（微生物学专业论文）产共轭亚油酸植物乳杆菌的筛选及发酵工艺研究.pdf

摘要 摘要 近年来共轭亚油酸( c l a ) 作为一种新型的具有广泛生物活性的脂肪酸而备 受关注，在抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、强化免疫和促进生长等方面效果良好， 被广泛应用于医药、食品添加剂和保健品行业。目前工业上主要采用化学法生 产c l a ，难以满足药品、食品和饲料领域的高纯度、无有害成分残留的要求。 本论文以从食品中筛选出产c l a 的乳酸菌菌株和提高其产c l a 量为目的，建立 了c l a 含量测定方法，并对所筛选菌株的培养基和发酵培养条件进行了优化， 主要研究内容和结果如下： 1 从酸菜汁、原牛乳和酸奶中筛选出若干产c l a 疑似菌株，建立c l a 的紫 外检测方法，检测发现产c l a 较优菌株3 株来自酸菜汁( l j 0 5 、l j 1 2 、l j 4 1 ) ， l 株来自原牛孚l ( l j 一4 3 ) ，1 株来自酸奶( l j 5 3 ) ，菌株l j 0 5 的产c l a 水平最高。利 用气相色谱法对菌株l j 0 5 的产物进行分析，在所产脂肪酸产物中9 c ，1 1 t c l a 和 1 0 t ，1 2 c c l a 的相对含量分别为o 8 1 和1 7 9 ，9 c ，1 i t c l a 和1 0 t ，1 2 c c l a 分别占 所产c l a 的3 1 1 5 和6 8 8 5 。 2 利用传统的生理生化方法对菌株u 0 5 进行初步鉴定，再通过b i o l o g 微生 物自动鉴定仪进行到种的鉴定，对鉴定结果进行比较分析，最终岛猢朋为 植甥嚼湘落陋鲫0 6 批础溉切勃功。 3 通过正交实验和响应面分析方法研究植物乳酸杆菌l j 0 5 发酵生产c l a 的优化培养基配方和生成c l a 的最佳发酵工艺条件。得到的最优培养基组合为： 葡萄糖4 、蛋白胨1 、牛肉膏l 、酵母膏1 、柠檬酸氢二铵0 2 、乙酸钠0 5 、 磷酸氢二钾0 2 、硫酸镁0 0 4 、硫酸锰0 0 2 5 ；最佳发酵工艺条件为：静置限 氧培养条件下，l a 乳化液添加量0 2 3 、接种量3 9 5 、初始p h 值7 3 、温度3 6 。c 下培养3 6 d 时。植物乳杆菌l j 0 5 的c l a 产量由优化前的3 6 5 1 l a g ( m l 发酵液) 提 高至l j 5 1 0 9 t g ( m l 发酵液) ，产量增长3 9 9 3 ，有较大幅度的提高。 关键词：共轭亚油酸；檀甥啪茵筛选；鉴定；发酵工艺条件 i i a b s t r a c t a b s t r a c t c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ( c l a ) h a v er e c e n t l ya t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o na sa n o v e lt y p eo fb i o l o g i c a l l yb e n e f i c i a lf u n c t i o n a lf a t t ya c i d s s o m ei s o m e r so fc l a w e r er e p o r t e dt or e d u c ec a r c i n o g e n e s i s ，a t h e r o s c l e r o s i sa n db o d yf a t ，e n h a n c e o r g a n i s mi m m u n i t ya n dp r o m o t eg r o w t h c l a h a sb e e nw i d e l yu s e di nh e a l t hc a r e a n dp r o d u c t i o no ff o o da d d i t i v e t h ec h e m i c a la p p r o a c h e st os y n t h e s i z i n gc l a ， h a v eb e e ns t u d i e de a r l ya n dt h o r o u g h l yi ni n d u s t r yf i e l d s ，h o w e v e r ，t h er e s u l t i n g c l ap r o d u c tc o n t a i n e dt o x i cs u b s t a n c e s ，t h ec o s t so fp r o d u c tp u r i f i c a t i o na n du s ei n al a r g ea m o u n tw e r et h u sv e r yh i g h i nt h i sr e s e a r c h ，w es c r e e n e dl a c t i ca c i d b a c t e r i u ms t r a i