（应用化学专业论文）高效耐酸性液化糖化酶的制备及其应用.pdf

高效耐酸性液化糖化酶的制备及其应用研究 应用化学专业 研究生刘春莉指导教师张文学 在实验室条件下，首先利用摇瓶培养方式，对含有多拷贝耐酸性a 淀粉酶 和糖化酶融合基因的自曲霉基因工程菌进行了菌体生长及产酶代谢的初步研 究。通过考察培养基配方、发酵周期、培养基装量、初始p h 值、接种量等多种 因素和进行因素优化，建立起了经过一次发酵过程、获得同时具有两种较高酶 活力的新型酶制剂的液态发酵工艺，并且，借助自然分离纯化培养和原生质体 融合育种技术，使实用菌株获得了生长速度较快、产酶活力稳定的遗传性状。 进一步通过对白曲霉基因工程菌株t r l 2 在液态发酵中的补料量、补料时 间、补料次数、补料培养基配方等的研究，确定了实用菌株在3 l 放大摇瓶发酵 条件下产酶代谢的最佳补料工艺。在三次补料后，发酵液体积逐步增加，酶活 总量稳定提高。发酵9 6 h ，耐酸性a 淀粉酶和糖化酶的活力分别达到8 6 3 7 u m l 和2 5 2 2 9 7 u m l 的较高水平。而且，2 l 小型发酵罐的研究结果证实，在放大的 通气搅拌发酵条件下，摇瓶发酵水平可以再现。 发酵液经过提取、分离，可以得到收率7 0 左右，同时具有液化和糖化两 种酶活力的新型酶制剂。其最适p h 值4 6 。最适温度5 0 - 6 0 ，5 0 保温i h 仍 保留原酶活性。c a 2 + 对该耐酸性液化糖化酶有激活作用，f e ”、a r 等金属离子 有一定的抑制作用。 在固态酿酒发酵中，通过考察麸皮培养基的配比、培养温度、湿度、培养 时间及通风量等，确定了制备新型优质麸曲粗酶制剂的最佳发酵工艺。其耐酸 性c c 一淀粉酶和糖化酶活力分别达到8 6 6 4 u g 和5 4 1 4 7 4 u g 的较高水平，耐酸性 a 一淀粉酶的活力是目前酿酒厂常用大曲的几十倍。产酒发酵结果显示，残淀量 下降约6 ，淀粉转糖量高、产酒率上升，酒质与常规生产产品无异。 在实验室酒精发酵中，淀粉浆调p h4 6 ，不经糊化，加自制酶液l o u g 淀粉 质( 以耐酸性a 淀粉酶活力计) 于6 0 c 液化糖化1 h ，降温到5 0 c ，补加自制 酶液8 0 u g 淀粉质( 以糖化酶活力计) 糖化3 0 r a i n ，用于酒精发酵，乙醇收率为 4 9 4 4m l 1 0 0 9 淀粉，可达到理论收率的9 4 3 的极高水平。 在实验室淀粉糖及果葡糖浆制备中，3 0 3 2 淀粉浆调节p h4 ，5 4 6 ，不经 糊化，加自制酶1 0 u g 干物料( 以耐酸性旺淀粉酶活力计) 于温度6 0 c 6 5 c 液 化6 0 m i t l 左右，降温至5 5 c ，补充自制酶2 0 0 u y g 于物料( 以糖化酶活力计) 继 续糖化2 0 2 5h ，糖化d e 值可达到9 6 9 8 的理想效果。 该高效耐酸性液化糖化酶制剂的研制成功，不但可以填补我国酶制剂工业 在酶制剂种类上的一个空白，而且为淀粉糖工业水解工艺的改良、酿造工业原 材料利用率的提高、酒精工业废糟液的生物转化、以及医药工业助消化胃药的 更新换代等，提供了广阔的应用前景。 关键词：耐酸性旺一淀粉酶糖化酶液态发酵补料提取液化糖化 p r e p a r a t i o n a n d a p p l i e ds t u d y o fan o v e la c i d r e s i s t a n t l i q u e f y i n g s a c c h a r i f y i n ge n z y m e a p p l i e dc h e m i s t r y g r a d u a t es t u d e n tl i uc h u n l i s u p e r v i s o rz h a n g w e n x u e i nl a b o r a t o r yc o n d i t i o n ，a b o v ea l lap r e l i m i n a r ys t u d yw a sd o n er e g a r d i n gt h e s t r a i ng r o w i n ga n dz y m o g e n i cm e t a b o l i s mo fag e n e t i ce n g i n e e r i n gs t r a i nt r l 2o f a s p e r g i l l u sk a w a c h i iw h i c hc o n t a i n s f u s i o n g e n e so fm u l t i c o p ya - a m y l a s ea n d s a c c h a r i f y i n ge n z y m eb y s h a k e r f l a s kc u l t u r e t h r o u g hi n v e s t i g a t i o no f m a n yf a e t o m s u c ha sm e d i u m c o m p o s i t i o n ，f e r m e n t a t i o nc y c l e , m e d