（分析化学专业论文）小波分析技术在我国近海浮游藻群落组成荧光识别测定中的应用.pdf

小波分析技术在我国近海浮游藻群落组成荧光识别测定种的应用 摘要 近年来我国近海赤潮频发，制约了我国沿海近海省市的发展。迫切需要一种现场、 实时、快速的针对引发赤潮的浮游植物的群落组成监测技术，以便及时采取措施，减少 损失。浮游植物的三维荧光光谱包含了浮游植物丰富的特征信息，并且基于荧光光谱的 分析方法具有灵敏度高，对仪器要求不高，前处理简单等优点，在浮游植物群落组成的 实时、快速测定方面有很好的应用前景。但目前基于浮游植物荧光光谱的识别技术还存 在能识别的浮游植物类别少，分类太宽泛等不足，在我国近海的特定浮游植物群落组成 监测中的应用具有局限性。 本文在针对我国近海海域浮游植物群落组成特点的基础上，选择我国近海常见的分 属于7 个门，3 2 个属的4 3 种浮游植物进行培养，获得活体浮游植物的三维荧光光谱。 对同种浮游植物的荧光光谱的精密度，不同浮游植物的荧光光谱的差异性进行分析，阐 述了浮游植物的三维荧光光光谱对浮游植物的识别的可行性；利用小波分析技术，选择 两个正交小波，一个双正交小波分别建立我国近海常见浮游植物的定性识别技术。取得 的成果如下： 1 以相对标准偏差( r s d ) 对同种浮游植物的荧光光谱的稳定性进行分析，方差分析 对不同浮游植物的荧光光谱进行分析。证明大多数浮游植物的荧光光谱稳定性较好， 而不同浮游植物之间的荧光光谱存在显著性差异，应用浮游植物的荧光光谱对浮游 植物进行识别是可行的。 2 正交小波系选择c o i f 2 系列和s y m l e t 系列进行了研究。选择了c o i f 正交小波系列 对浮游植物的荧光光谱的特征提取具有更好的选择的c o i f 系列，s y m l e t 系列进行了 研究。选择c o i f 正交小波系列分解效果最好的c o i f 2 小波对浮游植物荧光光谱进行 5 分解，利用系统聚类法，建立了浮游植物门、属水平上的二级标准谱库，同时尺度 分量和小波分量的标准谱库之间，进行互补( 实际为4 层谱库) 。在此基础上，利用 非负最小二乘法建立了浮游植物荧光识别技术。对实验室培养的单种藻样品的总识 别j 下确率在门水平上达到9 5 以上，属水平上达到8 9 以上；对模拟混合藻样品光谱 的优势藻的总识别正确率，门水平上在9 0 以上，属水平上的在8 0 以上，对实验室 实际混合藻样品的识别正确率，在门水平上达到8 5 以上，在属水平上达到7 5 以上。 可对现场样品中藻细胞浓度超过5 x 1 0 6 c e ul 1 ( 发生赤潮时) 时，赤潮优势种进行属 水平上的识别。采用s y m l c t 系列正交小波中分解效果最好的s y m l e t 7 小波对浮游植 物的荧光光谱进行分解，采用和c o i l 2 小波同样的技术建立方法，建立基于s y m l e t 7 小波的浮游植物荧光识别技术。对实验室培养的单种藻样品进行识别，在门上可以 得到9 5 以上的正确率，属水平上得到8 5 以上的正确率。对模拟混合藻样品光谱 的优势藻的总识别正确率，门水平上在9 0 以上，属水平上的在8 0 以上。对实验室 实际混合藻样品的光谱的优势藻的识别正确率，在门水平上达到9 0 以上，在属水平 上达到7 5 以上。可对现场样品中藻细胞浓度超过5 x 1 0 6 c e l ll - 1 ( 发生赤潮时) 时， 赤潮优势种进行属水平上的识别。 3 对b i o r 双正交小波族的小波进行分析，选择特征提取效果最好的b i o l r l 1 小波。 基于系统聚类法进行门属水平上的二级标准谱库，使用非负最小二乘法，建立浮游 植物的荧光识别技术。对实验室培养的单种藻样品进行识别，在门上可以得到9 5 以上的正确率，属水平上得到8 5 以上的正确率。对模拟混合藻样品光谱的优势藻 的总识别正确率，门水平上达到达到9 0 以上，属水平上的在7 5 以上，对实验室实 际混合藻样品的识别正确率在门水平上达到8 5 ，在属水平上达到7 5 以上。可对现 场样品中藻细胞浓度超过5 x 1 0 6 c e l ll - 1 ( 发生赤潮时) 时，赤潮优势种进行属水平上 的识别。通过和两个基于正交小波建立的识别技术得到的结果比较发现，双正交小 波的识别作用在总体水平上不如正交小波，但是对正交小波识别不好的部分浮游植 物的识别，具有互补作用。 4 研究了三种小波识别技术的互补性：c o i f 2 小波对单种藻样品，混合藻以及模拟混合 藻样品光谱的优势藻的识别在总体水平上的优于其他两种小波。但是s y m l e t 7 和 b i o r l 1 小波对c o i f 2 小波有补充作用。特别是b i o r l 1 小波在混合样品的识别上对 c o i f 2 小波的互补作用非常明显。基于三种小波的互补性，建立了三种小波的门属水 6 平上的互补标准谱库。采用互补标准谱库后，单种浮游植物的c s ，d b ，s e ，k b ，m a ，c y 的识别正确率得到了提高。