne n t h a l p ym e a s u r e dd i r e c t l ya n dc o m b i n i n gw i t ht h e o r yo fs d t , t h e t h e s i sd i v i d et h ep r o c e s so fd i s p l a c e m e n ta d s o r p t i o ni n t ot w ot h e r m o d y n a m i cf r a c t i o n s ：n e t a d s o r p t i o no fs o l u t ea n dn e td e s o r p t i o no fs o l v e n t ，w h i c hp r i m e l ye x p l a i ns u b p r o c e s s e sd u r i n g a d s o r p t i o no fp r o t e i n z h e n gm e i t o n 甙e n v i r o n m e n t c h e m o c a le n g i n e e r i n 曲 d i r e c t e db yp r o f e s s o rg e n gx i n p e n g k e yw o r d s ：m i c r o - c a l o r i m e t r y , d s c ，l y s o z y m e ，a d s o r p t i o n ，l i q u i d s o l i di n t e r f a c e ， d i s p l a c e m e n ta d s o r p t i o ne n t h a l p y 学位论文知识产权声明 本人完全了解西安工程科技大学有关知识产权的规定，即；研究生在校攻读学位期 间学位论文工作的知识产权归属西安工程科技大学。本人保证毕业离校后，使用学位论 文工作成果或用学位论文工作成果发表论文时署名单位仍然为西安工程科技大学。学院 有权保留送交的学位论文的复印件，允许学位论文被查阅或借阅；学校可以公布学位论 文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名：差改皋 指导教师签名 取铉鹏 日 期：”7 卑弓田 、 学位论文独创性声明 禀承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明：所呈交的学位论文是我个人在 指导教师指导下进行的研究工作所取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注 和致谢的地方外，学位论文中不包含本人已申请学位或他人已申请学位或其他用途使用 过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了致谢。 学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名：鸟差檠 指导教师签名：雨之铉鹇 f t期：刈7 驴；。2 - 第一章绪论 1绪论 1 1 本课题的研究目的及意义 本课题的主要任务是用摇床法和精密微量热法测定不同硫酸铵( n h 4 ) 2 s 0 4 ) 浓度 下天然( 变性) 鸡蛋白溶菌酶( l v s ) 在高效疏水相互作用色谱( h p h i c ) 填料( 端基 p e g 6 0 0 ) 表面置换吸附时的吸附量( f ) 和总焓变( a h ) 。目的是通过直接测量天然( 变 性) 蛋白在液固界面上的置换吸附焓，得到蛋白在疏水表面上吸附时的焓变、熵变、 自由能变及其热力学分量，探讨盐浓度的变化对蛋白在疏水色谱填料表面的吸附行为的 影响，找出盐浓度与液固界面蛋白吸附的置换吸附热效应和自由能之间的关系。 关于蛋白折叠，至今仍然存在着两个悬而未决的问题：一是对应干折叠过程中自由 能最低的中间态，另一个是对应于在折叠途径中潜在的能垒”1 。因此研究蛋白吸附折叠 中的能量变化问题就显得尤为重要。