i u mv o l u m e ，i n i t i a lp hv a l u e , s e e d i n gv o l u m e ，e t c ，a n dt h r o u g ho p t i m i z a t i o no f t h e s ef a c t o r s ，an e w l i q u i dp h a s e f e r m e n t a t i o nw a sf o u n dt h r o u g hp r i m a r yf e r m e n t a t i o np r o c e s st oo b t a i nt w os o r t so f n e w e n z y m i cp r e p a r a t i o n sc o n t a i n i n g t w o h i g he n z y m ea c t i v i t y a l s ot h r o u g hf u s i o n b r e e d i n gt e c h n o l o g yo f n a t u r a ls e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nc u l t u r ea n d p r o t o p l a s t ，t h e p r a c t i c a ls t r a i nh a so b t a i n e dg e n e t i cc h a r a c t e r i s t i c so fh i g hg r o w i n gs p e e da n ds t a b l e a c t i v i t yf o re n z y m i cp r o d u c t i o n t h r o u g h f u r t h e r s t u d y o nt h e f e e d b a t c h i n gq u a n t i t y ，t i m e ，b a t c h e sa n d c u l t u r em e d i u m o f g e n e t i ce n g i n e e r i n gs t r a i nt r l 2o f a s p e r g i l l u sk a w a c h i i i nl i q u i d p h a s e ，a no p t i m u mf e e d - b a t c h i n gp r o c e s s f o rz y m o g e n i cm e t a b o l i s m i nt h i sp r o c e s s ， t h ev o l u m eo ff e r m e n t i n gl i q u o ri n c r e a s e db i tb yb i ta f t e rt h r e ef e e db a t c h e s t o t a l e n z y m ea c t i v i t yp r o d u c e db y t r l 2i s s t e a d i l y i n c r e a s e d a r e r9 6h o u r so f f e r m e n t a t i o n ，t h ea c t i v i t yo fa c i d r e s i s t a n ta - a m y l a s ea n ds a c c h a r i f y i n ge n z y m e r e a c h e dah i 曲l e v e lo f8 6 3 7 u m la n d2 5 2 2 9 7u m lr e s p e c t i v e l y t h er e s u l to f2 l s m a l lf e r m e n t a t i o nd r u ma l s op r o v e dt h a ts h a k e r - f l a s kf e r m e n t a t i o nl e v e lc a nb e r e a c h e du n d e rs c a l e - u pa i r a g i t a t i n gf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 3 t h ef e r m e n t e dl i q u o rw a se x t r a c t e da n d s e p a r a t e dt oo b t a i na b o u t7 0 y i e l d w i t han o v e le n z y m ep r e p a r a t i o nw i t hl i q u e f y i n ga n ds a c c h a r i f y i n ge n z y m ea c t i v i t y ， i t so p t i m u mp hv a l u ew a s4 6a n dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo ft h ea c i d r e s i s t a n t n a m y l a s e a n d g l u c o a m y l a s ew a s6 0 a n d5 0 t 2r e s p e c t i v e l y a tp h 4 6 t h e e n z y m ea c t i v i t yw a ss t a b l ea t5 0 c f o r1ha n di t s a c t i v i t yw a se n h a n c e db yc a 2 + ， w h i l ei n h i b i t e db yf e ”，a i n ，e t c t h r o u g hi n v e s t i g a t i o n o fm i x i n g r a t i o ，c u l t u r et e m p e r a t u r e ，h u m i d i t y ， c u l , t u r i n gt i m ea n dv e n t i l a t e da i rq u a n t i t yo fw h e a tb r a nm e d i u mi ns o l i db r e w e r y f e r m e n t a t i o n 。a no p t i m u mf e r m e n t a t i o np r o c e s sw a sf o u n dt op r e p a r e8n o v e l t y p eo f m o l d yb r a nc r u d ee n z y m i cp r e p a r a t i o n t h ea c t i v i t i e so f i t sa c i d - r e s i s t a n t 证- a m y l a s e a n ds a c c h a r i f y i n ge n z y m er e s p e c t i v e l yr e a c h e dah i g hl e v e lo f8 6 6 4 w ga n d5 4 1 4 7 。4 u g a c t i v i t yo fa c i d - r e s i s t a n t ( i t - a m y l a s ei sd o z e n sh i f g h e rt h a nt h ec o m n l o n b r a n q u u s e di nc u r r e n tb r e w e r i e s t h er e s u l to fl i q u o rf e r m e n t a t i o ns h o w st h a t r e s i d u a ls t a r c ha m o n r td r o p p e da b o u t6 s t a r c ht r a n s g l u c o s y l a t i o ni s h i g ha n d a l c o h o l y i e l d i s h i g h a l c o h o lq u a l i t y h a s n od i f f e r e n c ef r o mc o n v e n t i o n a l p r o d u c t i o n ， i na l c o h o lf e r m e n t a t i o nt e s ti nl a b o r a t o r y ，a d j u s ts t a r c hs l u r r yp h t o4 6 ，n o p a s t e ，a d ds e l f - m a d ee n z y m i cs o l u t i o nl ou 馆s t a r c h ( a sa c i d r e s i s t a n ta - a m y l a s e ja t 6 0 * ( 2 l i q u i ds a c c h a r i f y i n gf o rlh ，t e m p e r a t u r ed r o p p e dt o5 0 ( 2 ，m a d eu ps e l c m a d e e n z y m i c s o l u t i o n8 0 u gs t a r c h ( 鹤a c i d r e s i s t a n ta - a m y l a s e ) 幻s a e c h a r i f y3 0m i n u t e s ， u s e df o ra l c o h o lf e r m e n t a t i o n a l c o h o l y i e l d i s4 9 4 4m l 10 0gs t a r c h t h et e s t r e a c h e dah i g hl e v e lo f t h e o r e t i c a ly i e l do f 9 4 t 3 i nl a bp r e p a r a t i o no fs t a r c hs u g a ra n dp r e s e