单种浮游植物的识别种可实现单种藻样品在门水平上达 到9 7 2 ，属水平上达到9 1 7 ；模拟混合藻光谱的识别中， c u ，d e ，c a ，o c ，c f ，t w ，d s ，p d ，g s 的识别j 下确率获得了提高，模拟混合藻光谱的识别在 门水平上达到9 5 o ，属水平上达到8 5 2 ；实验室实际混合藻的识别过程中， s k ，t r ，m a ，a m 的识别j 下确率获得了提高，对实验室实际混合藻的识别在门水平上达到 8 6 5 ，属水平上7 8 5 ；。 本文的创新之处为，基于浮游植物活体三维荧光光谱，利用正交小波函数c o i f 2 ， s y m l e t 7 和双正交小波函数b i o r l 1 构建浮游植物荧光特征谱库，建立浮游植物群落组成 荧光识别测定技术，该技术能够在未发生赤潮时在门类的水平上识别测定浮游植物群落 组成，而在发生赤潮时能够在属的水平上识别引发赤潮的浮游植物。 关键词：浮游植物，荧光光谱，小波分析，b a y e s 分析，非负最小二乘法 7 f l u o r e s c e n c ed i s c r i m i n a t i o nt e c h n i q u eb a s e do nw a v e l e ta n a l y s i sf o r t h ep h y t o p l a n k t o ni nt h ec o a s t a lw a t e r so fc h i n a a b s t r a c t p h y t o p l a n k t o na r em i c r o s c o p i cp l a n t sw h i c ha l ea q u a t i c ，u n i c e l l u l a r s o m eo ft h e ma r e t h er e a s o no fh a r m f u la l g a lb l o o m s ( m b s ) r e c e n t l y , t h en a b sh a db e c o m eav e r ys e v e r e p r o b l e mi nt h ec o a s t a lw a t e r so fc h i n a ，a n dr e t r i c kt h ed e v e l o po ft h el i t t o r a l se c o n o m y i th a d b e c a m ea nu r g e n tn e e df o rd e t e r m i n i n gt h ea l g a ec a u s i n gh a n si na c t u a ll o c a l e ，r a p i d l ya n d r e l i a b l y , s ot h a tw ec a nt a k e a v a i lm e a s u r et or e d u c i n gt h ei n f l u e n c eo fh a b s t h e e x c i t a t i o n - e m i s s i o nm a t r i x e s ( e e m s ) c a np r o v i d ea b u n d a n ti n f o r m a t i o n ，a tt h es a m et i m e h a v eh i g l ls e n s i t i v i t y 、s e l e c t i v i t ya n dn e e d l e s so fc o m p l i c a t e dp r e - d i s p o s e i tc a ns a t i s f yt h e r e q u i r e m e n t so fa c t u a ll o c a l ea n dr e a lt i m e b a s e do nt h ea n a l y s i so ft h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ep h y t o p l a n k t o nc o m m u n i t i e si nc o a s t a l w a t e r so fc h i n a ，i nt h i sp a p e rf o r t y t h r e ea l g a ew h i c ha l ef a m i l i a ri nc o a s t a lw a t e r so fc h i n a a r es e l e c t e da n dc u l t u r e di nt h el a b t h e yb e l o n gt os e v e nd i v i s i o n sa n dt h i r t y - t w o g e n e r a a f t e rm e a s u r i n gt h e3 d - f l u o r e s s c e n c es p e c t r a , a n a l y s i st h es t a b i l i t yo ft h ee e m so f t h es a m ep h y t o p l a n k t o na n dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e