（生物化学与分子生物学专业论文）桑尺蠖线粒体全基因组序列的测定及分析.pdf

摘要a b s t r a c t 摘要 本研究利用长聚合酶链式反应( 长p c r ) 的方法，扩增、克隆测定了桑尺 蠖( p h t h o n a n d r i aa t r i l i n e a t a ) 的线粒体基因组序列。桑尺蠖的线粒体基因组总长 1 5 4 9 9 个碱基对，包含1 3 个蛋白编码基因( p c g s ) ，2 个r r n a 基因，2 2 个t r n a 基因，和一个控制区域。与鳞翅目中的其他物种相比较，桑尺蠖的线粒体基因组 与其它鳞翅目昆虫的基因结构类似。桑尺蠖线粒体基因组的核苷酸组成中a + t 含量的的均值是8 1 0 2 ，1 3 个蛋白编码基因( p c g s ) 中a + t 含量的范围从c o x l 中的7 3 2 5 至ua t p 8 中的9 2 1 2 。桑尺蠖具有的2 2 个t r n a 基因，t m s ( a g n ) 缺乏d 环，其它均具有标准的三叶草结构。基于线粒体基因组的1 3 个蛋白编码 基因( p c g s ) 的核苷酸序列和氨基酸序列，构建了鳞翅目昆虫系统发生树，证 明桑尺蠖与蚕蛾总科关系较近。 关键词：线粒体基因组鳞翅目尺蛾科桑尺蠖 摘要a b s t r a c t a b s t r a c t u s i n gl o n g p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( l o n g - p c r ) m e t h o d ，w ed e t e r m i n e dt h e c o m p l e t e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o ft h em i t o c h o n d r i a lg e n o m e ( m i t o g e n o m e ) o f p h t h o n a n d r i aa t r i l i n e a t a t h ec o m p l e t em t d n af r o mp a t r i l i n e a t aw a s15 ，4 9 9b a s e p a i r si nl e n g t ha n dc o n - m i n e d13p r o t e i n c o d i n gg e n e s ( p c g s ) ，2r r n ag e n e s ，2 2 t r n ag e n e s ，a n dac o n t r o lr e g i o n t h e1 7 a t r i l i n e a t ag e n e sw e r ei nt h es a m eo r d e ra n d o r i e n t a t i o na st h ec o m p l e t e l ys e q u e n c e dm i t o g e n o m e so fo t h e rl e p i d o p t e r a ns p e c i e s t h en u c l e o t i d ec o m p o s i t i o no fpa t r i l i n e a t am i t o g e n o m ew a sb i a s e dt o w a r da + t n u c l e o t i d e s ( 81 0 2 ) ，a n dt h e13p c g ss h o wd i f f e r e n ta + tc o n t e n t st h a tr a n g ef r o m 7 3 2 5 ( c o x l ) t o9 2 12 ( a t p 8 ) p h t h o n a n d r i ah a dt h ec a n o n i c a ls e to f2 2t r n a g e n e s ，t h a tf o l di nt h et y p i c a lc l o v e r l e a fs t r u c t u r ed e s c r i b e df o rm e t a z o a nm tt r n a s ， w i t ht h eu n i q u ee x c e p t i o no ft m s ( a g n ) t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sw e r e r e c o n s t r u c t e dw i t ht h ec o n c a t e n a t e ds e q u e n c e so ft h e13p c g so ft h em i t o c h o n d r i a l g e n o m e ，w h i c hc o n f i r m e dt h a tpa t r i l i n e a t ai sm o s tc l o s e l yr e l a t e dt ot h es u p e r f a m i l y b