n sw i mh i g hc l ap r o d u c i n gc a p a c i t yf r o mf o o da n do p t i m i z e dt h e f e r m e n t a t i o nm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sb a s e do nt h ef a s td e t e r m i n a t i o n m e t h o do fc l a ，a n dt h er e s u l t so ft h i sp a p e ra r ea sf o l l o w i n g ： 1 s e v e r a ls t r a i n sp o s s i b l ep r o d u c i n gc l aw e r es c r e e n e df r o mf e r m e n t a t i o n c h i n e s es a u e r k r a u tj u i c e ，l a c t o b i na n dy o g u r t t h r e es t r a i n sp r o d u c i n gc l aw e r e s c r e e n e df r o mf e r m e n t a t i o nc h i n e s es a u e r k r a u tj u i c e ，a n do n es t r a i n sw e r es c r e e n e d f r o ml a c t o b i na n dy o g u r tr e s p e c t i v e l yb yu s i n gu vs p e c t r o p h o t o m e t r ym e t h o d s t r a i nl j - 0 5 ，h a v et h eh i g h e s tc l ap r o d u c i n gc a p a c i t y c l ap r o d u c e db ys t r a i n u 一0 5c o n t a i n s3 2 1 5 c i s 9 ，t r a n s l1 - c 1 8 ：2i s o m e ra n d6 8 8 5 t r a n s l 0 ，c i s l 2 c 1 8 ：2 i s o m e r , a n dt h er e l a t i v ea m o u n to fc i s 9 ，t r a n s11 - c 18 ：2a n dt r a n slo ，c i sl2 c18 ：2 i s o m e ri ne x t r a c ta r e0 81 a n d1 7 9 d e t e c t e db yg a sc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d 2 i d e n t i f ys t r a i nl j 一0 5b yp h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r ya p p r o a c h e s ，t h e n i d e n t i f ys t r a i nl j 一0 5b yb i o l o gm i c r o b i a li d e n t i f i c a t i o ns y s t e m ( b m i s ) ，c o m p a r e m e r i ta n dd e m e r i to ft h i st w oi d e n t i f i c a t i o nm e t h o d ，a n ds t r a i nl j 一0 5w a si d e n t i f i e d a sl a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u mf i n a l l y 3 t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n st op r o d u c ec l ao f l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ml j 一0 5w e r es t u d i e db yu s i n go r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n d r e s p o n s es u r f a c em e t h o d t h eo p t i m u mm e d i u mc o n s i s t e do fg l u c o s e4 ，p e p t o n e 1 ，b e e fe x t r a c t1 ，y e a s te x t r a c tl ，d i a m m o n i u mc i t r a t e0 2 ，s o d i u ma