ne e m so fd i f f e r e n tp h y t o p l a n k t o n ，t h e n e x p o u n dt h ef e a s i b i l i t y o fu t i l i z a t i o nt h ee e m si nt h ei d e n t i f i c a t i o no ft h ef a m i l i a r p h y t o p l a n k t o no fc h i n e s ec o a s t a lw a t e r b a s e do nt h ef e a s i b i l i t y , t h r e ew a v e l e t sa l es e l e c t e d t ob eu t i l i z e di nt h ea n a l y s i so ft h ee e m so fp h y t o p l a n k t o n t h ei d e n t i f y i n gm e t h o d so ft h e f a m i l i a rp h y t o p l a n k t o ns p e c i e so fc h i n e s ec o a s t a lw a t e ra l ee s t a b l i s h e dw i t hu t i l i z a t i o no f w a v e l e ta n a l y s i s ，a tt h es a m et i m ee s t a b l i s h e dt h ep r i m a r ys e m i q u a n t i t a t i v ef l u o r e s c e n c e m e t h o d t h em a i nc o n c l u s i o n so ft h i sp a p e ra l ea sf o l l o w s ： 1 u t i l i z i n gt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) t oa n a l y s i st h es t a b i l i t yo fe e m s o ft h e s a m ep h y t o p l a n k t o n ，a n dt h ea n a l y s i so fv a r i a n c e ( a n o v a ) t oa n a l y s i st h ed i f f e r e n c eo f t h ee e m so fd i f f e r e n tp h y t o p l a n k t o n t h er e s u l t sp r e s e n tt h a tm o s tp h y t o p l a n k t o np r e s e n t g o o ds t a b i l i t i e si nt h es a m es p e c i e sa n ds i g n i f i c a n c ed i f f e r e n c eb e t w e e nd i f f e r e n ts p e c i e s 8 t h em e t h o db a s e do nt h ee e m so fp h y t o p l a n k t o nt oi d e n t i f y i n gt h es p e c i e si sf e a s i b l e 2 t w oo r t h o g o n a lw a v e l e t s ( c i o f 2a n ds y m l e t 7 ) w h i c hh a v eb e t t e ra b i l i t yo ff e a t u r e e x t r a c t i o na r es e l e c t e dt od e c o m p o s et h ee e m so ft h ep h y t o p l a n k t o n c l u s t e r i n ga n a l y s i s i su t i l i z e dt oe x t r a c tt h er e f e r e n c es p e c t r at oe s t a b l i s ht w o - r a n kd a t a b a s eo fr e f e r e n c e s p e c t r ao nt h el e v e lo fd i v i s i o na n dg e n e r a b a s e do nt h ed a t a b a s e s ，af l u o r e s c e n c em e t h o d f o ri d e n t i f i c a t i o no fp h y t o p l a n k t o ns p e c i e si se s t a b l i s h e dw