（微生物学专业论文）丙酸杆菌vb12合成及耦合发酵工艺研究.pdf

摘要 摘要 钴胺素是人体组织代谢过程中必需的维生素，具有广泛的生理作用。广泛应用于医药 和食品行业。目前钴胺素主要由微生物发酵生产。本论文从应用角度出发，初步研究了 d m b 、丙酸等因素对腺苷咕啉醇酰胺( 关键中间产物) 、菌体生长及脱氧腺苷钴胺素 ( a d e n o s y l c o b a l 觚血，简称触) o ) 生物合成的影响，探索了解除有机酸( 丙酸) 抑制的发酵 工艺过程，期望为钴胺素发酵生产工艺的改进提供参考借鉴。本论文主要进行了以下两方 面的研究。 1 丙酸杆菌厌氧合成维生素b 1 2 研究 在费氏丙酸杆菌( 册卿册黼i 姗l 加“沈棚p 缸锄j f ) 发酵生产维生素b 1 2 的研究中，分 离到脱氧腺苷钴胺素生物合成途径中一种关键而稳定的中间产物。该物质在维生素b 1 2 发酵 过程中大量积累，在研究中发现该中间产物腺苷钴啉醇酰胺( c b i ) 与5 ，昏二甲基苯并咪 唑( d m b ) 来源的前体q 吡咯核糖( a r i b 0 盟l e ) 结合后可转化为脱氧腺苷钴胺素( a d o ) 。 光谱和质谱分析该物质应是脱氧腺苷钴胺素生物合成途径中的一种重要中间产物一腺苷钻 啉醇酰胺( a d 锄o s y l c o b i 彻1 1 1 i d e ，简称c b i ) 。对此中间产物的分析可深入了解厌氧合成脱氧 腺苷钴胺素的代谢途径。进一步以c b i 为核心，考察不同时间添加d m b 对菌体生长及a d o 合成的影响，从而运用代谢调控手段优化d m b 的添加时间。从而优化发酵工艺，指导发酵 生产维生素b 1 2 的生产实践。批次发酵条件下，考察了菌体的c b i 合成量，a d o 产量和菌体 的生长曲线，可确定d m b 对菌体生长的抑制作用并不明显，但可抑制c b i 在细胞内的生物 合成，因此可影响单位菌体产量。 2 反应与分离耦合的发酵工艺研究 初步探索了用离子交换树脂吸附和更换新鲜培养基两种方法解除有机酸抑制对费氏丙 酸杆菌发酵生产v b l 2 的影响。初步探索了发酵过程中定时对丙酸进行分离的发酵工艺，可 有效解除有机酸对细胞生长的抑制，实现了细胞的连续生长，为连续发酵的生产工艺提供 了借鉴。 进一步考查了弱碱性阴离子交换树脂z g a 3 3 0 对费氏丙酸杆菌发酵液中丙酸的静态和 动态吸附性能。树脂z g a 3 3 0 对含有1 2 6g l 丙酸的发酵液中丙酸的静态吸附量最大，吸附 量为4 4 9g ，l ；动态吸附过程中对发酵液中主要营养成分糖、氨基酸吸附很少，而对丙酸 l 摘要 吸附量高达2 0 5 5g l 。成功地通过树脂吸附将发酵系统中的丙酸分离出去，实现了维生素 b 1 2 的高密度发酵。研究结果为丙酸的发酵与吸附分离耦合过程研究提供了基础，丙酸吸附 分离后的发酵液继续进行维生素b 1 2 发酵生产可以解除丙酸的抑制作用，提高了维生素b 1 2 的产量。 关键词钴胺素中间产物5 ，6 二甲基苯并咪唑丙酸离子交换树脂 u a b s t r a c t a b s t r a c t n a t i o n a lf o 加鸺o fc o b a l a m i nc o m p o u n d sa r et l l en e c e s s 砌了v i t a m i i l si nm ep r o c e s so f o r g a i l i z a t i o nn l e t a ：b o l i z e i ni l 啪a nb o d y 觚d 也e yh a v eab r o a do fp h y s i o l 0 西c a l 如n c t i o n s c o b a l 锄i i li s 、) l ，i d e l yu s e di 1 1m e d i c i n e 觚df o o di n d 删时a n di th 嬲b e e np r o d u c e di 1 1 l e p r o c e s so fm i 础i a lf e 傩e n t a t i o n i i lt h i sp a p e r ，t i 伦e 饿c t so fd m b 、p r o p i o i l i c i d0 n e d i a t eb i o s ) ，i l m e s i s 、b i o m 嬲s 锄da d e n o s y l c o b a l a l r 曲b i o s ) ，i l t l l e s i sw e r es t u d i e d t h e f e m l e i 她t i o np r o c e s so f m 0 v a lp r o p i o l l i ca c i dw 淞a l s oe x p l o r e d t h cs t u d yi 1 1n l i sp a p e r w 弱b a s e do ni 呔i u s 姆a p p l i c a t i o n s ，w m c hh a v es p e c i a lv a l 瑚b l