o m b y c o i d e a k e yw o r d s ：m i t o c h o n d r i a l g e n o m e ，l e p i d o p t e r a ，g e o m e t r i d a e ，p h t h o n a n d r i a a t r i l i n e a t a i i 中国科学技术大学硕士研究生毕业论文 论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：姓 加盯日 ( 嘲 中国科学技术大学硕士研究生论文 第1 章昆虫线粒体基因组研究进展 1 1 昆虫的线粒体基因组 昆虫的线粒体基因组( m t d n a ) 是共价闭环的双链分子，广泛存在于昆虫体内 富含线粒体的飞行肌和卵等组织细胞中。昆虫的线粒体基因组大小为1 6 k b 左右， 以高拷贝数目存在于线粒体中。其中包含1 2 s 和1 6 s 两个核糖体基因( r r n a ) ，2 2 个转运r n a 基因( t r n a ) ，1 3 个蛋白质编码基因( p r o t e i nc o d i n gg e n e s ) 及1 个包含 复制起点的控$ l j l 又 ( c o n t r o lr e g i o n ) ，称为a + t - r i c h 区。1 3 个蛋白质编码基因包括 1 个细胞色素b 基因，2 个a t p 酶亚基基因( 6 和8 ) ，3 个细胞色素氧化酶亚基 ( c o x l ，c o x 2 ，c o x 3 ) ，7 个n a d h 降解酶基因( n d l 6 及n d 4 l ) ( b o o r e 儿1 9 9 9 ；翟 中和等，2 0 0 0 ) 。 线粒体基因组含细胞色素氧化酶三个亚基基因( c y t o c h r o m eo x i d a s es u b u n i t i ，i i ，i i i c o x l ，c o x 2 ，c o x 3 ) 、细胞色素b 基因、a t p 6 、a t p 8 等1 3 个蛋白基因，它们 都是线粒体内膜呼吸链的重要组分。其中c o x l ，c o x 2 和c o x 3 最保守，对其序列进 行克隆和分析是研究远缘物种分子系统演化和分类的有效基因之一 ( t a a n m a n ，1 9 9 9 ；a n d e r s o n ，1 9 8 1 ；高泽，1 9 8 2 ) 。 线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的、重要的细胞器它是细 胞进行氧化磷酸化的场所。线粒体本身的遗传物质线粒体基因组( m t d n a ) 的发 现为细胞信息结构的研究揭开了新的一页。人们把这一遗传信息系统归于真核细 胞的第二遗传信息系统，或核外基因及其表达系统( 另外还包括叶绿体基因组) ( 高泽，1 9 8 2 ；b o o r e 等，1 9 9 8 ) 。 线粒体d n a 的分子量小，核酸序列和组成比较保守，基因组中不含间隔区 和内含子，无重复序和不等交换：拷贝数多，易于提取，扩增和分析；在遗传过 程中不发生基因重组，倒位，易位等突变，且严格的遵守母系遗传方式，避免了 双亲遗传方式引起的随即性，只需少量个体材料就能反映群体的遗传结构；其基 因的碱基替代率比单拷贝的核d n a 基因组快5 - - 一1 0 倍，其进化速率很快( b o o m 等，1 9 9 8 ；h a s s a n i n ，2 0 0 5 ) 。 由于m t d n a 具有用于系统分类的众多优点：( 1 ) m t d n a 以母系遗传方式遗传。 ( 2 ) m t d n a 进化速度快。与核d n a 相比，m t d n a 更适合做进化生物学研究，特别 对较低分类阶元的研究有优势。( 3 ) m t d n a 基因结构相对简单，便于分析。 f 4 ) m t d n a 结构无组织特异性。因此，线粒体基因组是研究真核生物分子遗传学、 发育生物学和分子进化的重要的模式体系。 中国科学技术大学硕士研究生论文 1 2 昆虫系统分类学 作为生物学的基础之一，物种的分类一直是人们感兴趣的课题之一。自从人 类文明的早期，人们就通过各种方法对于生物进行分类，包括各种形态特征，化 石资料等等，并且逐渐形成较为完善的体系，如创建二名法的林奈根据花中的雄 雌蕊的情况将植物进行分类，同时根据各种特征，包括动物内部解剖结构的观察 对于动物进行了分类。 1 2 1昆虫分类学简介及传统分类学 昆虫纲( i n s e c t a ) 旧称“六足虫纲”，是整个动物界中最大的一个类群。地球 上有1 5 0 余万种动物，昆虫有1 0 0 多万种，占动物总数的8 0 。正是由于昆虫的 数量庞大，形态特征丰富，同时与人们的生活、生产联系紧密，因而昆虫的系统 演化研究一直是动物系统学研究的一个重要领域。 传统分类学对于昆虫品种的鉴定和分类基本依据其体型外貌、地理分布和生 态类型、历史及考古资料。根据中国昆虫分类法，昆虫纲可以分为无翅亚纲 a p t e r y g o t a 和有翅亚纲p t e r y g o t a ，3 3 个目( 包括鳞翅目、直翅目、膜翅目等) 。 