i t hu t i l i z i n gt h en o n n e g a t i v e l e a s ts q u a r e s ( r 州l s ) t h er e s u l t st h em e t h o dc a ni d e n t i f y i n g ：m o r et h a n9 2 a tt h el e v e l o fd i v i s i o na n dm o r et h a n8 3 a tt h el e v e lo fg e n u s s o m ep h y t o p l a n k t o ns p e c i e sc a nb e i d e n t i f i e da tt h el e v e lo fg e n u sb yt h ef l u o r e s c e n c em e t h o dw h e nt h ec e l ld e n s i t ya b o v e 5 x 1 0 6c e l ll - 1i na c t u a ls e aw a t e r ss a m p l e s 3 b i o r l 1w h i c hh a sb e t t e ra b i l i t yo ff e a t u r ee x t r a c t i o na r es e l e c t e df r o mt h eb i o r t h o g o n a l w a v e l e t s u t i l i z i n gt h ec l u s t e r i n ga n a l y s i sa n dn o n n e g a t i v el e a s ts q u a r e s ( n n l s ) t o e s t a b l i s hf l u o r e s c e n c em e t h o df o ri d e n t i f i c a t i o no fp h y t o p l a n k t o n t h er e s u l t sp r e s e n tt h a t t h ei d e n t i f i c a t i o no ft h ei d e n t i f y i n ga b i l i t yo fb i o r l 1i sn o ta sg o o da st h eo r t h o g o n a l w a v e l e t so nt h ew h o l e ，b u th a v eb e t t e ri d e n t i f y i n ga b i l i t ya ts o m ep h y t o p l a n k t o nw h i c h t h eo r t h o g o n a lw a v e l e t sc o u l dn o tg e ts a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h eb i o r l 1w a v e l e ti s c o m p l e m e n t a r yo ft h eo r t h o g o n a lw a v e l e t 4 c o m p a r i n gt h et h r e ei d e n t i f y i n gt e c h n o l o g yb a s e do nd i f f e r e n tw a v e l e t s ，c o u l dg e tt h e c o n c l u s i o nt h a tt h ec o i f 2w a v e l e th a v eb e t t e ra b i l i t yo fi d e n t i f i c a t i o nt h a no t h e rt w o w a v e l e t s ，b u tt h es y m l e t 7a n dt h eb i o r l 1w a v e l e t sc o u l dg e tb e t t e rr e s u l t a ts o m e p h y t o p l a n k t o ns p e c i e sw h i c ht h ec o i f 2w a v e l e tc o u l dn o tg i v es a t i s f y i n gr e s u l t s b a s e do n t h ec o m p l e m e n t a r yo ft h r e ew a v e l e t s ，w ec a l lg e t ：m o r et h a n9 5 a tt h el e v e lo fd i v i s i o n a n dm o r et h a n8 5 a tt h el e v e lo fg e n u s t h ei n n o v a t i o no ft h i sp a p e ri st h ee s t a b l i s h m e n to ft h et w o - r a