er e f e r e n c et 0i m p m v e m e n to f c o b a l a m i i lf i e 朗吐e n 枷o n 1 r e s e a r c ho n d e o x y a d e n o s y l c o b m 锄i nb i o s ) ，n _ m e s i so f 尸唧幻刀汤口咖，f 姗 扣e 谢e 甜e t c h i i a ni m p o r t a i l ti l l t e 彻e d i a t eo fd e o x y a d e n o s y l c o b a l a m i l lb i o s y 劬e s i sb ya m e r o b i c p a t h w a yo f 尸卸幻捍珀n c 据，f o 删加z 如埘记 露w 弱义p 锹a t e d 矗0 mt 1 1 e b r o n l i th 弱b e e n q u a l i t a t i v e l y 锄【a l y z e db ys p e c t 九= 吼a n de s im s g c 锄a l y s i sa n d 矗l n l 】e rd e t e n i l i n e d 勰ak e y i n t e n n e d ia _ t eo fd e o x y a d e n o s y l c o b a l 舭血：a d e n o s y l c o b i i l 乏嗡i d e 砌c hc a nb e 仃a i l s f o n n c dt 0 d e o x y a d e n o s y l c 0 b a l l a i i 曲w l l e n妇d5 ，6 - d i m e t l l y l b e i l z i m i d a z o l e( d m b ) t 0 廿1 e f e 衄钮t a t i o nm e d i 啪ni sh o p et l l a tm ei n t e 衄e d i a t ec o l l l db eak e yf a c t o rw l l i c hg u i d e sm e i n 觚i o no fd m b 觚df i l r t b e r0 p t i i i l i z et h ef e 】m e n t a t i o np r o c e s s i k e f r e c t s ：o f5 ，6 埘m e t i l y l b e n z i m i d a z o l e ( d m b )0 n l e g r o w c h a n d d e o x y a d e n o s y l c o b a l 锄i i lb i o s y n t h e s i so f 脚z d 甩f 6 翻e 胞一册加龇如棚叩纪厅打a r ee x p l o r e di 1 1 虹l i sp a r t h lt h e 雒a e r o b i cp a 廿1 w a y a ni n l p o n a n ti n t e 珊e d i a t ca d e n o s y l c o b i i l a i n i d e ( c b i ) ， 删c hc a i lb e 蛔i l s f o n n e dt 0 d e o x y a d e n o s y l c o b a l 锄i i lw h e n i 1 1 ：丘l s e dd m bt 0m e f e 吼e n t a t i o nm e d i 嘞w h e nm ec b i 嬲ak e yf a c t o r ，t l l ee f f e c t i o no fd m ba d d i t i o na t d i f 梵r e n tp 叠娜e so ff 打m e n t a t i o n ，们c b ib i o s y n t h e s i sc u r v 岛m ed e o x y a ( 1 e n o s y l c o b a l m i l i n y i e l d 雒dc e l lg r o w t l lc u ew e r em e a s u r e di n 也eb a t c hf e h n e 玎c a t i o np r o c e s s ，n l ei m s i o no f d m ba tt h ep h a s eo f9 0 - 1 0 0 ho f 妣u b a t i o nh a sb e e nf o u l l do p t i m 眦f o rm 觚狮z i l l g m e 切怕l i ce m c i e n c yo ft h ec u l t l 玳，肌d 也e r ew 嬲n 0o b v i o u sr e s 础le f f e c t i o no nc e l lg r o w t l l 2 t t l er c a r c ho nc o u p l i n gf e 功1 e n t a t i o nt e c l