（生物化学与分子生物学专业论文）菲降解菌鉴定及其降解机制的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其他教育机构的学位或证书雨使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：奄研 时间： 。i ) 年6 月妁日 珍尹西 1 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 鞋 时间：矿r 7 年6 月) j 日 时间： o r 1 影, e l p 日 m 中l 瓠 叮 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 多环芳烃( p o l y e y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p i i s ) 在环境中分布十分广泛， 极易在环境中累积并可通过食物链传递，对人类健康和生态环境具有很大危害性。本 研究从右油污染壤中分离刭3 株菲降解细菌( 菌株j 、菌株h 、菌株n 1 ) ，它们都能 以菲为唯一碳源和能源生长。3 株菌中，菌株t i 的生长和菲降解性能最好，经鉴定菌株 应属于枯草芽孢杆菌，并命名为b a c i l l u ss u b t i l i s 。菌株1 6 sr d n a 序列与枯草 芽孢杆菌属多种菌株的序歹 j 租似性都高达9 9 。通过对菌株1 1 实验分析得到韵主要结论 如下： 1 试验证实该菌株能以菲和芘为唯一碳源和能源生长。菌株i i 对1 0 0m g l 1 和1 5 0m g 一菲浓度下降解效果褶近，接种后l o d ，降解率可分爨达到9 6 3 和9 9 筛。菌株i l 在以 1 5 0 r a g l - l 芘为唯一碳源下，接种后l o d 其降解率可达9 4 3 。 2 菌株t f 的最适生长温度为3 0 。c 。培养基初始p h 为7 时，菌株i t 的生长较好。添加 不同有机物碳源后发现，葡萄糖加入可棉锚菌株1 1 的菲和芘的降解效果；水杨酸是多环 芳烃的代谢中间产物，促进菲和芘的共代谢降解过程。与菲和芘的单基质培养相比。菲 和芘的共基质培养促进了菌株i i 的对菲和芘的降解速率：与菌株f t 的纯培养相比，菲降 解菌株菌株i 、菌株1 1 、菌株 i i 的混培可明显提高培养基中菲的降解速率。此结栗显示， 共基质培养和多种菌株混培在p a h s 污染的生物修复中可能更为可行。 3 在c u 2 + 浓度小于1 5 m g l 4 的情况下，c u “浓度对菌株l i 的生长影响不大，该菌株可 以在重金属存在的环境中生长存活。菌体能有效地吸附c f ，更适合于从低浓度( 3 0 m g 9 4 ) 的c u 2 + 溶液吸附回收。 4 菌株l i 的降解底物广谱性研究结果显示，菌株t t 能利用儿茶酚和水杨酸，却不 链剩用邻苯二甲酸，这表弱其很可能是通过水杨酸途径来降解菲。另外在菌株1 i 中检测 到t ) l 茶酚2 ，3 - 双加氧酶的活性，这基本上可认定菌林i t 中拥有菲的水杨酸降解途径， 至于其细胞内是否含有其他的菲降解路径还有待于进一步研究。此外，菲诱导前后全细 缒蛋白量和，k 茶酚2 ，3 一双加氧酶的诱导性分析结果均表明，菌株i i 的菲降解酶系为诱导 型酶系，只在需要时才大量表达，其中儿茶酚2 。3 一双加氧酶主要存在于胞内。 关键词：菲；芘；生物降解；c u ” 摘要 a b s t r a c t p o l y c y c l ；ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a i l s ) a l ew i d e s p r e n dp o l l u t a n t sa n d 啪b er e l e a s e d t oa t m o s p h e r e , s o i l s ，f o o d sa n dw a t e r e x p o s u r et op a h sw o u l db eh a z a r d o u st oh u m a nh e a l t h a n de n v i r o n m e n t s ，m a dt h e r e f o r e ，t h e i re l i m i n a t i o ni sc o n s i d e r e da p r i o r i t yi nm a n y c o u n t r i e s t h i st h e s i sd e a l sw i t ht h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft h r e ep h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n g b a c t e r i af r o ms o i ls a m p l ec o n t a m i n a t e db yo i la n dn a m e da 8s t r a i ni 、l i 、1 1 1 w h i c ha r e c a p a b l eo fu s i n gp h e n a n t h r e n ea ss o l ec a r b o na n de n e r g ys o u r c e s ；s t r a i n1 1w 8 8t h eb