c e t a t e o 5 ，d i p o t a s s i u mh y d r o g e np h o s p h a t eo 2 ，m a g n e s i u ms u l f a t e0 0 4 ，m a n g a n e s e i i i a b s t r a c t s u l f a t e0 0 2 5 ：t h es u i t a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n st o p r o d u c e c l ao f l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ml j - 0 5w e r e ：l ae m u l s i o n l i q u i l d0 2 3 ，t e m p e r a t u r e 3 6 c ，i n i t i a lp h7 3 ，i n o c u l u ms i z e3 9 5 ，t h eb e s tf e r m e n t a t i o nt i m ew a s3 6 hu n d e r s t a n d i n ga n d m i c r o a e r o b i cc o n d i t i o n t h ey i e l do fc l a p r o d u c e db yl a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u ml j - 0 5r e a c h e d5 10 9 1 a g ( m lf e r m e n t a t i o nl i q u i d ) u n d e rt h eo p t i m i z e d m e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ，w h i c hw a s3 9 9 3 h i g h e rt h a nt h a to ft h e o r i g i n a ls t r a i n k e y w o r d s ：c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ( c l a ) ，l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m , s c r e e n i n g ， i d e n t i f i c a t i o n ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n i v 学位独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：哆肄江签字日期：硝年二月劭咱 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南昌太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名( 手写) ：卜参h 导师签名( 手写) 签字日期：矽嗜年j 2 月谚日 签字日期：蚪年心月7 日 第1 章绪论 1 1 共轭亚油酸的概述 第1 章绪论 共轭亚油酸( c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ，c l a ) 是一系列含有共轭双键的十八碳二 烯酸的位置和几何异构体的总称，分子式为c h 3 ( c h 2 ) 5 ( _ h = c h - - c h = c h - ) ( c h 2 ) 7 c o o h ，分子量2 8 0 。它可以看成是人体必需脂肪酸亚油酸( 1 i n o l e i c a c i d ，l a ，9 c ，1 2 c 十八碳二烯酸) 的次生衍生物，这些异构体的共同特征是两个双键 直接通过一个单键连接，没有被亚甲基隔开。按化学结构理论来说其主要 位置异构有四种即8 ，1 0 、9 ，1 1 、1 0 ，1 2 和1 1 ，1 3 ，而每种位置异构又有4 种几何异 构体，这样c l a 的异构体数量就非常多，但事实上无论是天然的还是人工合成 的c l a 都以9 c ，1 l t 、9 t ，1 1 t 、1 0 t ，1 2 c 1 0 t ，1 2 t 一等4 种异构体为主要存在形式【1 卅， 其结构式如图1 1 所示。 0 c ga 2 l ah o 。c 、。 - 。 c c ￥ 鹊t 1 f 冀ll l 窖c ，11 t c l a h o k 一、磊i 泰 讹1 玲c l a h o & ， 器毁，v 图1 1l a 与c l a 的结构示意图 f i 9 1 1t h es t r u c t u r ef o r m u l ao f l aa n dc l a c l a 是天然存在于生物体内的活性物质，天然c l a 以9 c ，1 l t - c l a 和 1 0 t ，1 2 c c l a 为主要组成成分普遍存在于人和动物体内，人乳和体液就含有微量 的c l a ，具有较高生物活性的c l a 主要来源于瘤胃动物的乳脂和肉制品中( 2 5 ls m g g ) ，牛奶、黄油、天然乳酪中亦含较多c l a ( 3 6 7 o m g g ) ，天然植物油中 几乎不存在具有生理活性的两种c l a 异构体【5 吲。