l i l i c s t h e 撕on 坨t l l o d s 娥c l 坷喀i n gf o r 舶s hb r o ma n da d s o r b i n gb yr e s i nz g a 3 3 0t 0t a 】k e p r o p i o l l i ca c i do f ri nv i t 锄i i lb 1 2 ( v b l 2 ) f e 咖e n t a t i o nb r o 也w e r ee v a l u a t e d 1 1 l ef e 锄e 北吐i o n t t t a b s t r a c t p r o c e s so fr e m o v a lo fp r o p i o i l i ca c i dw 嬲a l s oe x p l o r e d nc 觚e m c i e n t l yr e l i e v e 廿l e i n h i b i t i o no fc e ug r o w t l l 龇l dr c a l i z ct h ec 0 n t 洒u sg r o wo fb i o m a s s a n dt l l er e s e a r c hr e s u l t s c a nb em ef o u l l d a t i o nf 0 r 雠t e c h o l o g yo fc o i n l 舢u sf 色r m 喇i o n t h ea d s o 印t i o ne f f e c t so fz g a 3 3 0o fw e 嬲yb a s i ca i l i o ne x c h a n g er e s i n sf o rp r o p i o i l i c i d ( p a ) i i lv i t 锄i i lb 1 2 ( 、，b 1 2 ) f e m e n t a t i o nb r o t l lw e r ee v a l u a t e d t h er e s u l tw 豁n l a tm e s t a t i ca d s o r l ) t i o nc 印a c i 够o nr e s i nz g a 3 3 0w 嬲4 4 9 ld 巧b e a d sa t1 2 6 lo fp a d y n a i i l i cs t a t ee x c h a i l g e 仃i a l s ，i n c l u d i r l g 血ea d s o 叩t i o nf o rg l u c o ，a i i l i j l oa c i d sa n dp ai i l t l l ef e m e n t a t i o nb r o t l l ，w e r ca l s 0d e t e 咖i n e dw h j c hi n d l c a t e dm a t 也ea d s 0 印t i o nw 嬲m i n i m a l f o rg l u c o 锄d 幽i d s 吐斌w e 陀m a i nn u t r i e n tc o m 】p o s i t i o i l so fm ef e m l e n t a t i o nb r o t h t i l ed ) r i l a l i l i ca d s o 叩t i o nc 印a c i t yw 嬲2 0 5 5g ld r ) rb e a d s b yt l l er e m o v a lo fp r o p i o i l a _ t e i d 谢t hz g a 0 3 0 ，l l i g l lc o n c e n n 嘶o no fv b l 2w 鹊o b t a i n e dc 0 i n p a r i n gt 0t 1 1 eb a t c h f e 衄e n t a t i o n n l ev b l 2c o i l c e n t r a t i o ni 1 1 c r e 舔e d 行o m9 1 m lt 0 1 3 1m l v b l 2 c o n c e n 仃a t i o nw a l s0 4 4f o l do f 恤s ei n 也eb a t c hf e m e n t a t i o nr e s p e c t i v e l y t 0b ec o n c l u d e d ， i tc a np r 0 v i d e t 1 1 e o 巧o ff e r i n e m a t i o np r o c e s sc o u p l i n gw i 廿l p a r a t i o n 龇l dt l l e c e1 1 c o n c e m a t i o na n dp r o d u c t m t yo f 1 2 、i l lb e 伊e a t l yi m p r o v e db yt 1 1 er e m o v a lo f p r o p i o r l a t e k e yw o r d s ：c o b a l 锄氓h n e m e d i a t e ，5 ，6 d i m e m y l b e i l z m d a z o l e ，p r o p i o n i ca c i d ， a i l i o ne x c h a i 坞er e s i n i v 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名： 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密白。 ( 请在以上相应方格内打“ ) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为( 丙聪晰荡旧吟做、磷黔篁j 穗瑾砷宄 的学位做是我个人在导师( 瓴山指导并与导师合作下取得的研究成 果，研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经 费资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制 定的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：互础 日期：丕! 皇阵五月上日 作者签名：至姻塾 导师签名：立云幽 日期：塑! 呈年l 月止日 日期：迎翟年l 月z q 日 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 钴胺素简介 钴胺素( c o b a l 锄i 1 1 ) 即维生素b 1 2 ( t 锄i 1 1 ) ，是一类含有钻的咕啉类化合物总称， 它是化学结构最复杂的维生素，因分子中含钻原子而呈红色。它是目前所知唯一含有金 属元素的维生素，其所含的钴也只有以钴胺素的形式，才能发挥其必需微量元素的作用。 1 9 2 6 年m i l l o t 和m u 讪y 从肝脏抽提物中发现了钴胺素，并发现它可以治疗恶性贫 血病，这一发现使他们获得了1 9 3 4 年诺贝尔医学奖【l 】；1 9 4 8 年黜c k e 和s i i l i t l l 从肝脏提 取物中分离出钴胺素晶体；1 9 5 6 年剑桥大学的d o r 0 岫h o d 承i l l 用x 射线法阐明了其晶 体结构【2 1 。历经十年的努力，1 9 7 3 年美国的w 的d w a r d 小组和瑞士的e s c h 锄m o s e r 小组 共同完成了钴胺素的化学合成工作【3 1 。 在自然界中它主要存在于动物性食品，如内脏、肝、肾和猪心等，瘦肉、色、牛乳 以及蛋黄也含有钴胺素；植物中不含钴胺素；只有少量的细菌、古细菌、放线菌具有合 成钴胺素的能力【4 1 。人体自身不能合成钴胺素，主要通过摄食动物源食品来获得。钻胺 素在人体的生理代谢过程中具有重要作用。 目前钴胺素广泛作为药用、食品和饲料添加剂，工业化生产钻胺素主要通过微生物 发酵。随着生产厂家的增加，产量也随之急增，相反其出口价格则由2 0 0 2 年的7 2 0 0 美 元千克下降到2 0 0 4 年的2 5 0 0 美元千克以下。 人体中钴胺素具有重要的生理功能。钴胺素以辅酶的形式参与体内d n a 合成，促 进脂肪及糖类代谢，并且具有维持和产生神经细胞髓鞘的作用。哺乳细胞中有两个钻胺 素依赖的酶【5 】：一个是甲硫氨酸合成酶( m e t l l i o n i i 圮s y n m 弱e ) ，需要利用甲基钴胺素作 为辅酶【6 】；另一个酶称为甲基丙二酰辅酶a 变位酶( m e i l l y l m a l o n y lc o ai n u t 鹪e ) ，利用 脱氧腺苷钴胺素形式的作为辅酶。甲硫氨酸合成酶【7 】是连接叶酸循环和同型半胱氨酸 ( h o m o c y s t e i n e ) 一甲硫氨酸循环的关键酶。甲硫氨酸合成酶失活会导致叶酸假性缺失 症，使同型半胱氨酸积累、s 腺苷l - 甲硫氨酸( s a d e n o s y l l m e t l l i o n i n e s a m ) 的合成 受阻【8 】。叶酸循环的破坏会直接导致d n a 合成的受阻；同型半胱氨酸的积累和s a m 的 缺乏会导致心血管疾病和神经管畸形( n e u r a lt u b ed e f e c t s ，n t d s ) 。甲基丙二酰辅酶a 变 位酶具有将甲基丙二酰辅酶a 催化为琥珀酰辅酶a 的功能，在单链脂肪酸、氨基酸及 1 河北大学理学硕十学位论文 胆固醇代谢过程中发挥重要作用【9 1 ，因此脱氧腺苷钴胺素缺乏导致的甲基丙二酰辅酶a 失活也会引起严重的代谢失衡症。 1 2 钴胺素的分子结构与理化性质 1 2 1 钴胺素的分子结构 钴胺素是自然界中由生物合成的最复杂的小分子物质之一【姗，图1 1 是钻胺素的结 构示意图。钴胺素分子由三部分组成：中心咕啉环、c o b 配基部分及一个含有核苷酸环 的c 配基。中心咕啉环由相连的四个吡咯和一个钴原子组成，钴鏊合在四个吡咯中心。 咕啉环通过氨丙醇与下方的仅一衲眈o l e ( 1 吨d 舶o f i l r 锄o s y l5 ，6 d i l i l e 岫l b 肌z i i n i d a z o l e ) 相连。