r v e df r u i ts y r u p u s e3 0 3 2 s t a r c hs l u r r yt o a d j u s tp h4 5 q ，6 ，n op a s t e , a d ds e l f - m a d e1 0l 如d r y e d 汹 a c i d r e s i s t a n tu - a m y l a s e ) a t6 0 - - 6 5 t e m p e r a t u r et ol i q u e f yf o ra b o u t6 0m i n u t e s ， w i t ht e m p e r a t u r e d r o p p e dt o5 5 ，a d ds e l f - m a d e10 0u 悖d r yf e e d ( 黔a c i d r e s i s t a n t 0 【- a m y l a s e ) t oc o n t i n u es a c e h a r i f i e a t i o nf o r2 0 2 5h t h es a c c h a r i f y i n gd ev a l u e r e a c h e da ni d e a ll e v e lo f9 6 9 9 ， t h es u c c e s s f u l r e s e a r c ho ft h e e f f i c i e n c y a c i d r e s i s t a n t s a c c h a r i f y i n g e n z y m ep r e p a r a t i o nn o to n l ym a k e sar e c o r df o re n z y m i cp r e p a r a t i o nv a r i e t i e si n 4 e n z y m i cp r e p a r a t i o ni n d u s t r yi n c h i n a ，b u ta l s ob r i n g sap r o s p e c t i v ea p p l i c a t i o ni n i m p r o v i n gt h eh y d r o l y s i sp r o c e s so f s t a r c hs u g a ri n d u s t r y ，i n c r e a s i n gr a wm a t e r i a l u t i l i z a t i o nr a t i oo f b r e w e r y b i o - t r a n s f e r r i n go f s p e n td r o s si na l c o h o li n d u s t r ya sw e l l a st h ed e v e l o p m e n to f s t o m a c hn e wm e d i c i n e si np h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y k e y w o r d s ：a c i d - r e s i s t a n ta - a m y l a s e ，s a c c h a r i f y i n ge n z y m e ，l i q u i ds t a t e f e r m e n t a t i o n ，f e e d - b a t c hc u l t u r e ，e x t r a c t i o n ，l i q u e f y i n g s a c c h a r i f y i n 5 叫川大学碗二学位论义 1绪论 1 1前言 酶是一种具有催化活性的蛋白质，由生命物体所产生。因此，酶具有催化 剂的特点，即能够加快特定反应的速率但不能改变反应的平衡。在反应中不消 耗，反应结束时回复到原来的形态；同时，酶又具有蛋白质的属性。即酶由氨 基酸通过肽键连矮而成。只有在适当的温度、p h 和离子强度下爿具有生物活性。 另外，有些酶还需要辅酶或者辅因子，刁能完整地表达酶的功能。由于酶催化 反应能够在常温常压下进行，而且具有很高的效率和专性，因而，酶的应用 同益受到人们的重视。 在细胞中，有数以千计的酶同时催化上万个反应，因此可以说酶是一切 生命活动的基础。目前已经知道的酶超过了2 0 0 0 种，但根据最简单的原核生物 大肠卡t 菌染色体的基因图谱分析，就可能包含3 0 0 0 4 5 0 0 种不同酶蛋白的信息， 所以还有更多的酶有待于认识和鉴鄹。 人类早在认识酶之前就已经知道了怎么利用酶来为生产和生活服务，例如 面粉发酵，酿造，鞣革及制造奶酪等已经有几千年的历史，都是人类不自觉地 利用酶的例子。1 7 8 3 年，s p a l l a n z a n i 提出消化不是磨碎两是胃液在起作用的概 念，对酶有了初步的认识；到了1 9 世纪，人们进一步认识到了酶的存在，并建 立起了酶的概念。