e s to n e o ng r o w t ha m o n gt h et h r e es t r a i n s s w a i n1 1b e l o n g st ob a c i l l u ss u b t i f i s ，b a s e do nt h er e s u l t s o fp h y s i c a l - b i o c h e m i c a la n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f1 6 sr d n as e q u e n c e t h er e s u l t so f p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h es t r a i n 1 1w a sc l o s e s tt ob a c i l l u ss u b t i f i ss t r a i n f s 3 2 a e f 5 3 0 2 0 8 1 】b yw a y o fa n a l y s i n gp h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n gb a c t e r i as t r a i ni i ，w ec a n g e tr e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 t h ee x p e r i m e n tt e s t i f i e dt h a tt h es t r a i nw a sa b l et ou t i l i z ep h e n a n t h r e n ea n dp y r e n ea s t h es o l ec a r b o ns o t l r c e p h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o ni d e n t i f i e dw i t l id e g r a d a t i o n 翰l eo f9 6 3 a n d9 9 3 w i t h i n1 0 da tc o n c e n t r a t i o no f1 0 0 r n ga n d1 5 0 m gp h e n a n t h r e n ei nm e d i u mb y s t l a i n i i p y r e n cd e g r a d a t i o ni d e n t i f i e dw i t hd e g r a d a t i o nr a t eo f9 4 3 w i t h i nl o da t c o n c e n t r a t i o no f1 5 0m g p y r e n ei nm e d i u mb ys t r a i ni i 2 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s3 0 a n di n i t i a lp h 7i nm e d i ao ng r o w t ho fs w a i n1 1 a d d i t i o no fd i f f e r e n to r g a n i c so np h e n a n t h r e n ea n dp y r e n ed e g r a d a t i o no fs t r a i nt is h o wt h a t g l u c o s ec o u l dr e s t r a i np h e n a n t h r e na n dp y r e n ed e g r a d a t i o na b i l i t y , a n ds a l i c y f i ca c i dc o u l d p r o m o t et h ep h e n a n t h r e na n dp y r e n ed e g r a d a t i o no fs t r a i ni i c o m p a r e dt op h e n a n t h r e n a l o n e ，t h em i x t u r eo fp y r e n ea n dp h e n a n t h r e ni nm e d i u me n h a n c e dt h ep h e n a n t h r e n d e g r a d a t i o nr a t eo fs i l a i l ll i c o m p a r i n gt ot h ep u r ec u l t u r eo fs i n g l es t r a i ni i t h em i x t u r eo f s w a i ni 、 a n di l lc o u l de f l h a n c et h ep h e n a n t h r e na n dp y r e n ed e g r a d a t i o nr a t er e m a r k a b l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc o - m e t a b o l i s ma n dm u l t i s t r a i nm i x t u r ei sp r o b