1 2 2 现代分子系统发育学研究 随着生物化学和现代遗传学技术的发展，人们己经开始从血液型、酶型、血 液蛋白多态性及染色体特征上研究品种间的差异和亲缘关系。 2 0 世纪6 0 年代，分子系统发育学( m o l e c u l a rp h y l o g e n y ) 的建立开创了利用分 子标记研究生物系统发育的途径。随着分子生物学技术和计算机数据处理技术的 迅速发展，该学科在研究各种生物类群间亲缘关系、起源与进化等方面得到了广 泛的应用( 缪炜等，2 0 0 2 ) 。例如，2 0 世纪9 0 年代以后科研人员通过分子水平研 究了柳珊瑚的分子系统发育学问题，逐步解决了其区系分类方面的争议( 黄晖等， 2 0 0 5 ) 。 随着分子系统发育学的兴起和发展，人们选用众多的分子标记应用于物种的 系统演化和分类研究。目前在分子研究水平采用的遗传标记主要是m t d n a 和 r r n a 。通过对线粒体基因和核r r n a 基因核酸序列的比较分析可以得到相应的 系统发育树，在对传统分类系统进行验证和补充的同时，亦可为传统分类系统中 存在的有争议的，或者形态学尚不能解决的某些类群的系统发育学问题提供新手 段。总之，传统的形态分类仍然是进行深入分类研究的前提和基础，只有将分子 系统学与传统分类学结果结合起来，才有可能对生物多样性做出更好的描述和解 释。 1 3 线粒体在系统发育中的应用 2 中国科学技术大学硕士研究生论文 目前，依据m t d n a 序列进行分子系统学研究国内外已有部分报道。 b u r b r i n k 等通过对北美r a t s n a k e 的线粒体系统学研究，批评了它在传统分类中 的概念，认为它不属于一个亚种。h a s e g a w a 研究认为，长臂猿、猩猩、大猩 猩、黑猩猩与人类祖先分歧的时间分别为1 3 3 0 、1 0 8 6 、3 6 7 和2 6 8 百万年。 d u r a n d 等也进行了龟和海龟等物种的亲缘关系研究。b r e h m 等根据蜥螅的线粒 体核甘酸序列分析了m a b u y as p p 、r e p t i l i a 和s c i n c i d a e 三个亚种的进化关系。 b e r m i n g h a m 讨论了热带淡水鱼与中美洲鱼的起源和进化。在昆虫方面， a i k h i o n b a r e ( 2 0 0 0 ) 测定了麦二叉蚜7 个生物品系的线粒体1 6 s r r n a 、c y t b 、 n d l 、n d 4 基因的部分序列，比较了核苷酸序列，构建了该7 种生物品系的系 群关系。c h a p c o ( 1 9 9 7 ) 沏j j 定了线粒体的部分序列，用简约法和最大似然法分析 了北美斑翅蝗的系统关系及起源问题，并对各个分类单位的分类地位进行了详 细描述。g a r c i a m a c h a d o 等通过比较龙虾和4 种昆虫的线粒体完整的c o x i 基 因序列和部分的c o x 2 、c o x 3 序列，认为甲壳纲十足目的龙虾与昆虫纲的昆 虫在分类上很接近。张亚平院士和瑞典研究小组一起利用线粒体基因分子系统 学研究证实，全世界的狗具有相同的遗传基因，都起源于东亚，之后才逐渐扩 散到世界各地，并使它们今天的认知能力远远超过其他物种，并在s c i e n c e 杂 志上作为封面文章发表。同时，他依据线粒体基因特点，深入研究灵长类、食 肉类、兔形类和啮齿类的进化，在国际上建立了第一个较为全面的熊超科分子 系统树，阐述了大熊猫等的进化地位。 另外，在国家自然科学基金资助下( 编号：3 0 0 5 0 0 0 1 ) ，陆剑等依据线粒体 c o x l i 基因序列进行了金色果蝇复合种的5 个姊妹种及其近缘种的分子系统分 析，并推算出他们的分化时间。张保卫等在国家杰出青年基金( n o3 0 1 2 5 0 0 6 ) 资 助下，依据线粒体c y tb 序列进行了鹭科鸟类的系统学分析。鲍蕾、牛翠娟等 【1 6 】依据线粒体c o xi 基因部分序列进行了四种臂尾轮虫的系统发育关系分析 ( 国家重点基础研究规划项目g 2 0 0 0 0 4 6 8 0 4 ) ，认为中方形臂尾轮虫和壶状臂 尾轮虫的亲缘关系最近，矩形臂尾轮虫次之，萼花臂尾轮虫最远。陈晓芳等依 据线粒体细胞色素b 基因序列对1 2 种鸟类进行了分子系统发育关系分析( 国 家自然科学基金资助，编号：3 9 9 7 0 3 8 9 ) ，包括蒙古沙、环颈、大杓鹬、白腰杓 鹬、中杓鹬、红脚鹬、林鹬、翘嘴鹬、翻石鹬、大滨鹬、反嘴鹬和砺鹬，分子 系统分析的结果验证并补充了形态学的分析结果。 1 4 分子进化树的构建 目前研究分子系统学的一个很重要的内容就是构建分子进化树。进化树 中国科学技术大学硕士研究生论文 ( e v o l u t i o n a r yt r e e ) ，又名系统树( p h y l o g e n e t i ct r e e ) ，是包括生命科学中的进化论、 遗传学、分类学、分子生物学、生物化学、生态学及数学中的概率论、图论、计 算机科学和群论交叉形成的边缘领域。以不同物种的分子数据( 如d n a ) 为依据构 建的进化树称为分子进化树( r z h e t s k y1 9 9 4 ) 。