a r b a z o l e 中二甲基苯咪唑( d m b ) 的一个氮原子和中心咕啉环的四个氮原 子起螯合钴原子的作用。咕啉环轴向上方的配基不同( 即c o b 配基不同) ，产生不同形 式的钴胺素类物质。羟基钴胺素( h y d r o x y c o b a l a i t l i n ) 、氰基钴胺素( 唧c o b a l a m i l l ) 、 脱氧腺苷钴胺素( d e o x y a d e s y l c o b a l 觚血) 和甲基钴胺素( m 嘶l c o b a l 锄i n ) 是钴胺素 主要存在形式。其中氰基钴胺素是在工业提纯时用氰化物取代天然钴胺素而得到的产物 【l l 】，商品形式的钴胺素多为氰基钴胺素。多种形式的钴胺素在哺乳动物体内会转化为两 种生物活性形式：脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。 图1 1 维生素b 1 2 分子结构 f i g 1 1s 咖c t u 托o f t a m i nb 1 2 1 2 2 钴胺素的物理与化学性质 敦 s d o d 葺y a d a o 尊y i c o l b a i a m i n _ d e 善y i c o b a l 撇l 抽 t a b c m 。窑。甑喀y 打蝣b i 】 h 疆i y i h h 啊i 斑 ( m 艇：b l j x | o h l | i y 函【均喁o b h 啪缸 x ；洲 c 驴盘n d c o b 一舢n i n ( c n c m “协m i n 日1 2 钻胺素为深红色晶体或结晶性粉末，无特殊气味，具有较强的吸湿性，可溶于水或乙 2 第1 章文献综述 醇中，但在丙酮，氯仿或乙醚中不溶。其中氰基钴胺素为人工合成产品，其水溶液在室 温下稳定，在p h4 6 间最稳定，此时即使经高压灭菌损失也很少；但在p h2 以下或 p h9 以上则分解，遇强光或紫外线亦不稳定，故药品钻胺素强调避光保藏。还原剂和氧 化剂对钻胺素有破坏，抗坏血酸或亚硫酸盐皆可破坏它。 1 2 3 钴胺素的检测方法 1 2 3 1 微生物法 原理同微生物学浊度法，菌种采用乳酸杆菌以跆玉曲m 口朋豇，a t c c 7 8 3 0 ) ，此菌种生长 对钴胺素有很大依赖性。将待测样品接入菌种培养基，培养后用比浊法测定微生物生长 强度，并依照标准曲线读出钴胺素含量【1 2 1 。微生物测定法操作复杂，测定周期长，不能 快速准确的检测样品中钴胺素。 1 2 3 2 比色测定法 中国药典检测法 药典测定钴胺素是使用分光光度法。避光操作，精密称定钴胺素，加水溶解并定量 稀释制成约2 5 m g l 钴胺素溶液，使用分光光度计在3 6 l m 下测定光吸收度【13 1 。此测定方 法适用于纯品及杂质干扰比较小的药品中钴胺素含量测定。 离子交换层析一分光光度测定法 药物中的钴胺素经离子交换树脂分离纯化后，使用分光光度计测定。测定氰基钴胺 素的常用波长为3 6 l 衄和5 5 0 l 】m 。如果待测样品中钴胺素使用离子交换层析可很快与杂 质分离，可使用此方法测定。 双氰络合物比色法 钴胺素在碱性溶液中与过量的氰化物结合成钴胺素双氰络合物。钴胺素的双氰络合 物用苯甲醇提取，可除去干扰物质，并达到浓缩维生素b 1 2 的目的。利用维生素b 1 2 和维 生素b 1 2 双氰络合物在5 8 2 姗处吸光率的差值，可进行定量测定。本法常用于测定药品或 干扰物较少样品中维生素b 1 2 含量。 1 2 3 3 间接测定法 间接测定法是通过测定维生素b 1 2 中的钴元素的含量，折算出维生素b 1 2 的含量。主 要有原子吸收法、显色反应法、荧光反应法、电化学法等。 原子吸收法 3 河北大学理学硕十学位论文 维生素b 1 2 分子中含有钴原子，采用原子吸收分光光度计可以测定维生素b 1 2 中的钻 含量，再通过质量换算即可得到维生素b 1 2 含量。在测定药品中维生素b 1 2 时，可以直接将药 品溶液吸入原子分光光度计中测定：用于测定食品中的维生素b 1 2 时，样品需要预处理。 样品首先用提取剂提取，向滤液中加入e d t a ，用n h 4 0 h 调节p h 至7 0 ，再加入活性炭， 用无灰滤纸过滤，维生素b 1 2 被吸附在活性炭上，将活性炭连同滤纸一起在6 0 0 下灰化 完全，用5 n 1 0 儿的硝酸将残渣溶解，然后用原子吸收分光光度法测定钴的含量。 电化学法。 维生素b 1 2 的电化学测定法是在丁二酮肟一氯化铵一硝酸钠体系中进行的。痕量的 钻具有灵敏的极谱催化波，在该体系中引入o 0 0 1 的聚乙烯醇能明显的改善波的稳定 性，对灵敏度也有很大提高，此方法可应用于生物组织中的痕量钴测定。样品中的维生 素b 1 2 用磷酸氢二钠一柠檬酸一焦亚硫酸钠提取剂提取后，将维生素b 1 2 吸附于活性炭 上，与可能存在的游离c 0 2 + 和其它干扰组分分离，再将吸附的维生素b 1 2 与活性炭在 5 5 0 6 0 0 灰化，采用电化学法测定钴含量，换算成样品中的维生素b 1 2 含量。本方法 操作简便、检测灵敏，可检查样品中痕量的维生素b 1 2 。 