1 8 3 3 年p a y e r 用麦芽，并用于淀粉水解和织物退浆；1 8 8 7 年 b u c h n e r 发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳：1 9 2 6 年 s u m n e r 第一次分离出脲酶并获得了该蛋白的结晶；4 0 年代末，生产舡淀粉酶的 液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制荆工业的开始1 1 1 。 商品酶制剂根据其来源可以分为动物酶、植物酶及微生物酶，依据其用途 可分为工业用、食品用、分柝用及药用等。不周用途酶制剂，产品的价格和生 产规模也有很大差别，见表1 1 。由于用微生物发酵的方法能够不受原料的限制， 实现大规模工业化生产，成本低、效率高，因此目前已经能够大规模工业化生 产的1 0 0 多种酶制剂中，极大部分都是通过微生物发酵生产的。 酶可以分为六大类( 2 j ： 1 ) 氧化还原酶：催化将氢或氧或电子从一种底物转移到另一种物质的反应， 常称为氧化酶或脱氢酶。 四川大学硕士学位论文 2 ) 转移酶：催化基团转移反应，但不包括氧化还原反应和水解反应。 表1 1 商品酶的来源、用途及生产规模 3 ) 水解酶：催化水解反应。 4 ) 裂合酶：催化除水解外的从底物中脱除基团的反应或其逆反应，产物一 般含有一个双键。催化逆反应的酶又称为合成酶。 5 ) 异构酶：催化异构化反应。 6 ) 连接酶；催化各种键的合成，键的形成反应和含能化合物键的断裂同时 发生。 目前，上述六大类中都有一些可以通过微生物发酵生产。部分典型的酶制 剂及其生产菌列于表1 2 。 表1 2 中只列出了一小部分工业酶制剂从中可以看到酶的用途已经渗透 到各个工业部门和人们的日常生活。以酶的工业化应用为例，静淀粉酶和糖化 酶已经代替传统的酸法水解用于淀粉生产葡萄糖及纺织品的退浆；蛋白酶、脂 肪酶及纤维素酶广泛用于洗涤剂、食品、纺织、精细化学品及手性化合物拆分 和合成等；出葡萄糖异构酶催化的从葡萄糖生产高果玉米糖浆( h i g hf r u c t o s e c o r ns y r u p h f c s ) 年产量已超过去1 0 0 0 万吨；a 淀粉酶、糖化酶的应用，促 进了果葡糖浆的大量生产1 3 】；通过青霉素酰化酶催化青霉素g 分解生产6 - a p a 已成为半合成抗生素最重要的中间体等；许多酶直接应用于疾病的诊断和治疗， 如链激酶，葡萄糖氧化酶及乳酸脱氢酶等：更多的酶则被用于科学研究，可以 说，没有众多的工具酶，就没有人类基因组计划和以基因重组为核心的现代生 物技术。随着人们对酶的认识不断深入和更多的酶被发现，酶的应用领域将更 加广阔，微生物工业也必将得到进一步发展。 四川大学硕士学位论文 酶名称酶类型典型生产菌名称 用途 1 2 国内外酶制剂工业的现状和发展趋势 近年来，随着酶工程领域的不断进步发展，酶制剂产业的发展也非常迅速， 成为2 1 世纪大有发展前途的新兴产业之一。 1 2 1国内外酶制剂的生产和应用现状i 珥“1 据报道，全世界已发现的酶有3 0 0 0 多种，且前工业上生产的酶有6 0 多种， 真正达到工业规模的只有2 0 多种。剂型和品种有6 0 0 多个。1 9 9 8 年全世界工业 酶制剂销售额为1 6 亿美元。预计到2 0 0 8 年，销售额将达到3 0 亿美元。 据9 0 年代初统计，世界上酶制剂生产厂商有7 0 多家，其中较大的有2 5 家。 最大的8 家酶制剂生产厂商分别是： 1 ) n o v on o r d i s k ：诺和诺德公司，丹麦； 2 ) g i s t b r o c a d e s ：荷兰： 3 ) c u l o r ：科特公司，芬兰： 四j i i 大学硕： ：学位论文 4 ) g e n e n e o ri n t e r n a t i o n a l ：杰能科公司，美国： 5 ) s o l v a y ：苏尔威公司，比利时： 6 ) c h r h a n s e n ：汉森公司，丹麦； 7 ) r h o n e p o n l e n c ：罗兰普朗克公司，法国： 8 ) q u e s t ：荷兰； 随着国际酶制剂市场竞争日趋激烈，国际上一些大型酶制剂生产厂商，为 了扩大生存空间和寻求持续发展，不断进行收购、兼并和扩建。1 9 9 5 年6 月 g e n e n c o r 公司又收购了比利时s h o v ad e n b o m 公司工业酶制剂的专利，s h o v a d e n b o m 公司退出工业酶制剂市场。1 9 9 8 年n o v on o r d i s k 公司在天津的酶制剂 工厂第一期工程建成投产，该公司在全世界建成3 大市场基地，即丹麦、美国 和中国，从而可就近生产、销售，进而能够达到降低成本和扩大市场。目前， n o v o n o r d i s k 公司和g e n e n c o r 公司成为世界上最大的酶制剂生产商和供应商。 1 9 9 7 年两公司的销售额达到l l 亿美元。占全世界酶制剂销售额的7 0 以上。 由于收购、兼并和扩建，使得国际上大的酶制剂公司结构精简，人才集中，技 术优化，使新产品的开发周期显著缩短，数量大大增加，应用领域迅速扩大。 表1 3 列举出1 9 9 1 1 9 9 8 年全世界工业酶制剂销售额的变化及其在工业领 域所占有比重。