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GM试验培训课件,市场部2014年8月,GM试验培训课件市场部,GM试验适用的科室,1,3,2,LinSJ,etal.JClinInfectDis,2001,32(3):358-366,烟曲霉,黄曲霉,黑曲霉,定义：曲霉菌(Aspergillus)是广泛存在于自然界一种腐生菌，孢子较小直径2-3um，可在空气中漂浮，可通过呼吸道进入人体。多种曲霉菌都可引起侵袭性曲霉病，如烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉和构巢曲霉等。,一、曲霉菌简介,（一）曲霉菌感染现状曲霉感染不容忽视,TortoranoAMetal.Mycoses.2011,55:7379.,38个ICUsof27个意大利医院384例真菌感染(318例侵袭性念珠菌感染；63例霉菌感染；3例隐球菌感染),曲霉感染57例毛霉菌感染4例镰刀菌感染1例木霉菌感染1例,霉菌感染的比例为16%,（二）曲霉菌感染现状曲霉感染死亡率高,二的检测原理,ELISA方法简介酶联免疫吸附测定技术(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是以抗原、抗体的特异性结合反应为基础，将抗原或抗体的检测与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的免疫检测技术。曲霉菌抗原检测采用了间接竞争法。ELISA试验操作过程由样本处理、加样、孵育、洗涤、显色、终止等几个基本环节组成。,（一）的检测原理,检测物质本实验检测曲霉菌中的半乳甘露聚糖。半乳甘露聚糖（Galactomannan，简写GM）是曲霉菌细胞壁上特有的成分，当菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原。当曲霉在深部组织中生长时，半乳甘露聚糖可释放入血液，因此检测病人血液或者是体液中的半乳糖甘露聚糖可以作为早期诊断感染的方法。,（一）的检测原理,实验原理本实验使用特异抗体检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原。其原理是标本中的抗原和包被的固相抗原均与试剂中抗体竞争结合。标本中抗原量含量愈多，与试剂中抗体结合越多，结合到固相上的酶标抗体愈少，最后的显色也愈浅。标本和试剂反应后所产生的颜色变化（OD值）与标本中待测定的GM含量成反比关系。通过标准曲线，便可以通过反应显色的OD值计算出待测标本中GM的含量。,（一）的检测原理,三实验操作流程,GM实验所需的仪器及耗材1.酶标仪：必须能使用450nm波长用于检测。2.高速离心机：必须达到10000g离心力以上，最好是低温离心机。3.37恒温培养箱（或其他可替代的恒温空气浴设备）必须设置温度为37，其他温度（如35）不可以使用，否则会影响检测值，同时要保证恒温箱的洁净。4.沸水浴：一般的电磁炉或者其他可以保证沸水浴的设备皆可，但暂不推荐干浴,5.漩涡混合仪6.100L和300L多道移液器（排枪）及配套吸头：可以减少不同孔的加样时间差。如果使用洗板机，无需用300L多道移液器。7.100L和1000L单道移液器及配套吸头8.配制洗液的量筒和保存洗液的试剂瓶9.封板膜：需用户根据每盒试剂做实验次数自备一部分备用10.浮漂：沸水浴使用,（一）试剂盒组成,试剂盒组成：酶标板标准品半乳甘露聚糖抗体半乳甘露聚糖抗体稀释液酶标抗体酶标抗体稀释液底物溶液终止液封板膜存储条件：2-8冷藏保存试剂规格：96人份/盒,（一）试剂盒组成,（二）GM实验操作流程图,洗板后加100L显色液,样本处理1.向离心管中加入300l待测血清。2.向离心管中加入l00l样本处理液R5。3.漩涡震荡10s以彻底混匀，将离心管放入水浴锅100加热3min。4.将离心管从水浴锅内取出，小心放入离心机内，10000r离心10min。5.取上清液50l用于检测。,（三）GM实验操作流程,取300L血清,100L处理液,+,样本处理示意图,沸水浴3min,1.实验前将试剂盒取出置于室温30min2.配液：（1）洗涤工作液：浓缩洗液稀释20（l份浓缩洗液R6加l9份的无菌去离子水或超纯水）（2）半乳甘露聚糖抗体工作液：半乳甘露聚糖抗体稀释100（l份半乳甘露聚糖抗体R3b加99份的半乳甘露聚糖抗体稀释液R3a）；（3）酶标抗体工作液：酶标抗体50（l份酶标抗体R4b加49份的酶标抗体稀释液R4a）；,（三）GM实验操作流程,3.样本混合：,（1）分别设标准曲线组、待测样本组。标准曲线组：各标准品分别取50l加入到酶标板孔中。待测样本组：处理后的待测样本各取50l分别加入到酶标板孔中。（2）向酶标板孔中分别加入半乳甘露聚糖抗体50l。（3）另设空白对照1孔，加入样本稀释液l00l，封上封板膜，37下孵育601min。,4.洗涤酶标板：揭开封板膜，洗涤酶标板。每孔每次加入250l的洗液，静置2min后，将酶标板孔内的液体除去，在吸水纸上反复拍打以去除残留液体，重复上述洗涤操作，共洗涤3次。