a b l ym o l ee f f e c t i v e a n df c a s i b l ef o rb i o r e m e t h a t i o no f p a h sc o n t a m i n a t e de n v i r o n m e n t s 3 b es m a l l e rt h a nu n d e rt h ec i r c u m s t a n c e so f1 5 r a g l 1a tc i l 2 + sc o n s i s t e n c y , c u 2 + , s c o n s i s t e n c yi sn o ti n f l u e n c et ot h eg r o w t ho fw a i n1 i t h i ss t r a i nc a l le x i s t ss u r v i v e si nt h e e n v i r o n m e n tu n d e rt h eh e a v ym e t a l t h et r a i np h y s i c a ls t a m i n ae f f e c t i v e l yb e i n ga d s o r b e d 2 沈阳农业大学硕士学位论文 c u “a n dm o r eb e i n gf l tf o ri na d s o r b i n gt h er e c o v e r yf r o mc u 2 * , ss o l u t i o no fl o w c o n s i s t e n c y ( 3 0 r a g - g 1 ) 4 t h ed i v e r s i t yo fd e g r a d a b l es u b s u a t e sb yt h es h a i l l1 1s h o w s ：s t r a i n1 1c o u l du t i f i z e c a t e c h o la n ds a l i c y l a t e ，b u tn o to p h t h a l a l 宅a ss o l ec a r b o na n d 伽a 韶s o u r c c s ot h er e s u l t so f d e g r a d a b l es u b s t r a t e si l l u m i n a t e dt h a ts t r a i ni ip r o b a b l yd e g r a d e dp h e n a n t h r e n et h r o u g h s a l i e y l a t er o u t e i na d d i t i o n t h ea c t i v i t yo fc a t e c h o l2 , 3 - d i o x y g e n a s ew h i c hc a nt e s t 毋t h e e x i s t i n go fs a l i c y l a t er o u t e , w a sd e t e c t e di n s t r a i ni i a sf a ra sw h e t h e rt h e r ei so t h e r p h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o nr o u t ei n c e i lo fs t r a i ni t o rn o t , n e e d st ob ef u r t h e rs t u d i e d t h e d e t e c t i o no fw h o l ec e l lp r o t e i n sc o n t e n ta n di n d u c t i o no fc a t e c h o l2 , 3 - d i o x y g e n a s eo fs u a i n i ia f t e ri n d u c e db yp h e n a n t h r e n es h o w e dt h a tp h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n ge n z y m es y s t e mi s i n d u c i b l ea n dm a ya b u n d a n t l ye x p r e s s e d c a t e c b o l2 ，3 - d i o x y g e n a s eo fs n a i n1 1e x i s t e d m o s t l yi n s i d ec e l l k e y w o r d s ：p h e n a m h r e n e ；l y r e ；b i o d e g r a d a t i o n ；c u 2 + 3 前言 第一章前言 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，简称p a h s ) 是一大类广泛存在于 环境中的有机污染物，因其具有致癌、致畸、致突变性而受到普遍关注。