n kr e f e r e n c es p e c t r af o rt h e m a i np h y t o p l a n k t o no nt h el e v e lo fd i v i s i o na n dg e n u sb a s e do nt w oo r t h o g o n a lw a v e l e t sa n d o n eb i - o r t h o g o n a lw a v e l e t ，r e a l l ya c h i e v e dt h ej o i n tu s eo ft h et w o r a n kr e f e r e n c es p e c t r a d a t a b a s e s b a s e do nt h ec o m p l e m e n t a r yo ft h r e ew a v e l e t s ，e s t a b l i s hm u l t i - r a n kr e f e r e n c e s p e c t r ad a t a b a s e s k e yw o r d s ：p h y t o p l a n k t o n ；f l u o r e s c e n c es p e c t r a ；w a v e l e ta n a l y s i s ；b a y e sa n a l y s i s ； n o n n e g a t i v el e a s ts q u a r e s q 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含未获得( 注! 如遗直甚他盂要 挂别声明的，奎拦可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收 录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。( 保密的学位 论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签字： 签字日期：年月日签字日期：年月日 4 小波分析技术杠戒固近海浮游藻群落组成荧光识别测定中的腑用 o 前言 近年来我国近海赤潮发生呈现频率加大，爆发区域增多，持续时间增长等特 点，制约了沿海地区经济的发展。迫切需要对赤潮进行现场、快速、实时的监测。 对浮游植物群落的组成的监测能很好的分析引发赤潮的浮游植物的种类，便于及 时采取措施，控制赤潮的影响，减少经济损失。同时也能为赤潮研究提供更多的 资料。 浮游植物的活体荧光光谱能够提供丰富的特征信息，具有前处理简单、灵敏 度高、选择性好的特点，能满足对浮游植物群落组成快速、实时监测的需要。但 是现有的荧光技术能有效识别的藻类有限，或只是将浮游植物分为几大类，不能 满足我国近海特定的浮游植物群落组成特点的监测需要。 基于国内外的研究成果，本文选择我国近海常见的分属于7 个门3 2 个属的 4 3 种优势藻种和赤潮浮游植物在实验室进行培养，获得活体浮游植物的三维荧 光光谱，基于此，采用小波分析技术、系统聚类分析、贝叶斯判别技术以及非负 最小二乘法等技术建立活体浮游植物的三维荧光光谱识别技术，建立未发生赤潮 时在门水平上对浮游植物群落进行分析，在发生赤潮时在属水平上对浮游植物群 落组成进行分析的识别技术。本课题来源于国家8 6 3 计划合作项目“有害赤潮生 物诊断系统技术研究”( 2 0 0 6 a a 0 9 2 1 7 8 ) 和国家自然科学基金项目“赤潮浮游植 物活体荧光鉴别方法研究”( 4 0 7 0 6 0 3 6 ) 。 由于本人水平能力有限，本文在撰写，以及研究中尚存在不足之处，在此， 真诚的希望各位专家、老师、同学对本文提出宝贵意见。 小波分析技术在我国近海浮游藻群落组成荧光识别测定中的应用 1 文献综述 1 1 浮游植物及赤潮概况 我国水域中生活着种类众多的浮游植物。海洋浮游植物是海洋生态系统中的最主要 的初级生产者，其群落组成的生物多样性和稳定性是维持海洋生态系统平衡的重要因 素，也是海洋生物资源的重要组成部分，具有种类多、数量大、繁殖快等特点，在海洋 生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用，他们的盛衰直接或间接的影响 着整个海洋生态系统的生产力，并最终直接或者间接的影响渔业的产量。因此浮游植物 与渔业资源、水产养殖、环保、地质等密切相关。另一方面，海洋浮游植物本身营养丰 富，富含蛋白质，可以作为单细胞蛋白质的一个重要来源；而且富含具有重要营养和医 疗保健作用的不饱和脂肪酸、多糖、蛋白、类胡萝卜素等生物活性物质，随着陆地资源 的衰竭，丰富的海洋浮游植物资源成为人们关注的热点，海洋浮游植物在保健食品、药 物、饲料、化妆品、生物农药等方面也展现出了广泛的应用前景。海洋浮游植物在以上 这些领域的开发与利用，都离不开对其种类的分类和鉴定。 海洋浮游植物既是重要的海洋生物资源，同时也是赤潮等自然灾害的肇事者。赤潮 是全球性的海洋环境问题之一，不仅严重的破坏了海洋渔业和水产资源，甚至威胁人类 的身体健康和生命安全，对赤潮的监测同样离不开对赤潮生物进行分类和鉴定。 