5.加入稀释后的酶标抗体：洗涤结束后，每孔加入酶标抗体100l。用封板膜封板，37下孵育401min。6.洗涤：同步骤4,7.显色：洗涤结束后，每孔加入底物溶液100l，不用封板膜封板，在37下孵育20min，避光。8.终止：每孔加入50l终止液，加样顺序与加入底物顺序相同，混匀后，在OD450nm处读数。,阳性：GM0.95g/L阴性：GM0.75g/L灰区：0.75GM0.95g/L，建议连续多次检测并应结合临床资料综合评价,结果判读,R2a：试验OD值控制在1.00.4；R2e：试验OD值控制在0.40.2；空白对照：试验OD值控制在0.1以下。标准曲线：r20.96如果没有达到上述指标，则影响分析的可靠性，检测结果不予报告，需重新检测。,质量控制,GM检测曲霉的优势,特异性高：检测曲霉阴性预测值高：GM试验阴性排除曲霉病价值高GM检测阳性结果比临床诊断侵袭性曲霉病提前约614天此外，还可以帮助评价治疗的有效性,SinghN，PatersonDL.ClinMicrobiolRev.200518：44-69,四GM试验的注意事项及影响因素,（一）注意事项1.样本不能及时检测，应在适当条件下保存，并避免反复冻融。2.处理样品时应沸水浴，否则将影响结果。3.配制洗液时要混合充分，并使用无菌去离子水或超纯水。4.洗涤操作时每孔的加样量应保持一致，拍板时应确保孔内无明显液滴残留。5.保证每孔充分洗涤，避免产生泡沫，不要使用洗瓶洗涤。,6.严格按说明书要求控制孵育温度及时间，不能随意变动。7.试剂盒中显色试剂-TMB底物溶液（R8）易氧化，尽量缩短开盖时间且避免强光照射，若溶液颜色变为浅蓝色时（正常使用时应为无色），应弃用。8.终止液具腐蚀性，易发生灼伤，操作时请注意人身安全。9.各产品同时使用时，除浓缩洗液及终止液外，请勿将同一名称试剂互相替代使用。,（二）GM试验的影响因素,造成GM实验假阳性的因素主要有：半合成青霉素，如哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸与其他细菌或真菌成分交叉反应肠道中定植的曲霉释放GM进入血液谷物食物中存在GM（如大豆），通过受损肠粘膜进入血液接受白蛋白、免疫球蛋白和其他营养液治疗血液透析接受心肺旁路手术自身免疫性肝炎等免疫性疾病新生儿和儿童（FP83%，与双歧杆菌交叉反应）,造成GM实验假阴性的因素主要有：抗原过多，出现后带现象抗原和抗体形成免疫复合物释放入血的半乳甘露聚糖不持续，很快被清除局部感染，包括慢性肉芽肿菌丝少，侵血管性弱抗真菌药物使用（如两性霉素B、三唑类药物），抑制菌丝生长从而减少GM分泌非粒细胞缺乏患者,可能造成GM实验假阴性的因素1.曲霉菌生长和抗原释放与周围环境的营养条件和pH有关。如果营养充分，pH在7.5，真菌可持续生长并释放GM，但是当炎症发展时，真菌生长受到抑制，GM释放会减少。2.GM抗原与血液中的某些物质结合遮蔽了与抗体相结合的抗原决定簇。Mennink-KerstenMA,DonnellyJP,VerweijPE.Detectionofcirculatinggalactomannanforthedeagnosisandmanagementofinvisiveaspergillosis.LancetInfect,2004,4(6):349-359,可能造成GM实验假阴性的因素：3.宿主的抗真菌治疗：检测前是否进行抗真菌的治疗是关系到实验灵敏性的重要因素。Marr等对67位患者的986份血清进行分析，发现在未接受抗真菌治疗的患者里面ELISA方法的敏感度可达到80%，而经抗真菌治疗患者的敏感度仅为20%。MarrKA,BalajeeSA,MclaughlinL,etal.Detectionofgalactomannanantigenemiabyenzymeimminoassayforthediagnosisofinvasiveaspergillosis:variablethataffectperfomane,JInfectDis,2004,190(3):641-649,（五）GM试验与G试验联合检测,G试验检测真菌谱较广，除了隐球菌和接合菌（毛霉、根霉、犁头霉）之外的深部真菌感染均可呈阳性，而GM试验只针对曲霉感染。两者结合可以互补，并提高临床检测的灵敏度和阳性预测值。两个项目的检测均使用血清标本，联合检测也很方便。如果将G试验和GM试验联合检测，有助于真菌属的鉴别。,SuhailAhmad,ZiauddinU.Khan.DiagnosticvalueofDNA,(1-3)-D-glucan,andgalactomannandetectioninserumandbronchoalveolarlavageofmiceexperimentallyinfectedwithAspergillusterreusJ.DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease59(2007)165171,血清,敏感性,