通过d n a 序列分析研究生物的 进化过程，确立物种间的进化关系具有许多优越性。d n a 仅仅由4 种碱基基本结 构单位组成，其序列的异同是明确无误的，因而易于分析；d n a 序列含有丰富的进 化信息，如有些物种含有1 0 1 1 个碱基对；d n a 序列相对易于获得，特别是随着近年 来p c r 技术的应用以及人类基因组计划的实施，d n a 序列正以爆炸性的速度积 累起来。因此，基于d n a 序列的分子进化树的构建已成为生物系统研究中最重 要的工具之一。 1 4 1 系统树的构建的几种策略及检验 构建分子系统发育树的分析方法主要有三种：简约法( p a r s i m o n y ) 、距离法 ( d i s t a n c e ) 并l 似然法( 1 i k e l i h o o dm e t h o d ) 。简约法中常用的是最大简约法( m a x i m u m p a r s i m o n y ，可用m e g a 软件获得；距离法中的邻接法( n e i g h b o r j o i n i n g ，n j ) 和不 加权对群分析法( u n w e i g h t e dp a i rg r o u pw i t hm a t h e m a t i c a la v e r a g e ，u p g m a ) 最为 常用，其中邻接法可用m e g a 软件计算；似然法中影响最大的是最大似然法 ( m a x i m u ml i k e l i h o o dm e t h o d ) ，可用p a u p 软件中d n a m l 程序执行。 1 4 2 邻接法 邻接法是一种快速的聚类方法。该方法的基本思想是：在进行类的合并时， 不仅要求待合并的类是相近的，同时，还要求待合并的类远离其他类。在聚类过 程中，根据原始距离矩阵，根据所有节点间的平均趋异程度，对每两个节点间的 距离进行调整，即将每个分类单元的趋异程度标准化，从而形成一个新的距离矩 阵。重建时，将两个距离最小的子节点连接起来，合并这两个叶节点所代表的分 类，形成一个新的分类。在树中增加一个父节点，并在距离矩阵中增加新的分类， 同时删除原来的两个分类。随后，新增加的父节点被看成子节点，重复上一次循 环。在每一次循环中，都有两个子节点被父节点所取代，两个类被合并成一个新 类。整个循环直到只剩下最后一个类为止。从所得到的系统发生树来看，对于两 个聚在一起的分类单元，其所在的子节点到父节点的距离并不一定相等。该方法 是s a i t o u 和n e i 于1 9 8 7 年首次提出的( s a i t o u 等，1 9 8 7 ) 。与非加权分组平均法 相比，邻接法在算法上相对复杂，它跟踪的是树上的节点而不是分类单元。 1 4 3 最小进化法 最小进化法从所有可能的进化树中挑选树长最短的作为最优树，是相对好的 方法【5 】。 1 4 4u p m g a 法 4 中国科学技术大学硕士研究生论文 u p m g a 法又称非加权分组平均法，是一种较为常用的聚类分析方法，最早 是用来解决分类问题的( s n e a t h ，1 9 7 3 ) 。使用该方法的前提条件是稳定的进化 率。在非加权分组平均法中，在计算新分类到其他分类之间的平均距离是按照各 个分类的数目进行加权处理。 1 4 5 最大简约法 最大简约法最早是基于形态特征分类的需要而发展起来的，该方法利用的是 对简约分析能提供信息的特征，如在d n a 序列数据中，利用的只是存在于核苷 酸序列差异的位点，即简约信息位点。利用最大简约法构建系统发生树，实际上 是一个对给定的分类单元所有可能的树进行比较的过程。针对某一个可能的树， 首先对每个位点祖先序列的核苷酸组成做出推断，然后统计每个位点用来阐明差 异的核苷酸最小替换数目。在整个树中，所有简约信息位点的最小核苷酸替换树 的总和称为树的长度或树的代价。通过所有可能的树，选择其中长度最小，代价 最小的树作为最终的系统发生树，即最大简约树( f i t c h ，1 9 7 7 ) 。 1 4 6 自举检验 由于不同的方法构建系统树时存在一定的偏差，因而有学者建议采用多种方 法同时建树。若多种方法所获的系统树一致，将大大提高结果的可靠性。若不一 致，则应该进行检验，最主要的检验方法是自举检验法( f e l s e n s t e i n ， 1 9 8 5 ) 。 通过系统发生分析推断出的树的不同部分可能有不同的置信度。自举检验是一种 重抽样技术，能粗略地量化这些置信度水平。 1 5 鳞翅目昆虫 鳞翅目包括蛾、蝶两类昆虫。属有翅亚纲、全变态类。全世界已知约2 0 万 种，中国已知约8 0 0 0 余种。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2 个大目。分布 范围极广，以热带种类最为丰富。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形 较大者常食尽叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或 钻入植物组织取食为害。成虫多以花蜜等作为补充营养，或口器退化不再取食， 一般不造成直接危害。 鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 是昆虫纲中第二大的目，全世界已知有十四万种左 右，我国已有记载的约两万种，由于身体和翅膀上被有大量鳞片而得名。属完全 变态昆虫：一生经历卵、幼虫、蛹、成虫等阶段。幼虫多以植物为食，成虫则以 虹吸式口器吸食花蜜。 蛾类是鳞翅目中最大的类群，占到鳞翅目种类的9 1 0 左右。另一主要类群 是蝴蝶。蝴蝶是日间活动的鳞翅目昆虫，通常可以从它们明亮的色彩和棒状的 中国科学技术大学硕士研究生论文 触角，以及它们休息的方式一一四翅合拢，树立于背上来辨别。世界上蝴蝶已 知种类有1 7 0 0 0 种左右，都是些惹人瞩目的昆虫。我国的蝴蝶种类有1 3 0 0 余种。 鳞翅目昆虫大多数种类与国民经济有重大关系，如螟虫、粘虫、松毛虫和菜 粉蝶和黑纹粉蝶等，为农林植物的重要害虫；家蚕、柞蚕和蓖麻蚕等，是著名的 资源昆虫；蝴蝶和部分蛾类的体色艳丽，形状奇特，具有很高的观赏价值。同时 鳞翅目昆虫种类繁多，变异丰富，分布广泛，适应性强，是生物地理学、生态学 及生物进化研究的重要对象。 桑尺蠖p h t h o n a n d r i aa t r i l i n e a t a 是桑树芽叶的重要害虫之一，鳞翅目、尺蠖蛾 科，别名桑搭、造桥虫。成虫体长1 6 2 0 毫米，灰褐色，翅面散生黑色短纹，并 具黑色波浪形斜走横纹。卵扁平椭圆形，长径0 8 毫米，幼虫体圆筒形，前细后 粗。背面散有黑色小点，腹足2 对，着生在第6 、1 0 腹节上。蛹圆筒形，长1 9 毫米，紫褐色，具粗糙不规则的皱纹，臀棘略呈三角形，茧浅褐色，茧层疏薄。 它的生活习性是在江苏、浙江省1 年发生4 代，以第4 代幼虫潜入树隙或平伏枝 上越冬。次年3 、4 月之交开始活动，剥食桑芽，桑芽萌发后为害桑叶，再脱2 、 3 次皮后化蛹。越冬代成虫于5 月中旬产卵，下旬孵化，以后各代分别于7 月上 旬、8 月中旬、9 月下旬出现幼虫，1 1 月上旬开始蛰伏越冬。卵多产在枝顶嫩叶 反面，群集一处，一叶上多至5 0 0 余粒，卵期4 - 9 天。幼龄幼虫日夜为害。成虫 夜间活动，有趋光性。 桑尺蠖分布中国、朝鲜、日本；中国山东、山西、安徽、江苏、浙江、台湾、 湖北、广东、四川、贵州等省均有发生。寄主为桑树。 1 6 鳞翅目昆虫线粒体全基因组进展 检索g e n b a n k 数据库，目前共1 0 个鳞翅目昆虫的线粒体全基因组全序列已 经测定，分别为凤蝶总科的黑纹粉蝶a r t o g e i am e l e t e ( h o n g 等，2 0 0 8 ) 和韩国 细纹蝶c o r e a n ar a p h a e l i s ( k i me ta 1 ，2 0 0 6 ) ，天蛾总科的烟草天蛾m a d u c as e x t a ( c a m e r o na n dw h i t i n g ，2 0 0 8 ) ，蚕蛾总科的柞蚕a n t h e r a e ap e r n y i ( l i ue ta 1 ，2 0 0 8 ) 、 野蚕b o m b y xm a n d a r i n a 和家蚕b o m b y xm o r i ( y u k u h i r oe ta 1 ，2 0 0 2 ) ，螟蛾总科的 亚洲玉米螟o s t r i n i af u m a c a l i s 和欧洲玉米螟o s t r i n i an u b i l a l i s ( c o a t e se ta 1 ， 2 0 0 5 ) ，卷蛾总科的茶小卷叶蛾a d o x o p h y e sh o n m a i ( l e e e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。鳞翅目昆虫 线粒体基因组基因组成、a t 含量、结构等基本类似，但也存在一定的差别，如 韩国细纹蝶c o r e a n ar a p h a e l i s 比其它鳞翅目昆虫多一个t r n a 。 目前，桑尺蠖线粒体基因组至今尚没有报道，本研究采用l a p c r 方法获得 桑尺蠖线粒体基因组长片断，进一步作为模板，进行p c r ，获得不同区域的p c r 6 中国科学技术大学硕士研究生论文 产物，序列测定后进行拼接，获得桑尺蠖线粒体全基因组序列。对序列进行分析， 探讨鳞翅目昆虫系统发育关系。 中国科学技术大学硕士研究生论文 2 1 实验昆虫 第2 章材料与方法 桑尺蠖幼虫从安徽省农业科学院蚕桑研究所的桑园内捕捉获得的，经相关专 家鉴定后，直接用于抽提基因组d n a 。 2 2 主要试剂 d n a 抽提试剂盒( t a k a r a 公司) 、p c r 反应试剂盒( i n v i t r o g e n 公司) 、引 物( t a k a r a 公司合成) 、d n a 回收试剂盒( a x y g e n 公司) 、p m d l 8 一t 载体( t a k a r a 公司) ；琼脂糖、e b 、6 上样b u f f e r 、d n a m a r k e r 、胰化蛋白胨、酵母提取物、 n a c l 、氨苄青霉素、c a c l 2 、甘油、液体石蜡等均从南京生兴生物技术有限公司。 