多项研究表明，c l a 活性强、 安全无毒、无副作用，是近年所发现的最重要的天然活性脂肪酸之一，将对人 类健康产生积极的影响【7 - 引。 第1 章绪论 1 2 共轭亚油酸的生理功能与应用 近年来，c l a 在人体和动物健康方面的作用越来越受到关注，并逐渐成为 生物保健和疾病治疗研究的新热点和创新领域，被世界公誉为“2 l 世纪的新型营 养素”，1 9 9 6 年美国国家研究委员会( n r c ) 把c l a y 0 为唯一具有抗癌作用的动物 源脂肪酸，1 9 9 9 年美国油脂化学家协会( a o c s ) 将“c l a ”正式确认作为这一大类 生理活性脂肪酸异构体的英文缩写。c l a 有可能成为未来人类健康食用油脂的 一个重要发展方向。c l a 具有广泛的生物活性功能主要包括：抗肿瘤、预防糖 尿病、抗动脉粥样硬化、强化免疫、促进生长、改善肉品质、抑制脂肪沉积、 改善体质、治疗肥胖、调节骨组织代谢等。 1 2 1 抗肿瘤作用 国外学者对c l a 的抗肿瘤作用和机制进行了比较广泛和深入的研究，为人 类对癌症的预防与治疗提供了较好的理论支持。研究表明多不饱和脂肪酸一般 通过去饱和和碳链延长作用生成各种廿碳烷如前列腺素、凝血恶烷和白三烯， 这些物质影响许多生物化学途径【9 】。研究初步证实c l a 能影响肿瘤细胞的转移特 性，在一定程度上抑制人m d a m b 4 6 8 孚l 腺癌细胞、小鼠乳腺癌细胞系d u l 4 5 和 人前列腺癌细胞在动物体内的转移，诱导癌细胞凋亡，并抑制癌细胞的生长。 c l a 的抗癌作用机制亦有可能是通过与其它的脂肪酸竞争细胞膜磷脂，调节廿 碳烷合成，抑制衍生自花生四烯酸的类二十烷合成的能力，改变细胞信号传导 来实现【l0 1 。各项动物实验证明c l a 异构体对胃癌细胞、乳腺癌细胞、结肠直肠 癌细胞，肝癌细胞等都具有一定程度的抑制作用。 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其危害在消化道恶性肿瘤中排在第一位。 目前，国内学者采用体外培养方法研究c l a 对胃癌细胞的作用和机制时发现， 9 c ，l i t c l a 能抑制胃癌细胞s g c 7 9 0 1 的增殖，且随着浓度的增加，抑制作用增 强；刘家仁等认为，9 c ，l l t c l a 诱导胃癌细胞凋亡的机制可能是其通过抑制 s c , - c 一7 9 0 1 细胞内突变型p 5 3 蛋白的表达，从而诱导了s g c 7 9 0 1 产生凋亡：杨艳 梅等研究t 9 e ，l l t c l a 对人胃癌细胞侵袭及转移相关基因表达的影响，其结果表 明，9 c ，1 i t c l a 对s g c 7 9 0 1 细胞侵袭重组基底膜有抑制作用，并认为9 c ，1 i t c l a 的抗侵袭活性与降低i v 型胶原酶活性和诱导肿瘤细胞中组织基质金属蛋白酶抑 制物t i m p 1 、t i m p 2 和n m 2 3 m r n a 的表达有关【l l 】。 2 第1 章绪论 国内外学者在体外培养实验中针对c l a 对乳腺癌细胞的作用有较多研究。 将不同浓度的c l a 异构体混合物与人乳腺癌细胞m c f 7 共同孵育，发现与对照组 相比，c l a 异构体混合物能明显降低癌细胞增殖率( 1 8 1 0 0 ) ，且浓度和时 间呈依赖关系：l i u 等的研究则认为，9 c ，li t c l a 抗乳腺肿瘤活性的机制可能是 9 c ，l l t c l a 诱导m c f 7 细胞产生了凋亡；曹树稳等研究了两种c l a 异构体 9 c ，1 i t c l a 及1 0 t ，1 2 c c l a 对两种人乳腺癌细胞m c f 7 ，m d a m b 2 3 1 和大鼠扩 散乳腺癌细胞f 3 i i 活性影响的异同，结果表明c l a 的这两种异构体在该实验条件 下对上述三种癌细胞增殖抑制能力和作用有明显差异，其中1 0 t ，1 2 c c l a 活性明 显强于c 9 。t l1 - c l a 1 2 j 。 许多研究表明c l a 对哺乳动物的结肠和直肠癌细胞的生长、发育及增殖同 样有抑制作用，不同的c l a 异构体对不同结肠癌细胞的抗增殖作用与c l a 异构 体的类型及浓度有关。m i l l e r 等验证了3 种商品化的c l a ( 纯9 c 1 i t c l a 、纯 1 0 t ，1 2 c c l a 及含2 9 5 9 c ，l i t c l a 和2 9 l o t ，1 2 c c l a 的混合物) 对结肠直肠癌细 胞系s w 4 8 0 的作用，结果表明1 0 t ，1 2 c c l a 对抑制结肠直肠癌细胞系s w 4 8 0 的增 殖具有较强的生理活性。 目前对c l a 对哺乳动物肝癌细胞的生长、发育及增殖抑制作用的研究较少。 