而蛋白在液固界面上的置换吸附焓的研究正是从 能量角度来探讨蛋白吸附折叠规律及特性这一前沿课题极其重要也是最直接的一条途 径。本文通过对液固吸附的单元体系吸附量的测定，结合相同研究条件下蛋白置换吸 附热效应的测定，探讨在蛋白吸附折叠过程中各种相互作用力的大小和从属地位关系， 为从分子水平上研究蛋白折叠机理提供重要的信息，对研究蛋白折叠规律很有价值。盐 浓度和蛋白浓度变化对蛋白吸附折叠影响的研究对于选取合适的蛋白复性条件将起到 直接的指导作用，对基因工程产品的生产和纯化具有重大意义。 1 2 国内外研究现状 蛋白质在界面上的吸附是众所周知的现象，因此近年来报到的关于蛋白在液固界面 上的吸附研究不断涌现。n o r d e 和f a v i e r _ 【2 】利用圆二色性光谱( c d ) 测量了鸡蛋白溶菌 酶和牛血清蛋白吸附在分散的硅粒子前后的a 螺旋含量，发现吸附后蛋白质的二级结 构含量减少，蛋白分子的稳定性越低，a 螺旋含量的被破坏量就越增加。j o sb u i j s 和 v l a d i m i r h l a d y 3 l 应用全内反射荧光法( t 1 r f ) 考查了溶菌酶和生长激素蛋白在固体表面 上的吸附动力学行为和构象变化，结果表明溶菌酶的吸附受到离子强度的影响，而生长 激素蛋白的吸附则受到疏水作用的强烈影响，但是这两种蛋白与疏水性表面之间都有较 强的吸附亲和作用，吸附后蛋白形成了较为松散的构象。j r l u 等1 4 l 应用中子反射方法 ( n r ) 研究了在疏水性液固界面上吸附的溶菌酶的变性，发现溶菌酶在疏水表面上的 吸附导致了蛋白分子的疏水碎片的暴露，蛋白和吸附剂之间的疏水作用和静电作用使蛋 白发生了变性，吸附层的厚度表明变性蛋白的吸附方式为疏水性氨基酸侧链接触三氯矽 烷( o t s ) 表面，亲水性侧链则伸向溶液中。n a t a s c h a b r a n d e s 等1 5 1 利用差示扫描量热法 ( d s c ) 和傅立叶红外光谱法( f t i r ) 测定了牛血清蛋白、溶菌酶和牛血清纤维蛋白 从溶液体系吸附到陶瓷颗粒上时的转移焓，结果发现蛋白的吸附降低了蛋白结构的稳定 第一章绪论 性，转移焓随着q 一螺旋结构的减少而减少。t s u e uj us u 等 6 1 同样利用中子反射法( n r ) 考查了溶菌酶在硅一水界面上的吸附，他们认为吸附过程是一个不可逆过程，表面剩余 量取决于溶菌酶分子之间的静电斥力，而不是溶菌酶分子与吸附剂之间的吸引力。 n o r d e 7 1 研究了溶菌酶和牛乳蛋白这两种球状蛋白的吸附，发现溶菌酶在疏水表面上吸附 时保留了其大部分三级结构，但是牛乳蛋白则失去了几乎全部天然构象，原因有可能是 因为吸附使得牛乳蛋白疏水碎片暴露。s a m i ru s a n ei s j 等探讨了蛋白在色谱表面上的结 构微扰现象，认为与溶液中的蛋白结构相比，反相载体色谱上的吸附态蛋白分子的二级 结构受到了明显的结构微扰，微扰程度随着吸附态蛋白浓度的降低而降低。a m a l z e r t 等1 9 】研究了p e g 与溶菌酶之问的相互作用，发现尽管p e g 可以使水分子发生重排，但 蛋白质的二级结构和三级结构没有发生变化。 关于在液固界面上蛋白折叠、自由能的测定的微量热研究的报道目前也层出不穷。 n a r al a l m e i d a 等1 1 0 l 所作的等温滴定量热实验表明了液固混合时的焓变为正值且逐渐增 加，暗示了吸附为疏水作用驱动的熵增过程。h a n s j f i r g e nh i n z i “j 应用差示扫描微热量 计( d s c ) 测得鸡蛋白溶菌酶的平均热变性转变温度为3 3 1 2 k ( 数值的变化介于3 2 9 4 k 至3 3 1 9 k ) ，平均变性转变焓为4 0 5 k j m o l ( 数值介于3 3 7 k j m d 至4 3 9 k j m 0 1 ) 。k a n gs u n g k i m 等1 1 2 】用d s c 和圆二色仪研究了在不同p h 值，热及盐浓度条件下大豆球蛋白的构象 变化情况，结果表明无盐条件下当p h = 4 5 时蛋白构象最稳定，变性温度和变性焓分别 为9 3 5 和1 8 1 j 僖当p h 值增加至9 5 时变性温度和焓变逐渐减小；这是由于盐的存 在中和了蛋白氨基酸残基侧链的荷电基团，使蛋白质链内和链问的排斥力减小的缘故。 