2 3 主要仪器 a l l e g r a r m6 4 r 台式冷冻离心机( b e c k m a nc o u l t e r t m ) 、l i f ee x p r e s s 基因扩增仪、s w - c j 1 d 型单人净化工作台、t a n o n 水平电泳槽、d y y - 6 b 型稳 压稳流电泳仪、z f a 3 型紫外透射反射分析仪、r j t g l 1 6 b 离心机、电热恒温 培养箱、h q 4 5 z 恒温摇床、h h s 恒温水浴锅、制冰机、旋涡混合器( q l 一9 0 1 ) 、 l x 1 0 0 手掌型离心机等。 2 4 桑尺蠖基因组d n a 抽提方法 基因组d n a 抽提采用t a k a r a 试剂盒抽提，具体步骤如下： ( 1 ) 准备6 5 的水浴锅，s o l u t i o nc 置4 c 预冷； ( 2 ) 取一黑纹粉蝶蛹剪下其头部置于冰上预冷的匀浆器中，加7 0 0 u ls o l u t i o na ， 充分研磨； ( 3 ) 加入1 8 u l 的r n a s e a ； ( 4 ) 6 5 保温5 m i n ： ( 5 ) 加入4 0 0 u ls o l u t i o nb ，振荡混匀； ( 6 ) 加l m l 4 预冷的s 0 1 i o nc ，充分混匀后，1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n ； 中国科学技术大学硕士研究生论文 ( 7 ) 弃上层有机相，然后将水相溶液( 无色下层) 转移至f i l t e rc u p ( 置于c o l l e c t i o n t u b e 上) 中，1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i r a ( 8 ) 弃f i l t e rc u p ，在滤液中加4 0 0 1 x ld b - - b u f f e r ，混匀； ( 9 ) 将s p i nc o l u m n 置于c o l l e c t i o nt u b e 上，再将步骤8 得到的混合液转移至s p i n c o l u m n 中静置l m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i m 0 0 ) 向s p i nc o l u m n 中加5 0 0 1 x l r i n s e a ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，弃滤液； ( 1 d 向s p i nc o l u m n 中加7 0 0 1 x l r i n s e b ，12 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，弃滤液； 重复步骤( 1 d ； 将s p i nc o l u m n 置于新的1 5 m l 的离心管上，加入6 5 c 温育的1 0 0 u l 的e l u t i o n b u f f e r ，室温静置l m i n ； 1 2 0 0 0 r p m 离心1 m i n ( 洗脱d n a ) ； 取5 u l 电泳检测，其余2 0 冷藏备用 2 5 引物设计 首先，根据h u a n g 等( 2 0 0 1 ) 长片断扩增线粒体基因组的方法，首先合成 引物1 6 s a a 和1 6 s b b ( 表1 ) ，利用桑尺蠖基因组d n a 作为模板，扩增1 5 k b 的p f l 长片断。然后再1 5 k b 的p f l 长片断作为模板，扩增其他p f 2 一p f l 2 片断。 利用引物p f l 3 f p f l 3 r 扩增p f l 3 片断。引物序列及长度见表1 。 表l 扩增桑尺蠖线粒体全基因组的引物及序列 t a b l elp r i m e r su s e df o ra m p l i f i c a t i o no ft h ep h t h o n a n d r i aa t r i l i n e a t am i t o c h o n d r i a lg e n o m e s f r a g m e n t p r i m e rp r i m e rs e q u e n c e s i z e ( k b ) p f l p f 2 p f 3 p f 4 p f 5 p f 6 p f 7 1 6 s a a 1 6 s b b 1 6 s a a p f 2 r p f 3 f p f 3 r p f 4 f p f 4 r p f 5 f p f 5 r p f 6 f p f 6 r p f 7 f p f 7 r a t g c t a c c t 丌g c a c r g t c a a g a t a c y g c g g c c 1 v r a t c g a v a a a a a a g w t t g c g a c c t c g a t g t t g a t g c t a c c l v r t g c a c r g t c a a g a t a c y g c g g c a c t a g g d t