i g a r a s h i 等研究了c l a ( 9 c ，l i t c l a 及1 0 t ，1 2 c c l a 的混合物) 对人肝胚细胞瘤细胞 系h e p g 2 的生长抑制作用，发现瘤细胞的增殖受到了明显的抑制，且与c l a 呈浓 度及时间依赖性关系；y a m a s a k i 等发现l o t ，1 2 e c l a 具有诱导鼠肝癌细胞d r l h 8 4 细胞凋亡的作用，从而影响鼠肝癌的发病概率【1 3 l 。 1 2 2 降脂作用 c l a 能显著使动物体内脂肪含量降低，蛋白质含量增加。有学者用含 0 5 c l a 的饲料饲喂幼猪，与对照组相比其体内脂肪含量下降2 7 ，而蛋白质含 量则增j 5 ，其机理可能与c l a 对动物体内几种与脂质代谢的酶的活性的影响 有关。研究表明，c l a 可以提高肉毒碱棕榈酰转移酶( 一种脂肪酸b2 氧化的限速 酶) 和荷尔蒙敏感酶( 负责脂肪水解释放至血液中的酶) 的活性，而显著降低脂蛋 白脂肪酶( 促进脂肪吸收) 的活性，上述变化都利于体内脂肪的分解，有利于蛋白 质的合成。y p a r k ，k j a l b r i g h t 等用添加有0 5 c l a 的饲料饲喂刚断奶的雄鼠， 发现与对照组相比，c l a 组的平均脂肪含量降低非常明显，而蛋白质和灰分含 3 第1 章绪论 量则有明显的增加，小鼠的平均体重有所下降，并且身体都很健康；r i s e r u su ， s m e d m a n a 研究了c l a 对人体身体重量的调节作用，结论是c l a 能减少人体脂肪 储备，尤其是腹部脂肪，但身体重量不变；l i n t y 对给猪和老鼠的日粮添力 i c l a 进行研究，结果也表明c l a 能够通过抑制脂肪组织的脂合成和强化脂分解，抑 制动物体脂肪沉积，提高瘦肉率；a l o n s o l 通过给老鼠饲喂高脂和低脂c l a 补充 日粮发现，c l a 能通过降低采食量、提高代谢率和降低夜间呼吸等作用使机体 脂量减少；对人体研究同样表明，以3 9 d 的剂量补充c l a 混合异构体 ( 5 0 9 c ，1 i t c l a 和5 0 1 0 t ，1 2 c c l a ) 显著降低了空腹时血液中三酰甘油的浓度， ( 8 0 9 c ，1 i t c l a 和2 0 1 0 t ，1 2 c c l a ) 添加物明显降低了低密度脂蛋白胆固醇的浓 度。c l a 改变脂肪新陈代谢活性功能的机理可能包括诱使细胞凋亡、提高脂解 和脂肪酸氧化速度以及减少组织对脂肪酸的摄入等【1 4 - 1 6 。 1 2 3 强化免疫作用 c l a 是一种能够提高人体免疫力的动物源脂肪。通过对动物的研究发现， c l a 能够延缓肌纤维老化，阻止机体免疫系统功能衰退，加速细胞的分裂等。 w o n g ，m w 等证明，c l a 可参与免疫系统的调节作用，增强促有丝分裂原，促进 淋巴细胞增殖和淋巴细胞的细胞毒性，增强巨噬细胞的杀伤活性；c h e w , b p 等发 现，在猪淋巴细胞培养介质中加入c l a ，可以强化促有丝分裂剂诱导的淋巴细 胞的胚细胞样转变、淋巴细胞毒力和巨噬细胞的杀伤力；h a y e k ，m g 等利用喂饲 c l a 的动物的脾细胞进行离体实验也证实c l a 能增强植物血凝素( p h a ) 诱导的 淋巴细胞增殖；m i l l e r 以老鼠为模型研究发现c l a 还能降低脂多糖引发的炎症反 应，降低过敏性，线性的增力h c d 8 + 淋巴细胞的百分含量；y a n g 等报道了与饲喂 玉米油的试验组相比，饲喂9 c ，1 1 t c l a 能降低脂多糖诱发的t n f a 以及直接影响 巨噬细胞和单核细胞，通过体外培养试验发现c l a 异构体中1 0 t ，1 2 c c l a 能显著 地增加淋巴细胞分化能力【1 7 1 引。 通过分子免疫学方面研究c l a 的作用机制，发现c l a 能够增加外周血液和 肠系膜淋巴结中的i g g 、 g a 和l g m 的含量，降低i g e 的水平；增加促有丝分裂原 和促进t 、b 淋巴细胞的增殖调控；提高t 细胞c d + 特异效应物的功能和淋巴细胞 的细胞毒性；以及激活巨噬细胞表达i n o s 2 m r n a 、i l 2 1 、i l 2 6 、i l 2 4 和t n f 2 等细胞因子能力，从而参与对机体免疫系统的调节作用【1 9 - 2 0 。 4 第1 章绪论 1 2 4 在畜禽业中的应用 c l a 作为饲料添加剂较多的应用于畜禽业，c l a 具有改善动物机体代谢、 重新分配营养素、增加瘦肉率等功能，在现代养殖业中的应用具有重要的社会 和经济效益。营养再分配作用能增加饲料利用率，降低胴体脂肪沉积，大量的 研究发现，在饲料中添力h c l a 可提高畜禽的生产性能。