t z o u n g r a n a 和w n o r d e i ”j 研究了a 糜蛋白酶在聚苯乙烯的热力学稳定性和活性，发现 吸附导致了生物活性的丧失；d s c 实验表明了在吸附后，变性焓降低了，但变性温度没 有改变，有可能是因为蛋白构象的改变和被吸附蛋白分子的分布非均匀性造成的。 w e n y i hc h e n1 1 4 1 等人研究了肌红蛋白在疏水吸附剂丁基和辛基琼脂糖上的吸附行为， 发现其在两种疏水性吸附剂的保留值和吸附亲和力都随着硫酸铵浓度的增大而增大，但 是等温滴定微量热实验所测定的吸附焓变却随盐浓度增加而减小，他们认为这是由于盐 浓度的增加，去水合热减小，疏水作用亲和热增加所引起的结果。a o n e n gc a o 等【15 j 利 用d s c 在一个很宽的p h 值范围内( 从1 5 至9 4 ) ，研究鸡蛋白溶菌酶的热变性和复性， 结果发现热变性温度( t m ) 与鸡蛋白溶菌酶缓慢再折叠速率的对数l n k 2 成线性关系。 定量的表达固体表面对蛋白吸附折叠贡献的一个直接的途径是使用微量热的方法 对蛋白折叠的焓变a a h 进行测量，从而进一步获得蛋白折叠的自由能a a g 。b u r o v a t 等 【16 j 用高灵敏度的d s c 通过测冻干的鸡蛋白溶菌酶在1 0 1 5 0 c 温度范围内的协同型转移 焓及热容后，获得转移自由能，揭示了溶菌酶折叠构型的稳定性。h e l e nl a r s e r i c s d o t t e r 等1 17 】将氢同位素交换法( h d ) 与质谱法和d s c 实验相结合，测定了溶菌酶在硅粒子上 2 2 第一章绪论 吸附时的焓变及自由能变，结果表明吸附行为导致了变性焓逐渐减小，溶液中蛋白质与 吸附态蛋白质的吉布斯自由能变数值大致相同，这暗示了吸附后体系的熵值是增加的， 并且熵值的增加与焓变的减小是互相补偿的，h d 实验结果发现溶菌酶以不同的动力学 方式展现了两种不同的结构单元，其结构稳定性差值大约为8 1 d m o l 。t a k a n ok 等1 1 s 】 用d s c 研究了转折结构处删去或代入氨基酸残基的6 种突变( 变异) 溶菌酶，来考查 球形蛋白在转折处的形态稳定性和折叠时氨基酸残基的作用，结果发现转折处的结构可 改变主链的构象，转折处取代残基采取左旋的构象在能量上是有利的。近来，虽然由色 谱法实验测定了固液界面蛋白折叠自由能【1 9 l ( 即平衡常数法) ，但仍需量热验证。西北 大学张静i2 0 】用色谱法测定了n 一淀粉酶的折叠自由能，发现液固界面的蛋白折叠自由能 比在溶液中高出许多，且认为蛋白折叠路径中有中间体存在，并提出了能垒和能阱的概 念以解释折叠路径可能由动力学控制的猜测。张会芳1 2 l j 用精密微量热法测定了2 5 不 同盐酸胍浓度下的变性溶菌酶在疏水色谱表面的折叠焓变，发现在1 8 m o l l 盐酸胍浓度 时置换吸附焓变最小，折叠焓变最大，认为溶菌酶可能在此变性剂浓度下发生了构象突 变，暗示了复性过程中确有能量最低的中间态存在，证实了蛋白折叠动力学和热力学中 提出的蛋白折叠中间体确实存在。 关于界面上蛋白相互作用的研究，肖厚荣等【笠】研究了经盐酸胍变性的烟草多酚氧化 酶的复性，结果表明在蛋白质复性过程中，蛋白分子之间内的疏水作用可促进蛋白质正 确折叠成天然活性状态，而肽链部分折叠的分子之间的疏水相互作用则导致蛋白质形成 无活性的聚集体，影响蛋白质的复性。高莹等【冽利用蛋白质结构数据库( p d b ) ，以其开 发的从蛋白质结合部位推导出其界面所具有的疏水性质和氢键性质的计算程序p p - s i t e 为基础，对蛋白质一蛋白质相互作用界面进行了统计分析。结果表明界面大小、氢键和 疏水相互作用在界面所占比例以及疏水相互作用的集中程度可以作为分类的依据。 