a g a i a c c c t a t t c c a g t a c c tc t a c t t t g t ta c g t c a ( a g ) a a a t g ( a g ) a a ( g t a ) g g ( g t ) g c t g a t c c t a t t o a t t t g g ( t a g ) t g t t g a a t t g g ( a c ) ( t c ) t a g a a g c t c c t a a a a l v r g a a g a a a l v r c c a g c t g g t g c a g g a a c a g g a t g a a c g a g a c c a ( g f r ) t a c t t g c t t t c a g a 1 1 t g t g g a g c t aa t c a r a g g g t c a g g g ( t a ) c t a t a a t c ( t c ) a c t c g a c c t g g a a c t i v r ag c t g g a r c a a a t c c a c a r t c a 9 3 8 6 9 l 2lll-l 中国科学技术大学硕士研究生论文 2 6 p c r 扩增反应 扩增p f l 长片断采用l at a q 进行扩增，反应体系及反应条件如下：9 6 预 变性2m i n ，然后9 8 变性1 0s ，5 8 条件下1 5m i n ，3 0 个循环；再7 2 延 伸1 5m i n p f 2 - - p f l 3 扩增条件及体系为：9 44 c 预变性，5 分钟；9 4 c 变性- - 4 0 秒、 5 5 c 复性- - 4 0 秒、7 2 。c 延伸一1 分钟3 0 秒( 3 5 个循环) ；7 2 充分延伸，1 0 分 钟。反应体系见表2 。 表2p c r 扩增体系 t a b l e2t h ec o n t e n t so fp c r 2 7 p c r 产物回收 利用a x y g e n 试剂盒进行p c r 产物回收。p c r 产物电泳后，在紫外条件下， 1 0 中国科学技术大学硕士研究生论文 用手术刀切出目的片段，再用a x y g e n 胶回收试剂盒回收，回收方法依照说明书 进行： 在紫外灯下切下含有目的d n a 片段的琼脂糖凝胶，放进1 5 m l e p 管里。 在e p 管内加入4 0 0 p j 的d e a ( 凝胶融化及剂) 混合后于7 5 * ( 2 下加热，间断混 合。( 每2 3 分钟) 直至胶完全融合。 加入o 5 个b u f f e rd e a 体积的b u f f e rd e b 混匀( 当分离的d n a 片断小于 4 0 0 b p 时，加入1 个凝胶体积的异丙醇) 。 吸取中的混合物，转移到d n a 制备管中( 制备管置于2 m l 离心管中) ， 12 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃滤液。 将制备管放回离心管中，加入o 5 m l b u f f e rw 1 ，1 2 0 0 0 r p m 离心，3 0 秒，弃滤 液。 将制备管放回离心管中，加入o 7 m l b u f f e rw 2 ，1 2 0 0 0 r p m 离心，3 0 秒，弃滤 液。 将制备管置于2 m l 离心管中，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n 。 将制备管置于洁净的1 5 m l 离心管中，在d n a 制备膜中央加2 5 3 0 “le l u e n t ， 静置l m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，洗脱d n a 。 电泳检测纯化结果 2 8 连接 取1 斗l 回收的p c r 产物，按照p m d l 8 t 载体试剂盒说明书( 见下面) ，1 6 连接 1 小时以上： 组分加入量 p m d l8 - t 载体 p c r 产物 l i g a t i o nm i x 1p l 2 5p l 3 5 p l p m d l 8 t 载体图如图所示( 注：p m d 1 8 t 载体具有a m p 抗性) ： 中国科学技术大学硕士研究生论文 p m d l8 - t & v e c t o r 的结构 f j 州。一t j h - q _ 麴! 船i t l j e l 3 日7 1 _ 苎l 一挈屿r 苎生挈吐l 掣擘生r - 神- - - - 1 叫。生陋骂塑娑 仙蹦删 僦一一伽m 蛐粗n 删陇m 耵k 一“。“一“州“h 础r “涮“h “却“ ”舢“ 协j f ： 矗“_ t 鼬“谴疆 二m 仕m 疆订矾1 饼誓 批】m 舭 l n 一，蚵自哦v + 乏= 名竺箸鬻箸蛳 l 粕“h i i - - 咿曲叼h r t 时l 疆耵i t 。t “口4 哆? | t 一6 。龋口赫。 f i 曲嘲_ m 舢j t l “：t di l 哪r t n t l 口口， 。 