。 荧光反应法 荧光反应法是指金属原子与一些化学试剂反应，当用紫外光、波长较短的可见光或 红外光照射时，能发射共振荧光和比光源波长较长的紫外、可见或红外光荧光。揭念芹 等【1 4 】发现，在碱性介质中，钴与硫胺素反应产生荧光物质，表面活性剂t r i t x - 1 0 0 对 该反应具有敏化作用，据此建立了测定微量钴的荧光分析法。其荧光光谱的激发波长为 3 7 5 咖，发射波长4 4 0 i l i i l ，在6 l o 8 2 4 1 0 一7 m o 儿范围内荧光强度与钴离子的浓度呈 良好的线性关系，从而可间接测定维生素b 1 2 含量。 显色反应法 显色反应是利用金属离子与配位体形成稳定的有色络合物，使吸光光度系数大大增 加，从而提高检测灵敏度，此方法具有很高的灵敏度，适用于微量分析。李俊【1 5 】等研究 发现，在弱碱性介质中，沸水浴加热，不加任何辅助试剂，朋嚣d 四( 3 氯4 磺酸苯基) 卟啉( 朋c i t p p s 4 ) 与钴可形成灵敏度很高的络合物，最大吸收波长在4 2 6 衄。利用此 钴络合物光谱性质，可准确检测微量维生素b 1 2 1 2 3 4 化学发光检测法 化学发光法是以不流动态或固态的分析试剂与树脂混合装柱作为阳极，过氧化氢与 4 第1 章文献综述 溶解氧反应作为阴极形成两个电极。当流动相流过阳极柱时，分析试剂被释放出来，与 待测物反应产生化学发光信号从而对目标物进行分析。w a t a i l a b wf 等【1 6 】使用全自动化学 发光维生素b 1 2 分析仪( c ：1 1 i r 眦d i a 五硝c s ，e 鼬tw 砌p o l e ，m a ) 对食品中对维生素b 1 2 成 功地进行了定量分析。化学发光分析法适合于测定食品中和血浆中的维生素b 1 2 ，且具有 方法简单、快速、高选择性、重复性好等优点，但由于仪器昂贵，推广性不强。 1 2 3 5 高效毛细管电泳法( h p c e ) h p c e 根据混合组分中各个组分的迁移速度不同，在毛细管分离过程中形成了各自 区带，并逐个迁移，通过检测点( 在柱检测) 对样品进行分离。反映在电泳谱图上就是以 迁移时间和峰宽为特征的电泳峰。分离操作可以在很短的时间内完成，具有分离效率高、 操作简便、溶剂消耗少、环境污染轻等优点。k 0 w d o 等曾利用h p c e 检测多种制剂中的 维生素b 1 2 含量，其方法的最低检出限为1 4 m 州1 7 1 。 1 2 3 6 高效液相色谱法( h p l c ) 高效液相色谱方法是利用物质在不同的两相中溶解、吸附、分配、离子交换或其它 亲和作用的差异，使混合物中各组分达到分离。h p l c 是目前最常用的分析手段，能对 维生素b 1 2 进行快速、灵敏、准确测定。h p l c 使用的溶剂经济，容易与其它技术联用， 需要的样品量小，而且可配备不同的检测器。目前高效液相色谱已经广泛应用于食品、 药品及饲料添加剂中维生素b 1 2 的快速检测【1 8 】。 微生物测定法耗时长，检测灵敏度低，不利于发酵过程中快速测定；比色测定法只 适用于对药品制剂等基质比较简单的样品进行分析，而对于发酵液或食品类组成复杂的 样品，存在干扰而不适用；高效毛细管电泳法则由于检测限低，导致它在检测食品中所 含的微量维生素b 1 2 时具有一定的局限性；化学发光分析法由于仪器购置所需费用较高， 较难普及。间接法是通过c 0 2 + 来间接测定维生素b 1 2 含量，虽然具有简单、快速、操作 简便等优点，但会因样品本身含有c 0 2 + 而造成很大误差。高效液相色谱法适用于含量较 低的样品中维生素b 1 2 的分析，具有快速、简便、灵敏等特点。对于基质复杂、含量较 低的样品，h p l c 测定具有很强的适用性。 1 3 钴胺素的生物合成研究 1 3 1 钴胺素的生物合成途径 钴胺素属于四吡咯类物质家族，其它类似物还有血红素、叶绿素、辅酶f 4 3 0 和 河北大学理学硕士学位论文 s i r o h e m e 等，它们都起源于同一个中间产物尿卟啉原( u r 0 g 胁) 钴胺素作为一 种古老的辅酶，有着重要的进化学地位，进化学家认为它是自然界中最早出现的四吡咯 类物质，其它物质都源于钴胺素合成路径的分枝步骤。 钴胺素的生物合成十分复杂，涉及相关合成基因3 0 余个【1 9 1 。b a 仕e r s b y 和s c o t t 实 验室的工作者通过对脱氮假单孢菌( a 砌d ，郴锄帆船) 的研究，阐明了钴胺素 好氧合成路径洌。对厌氧合成路径的研究成果源于以下三株菌：鼠伤寒沙门氏菌 ( 勋加。捍e 朋ao 矽 f m “，也m ) 、费氏丙酸杆菌( p ，o p f d 玎汤口c 玉g 一“m 加毵翻阴陀砌矗) 【2 1 】和巨 大芽孢杆菌( 鼢c f z f 妇朋唧自删切1 ) 。研究方法涉及分子克隆、酶学、化学合成、同位 素标记和核磁共振等，最终历时2 5 年才绘制出钴胺素的合成路线图。下面将以合成腺 苷钴胺素为例，分三部分概述钴胺素好氧及厌氧合成过程。 ( 1 ) 5 氨基乙酰丙酸缩合形成尿卟啉原( u r 0 蜘m g e i l ) 5 氨基乙酰丙酸的合成有两种途径：一种是由琥珀酰辅酶a 和甘氨酸缩合产生( 称为 c 4 途径) ；另一种途径较为复杂，由谷氨酸的完整碳骨架转化得到，需要t r n a 及3 个 酶参与( 称为c 5 途径) 【勿。尿卟啉原i 是钻胺素中心咕啉环的前体，8 分子5 氨基乙 酰丙酸经氨基乙酰丙酸脱氢酶( h 锄b ) 、胆色素原脱氨酶( h 锄c ) 和尿卟啉原合成酶 ( h e i l l d ) 的催化，最终缩合成尿卟啉原。尿卟啉原i 的合成标志着钴胺素的中心环 碳骨架初步形成。 悔好气芦产芦卜 附一笋n r、一_f、。 饕一一鬟 图1 3 维生素b - z 合成路径简图 f i g 1 3b i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fv i t a m i nb 1 2 ( 2 ) 催化尿卟啉原i i i 合成腺苷钴啉胺酸( a d e i l o s y l c o b 舛ca c i d ) 。 6 第l 章文献综述 尿卟啉原甲基转移酶是钴胺素生物合成的关键酶，催化将s 腺苷【广甲硫氨酸 ( s a d o s y l l m 甜l i o n i i l e ，s a m ) 上的2 个甲基转移到尿卟啉原分子上，第一个甲基 转移到中心环c 2 位置形成前咕啉1 ( 卿渤r r i n - 1 ) ，接着在c 7 位置进行第二次甲基化 反应，产生前咕啉2 ( 舯o 州n 2 ) 。至此好氧和厌氧合成路径没有区别，在随后的中心 环缩合反应两条合成路径开始出现差异。 在好氧路径中，前咕啉2 在c 2 0 位再次发生甲基化生成前咕啉3 ( p r ie c _ o n 3 ) 。 由c d 6 g 编码的单加氧酶( m d n 0 0 x y g 舔e ) 催化两个氧原子加入中心咕啉环的a 环， 形成了分子内丫内酯，导致a 、d 环问的碳原子以乙酸的形式脱去【冽。前咕啉3 经过咕 啉环缩合反应及3 次以s 触垤为供体的甲基化反应，形成重要中间体前咕啉6 ( 脚r r i n - 6 ) 。前咕啉6 经过甲基化、甲基基团重排和酰胺化反应形成氢咕啉酸a ，弘 二酰胺( h y d r o g 0 b 妒l l i ca c i da ，础锄i d c ) 。好氧菌利用依赖于a r p 的钴鏊合酶催化钴 元素插入到氢咕啉酸如c - 二酰胺的咕啉环中心【2 4 】，从而得到具有钴元素的中间体一钴啉 酸a ，争二酰胺( c o b y r 陆ca c i d 如c - d i 锄i d e ) 。 厌氧路径中，形成前咕啉2 后随即发生了钴鏊合反应，形成钻前咕啉2 ( c o b a l t p 懒涮m 2 ) 。在鼠伤寒沙门氏菌( 加d ，l e 砌铆炳f m r m m ) 和费氏丙酸杆菌 ( 尸脚幻以f 施c 纪砌m 咖”如以您砌玎) 中钻鏊合酶是由c 必g 或迸编码的。c y s g 蛋白 在钴胺素的厌氧合成过程中具有非常重要的作用，它不但具有转甲基酶活性和催化钴鏊 合的能力，同时还具有铁鏊合酶和依赖于n ad ，n a d h 韵氧化还原酶活性【2 5 1 。相对于好 氧合成菌而言，厌氧菌中钴的鍪合较早。钴元素在此阶段的鏊合对随后钴胺素中心咕啉 环的缩合是有重要意义的。位于咕啉环中心的钻原子带有一个正电荷，它直接介导了中 心咕啉环的a 环分子重排，导致a 、d 环间的碳原子以乙醛的形式脱掉瞄l 。在厌氧合成 路径中提前鏊合的钴元素起到了好氧合成菌中氧原子的作用。在中心咕啉环缩合的同 时，钻前咕啉2 又发生了3 次以s a m 为甲基供体的甲基化反应，形成了重要中间体钴 前咕啉6 ( c o b a l tp r e c o 枷) 。钴前咕啉6 再经过甲基化、甲基重排及酰胺化反应生成 钴啉酸钆c 二酰胺( c o b 州i l i c 撕da 弘d i a m i d e ) 。 前咕啉2 催化合成钴啉酸文c 二酰胺后，好氧和厌氧合成路径又重新趋于一致。在 脱氮假单孢菌( 风口“如聊d ，l 鲫d 幻f f r 圻阳瞪) 中c d 6 d 编码的蛋白质具有腺苷转移酶活性， 它催化腺苷基团与钴啉酸a ，c - 二酰胺中的钴相连，形成腺苷钴啉酸a c 二酰胺 ( a d e i l o s y l c o b 蜘n i ca c i da ，c d i a m i d e ) 。在厌氧合成菌勋砌d n 口肠卯j l l 砌“一“，l 中，c o b a 7 河北大学理学硕士学位论文 具有腺苷转移酶活性，与好氧菌中的c 0 b o 是同功酶。最后，与腺苷钴啉酸如c - 二酰胺相 连的4 个羧基再次发生酰胺化反应，就生成了腺苷钴啉胺酸( a d 锄o s y l 曲y r i ca d d ) 。至 此，带有腺嘌呤核苷酸的中心咕啉环合成完毕。 ( 3 ) 催化腺苷钴啉胺酸最终合成腺苷钻胺素( a d e n o s y l c o b a l 锄i n ) 。 这一部分主要包括与中心咕啉环相连的c 配基的合成。腺苷钻啉胺酸咕啉环侧链 上唯一未酰胺化的羧基与氨丙醇( r 1 a m j n 0 2 p r o p 锄0 1 ) 的氨基相连形成腺苷钴啉醇酰 胺( a d o s y l c 0 b i 触r i l i d e ) 。