o s t r o w s k a 等报道，在猪 日粮中添) h h c l a 可显著提高日增重；b e e 研究报道了在妊娠和哺乳母猪日粮中添 力i ；1 2 c l a ，可显著提高仔猪增重；t l l i e l c o o p e r 等研究表明，在起始体重为2 6 3 虹 的公猪日粮中添加不同含量的c l a ，平均日增重和饲料转化率随c l a 添加量增 加呈线性提高；b a s s a g a n y a r i c r a 等研究了日粮中添加不同含量c l a 对幼龄断奶 仔猪在不同饲养环境条件下生长性能和免疫指标的影响，结果表明：在断奶1 2 周时，日粮c l a 的添加导致仔猪日增重降低，而在断奶3 - - 一5 周日粮中添加 0 6 7 、1 3 3 c l a 使日增重显著提高【2 1 - 2 2 。据研究报道，给母鸡饲喂c l a 可显 著降低鸡的体脂肪含量、提高母鸡的饲料摄入量、产蛋率和平均蛋重，并增加 蛋中c l a 含量。s z y m c z y k 等在8 一- - 4 2 同龄阶段小鸡日粮中添加不同含量的c l a ， 与对照组相比，试验组腹脂率显著降低，由2 6 8 降至1 7 8 ，腿肌率显著增加， 由1 9 o 上升至2 0 6 ，并发现鸡体组织中c l a 含量与日粮添加量呈正相关，饱 和脂肪酸( 1 6 ：0 ，1 8 ：o ) 比例显著增加，而不饱和脂肪酸比例显著降低。 c l a 可直接影响机体中的脂肪酸组分和腹脂硬度，从而改善畜禽产品的品 质1 2 w 引，c a r r o l l 等报道，在猪日粮中添) b i i c l a 可显著改善腹脂硬度，降低背膘厚 和增大眼肌面积，大量的主观评价结果发现，饲喂c l a 后使猪眼肌色泽、硬度 和肌间脂肪得到了改善，能够提高猪肉的大理石花纹；另外，s t a h l 等研究表明， c l a 有利于猪肉产品的色泽稳定性及其货架寿命，巴西圣保罗卅l 基罗斯高等农 业学院的研究人员用增加了c l a 的饲料喂养奶牛，发现所产奶中的脂肪含量降 低5 0 ，c l a 含量比普通牛奶高5 倍。 综上所述，c l a 具有提高畜禽生产性能，改善畜禽产品品质，增强免疫力， 营养再分配和增加畜禽产品c l a 含量等生物学功能，随着研究的深入，c l a 在 畜禽业将得到越来越广泛的应用。 1 2 5 在食品工业中的应用 c l a 在食品中的安全性是许多学者关注的重点，这也直接关系到c l a 的应 第1 章绪论 用能否为人类健康产生积极影响。c l a 是动物性食品中的天然成分，作为动物 的次生代谢物，是天然的，不存在所谓的同源性问题，所以原则上讲也不存在 使用限制，科学家对大鼠作亚急性毒理试验时，未发现任何不良生理影响，初 步证明c l a 有极好的安全性，可达g a r s 标准( 美国食品及药物安全性标准) 【2 5 1 。 c l a 可作为主要功能因子添加在抗疲劳食品、减肥食品和降胆固醇食品中，如 运动食品、运动饮料、保健油脂、营养增补剂等用于提高人体免疫力，我国已 生产出以c l a 为原料的共轭亚油酸软胶囊保健食品在市场上销售流通；c l a 也 可以作为新型的食品防腐剂，c l a 的钠盐、钾盐可以抑制霉菌的生长，且无毒 副作用，性质相对比较稳定，无使用上限，可用于食品、化妆品等行业作为苯 甲酸钠的替代品，既可达到防腐抑菌的作用，又可起到良好的保健作用，这正 好迎合了消费者对于无毒无害的天然防腐剂的需求。 c l a 亦可作为食品添加剂【2 6 2 7 1 ，c l a 添加剂于1 9 9 5 年开始在美国上市，是 美国食品学会推荐的流行添加剂之一；1 9 9 9 年c l a 减肥胶囊( 营养补充剂) 在美国 上市；2 0 0 2 年我国“十五”国家重大科技专项“奶牛现代集约饲养关键技术研究与 产业化开发项目”将c l a 列入其中：2 0 0 3 年我国试销t o n a l i n c l a 减肥胶囊，随后 我国也有了自主开发的c l a 产品；在新西兰，c l a 作为食品添加剂被添加在奶 粉作为保健配方奶取得了不错的效果；日本企业将c l a 添加进食用油中补充日 常c l a 需求，还有的国家己在面包、火腿肠、糖果、奶制品、肉制品等食物中 添加了c l a 并推向了市场。在一些国家c l a 也常用作减肥食品添加剂，人体主 要通过牛乳和牛肉摄入的天然c l a ，在摄) k 7 m g c l a 的同时也摄入1 9 m g 脂肪， 而过多地摄入能量会引起脂肪在体内的积累，引起发胖，如果食用c l a 含量较 高的替代品，则既能补充体内c l a 之不足，又能避免摄入过多的脂肪，促进代 谢，同时也能提高肌肉张力，使肌肉更加发达，所以在欧美国家，特别是美国 己将c l a 作为运动食品和营养辅助保健食品原料，面向锻炼身体和吸氧健身运 动的人员销售。 1 3 共轭亚油酸的生产现状 人们在2 0 世纪8 0 年代末认识到c l a 的生理活性，随着c l a 各种生理活性的 逐步发现，获得高纯度、高活性异构体含量的c l a 也成为各学者研究的目标。 国内外研究得较早的制备共轭多烯酸主要方法主要有：碱性催化法、金属( 合金) 6 第1 章绪论 催化法、羟基脂肪酸脱水法等，分述如下： 1 3 1 碱性催化法 利用碱催化产生共轭反应是研究的较早和较充分的一种技术【2 8 - 2 9 。目前市 场上销售的c l a 产品多数是利用碱催化共轭化的产品。