形成赤潮的原因很多，一般来说包括海域的地形，地理位置，水文特征，还留等自 然因烈啦j ；向海洋过度排污、过度海产养殖、航运业等人为因素；以及海底地震、火山 爆发、航运泄漏等突发性因素。在自然环境和人为活动的共同影响下，我国近海海域的 赤潮发生呈现以下特点：频率增高【2 ，3 捌；持续时间增长，发生范围增大，危害性增大； 肇事藻种增多【3 ，4 ，5 ，6 】；仍以单相赤潮为主【5 , 6 , 7 , 8 , 1 3 , 1 4 】，但双相赤潮有增加的趋势。 1 3 浮游植物监测的方法及其现状 常用的浮游植物鉴别技术主要有显微镜技术、图像识别技术、色素分析技术、荧光 分析技术等。显微镜技术是最传统的浮游植物定性定量的分析方法【1 5 l ，可同时获得浮游 植物群落组成和各种类浮游植物数量，是目前浮游植物鉴别和测定的标准和基础。但是 由于显微镜技术需要依靠藻类专家依靠显微镜进行逐个藻的分析，每个样品都需要大量 的时间进行分析，对于微型浮游植物，特别是微微型浮游植物的识别存在困难【1 6 l ，如借 2 小波分析技术柏：我困近海浮游藻群落组成荧光识别测定中的应用 助电子显微镜，则需要专业人员进行操作，劳动强度大，耗费时间长。因而显微镜技术 耗时耗力，难以满足对大量样品快速分析的要求。图像识别技术是利用自动分割技术将 浮游植物细胞图像单独从其他图像中分离出来【1 刀，然后借助计算机辅助，使具有学习能 力如人工神经网络等化学计量法【1 8 】，多角度测量数据，以达到对确定细胞影像进行分类 识别的目的。该方法可以初步实现对浮游植物图像的人工智能识别，但是由于浮游植物 外观特征变化较大，光照、温度、生长周期都有影响。因此处于不同生长周期的、不同 光照、温度条件下的同一浮游植物均有可能因为不同的外观特征被识别为不同的类别； 相反，不同的浮游植物也可能被识别为同一类别。因此，图像识别技术的实现还存在一 定得困难，而且可区分的浮游植物较少。色素分析技术是在不同浮游植物色素组成不同 的基础上对浮游植物进行定性定量分析的啪1 。目前最常用的是高效液相色谱法。该技术 最早在2 0 世纪8 0 年代应用于浮游植物的色素组成分析，1 9 9 6 年澳大利亚的m a c h e y 1 9 】 开发了高效液相色谱的基于m a t l a b 平台的应用程序c h e m t a x 。c h e m t a x 软件是利用每一 类群浮游植物特征色素比例的差异，通过优化计算得到每个藻类种群的色素比值数据来 定量的确定浮游植物群落的组成。目前c h e m t a x 已经得到了广泛的认可和应用【2 0 ，2 1 捌。 但是由于高效液相色谱仪的工作条件等原因，必须将样品带回实验室分析，很难做到现 场分析。如上所述显微镜技术、图像识别技术、色素分析技术由于技术本身或者使用仪 器等因素的影响，限制了它们在现场、实时、快速的识别浮游植物方面的应用。 荧光技术是基于浮游植物中包含的光合色素的荧光特性建立的方法。浮游植物的光 合色素主要分为三类，即叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素瞳2 3 叶绿素和类胡萝卜素是脂溶性 的，藻胆素包括藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白，都是水溶性的。光合色素从功能上 分可分为两类：一是反应中心色素，指少数具有光学活性的叶绿素a 分析，它们将获得 的光能进行电荷分离，直接用于光合作用；二是天线色素，指那些没有光学活性，不直 接参与光合作用，只是把吸收的光能以诱导共振的方式传递到反应中心的色素。叶绿素 内大部分色素都是天线色素，包括大部分叶绿素a 分子，全部的叶绿素b ，叶绿素c ， 部分类胡萝卜素以及藻蛋白。类胡萝卜素种类较多，主要有两个方面的作用：一是捕获 光能传递给反应中心，二是防止有害辐射对光合作用组织造成破坏，对光合系统起到保 护作用。 表卜3各门类浮游植物的主要色素组成 门类主要色素成分 3 小波分析技术4 j 我国近海浮游藻群落组成荧光识5 ；i l 测定中的心用 门类主要色素成分 甲藻门 d i n o p h y t a 硅藻门 b a c i l l a r i o p h y t a 金藻门 c h r y s o p h y t a 蓝藻门 c y a n o p h y t a 隐藻门 c r y p t o p h y t a 绿藻门 c h l o r o p h y t a 叶绿素：叶绿素a 、叶绿素c 2 ： 类胡萝卜素：b 胡萝卜素、甲藻索； 藻胆素及其他：硅甲藻素、甲藻黄素、多甲藻素 叶绿素：叶绿素a 、叶绿素c l 、叶绿素c 2 ； 类胡萝卜素：a 胡萝卜素、b 胡萝卜素、胡萝卜素； 藻胆素及其他：硅甲藻素、硅黄素、岩藻黄素 叶绿素：叶绿素a 、叶绿素c l 、叶绿素c 2 ； 类胡萝卜素：1 3 胡萝卜素及其他胡萝卜素； 藻胆素及其他：岩藻黄素、叶黄素等 叶绿素：叶绿素a ；b 胡萝卜素； 类胡萝卜素：束丝藻黄素、束丝藻叶素、金黄素、蓝藻黄素、玉米黄素等； 藻胆素及其他：c 藻蓝蛋白、c 藻红蛋白、别藻蓝蛋白 叶绿素：叶绿素a 、叶绿素c ： 类胡萝卜素：0 【胡萝卜素、b 胡萝卜素、胡萝卜素；硅甲藻素、甲藻黄素； 藻胆素及其他：藻红蛋白，藻蓝蛋白 叶绿素：叶绿素a 、叶绿素b ； 类胡萝卜素：a 胡萝卜素、b 胡萝卜素； 藻胆素及其他：叶黄素、新叶黄素、菜黄素、玉米黄素 浮游植物的利用光合系统吸收光能进行光合作用，主要以叶绿素分子吸收光子获得 光能，获得的能量有三种转化途径【2 3 , 2 4 , 2 5 ，2 6 1 ：一是在叶绿素分子间传递在反应中心推动 光合作用；二是直接以热的形式耗散；三是产生荧光( 图1 ) 。