由表l 一3 可见，从1 9 9 3 年到1 9 9 8 年，酶制剂的年销售额，平 均增长率为1 2 7 4 ，最低为1 3 8 。近年来，增长速度趋缓。据预测，今后l o 年世界上工业用酶的销售额将按6 8 的速度增长。而n o v on o r d i s k 公司将以 1 0 1 5 的速度增长。 表卜31 9 9 1 1 9 9 8 年全世界工业酶制剂销售额的变化及其在工业领域所占有的比重 目前，世界上工业用酶涉及的应用领域达1 0 多部门，主要工业用酶有l o 4 g _ qj 1 1 人学颁“l 学位论文 多种。美国是世界上工业用酶最大的市场，欧洲和日本位于第二和第三位。其 后是中国、印度和南非。日本9 0 年代工业酶制剂的销售额大都在2 5 0 3 0 0 亿日 元( 约为2 2 2 5 亿美元) 之间。日本工业酶制剂主要应用于淀粉糖工业、食品 工业、洗涤剂工业和纺织工业，4 者相加达到全部工业用酶的8 4 。 表1 41 9 9 1 “1 9 9 8 年中国各类酶制剂的产量、总产量和销售情况 我国酶制剂工业经过近4 0 年的努力，形成一定的生产规模。从9 0 年代起， 通过引进国外先进技术和国际合作，生产能力、产品品种和质量有了很大提高。 少数产品已经达到9 0 年代初的国际水平。目前，我国酶制剂的生产能力为4 0 , - - 4 5 万吨。1 9 9 6 年酶制剂总产量为2 4 万吨。在“六五”期间，酶制剂产量增长l 倍： 在“七五”期间，酶制剂产量增长2 4 5 倍：在“九五”期间，酶制剂产量增长2 3 倍。此外，“九五”期间，酶制剂产量年平均增长率为1 8 2 。 但是，与国际上发达国家比较，与国际上著名的诺和诺德公司和杰能公司 比较，我国酶制剂工业，无论是在产量和销售额方面，还是在品种、质量和应 用方面，都存在很大差距。表1 4 列举了1 9 9 1 1 9 9 8 年中国各类酶制剂的产量、 总产量和销售情况。从表1 4 可以看出，我国工业酶制剂的销售额只占全世界 酶制剂销售额的4 。而淀粉加工工业用酶却占我国整个工业酶制剂的8 0 以 上。这就充分说明，我国酶制剂工业潜力很大，但产业结构亟待调整。 1 2 2 国际酶制剂工业发展趋刻8 ，9 】 纵览国际酶制剂工业研究和发展动向，其发展趋势可简要归结如下4 个方 面： 5 四j i l 大学硕= l ：学位论文 1 ) 国外酶制剂公司的兼并、重组将继续进行 继美国g e n e n c o r 公司收购了荷兰g i s tb r o c a d e s 公司的工业酶及比利时 s o l v a v 公司全部酶制剂专利以后，国外酶制剂公司兼并、重组的势头依然强劲。 芬兰的丹尼斯公司( d e n i s e o ) 又和丹麦的科特公司( c u l t o r ) 合并。因此，国 际上酶制剂公司的数量还会减少，酶制剂的生产和销售将进一步向少数几家公 司集中。这一情况表明，国际上酶制工业的发展更趋向垄断化。 2 ) 研究、开发投入大，高新技术应用广 国外酶制剂公司的研究、开发经费一股占产品销售额的1 0 以上，高的可 达1 5 以上。以诺和诺德公司为例，1 9 9 8 年用于研究、开发的经费更达到其产 品销售额的1 9 。从事研究和开发工作的人数达到该公司总雇员的2 3 。直接 用于酶制剂的研究和开发的经费，估计在1 亿美元以上。由于经费充足，科研 力量雄厚，早已将基因工程和蛋白质工程等高新技广泛用于酶制剂的生产。1 9 9 1 年，1 5 的工业用酶采用基因工程菌生产，1 9 9 6 年，达到5 0 。1 9 9 8 年，利用 基因工程菌生产的工业用酶的比例，更高达8 0 。而蛋白质工程技术早在1 0 年 前也已用于酶制剂的生产。高新技术的广泛应用使国际上酶制剂新产品、新品 种不断涌现。 3 ) 大力研制、开发新酶种和新用途 国外酶制剂公司不断应用基因工程、蛋白质工程等高新技术，大力研制、 开发新酶种和新用途。如诺和诺德公司已经开发出不依赖钙离子的高温a 淀粉 酶，用于洗涤剂的碱性a 淀粉酶，极端耐热、极端耐酸的酶，用于非水有机溶 剂系统中反应的酶，能够应用半年以上的固定化酶等等。日本非常注意研制、 开发生产低聚糖的酶类，目前已能生产出l o 多种酶和1 0 多种功能性低聚糖。 这些低聚糖可以用于生产保健食品、药品和化妆品等。日本协和发酵公司研制 出羟脯氨酸，并e 开发其新用途。以往，酶制剂的应用领域集中在淀粉加工、 食品加工和洗涤剂工业。目前，已经扩展棉纤维与纺织加工、纸浆和造纸、动 物饲料、淀粉改良、植物油脂加工、焙烤食品、护肤用品、化妆品、保健食品、 调味品、微生物的控制、生物有机合成、药物生产等领域。即使在传统领域， 也不断出现新酶种和新用途。在洗涤剂工业，除原先使用的碱性蛋白酶外。已 经研制、丌发出对漂白剂有很强耐性的蛋白酶，与底物有很强亲和力的脂肪酶， 碱性a 一淀粉酶和纤维素酶等。各种酶的配合应用，可以制成各种不同的洗涤剂， 6 四川大学硕士学位论文 能够满足洗涤纺织品、餐具和卫生洁具的需要。在临床诊断方面应用广泛的过 氧化物酶，也已被用于洗涤剂。该酶只作用于游离的色素，而不作用于已经染 在纺织品的色素。因此，在洗涤时，既能防止衣物不被其它色素污染，又不会 使衣物褪色。