该法生产c l a 的主要反 应机理是使含有l a 的油脂在高温及碱性溶液条件下( 包括碱的醇溶液和水溶液) 皂化和水解，生成l a 盐，l a 盐在高温和碱的催化下将l a 的c l l 上脱去1 个质子， 形成碳负离子，转化为c l a 盐，再经过酸化处理、有机溶剂萃取等步骤即可制 得c l a ，但该法形成的产物含各种不同的共轭化异构体。碱性催化法制备c l a 的原料可以是l a 或富含l a 的天然植物油，前者的价格比较高使得生产应用受到 限制，但是在制备高纯度的c l a 产品上有很好的前景；目前广泛使用的是含l a 为5 0 以上的天然植物油，比如玉米油、大豆油、棉籽油、红花籽油、葵花籽油， 其中后两者用得最多，高油含量的天然盐生植物油逐渐成为人们研究开发c l a 新原料。碱性催化法生产c l a 的溶剂主要是二元醇，碱催化共轭化技术经历了 从低转化率到高转化率、产品从低纯度到高纯度、从混合物到纯净异构体的发 展而日臻成熟。 1 3 2 金属催化法 金属( 合金) 催化法的作用机理主要是在一定的温度和金属催化剂作用下，充 入氮气作保护，抑n l a 的氢化加成反应，使其发生共轭化反应生成c l a ，所以 该法也称为氢化催化共轭法【3 0 】。1 9 8 5 年，b a s u 等首先报道铑或铱阳离子配合物 可以将红花籽油等油脂或非共轭脂肪酸与有机溶剂在氮气的保护下加热反应， 催化异构生成c l a 。常见金属化合物催化剂主要是羰基铬、二茂铁、铱化物等， 这类催化剂的特点是活性高，选择性好，用量少，反应温度和压力低，可以重 复使用，这些化合物需要在甲酸或相似酸等辅助溶剂存在时才能很好地发挥作 用。单元体金属催化剂一般有镍、铜、钼、钯、铂、铱等，其中镍作为催化剂 是最早也是目前用得最多的。复合体金属催化剂的种类比较多，目前最典型的 复合体金属催化剂是镍铜( 1 ：1 ) 催化剂，在我国油脂氢化行业中较为常用，其特 点是活化温度低，选择性好，原料价格便宜，容易回收再生。冯清茂等报道了 以镍铜合金为催化剂，月苋草油为原料，在高压反应釜中制备c l a ，取得较好 7 第1 章绪论 的效果。金属氢化催化剂的制备多采用煅烧法、浸渍法、沉淀法及化学混合法， 近年研究沉淀法较多，祝洪杰等使用沉淀法制备含抗皂化性能的负载型镍催化 剂，催化活性和抗酸中毒性都优于美国催化剂u s a 2 4 0 ；邢英站、胡涛也分别报 道以活性炭、硅藻土、分子筛等惰性物质为载体通过沉淀法制作镍合金催化剂。 目前，我国对金属催化剂用于l a 异构化为c l a 的工业化应用研究还是比较少， 由于使用金属元素氢化催化剂生产c l a 具有反应温度低，效率高，操作简单， 尤其是反应后勿需大量的产物纯化工序，节约生产成本，污染小，经济环保等 优点，所以这种技术在c l a 化学生产中的应用前景非常广阔。 1 3 3 羟基脂肪酸脱水法 羟基脂肪酸脱水法也是制各c l a 的重要途径【3 ，油酸衍生物、蓖麻酸可以 在酸催化下形成脱水碳正离子，蓖麻酸衍生物则可以在酸或碱催化下形成碳正 离子，进而转化成c l a 。早在1 8 8 7 年k r a f t 就实现了蓖麻油的脱水，其后蓖麻油 脱水的技术不断发展，硫酸、磷酸、硫酸盐以及强酸性树脂等都先后用于催化 蓖麻油脱水的研究；v o nm i k u s c h 用过甲酸将油酸氧化成环氧油酸，进而水解成 邻二醇，然后在催化剂作用下脱去两分子水形成c l a ，共轭酸的得率为2 5 ，但 该反应步骤较多，总体产率不高，操作难度大，已证实的活性成分含量不高。 由于在化学反应过程中，不可避免地产生多种异构体，因此，高纯度单一 异构体的合成主要从两个方面着手：一是尽可能的减少副产物的比例；一是研 究更好的分离方法，从混合物中分离提纯产品。 1 4 微生物与共轭亚油酸 在国内，化学合成法是研究较早且较成熟的制备c l a 方法，目前工业上主 要采用碱催化异构法生产c l a 。化学合成c l a 产物中9 c ，1l t - c l a 和1 0 t ，1 2 c c l a 的含量虽可达到4 0 以上，但还存在其它多种异构体。为了获得高纯度 9 c ，1 l t - c l a 和1 0 t ，1 2 c c l a ，不得不采用复杂的分离纯化工艺，生产成本过高。 化学合成c l a 产品中易存在有害成分残留，难以满足药品、食品和饲料领域的 高纯度、无有害成分残留要求。 8 第1 章绪论 随着生物技术的进步，应用微生物发酵生产c l a 已被人们广泛关注，自然 界许多微生物能够利用自身的酶将l a 转化成c l a 。目前研究最多的是利用乳酸 菌生产c l a ，其次是利用丙酸菌进行c l a 的合成，瘤胃微生物虽被最早发现能 合成c l a ，但在实际应用中很少涉及。 1 4 1 瘤胃菌生产c l a 反刍动物中的瘤胃微生物被最早发现能够生产c l a ，对于反刍动物，c l a 在体内的合成主要有两条途径，即瘤胃微生物不完全氢化作用和c l a 内源合成。 19 6 6 年k e p l e r 等首先发现c l a 是瘤胃微生物溶纤维丁酸弧菌对l a 进行生物 氢化作用的中间产物，k i m 研究溶纤维丁酸弧菌后认为在瘤胃中形成的c l a 可能 和与l a 相关的细菌失活、死亡或溶解有关，在瘤胃中分离到一株产c l a 的埃氏 巨型球菌( m e g a s p h a e r ae l s d e n i i ) ，并从中纯化出一种异构酶，此酶可将经水解红 花籽油所产生的l a 转化成c l a 。