正常情况下，经过光适应 的浮游植物，能量在三个途径的分配比是相对稳定的，这是是使用荧光技术测量浮游植 物生物的基础。由外围天线色素，内部天线色素和反应中心组成的光合系统主要依靠天 线色素吸收的，光合过程中能量的传递方式决定了天线色素的构成。不同门类的浮游植 物的色素组成不一样，如表2 【2 7 嚣, 2 9 , 3 0 所示同门类的浮游植物则具有相似或相近的主要 色素组成。不同的色素具有不同的光学效应( 图2 ) ，也就基本上决定了活体浮游植物的 荧光光谱谱形。除了色素本身影响浮游植物的荧光光谱的谱形外，色素与蛋白质的结合 方式、能量的传递效率等也会有一定影响。 3 小波分析技术d ：我国近海浮游藻群落组成荧光识别测定中的应用 外部灭线色豢淡j l e f 1r i o ! 。i s c o i k ：eo f ；i ，r i p h e l a lf l r t to i i l l a 基 召 拿 翕 名 p | m t o c h e m is t r y 图1 - 1 浮游植物光合作用能量传递图 4 0 05 0 0 6 0 0 7 0 0 w a v e l e n g t hi n t o ) 图1 2光合色素的吸收光谱图 2 0 世纪7 0 年代末荧光技术开始在在浮游植物定性定量方面得到应用研究，y e n t s c h & y e n t s c h ( 1 9 7 9 ) 3 1 】提出利用浮游植物荧光光谱的差异性来区分浮游植物，1 9 8 5 年 y e n t s c h p h i n n e y 年根据叶绿素与辅助色素的比率将海洋浮游植物分为蓝藻、绿藻、隐 藻+ 红藻、甲藻+ 硅藻+ 球石藻四大类，掀开了以荧光光谱法对浮游植物进行分类的序幕。 同年，o l d h a m | 3 2 j 等以三维荧光光谱作为分属7 个门类的2 3 种浮游植物的“指纹”，经过傅 里叶变换处理加以研究，根据获得的特征对未知藻的光谱进行判别，精确率在8 0 以上， 4 小波分析技术n j 我国近海浮游藻群落组成荧光识别测定中的应用 同时分析了这种方法在混合藻识别中的潜在有效性。c o w l e s l 和h o g 等分别在1 9 9 3 年【3 3 l 和1 9 9 8 1 3 4 】年通过现场测量藻红蛋白荧光发射光谱波长的位移，推断了海水中含藻红蛋 白的浮游植物种类和数量的变化。1 9 9 8 年，芬兰的s e p p a e l a e b a l o d e l l 3 5 】根据一定荧 光波长下的主要辅助色素特征峰荧光强度，实现了对浮游植物门类的快速分类。激光荧 光遥感技术和具有低耗、高光强、长寿命的单色发光二极管等在这方面的应用推动了浮 游植物荧光检测技术。1 9 9 3 年，k e 【3 6 】等使用系列单色发光二极管为光源，根据蓝藻含 有的藻蛋白的特征荧光谱，建立了现场监测活体蓝藻含量的荧光分析技术，可在 0 0 1 1 毗gm l 1 的范围内可准确测定海水样品中的蓝藻含量； b o d d y ( 2 0 0 0 ) 1 3 7 】等使用流 式细胞仪，基于浮游植物的荧光性质和散射性质，通过神经网络实现了对7 2 种浮游植 物的识别。b e u t l e r ( 2 0 0 2 ) 3 8 - 4 2 1 等使用单色发光二极管为光源，利用五个激发波长( 4 5 0 n t o ， 5 2 5 n m ，5 7 0 n m ，5 9 0 n m ，6 1 0 n m ) 下的叶绿素荧光光谱将浮游植物分为四大类( 绿藻，蓝 藻，隐藻，混合藻( 甲藻和硅藻) ) 。基于此技术所研制的便携式仪器和建立的实时定点 监测系统，可用来测定活体浮游植物群落组成，这就是目前已经商品化的b b e 藻类分 析仪。b b e 技术采用发光二极管作光源，避免了一般荧光分光光度计使用氙灯为光源而 使得仪器结构复杂、耗能大、需固定使用、灵敏度低等缺点，适应了现场、实时、快速 监测的需要，同时可以再门类上较准确的将浮游植物在门类上识别。但b b e 藻类分析仪 无法将我国近海海域最重要的两类藻硅藻和甲藻分类识别，因而难以满足我国海域浮游 植物监测的需要 国内对浮游植物的荧光监测也有广泛研究，但主要集中在现场测定叶绿素上。贺俊 芳( 2 0 0 1 ) 1 4 3 】采用扫描荧光成像技术和高斯分解等技术，检测到c h l 6 分子发射荧光在6 5 8 n m 处。赵冬至等( 2 0 0 3 ) 【删在8 6 3 项目( 模块化赤潮卫星遥感监测技术) 的支持下，采用现场 实测和室内培养两种方式测定4 种赤潮藻和5 种非赤潮藻的荧光光谱曲线，对不同藻类归 一化荧光高度与叶绿素浓度关系进行了研究，建立了不同浮游植物归一化荧光光谱与叶 绿素浓度的关系，同时建立了不同浮游植物荧光峰位置与叶c h l a 的关系。