w e n y ic h e n 1 等利用等温量热法研究了溶菌酶与固定金属离子的相互作用，结果发现 高p h 值，高盐浓度下，溶菌酶与c u ”之间的去水合作用要小于溶菌酶与f e ”之间的作用。 s h i n g ok a t o l 2 5 】等在研究溶菌酶直接折叠过程时认为折叠过程是受成核作用控制的。来 鲁华【2 6 l 等研究了溶菌酶在有机溶剂中的折叠行为，发现1 1 砸( 三氟乙醇) 能显著改变折 叠路径，有机溶剂通过改变蛋白侧链与有机环境间的疏水作用影响蛋白的变性温度t 二。 w i l l e mn o r d e l 2 7 1 等研究了羧基化的溶菌酶和未修饰的溶菌酶在硅酸盐表面吸附时静电 作用的影响时发现经羧基修饰后的溶菌酶带电数量和结构稳定性均发生了变化。当蛋白 和吸附剂之间静电排斥时，吸附量随着离子强度的增加而增加；而静电吸引时，吸附量 随着离子强度的增加而减小。同时对吸附在固体表面的溶菌酶进行了质子滴定实验，发 现其滴定曲线与蛋白在固体表面的覆盖程度有关，说明界面电势对蛋白吸附有一定的影 响1 2 a l 。w e n y i c h e n 等p l 用等温滴定微量热法研究了a 胰凝乳蛋白酶原在琼脂糖凝胶吸 第一章绪论 附剂上的保留，发现随着温度的升高，蛋白与丁基琼脂糖凝胶的之间的相互作用从吸附 占优势转变为分配占优势，但是蛋白质与辛基一琼脂糖凝胶之间的相互作用则一直是分 配占主导地位。 溶菌酶在疏水表面吸附等温线的研究，不仅能为测量蛋白置换吸附焓变和自由能变 提供必须的吸附量，而且能为从分子水平上了解蛋白吸附机理提供重要的信息。现有的 吸附等温线的研究报道均为色谱法研究i 刈，但色谱中流动相是连续的，而量热实验是一 系列单元操作，为了解决量热实验中蛋白吸附量的计量，需要用摇床法测定蛋白的吸附 等温线，而目前还无采用此法对蛋白吸附量进行研究的报道。在液固界面吸附中，常 见的吸附模型有l a n g m u i r 方程，f r e u n d l i c h 方程和溶质吸附计量置换模型( s d m a ) ， 但是s d m - a 要远远优于l a n g m u i r 和p r e u n d l i c h 模型。边六交【3 l 】等研究了疏水界面上 标准蛋白质的吸附等温线，发现用吸附计量置换模型( s d m a ) 的关系式能很好描述7 种模型蛋白的吸附行为。我们1 3 2 j 对液固体系中疏水介质填料的蛋白吸附实验也进行了 s d m a 拟合，得到了好的相关性( 线性相关系数大于o 9 8 ) ，再次证实了模型的适用性。 本课题选择鸡蛋白溶菌酶为模型蛋白，探讨盐浓度和蛋白浓度变化对天然及变性蛋 白置换吸附焓变的影响。硫酸铵作为一种亲水感胶盐，其浓度的微小差异将导致蛋白在 填料表面保留的巨大变化，因此本课题的研究有助于寻找蛋白折叠自由能与蛋白复性规 律之间的关系，本课题的研究成果对于基因工程蛋白药物产品的生产与纯化也具有一定 的指导意义。此外，量热法能直接、精密而准确地描述液固吸附体系中蛋白在折叠复性 过程中的能量变化，其置信水平之高也是其它方法难以比拟的。这对于实际蛋白药物的 复性和纯化将起到直接的指导作用。 1 3 溶液中蛋白质分子构象的研究方法 蛋白质分子采取什么样的构象，主要取决于蛋白质的一级结构，其次决定于侧链与 水分子之间的相互作用。蛋白质分子构象还明显地依赖于蛋白质的溶剂环境，如温度、 离子强度、盐浓度或p h 的微小变化。在生物学中，研究蛋白变性及其分子构象变化的 方法很多，尤其是研究蛋白质分子构象的方法可以包括两大类：一类是测定溶液中的蛋 白质分子构象，另一类是晶体蛋白质的分子构象。在此将主要研究方法予以简要介绍： ( 1 ) 旋光性( 应用圆二色仪测定蛋白二级结构的变化) ： 圆二色仪在分子生物学中领域的最大应用是测定生物大分子的空间结构。研究蛋白 质的主链构象变化可用远紫外光谱。在远紫外区，一般天然蛋白质的c d 光谱包含一个 正峰( 1 9 0 n m 波长左右) 和一个副槽( 2 0 5 2 3 5 n m 波长范围) 。其中，副槽的形状与主 链构象密切相关。因此利用该c d 光谱可以推算蛋白质分子的a 一螺旋、b 一折叠、b 一转 角及无规则卷曲的含量。 ( 2 ) 核磁共振技术n m r ( 测定一定h 原子化学环境的变化) ： 第一章绪论 5 0 年代开始应用核磁共振法研究溶液中蛋白分子构象，8 0 年代取得了重大突破。 利用n m r 可测定溶液中接近于生理状态的蛋白构象和蛋白作用的动力学过程，研究各种 因子，如温度、变性剂等队蛋白质分子构象变化的影响，还可以研究底物、产物、抑制 剂、辅基、效应物与酶分子构象的相互作用，以获得活性中心或结合部位的结构信息； 此外，还可以用来研究相同或不同蛋白质分子之间的相互作用以及蛋白质与核酸分子之 间的相互作用；也可测定蛋白可变形尾部的构象，它往往和蛋白的活性功能紧密相关； 它的优点在于n m r 是一种非损伤性测定技术，对样品无破坏作用。 ( 3 ) 紫外和荧光( 测定色氨酸环境的变化) ； 蛋白质由于芳香族氨基酸侧链，如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和含硫氨基酸等残基 对光的吸收而产生紫外光谱。根据这些生色基团紫外差示光谱所提供的信息，可以推断 溶液中蛋白质分子的大致构象；可以推断这些残基是位于分子的表面还是内部，是处于 极性环境还是非极性环境，其数量是多少；还可以检测和跟踪蛋白质分子中和无规则卷 曲相互之间的构象转化过程。王海人等。2 3 利用紫外吸收光谱法研究了苯甲酸钠与牛血清 蛋白( b s a ) 的体外相互作用。研究表明，苯甲酸钠的加入使b s a 主链螺旋结构变得松散 魏晓芳等埽0 用紫外光谱研究了p l t 2 3 - 1 1 3 的范围内b s a 芳香氨基酸残基微环境的变 化，碱诱导蛋白空间构象充分伸展，将更多的疏水性氨基酸残基暴露于溶剂中。 荧光光谱法是研究水溶液中蛋白质分子构象的一种新方法。有两种途径：一条是测 定蛋白分子的自身荧光：另一条是向蛋白质分子的特殊部位引入探测剂，然后测定荧光 探测剂的荧光。由于蛋白质自身的荧光强度较弱，测定比较困难，现在常用外源荧光法 来测定蛋白质分子的疏水微区，二基团之间的距离，以及酶与底物结合过程中的蛋白质 分子构象变化等。 ( 4 ) x 射线衍射技术； x 射线波长小于原子问间距和分子间距，但是又基本在同一数量级，可用于了解原 子和分子的排布及其有序度等信息。目前测定生物大分子的结构，x 射线衍射技术是最 有效的方法。x 射线衍射技术不但可以确定晶体中烃链的组合状态，而且可以确定二级 结构的晶型和晶格纬度，测定分子量可大于几百万。同时，这项技术可以测定蛋白质分 子的静态构象，构象变化的始态和终态，以及一些稳定中间态。但是它不能测定过渡的 中问态。l a r b r i g h t 等1 报道了分辨率为2 0 的异三聚体g 蛋白结构模型，该研究表明 亚a 基中三个开关区在活化和钝化状态时的不同构象。t e s m e r 等”测定了腺苷酸化酶 复合物的2 3 分辨率的晶体结构，结果给出了有关两个信号蛋白质分子在质膜上相互作 用的三维图象，并提出了g 蛋白a 亚基激活腺苷酸环化酶的分子机制 ( 5 ) 氢同位素交换法； 氢同位素交换法是测定溶液中蛋白质分子结构含量的重要实验手段。蛋白质分子中 5 第一章绪论 可交换的氢原子分为两大类：氢键中的氢原子与d z 0 或h ：0 中的d 或舶交换速度较慢； 非氢键的可交换的氢原子与d 2 0 或h 2 0 中的d 或3 h 交换速度较快。氢同位素交换法的核 心就在于测出上述慢交换氢的数量，从而计算出氢键的数量以及a 一螺旋与6 一折叠的含 量之和。 上述各种方法均是从不同侧面来表征蛋白质的变性程度和分子构象的变化，但无论 哪一种仪器或手段都无法完全取代其他仪器或手段，要全面深入地研究生物大分子必须 依赖于多类仪器的综合使用。 1 4 本文研究的内容 以天然( 变性) 鸡蛋白溶菌酶为研究对象，选择与能同时进行复性和分离的高效疏 水相互作用色谱相同的条件，通过摇床法测定2 5 溶菌酶在不同硫酸铵盐浓度和蛋白质 条件下的吸附等温线，讨论了盐浓度和蛋白质的变化对溶菌酶吸附量的影响。 