由于溶纤维丁酸弧菌等瘤胃菌的培养需严格的 厌氧条件，而且会产生使c l a 还原成其它化合物的还原酶，使得产物复杂，所 以用此种菌来生产c l a 具有一定的局限性，很少应用到实际生产中【3 2 1 。 1 4 2 乳酸菌生产c l a 人们对不同的乳酸菌生产c l a 进行了较多研究，发现很多乳酸菌中含有亚 油酸异构酶，能有效地使l a 或甘油亚油酸酯变成c l a 而且产量较高【3 3 。3 7 1 。 2 0 0 0 年t u n g y l i n 选取了六株乳酸菌在含有l a 的脱脂乳中培养，发现其中嗜 酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 产c l a 能力最高，并证明该菌株最好的碳源 是果糖和乳糖，氯化钠对c l a 的产生有促进作用。 2 0 0 2 年，k i m 在对1 4 株乳酸菌的研究中发现乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 在加葵花籽油的全脂奶粉培养基上形成c l a 的能力很强，葵花籽油最适添加量 为0 1 ；k i s h i n o 贝l j 从1 4 种乳酸菌中筛选到一株能将l a 转化成c l a 的植物乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) ，在含0 0 6 l a 的培养基上培养并收集菌体，在含 1 2 l a 的反应液中反应1 0 8 h ，每毫升反应液能生成约4 0 m g c l a ，c l a 的产率为 3 3 。 2 0 0 4 年，张中义等从酸菜汁中筛选出i 株c l a 生成能力较强的的乳酸菌，发 酵液 c l a 生成量为2 6 7 5 “幽m ，鉴定为植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) ， 9 第1 章绪论 经气相色谱检测，该菌种合成的c l a 产物为9 c ，l l t 9 t ，l l c c l a 和1 0 t ，1 2 c c l a 的混 合物；周凌华等从传统泡菜和生牛乳中筛选出一株乳酸菌z s 2 0 5 8 能生物合成 c l a ，经a p i 系统鉴定为植物乳杆菌，该菌株将质量分数1 1 6 的l a ( 1 0 2 4 m g m 1 ) 转化为c l a ，经气相色谱分析证实所产生的c l a 产物中9 c ，1 i t c l a 占7 5 9 ， 1 0 t 1 2 c c l a 占2 4 1 。 2 0 0 7 年，周艳等利用紫外线和亚硝基胍多次诱变，从出发菌株嗜酸乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) p b l 中选育出c l a 高产菌株u n f 3 4 ，可将2 9 的l a 转化 成4 2 0 5 m g l 的c l a ；于国萍等则以德氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i ) 做发酵 研究，经硫酸二乙酯诱变处理，优化筛选了c l a 产量约1 1 6 1 p g m l 的菌株。 各国学者的大量研究表明，干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 、嗜酸乳酸杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 、乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 、德氏乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i ) 、发酵乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t u m ) 、路氏乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sr e u t e r ) 、植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) 等乳酸菌皆可将培养 基中的l a 转化为以9 c 。1 l t - c 1 8 ：2 和1 0 t ，1 2 c c 1 8 ：2 为主的c l a 。 1 4 3 丙酸菌转化合成c l a 研究中人们发现丙酸菌中的某些菌种在发酵中也可产生c l a 3 8 枷】，早期 j i a n g 对常用乳制品发酵剂进行研究，发现费氏丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u d e n r e l c h u ) r i g 将游离的l a 转化成c l a ，其中9 c ，1 1 t 9 t ，1 l c c l a 达7 0 9 0 ，同 时还发现丙酸菌可以把l a