吕洪刚等 ( 2 0 0 5 ) 4 5 】采用三维荧光技术分析了栅藻，微囊藻和小环藻的色素组成，通过对建立了叶 绿素浓度与藻密度的荧光强度矩阵方程。金海龙等( 2 0 0 6 ) 1 4 6 】基于发射荧光光谱法对活 体海藻进行研究，利用二阶导数极小值分析和比值光谱法将含c h i c 和c h l b 的两类海藻 分开。张前前( 2 0 0 4 ，2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) 1 4 7 , 4 s 】等用三维荧光光谱辅以主成分分析等方法，对 甲藻和硅藻的荧光特征进行了研究，并结合b a y e s 判别法和非负最d , - 乘法对1 1 种浮游 5 小波分析技术袖：我困近海浮游藻群落组成荧光识别测定中的应用 植物进行了分类识别，得至u 7 6 的门类水平正确识别率。唐晓静( 2 0 0 7 ) 1 4 9 l 利用同步荧 光光谱研究了甲藻与硅藻的特征差异；同年，卢璐等【5 0 1 也利用荧光激发光谱，辅助以四 阶导数及高斯分解法等对甲藻和硅藻的激发光谱的荧光特征进行了分析。胡序朋( 2 0 0 8 ) 【5 1 】基于浮游植物的荧光光谱的相似性指数的赤潮藻识别技术，结果表明，活体浮游植物 叶绿素的在平行测量和不同生长周期的相对偏差都在5 以下，混合藻的光谱和处理得 到的标准谱之间存在线性关系，通过计算相似性指数可以定性，半定量的识别赤潮藻种。 张芳( 2 0 0 7 ) 5 2 】利用小波分解手段结合b a y e s 分析对1 0 种不同属的藻类进行识别，得 到了9 6 以上的正确率。光谱的这些研究均表明浮游植物荧光光谱特别是三维荧光光谱 具有很好的特征性，在浮游植物群落组成测定赤潮肇事种的识别等方面具有巨大的潜 力。 综上所述，目前能够应用的浮游植物群落组成荧光识别测定技术存在各类局限性， 不能满足我国沿海浮游植物的识测定的需要，也没有一种针对赤潮肇事种的定性识别及 数量测定的现场监测技术。根据我国近海浮游植物群落结构的特点以及发生赤潮时浮游 植物群落组成特点，本文拟建立一种未发生赤潮情况下在门水平上测定浮游植物群落组 成，赤潮发生时在属的水平上识别测定赤潮肇事种的活体荧光分析技术。 1 4 小波分析法的发展及应用 1 4 1 小波分析的建立和发展 小波分析是近1 5 年来发展起来的一种新的时频分析方法，而时频分析的应用非常广 泛，涵盖了物理学，工程学，生物科学，经济学等众多的领域。 传统的时频分析一傅里叶分析，是一种全时域变换，信号完全是在频域展开的不包含 任何时域信息，这对某些不需要时域信息的应用来说很恰当，但是某些信号的时域信息 对研究也非常重要，因此人们对傅里叶分析进行了推广，最著名的是短时傅里叶变换 ( g a b o r 变换) 【5 3 1 ，即采用一个窗口函数对信号进行处理，然后进行傅里叶变换或反变 换，通过分割时间窗，在每个时间窗内把信号展开到视频就可以获得局部的频域性信息。 该变换是1 9 7 4 年物理学家g a b o r 眦1 受量子力学中测不准原理的启发，把时频原子定义为 在时频平面上有最小跨度的函数波形，再用这些基本的波形原子将信号分解。短时傅里 叶变换较好的解决传统傅里叶变换的局部化性质，但是由于其窗口的形状和大小( 窗口 的宽度) 是人为确定的，与被分析的信号无关，使用时候必须人工选择，高频信号需 6 小波分析技术4 ：我困近海浮游凛群落组成荧光识别测定中的应用 要采用小的窗口，而低频信号需要采用大的窗口，如果窗口大小不合适，将无法得到正 确的分析结果，也就是说，短时傅里叶分析只能在一个分辨率上进行，所以对某些应用 来说是不够精确的，存在很大的缺陷。 傅里叶分析在时域分析方面的局限性，使得小波变换得以发展。小波分析的思想可 以追溯到1 9 1 0 年，h a a r 根据一个分片常数函数构造了一个正交小波- h a a r d , 波，但是用 一个分片常数函数去近似一个光滑函数并不是最好的方法。七十年代，c a l d e r o n 表示定 理的发现、h a r d y 空间的原子分解和无条件基的深入研究为小波变换的诞生做了理论上 的准备，而且s t r o m b e r g 还构造了历史上非常类似于现在的小波基；1 9 8 4 年，法国地球物 理学家m o l e t 在分析地震波的局部性质时，把小波的概念引入到信号处理中来，并同理 论物理学家g r o s s m a n n 合作，促进了信号分析与理论物理学的结合，和连续小波变换的 诞生。针对m o r l e t 和g r o s s m a n n 的成果，1 9 8 6 年著名数学家m e v e 试图证明并不存在正则 小波的生成规范正交基，却最终构造出一组无限可微的真正的小波基，这一成果产生了 巨大的影响，最终导致了d a u b e c h i e s 6 5 】发现了具有紧支撑集的正交小波基。1 9 8 9 年 m a l l a t 与m o r l e t 合作提出了构造小波基的统一方法及多尺度分析思想，统一了之前各种 正交小波的构造方法，并建立了适用于正交小波的快速分解算法和重构算法【5 3 5 4 l 。极大 的推动