在2 5 不同硫酸铵盐浓度条件下，通过m i c r od s c i i i 微热量计测定了天然( 变性) 溶菌酶在液固界面的总的置换吸附焓a h i ，并结合吸附等温线的数据计算出相应的置换 吸附的焓变、熵变及总自由能变a g 的热力学分量，探讨了盐浓度和蛋白质浓度变化对 蛋白吸附过程中各次级过程的影响以及在吸附过程中各种作用力如何共同支配蛋白的 吸附折叠行为，从热力学观点对天然蛋白的吸附机理作出解释。 通过上述研究旨在阐明在液固体系这样一个多因素交叉的环境中，盐浓度和蛋白浓 度变化对蛋白在疏水吸附剂表面折叠吸附的影响，探讨吸附条件对不同吸附状态的蛋白 构象的影响，进而对蛋白的吸附折叠规律进行说明。 6 第2 章理论部分 2 理论部分 2 1 生物化学中的微量热法 大多数过程，不管是物理的、化学的或生物的，都伴有热的释放或吸收。其热量与 这个过程的程度有关，而且这个热量的数值是与释放或吸收的速度成比例的。因此，量 热法不仅在热力学工作上中是重要的，而且还可以作为一般的分析工具应用于物理、化 学及生物上。量热法在生化研究中的优点也是显而易见的，可用于复杂的生理系统，且 不干扰生物体系，既不需追加试剂又不必引入放射性。另外，微量热方法与分光光度方 法不同，不必要求澄清的样品，可直接检测非透明系统，如组织、土壤、细胞悬液或生 化粗悬液。因此，它已不仅仅是作为一种热力学研究的手段，而且也被广泛用于生物反 应热力学的研究。作为一种生化检测新技术，它正以其特有的优越性显示其广泛的应用 前景。 微量热计的主要类型及基本原理常用的量热方式有三种。第一种是绝热式量热计， 是直接测定产热过程的温度升高，即在一个绝热系统中，温度的升高将等于输入的热量 被这个系统的热容量来除。因此，如果已测出温度的变化，且己知这个系统的表观热容 量，则可算出伴随这个过程的热变化。属于这一类型的量热计：绝热式( i s o p e r i b 0 1 ) 量热计、t r o n a c 滴定量热计及l k b 8 7 0 0 量热计系统。 第二种是测定热效应产生的热流速度。常用两种程序来测定这个热流。一是通过一 个反馈系统来控制p e l t i e r 热一冷装置，即用一个热敏元件监测温度变化，当温度改变 时，便有一个电流加到p e l t i e r 装置上，以保持溶液恒温。实验期间，输入到装置上的 总能量便等于此反应的热效应。二是直接使用p e l t i e r 装置或类似的温差敏感器，在该 装置内产生的电压与产生的热流成比例。 第三种是改变一个系统的温度来起动一个反应或干扰它们的温度平衡位置。如加热 升温将一个系统调节到一个新的热平衡位置，这种温度的漂移直接与此系统的热容量有 关。而热容量的直接测定可以提供化学平衡变化的信息，并可解释这个过程的焓变。差 示扫描量热计( d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t e r ) 便是这一类型。 差示扫描量热法分为功率补偿型( p o w e rc o m p e n s a t i o n ) 和热流补偿型( h e a tf l u x ) ， 两种类型的测试原理如下所述。 功率补偿型：在样品和参比始终保持相同温度的条件下，测定为满足此条件时样品 和参比品两端所需的能量差，并直接作为信号q ( 热量差) 输出。本文测定液固界面 置换吸附热效应的m i c r o d s c i i l 生物量热计即是根据功率补偿型原理设计的。 热流补偿型：在给予样品和参比相同的加热速率条件下，因热容差异样品和参比两 端产生温差t ，然后根据热流方程，将t ( 温差) 换算成q ( 热量差) 作为信号输出。 7 第2 章理论部分 蛋白质分子三维结构处于热力学平衡态，它从一种构象转变成另一种构象总是伴随 着能量的变化，d s c 法正是利用这些热效应来测量转变过程中的能量变化以及相变温度 等热力学性质。用d s c 可测定热力学意义上的结构稳定性参数，并可用热力学的标准验 证生物大分子的结构模型【矧。另外，从生物大分子热变性的d s c 曲线上，可以得出有 关大分子结构稳定程度的系列热力学及分解动力学参数。d s c 可进行动态( 程序控温) 跟踪扫描，也可以对生物系统进行静态( 恒温式的) 连续测定。 球蛋白和胶原蛋白热变性的d s c 曲线