在纺织工业中，除利用纤维素酶处理纺织品提高其柔软性和染色 性外，近来又将新开发的原果胶酶用于棉纤维的加工，既能改善纤维的手感和 提高染色性，又不影响纤维的强度。同时，还可以避免在高温、高碱条件下处 理棉纤维，改善操作环境，减少工业废水。在纸浆和造纸工业，除使用原先常 用的纤维素外，已经开始使用脂肪酶、木聚糖酶等。在食品工业中，转谷氨酰 胺酶( t r a n s g l u t a m i n a s e ) 能使蛋白质分子内形成交联，使蛋白质聚合或明胶化， 从而改善食品的物性，提高硬度和弹性，已经广泛用于水产品、乳制品和肉类 的加工。磷酸酯酶用于面粉加工可以提高面粉的加工性，使表面光滑，品质改 善。近来，蛋白酶广泛用于水解动植物蛋白，制造营养性天然调味品。在化妆 品工业，酶的应用也越来越受到重视。染发剂中常用过氧化氢，但过氧化氢会 损伤毛发，正在研究用尿酸酶作为过氧化氢的供体，可以稳定地供应过氧化氢， 不会损伤毛发。在动物饲料中，普遍使用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀 粉酶和蛋白酶，可以提高饲料的可消化性，提高畜禽的产肉率、畜类的产乳率 和禽类的产卵率等。在饲料中也可添加植酸酶，除具有上述酶的作用外，还能 够减少环境污染。 4 ) 酶制剂的剂型趋向多样化 国外大型酶制公司生产的酶制剂的剂型，不断向多品种、多剂型、功能性、 专用性和复合性的多样化方向发展。诺和诺德公司向中国市场推销的食品用酶 制剂的品种和剂型，就有6 0 多种。而我国只有1 0 多种。例如，高温q 淀粉酶， 我国只有1 之个剂型，而诺和诺德公司可以复配出适合于不同原料、不同用途 的品种和剂型达8 种之多。糖化酶的品种和剂型也有5 - - 6 种。以果胶酶为主， 与纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶等复配，可以开发出各种专用酶、复合酶 等达1 6 种之多，广泛用于果汁、果浆、果酒等的生产。以中性蛋白酶和碱性蛋 白酶为主，与其它的酶一起复配，可以开发出用于蛋白质水解、焙烤食品、酒 精和啤酒等工业领域的酶制剂1 3 种。国外的酶制剂公司把酶制剂的生产与酶制 剂的品种、剂型的开发及其与酶应用领域的开拓紧紧结合在一起，既使酶制剂 的生产者赢得了市场和效益，又向酶制剂的使用者提供了廉价、高效的酶制剂 四川大学硕l ：学位论文 产品。这就形成了国际酶制剂工业发展的一个新动向。 1 2 ，3 我国酶制剂行业存在的一些问题 经过近4 0 年发展，我国酶制剂工业从无到有，逐步形成一定的生产规模，取 得了不少成绩。但是，与发达国家相比，与国际大公司相比，差距很大，问题 不少，主要表现在以下几个方面： 1 ) 重复建设，效益低下，生产能力闲置 我国9 0 年代酶制剂生产能力达到4 0 5 0 吨年。由于重复建设，粗放经营， 无序竞争，效益低下，酶制剂的制造成本占销售价的7 0 8 0 左右( 国外只占 3 0 3 5 ) ，很多酶制剂工厂已经停产，5 0 左右的生产能力闲置，目前实际生产 的不到5 0 家； 2 ) 工艺、设备落后，生产技术水平低下 我国酶制剂工厂由于经济效益差，无力采用新工艺、新技术，增添新设备， 致使生产技术水平低下。绝大多数工厂仍然沿用硫酸铵盐析工艺，或发酵液直 接喷雾干燥工艺，造成产品杂质多，质量差，不仅影响了下游产业产品质量的 提高和酶制剂产品用途的扩大，而且也造成自身环境的污染。前几年，虽曾引 进国外技术，进行技术改造，但除少数产品达到国际上9 0 年代初的水平外，大 多数产品的生产技术水平比国际水平低一到数倍； 3 ) 研究、丌发投入不足，新产品开发能力很差 我国酶制剂生产研究、开发等全部经费不到产品销售额的1 ，且科技人员 数量很少，新产品的开发受到很大制约，新酶种和新用途的研制开发速度非常 缓慢。迄今为止，真正形成生产规模的酶制剂只有a 淀粉酶、糖化酶和碱性蛋 白酶等3 - 4 个产品； 4 ) 品种少、剂型少，产品结构不合理，应用范围非常狭窄 以酶制剂产量最大的1 9 9 6 年为例。全年酶制剂产量为2 4 万吨。其中小淀 粉酶占1 3 5 ，糖化酶占6 6 6 7 ，碱性蛋白酶占1 7 4 。3 者相加占总产量的 9 7 6 5 ，而应用领域仅局限于淀粉加工和洗涤剂工业。同年，国际上这3 种酶 的产量只占总产量的4 5 3 1 ，其应用范围却遍及淀粉加工、洗涤剂、纺织、纸 浆和造纸、酒精发酵、焙烤食品、动物饲料、果汁生产等到众多领域。 四川大学硕j ：学位论文 1 3 国内外n 淀粉酶类的生产和应用 旺淀粉酶( e c 3 2 1 1 ) 作用于淀粉时，可以从分子内部切开a 1 ，4 键而生 成糊精和还原糖。产物的末端葡萄糖残基碳原子为构型，故称a 淀粉酶【l o 】。 3 ， 国夕| 、昏淀粉酶类的生产和应用 早在1 8 3 3 年p a y e n 从麦芽抽提液中用酒精沉淀出白色沉淀，可以使2 0 0 0 倍的淀粉液化，取名为d i a s t a s e ”。并蹬售用于棉布的退浆。i 8 9 4 年t a d a m i n 用 麸皮培养米曲霉制造淀粉酶作为消化剂，建立了高峰制药厂现m i l e s 公司的 前身。