2 9 转化 a 感受态细胞制备( c a c l 2 法) 取已培养的菌种x l 1l m l 加入到l o o m ll b 培养基中，2 5 0r p m3 7 。c 摇床振荡培 养2 5h 。分光光度计测量o d 6 0 0 值，使其在0 4 - - 0 6 左右( 实测值为0 5 5 ) ； 5 0 0 0r p m 4 c 离, t 二, 5 m i n ； 弃上清，加1 0 m l1 0 0 m m 的c a c l 2 ( 加之前需要冰上预冷) ； 50 0 0r p m4 c 离- t ) , 5 m i n ，弃上清； 加入2 m l1 0 0 m m 的c a c l 2 ( 含2 0 的甘油) ； 每管2 0 0 r t l 分装，送7 0 c 的低温冰箱冷藏。 注：所有操作都需要保持低温，同时必需无菌操作，以防止染菌。 b 转化过程 取连接混合物3 5 肛l 加到2 0 0p l 上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀； 冰浴3 0m i n ； 再进行热休克( 4 2 。c 保温9 0s ) ； 迅速置冰上2m i n ： 加入5 0 0p 1 已温育至3 7 的l b 培养基； 3 7 。c ，1 5 0 r p m 振荡培养1 ：， 稍离心，用枪吸去5 0 01 t l 上清后，把剩余菌液混匀，然后涂布于l b ( 含氨苄青 霉素) 平板上； 3 7 正置培养1 小时； 3 7 倒置培养过夜。 c 菌液培养 取培养的平板( 一般培养1 8 小时以上，有明显、均匀的单菌落) ，每板用无 1 2 中国科学技术大学硕士研究生论文 菌牙签挑取4 个单菌落，分别置于3m l 的l b 培养液中( 每管培养液加3 u l 的氨 苄青霉素) ，3 7 ( 2 ，2 5 0 r p m 振荡培养过夜。 2 10 p c r 鉴定阳性克隆 取出已培养过夜的菌液，分别用原来扩增的引物进行p c r 反应，直接用菌 液作为模板，用1 琼脂糖凝胶电泳p c r 产物，观察是否有目的条带。 2 1 1 煮沸法质粒d n a 小量抽提 接单菌落到3 m ll b 培养基中，振荡培养过夜； 取1 5 m l 菌液，1 2 0 0 0 9 离心3 0 s ； 倒出菌液，纸巾上倒置干燥； 加3 5 0 肛ls t e t 重悬( 5 4m ls t e + 2 7 0 山t r i t o n x 1 0 0 ) ，加2 5 l 1 新配溶菌酶， 振荡混匀，冰上5 m i n ( 3 7 5 m g + 3 7 5 “l1 0 m mt r i s h c l h8 o ) ) ； 沸水4 0 s ，冰上5 r a i n ； 4 c ，1 2 0 0 0 9 ，离心1 5 m i n ，无菌牙签挑去细菌碎片； 等体积酚、酚氯仿、氯仿各一次； o 1 体积3 mn a a c ( p h 5 2 ) 和2 5 体积乙醇( 或等体积异丙醇) ，一2 0o c ，1 0 m i n ， 1 2 0 0 0 9 ，4o c 离心1 5 m i n 回收核酸。 l m l7 0 乙醇，干燥，加入3 0p l 含2 0l x g m lr n a s e 的t e 重溶，3 7o c 放3 0 m i n 。 取5 1 a l 电泳。 2 1 2 桑尺蠖线粒体基因组片断序列测定 对获得的阳性克隆继续进行培养( 3 7 c ，2 5 0 r p m ，一般1 0 1 2 小时以上) ， 取菌液送i n v i t r o g e n 生物公司进行序列测定。 2 13 桑尺蠖线粒体基因组拼接及序列分析 对于测得的核苷酸序列，首先利用n c b i 数据库进行b l a s t 分析，并用 d n a s t a r 软件的e d i t s e q 程序将序列片断调整为正向。然后采用m u l t a l i n v e r s i o n5 4 1 软件( h t t p ：p r o d e s t o u l o u s e i n r a f r m u l t a l i n m u l t a l i n h t m l ) 拼接序列 片断( 图1 ) ，得到相应的全长序列。 中罔科学技术大学顾研究生蛇文 图i 利用m u l t a l i n 在线分析线粒律基因组基园o k f f i g u r elp r c d i c c i o n o f t h e o r f o f m i t o c h o n d r i a l g e n o m e 2 1 4 桑尺蠖线粒体基因组编码基因的注释 1 3 个蛋白编码基因注释方法：首先利用m u l t a l i n v e r s i o n5 41 软件进行同源 比较，确定桑尺蠖1 3 个蛋白基因位置，将确定的基因序列的编码框输八 d n a m a n 软件，选择i n s e c tm i t o c h o d r i a l 遗传密码表进行捌译获得对应的氨基酸 序列。 t p , n a 基因注释方法：利用t r n a s c a n s es e a r c hs e f e r 在线搜索 ( h t t p ：l o w e l a bi l c s ce d u t r n a s c a n s e 0 ( l o w ee