随后，氨丙醇的羟基发生磷酸化，生成磷酸化腺苷钴啉酵 酰胺。磷酸化腺苷钴啉醇酰胺通过磷酸化的侧链与鸟嘌呤核苷酸( g l 汀) 连接就形成了 腺苷二磷酸鸟嘌呤核苷酸咕啉醇酰胺( a d 髓o s y l g d p 渤i i 埘：l l i d e ) 。钴胺素合成的最 后一步是由嘶b 勉o l e ( 1 吨d 曲o f i j r a 】n o s y l5 ，6 d i l n e 吐i y l b 饥z i i i l i d a z o l e ) 替换腺苷一二磷酸 鸟嘌呤核苷酸咕啉醇酰胺中的鸟嘌呤核苷酸( g ) a 曲配o l e 的合成需要二甲基苯 并昧唑( 5 ，6 捌m e t l l _ y l b 饥z i i i l i d a z o l e ，d m b ) 和烟酸单核苷酸( n i c o t i i l i c a c i d m o n o n u c l t i d e n 心烈) 的参与f 2 7 1 。二甲基苯并咪唑( d m b ) 的前体是核黄素( 硒b o n a v i l l ) ； 烟酸单核苷酸( n 心仪) 是合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d ) 过程中的一个中间产物。 【2 8 】钴胺素合成酶催化泓曲北o l e 替代腺苷二磷酸鸟嘌呤核苷酸咕啉醇酰胺分子中的鸟 嘌呤核苷酸( g ) 后就完成了复杂的腺苷钴胺素的合成。 1 3 2 钴胺素合成相关基因的研究 随着基因组大规模测序技术的发展，钴胺素合成相关基因数据库已经建立。这样只 要通过相似性比较就可判断某一未知菌是否具有钴胺素合成基因。在进行钴胺素合成菌 的基因组研究时，发现了多个与厌氧或好氧合成钴胺素特异相关的特征基因。如在 肋c f 刀凇m e g 口幼妇m 和勋砌d 刀p 妇铆炳砌“一姗l 中西国、c 所g 基因和用于编码不依赖于 a r p 的钴鏊合酶的曲或c 6 基因被认为是厌氧合成菌的特征基因【2 9 删。钴胺素好氧合 成菌的特征基因是从a p 谢b ，l d 行傩如以f 批附中发现的c d 施、c 0 6 1 、c d 6 丁基因，它们 共同编码一个依赖于a t p 的三亚基钴鏊合酶。6 ：e 、6 职6 f 和6 g 基因也是好 氧合成菌的特征基因，其中6 g 是编码单加氧酶的基因。 应用于工业生产的钴胺素合成菌都具有典型的厌氧或好氧合成机制，对这些菌种相 关合成基因的研究也佐证了这一观点。于是长期以来一直依据是否有氧气参与划分钴胺 素的两条合成路径。随着对更多具备钴胺素合成能力的微生物的研究，人们发现好氧和 第1 章文献综述 厌氧合成路径并不是完全独立的。例如荚膜红细菌( r | l d 如6 口c 铆够粥“肠凇) 在厌氧及 好氧条件下均具有合成钻胺素的能力，并且钴元素的鏊合是发生在较晚的阶段，这说明 它具有一种全新的中心咕啉环缩合机制。研究发现荚膜红细菌缺失编码单加氧酶的c d 6 g 基因，钴胺素合成过程中咕啉环的缩合由一种铁硫蛋白催化完成【3 。此外，研究发现绿 脓杆菌( a p l “如力l d 刀傩口嘲伽) 同时具有钴胺素合成的好氧和厌氧特征基因，它在 有无氧气的条件下均具备合成能力。 现已证明是否有氧气参与并不是区分两条合成路径的关键，它们的本质区别是中心 咕啉环的缩合机制不同。钴原子的鏊合对于中心咕啉环的缩合具有重要作用，因此以钴 原子鍪合时间的早晚来划分钴胺素合成路径已经得到共识。由于应用于生产的菌种都具 有典型的厌氧或好氧合成机制，所以好氧合成路径和厌氧合成路径的称法还一直在发酵 工业中沿用。 1 4 钴胺素的生产 1 4 1 工业废液中提取钴胺素 造纸及乳制品工业废液，酒精、丙酮、丁醇、柠檬酸发酵废液都是生产钴胺素的原 料。生产上一般是从链霉菌废液中提取，近年来发现庆大霉素发酵液中也含有较高浓度 的钴胺素。工业废液中钴胺素毕竟只是作为一种发酵副产物被利用，远远不能满足医药、 食品工业的巨大需求。 1 4 2 污泥中提取钴胺素 采用生物活性污泥法处理的废水中，通常含有较多的钻胺素，干的活性污泥可先用 水浸提，然后过滤掉固形颗粒，即可分离、纯化钴胺素【1 l 】 从污泥中提取钴胺素无需前培养，大大减少了前期投入，但是提取过程较为复杂， 尤其是浓缩这一关键性步骤会造成巨大的能量损耗。而且受活性污泥这一来源的影响， 提取得到的钴胺素并不能直接进入食品或制药工业，通常只局限于饲料添加剂。 1 4 3 微生物纯种发酵 具备合成钴胺素能力的微生物主要为放线菌和细菌【3 2 】。其中放线菌主要为链霉菌 属，主要包括：& 唧f d 佛弦甜口舾蝴1 ，淞，抗生素链霉菌( 砌印f d ，1 ) ，配， 口刀打研d f f 嬲) ， 金霉素链霉菌( 肋印f d 疗吵c 酷口“彤q 屈c 记邶) ，勋印幻刀纱c 豁 c d 肠聊6 把刀s 西，灰色链霉菌 ( 砌印幻，l 烨，哪e 淞) 、橄榄色链霉菌( 鼢印幻缈即d 矗螂) 、玫瑰红链霉菌 9 河北大学理学硕十学位论文 ( 勋翠幻m y 睨，聊动肋”理册淞) 。产生钴胺素的细菌主要有：黄杆菌( 用舢施础衍聊l 阳肠您) 、巨大芽孢