1 9 1 3 年法国b i o d e n 与b f f r o n t 发明用枯革杆菌生产a 淀粉酶，以其耐热 性取代了麦芽淀粉酶用于棉布的退浆，创建了r a p e d a s e 工厂( 现并入了g i s t b r o c a d e s 公司) 。从此，酶制剂工业揭开序幂。 第二次世界大战后，随着抗生素工业的发展，微生物的培养技术、发酵工 艺和发酵罐的革新，酶制剂工业有了飞跃的发展，进入了工业化大生产的阶段。 1 9 4 9 年日本采用深层通风培养法生产a 淀粉酶【l l j ，1 9 5 9 年，日本采用淀粉酶和 糖化酶进行淀粉的液化和糖化，确定了酶法制造葡萄糖浆的工艺，革除了沿用 了1 0 0 年酸水解工业，使淀粉出糖率由8 0 提高到1 0 0 。1 9 7 3 年耐热性a 淀 粉酶投入生产，从此淀粉酶的生产又进入了一个新的阶段。 据统计，c 【一淀粉酶和糖化酶是酶制剂的主要品种。如美国1 9 7 5 年酶制剂总 产值为5 1 5 1 万美元，淀粉酶类为1 5 5 0 万美元，1 9 8 0 年总产值是6 6 8 1 万美元， 其中淀粉酶类约占2 0 。在日本，1 9 7 6 年酶制剂总销售额为2 9 9 9 百万日元，g t 淀粉酶为1 5 3 0 百万同元，占5 0 t 3 1 。 将淀粉用c t 一淀粉酶液化、糖化酶糖化进而提取葡萄糖的工艺奠定了果葡糖 浆和淀粉糖浆生产的基础，因而改变了糖品种的结构，开辟了淀粉加工的新途 径i 。2 】。1 9 8 0 年，美国果葡糖浆用量已达4 0 亿镑，折合成湿淀粉为2 8 0 万吨， 若加上未统计的数字，估计实际可达5 0 0 万吨，仅生产可口可乐每年则需用糖 浆1 0 0 万吨f j j 。 目前，除开展大量常规诱变育种工作外，国外已初步搞清了产c t 淀粉酶的 调控基因，探讨了有关转导转化和基因克隆等育种技术。将枯草芽孢杆菌重组 体的基因引入生产菌株1 1 3 1 ，使a 淀粉酶产量提高7 1 0 倍，并己应用于食品和 制酒工业，给选育高产a 淀粉酶菌株开创了新的途径。 9 四川大学顾i ：学位论文 1 3 2 国内n 淀粉酶类的生产和应用 我国酶制剂工业是解放后发展起来的，主要应用于饴糖、发酵原料加工、 造纸、医药、啤酒等部门。 1 9 6 5 年，我国开始应用解淀粉芽孢杆菌b f - 7 6 5 8 生产a 淀粉酶，当时只有 无锡酶制剂厂独家生产i j 们。1 9 6 7 年杭州饴糖厂实现了应用d 淀粉酶生产饴糖的 新工艺，可以节约麦芽7 一1 0 ，提高出糖率1 0 左右。1 9 6 4 年我国开始了酶 法水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。1 9 7 9 年9 月通过了酸酶法注射葡萄糖新工 艺的鉴定，并先后在华北制药厂，河北东风制药厂，郑州嵩山制药厂等得到应 用，取得了良好的经济效益，与传统的酸法相比可以提高收率1 0 ，降低成本 15 以上。另外我国以酶法技术进行柠檬酸、谷氨酸发酵，糖化制啤酒，以及 在酒精发酵，黄酒酿造，酱油制造，醋生产等方面的应用研究也已经成功并投 入生产。 表i - 5 o - 淀粉酶的主要用途 纺织品工业 面包工业 医药 业 饲料工业 其他 各种织物退浆 改善质量风味缩短时间，节约用祷 消化药 与其它酶一起添加促进消化 香料加1 = 、造纸、石油压裂、果汁制造 a 一淀粉酶的用途极为广泛，不同来源的a 淀粉酶，具有不同的性质，不同 l o 四川大学顾士学位论文 性质的酶具有不同的用途。黑曲霉酸性- 淀粉酶适用于制造助消化的药物。米 曲霉的淀粉酶耐热性较差，用于面包工业。在制作面包过程中，若加入a - 淀 粉酶，把淀粉变成单糖、双糖，帮助面团醒发，可提高面包质量。糖化型细菌 淀粉酶因水解产物具有较多的麦芽糖，可用以制造低d e 值的糖类。耐热性强 的细菌d 淀粉酶，由于液化完全，用酶量少，操作较容易，适于淀粉液化及棉 布退浆、酶法生产葡萄糖果以及石油压裂等【3 ，1 0 , 打1 。 目前，q 淀粉酶已用在淀粉j n 工业、面包工业、发酵工业、饲辩帝造等多 种领域。如表1 - 5 所示，由于n 淀粉酶的用途广泛，在市场上n 淀粉酶是产量 最大的酶类之一”。 近年来我国酶制剂工业蓬勃发展，品种和产量也不断增加。但是同国外酶 制剂行业相比尚有一定的差距。国外a 淀粉酶发酵水平达9 0 0 u m l ，耐高温a 淀粉酶发酵水平为3 0 0 u m l 。而我国常温a 淀粉酶活力为3 0 0 - 5 0 0 u m l ，耐高 温往一淀粉酶活力仅为1 5 0 u m l ，并且我国a 淀粉酶齐型、品种和生产菌株都很 单一。由于我国淀粉资源丰富，淀粉酶应用范围广泛，淀粉酶工业发展也必 将促进我国其它工业的迅速发展。为适合国民经济发展需要，应进一步扩大弘 淀粉酶的产量和品种。 1 4 特殊旺淀粉酶应用研究现状及展望 q 一淀粉酶通常p h 5 5 8 0 稳定，p h 4 下容易失活，酶活性最适p h 5 0 ，最适 温度5 0 c 一6 0 c 。根据酶性质的不同，可以把泓淀粉酶分为耐热a 淀粉酶、耐酸 u 。淀粉酶1 、耐碱n 淀粉酶、耐盐n 淀粉酶等。由于它们在特定条件下 的稳定性，在有关工业中具有高度的重要性。 1 4 1 耐热性淀粉酶 耐高温m 淀粉酶具有作用温度离、作用力强、反应速度快的特性，其最适 作用温度为9 0 9 5 c