p a h s 是指两个 或两个以上的苯环以链状、角状或串状排列组成的碳氢化合物，可分为芳香环和非芳香 稠环型，目前环境污染研究中的p a i i s 一般是指芳香稠环型( 程国玲等，2 0 0 3 ) ，其中1 6 种p a l - i s 化合物在上个世纪7 0 年代末就已被美国环保局( u s e p a ) 列入优先控制的污染物 黑名单，欧洲则把荧葱、b a p 等6 种p a h s 作为目标p a h s ，我国水体6 8 种优先控制污染物中， p a h s 有7 种。环境中的多环芳烃来源有天然和人为两种。天然来源主要有微生物和高等 植物合成( w o l f g a n g ，2 0 0 0 ) ，火山活动、森林火灾也产生一定量的多环芳烃。人类活 动特别是化石燃料的燃烧是环境中多环芳烃的主要来源，大多来自于化学工业、交通运 输和日常生活等方面，如煤、石油、木材及有机高分子化合物的不完全燃烧或高温裂解 时都能产生多环芳烃。 p a h s 在自然环境中分布极其广泛，尤其是在煤和石油加工场所p a h s 的污染更为严 重。这些污染物质进入大气环境后，绝大部分通过沉降进入土壤，污染土壤环境，据估 计，有9 0 的多环芳烃在土壤表面残留。且全世界每年有近4 3 0 0 0 吨p a h s 进入大气圈， 2 3 0 0 0 0 u 屯p a h s 进入水环境( 丁克强等，2 0 0 1 ) 。其中最具代表性的三致化合物b a p 每年进 入大气的量为5 0 0 0 吨左右，进入水环境的有7 0 0 吨之多( 刘志培等，1 9 9 9 ) 。因此，必须 对多环芳烃类物质进行有效控制和治理。 1 1 多环芳烃的去除 我国多环芳烃污染日益严重，环境异生物质的积累导致了严重的环境污染问题。在 过去几十年中，科研工作者从控制环境污染的目标出发，十分重视去除有机污染物的可 能途径，例如，有机物可以挥发进入大气，吸附于固体表面等，由于难降解污染物可能 对环境造成危害，应当尽量避免这些现象的发生。但另一方面，也可以利用这些机理来 处理含难降解有机物的废水。以下为几种可能去除人工合成有机物的途径。 1 1 1 吹脱 即在常温常压或减压，或升温减压等条件下，通过吹脱去除有机物。一般来说，该 方法仅适用于低沸点、高挥发性的有机物的去除，但应当注意不能造成对周围大气环境 的污染或引起爆炸，应利用冷凝法回收吹脱的污染物。 4 沈阳农业大学硕士学位论文 1 1 2 化学氧化 即在强氧化剂，如臭氧、过氧化氢等的作用下使有机物氧化分解，有时需要投入催 化剂以加速其氧化分解过程。但该净化方法一般需要投入大量的运行费用。 1 1 3 吸附 即通过某些介质的表面对有机物的吸附作用将污染物从水中除去，一般可在恒温条 件下测定单位重量活性炭对有机物的吸附量，以判断该有机物的可吸附性。通过解吸可 以回收所除去的有机物，但活性炭或其他吸附剂的解吸再生过程往往是一件需要较大投 入的工作。 1 1 4 萃取 即利用有机溶剂将废水中有机物取出并回收，该有机溶剂应与水不相溶，并可以采 用其他化学药剂使之溶解，其中的有机物被溶出，而萃取剂可重复再用。 1 1 5 生物降解 即在微生物作用下使有机物得到分解稳定( 陈明等，2 0 0 1 ，x i a o d o n g ，1 9 9 6 ) 。 乍看起来，研究难降解有机物的生物降解特性并采取生物处理方法来处理难降解有机物 似乎不符合逻辑，因为一般条件下，微生物在利用有机物作为碳源和能源的过程中，可 以有效地将有机物分解稳定。而合成有机物仅在地球上出现y s o 年或更短的时间，微生 物并不具有相关的酶系统可以利用这些有机物。但采用生物处理方法处理难降解有机物 的可能性确实存在。首先，某些合成有机物具有与天然有机物相类似的化学结构，使微 生物能够对其发生作用：其次，虽然对于每一种反应都有专一性的酶，而酶的专一性却 不是绝对的，它可以作用于一定范围的基质。因此，考虑到微生物降解有机物的强大能 力及其可变异性与可适应性，研究难降解有机物的可生物降解性和采用生物处理方法处 理难降解有机物的可行性，仍成为世界科学界关注的热点。 1 2 多环芳烃的微生物降解的代谢方式 1 2 1 完全矿化 绝大多数有机物的生物降解都是与微生物生长相关联的，即微生物能从有机物降解 中获得碳源和能源以支持自身的生长繁殖。换句话说，该有机物可以作为微生物生长中 的唯一碳源和能源。其结果是，有机物通过生物降解所产生的中间产物进入正常的代谢 途径，某些碳被结合进入新细胞，而其他则转化成为二氧化碳。在这种情况下，可以说 异型生物性有机化合物得到了矿化。多环芳烃降解矿化的生物化学研究进行得比较深 前言 入，对此进行论述的内容也比较多。在多环芳烃被完全矿化降解过程中，分子氧与芳香 环相结合，引发了多环芳烃的氧化。反应受双加氧酶催化，并产生顺二氢二醇中间产 物( g u e r i n ，1 9 8 8 ) 。完全矿化使得微生物能以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长， 因此矿化降解只能针对具有2 、3 、4 个苯环的多环芳烃而言。 1 2 2 共代谢降解 被处理的有机物不能作为微生物的碳源和能源，微生物降解它们所产生的产物不仅 不能被利用，有时还对细胞有害( t h o m a s ，1 9 9 8 ) 。微生物必须有其他有机物作为其碳 源和能源，因此被称为共代谢生物降解。l e a d b e t t e r ( 1 9 5 9 ) 最早提出了共代谢现象， 并命名共氧化( c o o x i d a t i o n ) 。这个定义描述了微生物能氧化底物却不能利用氧化过 程中的能量维持生长的过程。后来3 e r s e n 扩展其内涵，提出共代谢( c o m e t a b o l i s m ) 的 概念即在有其他碳源和能源存在的条件下，微生物酶活性增强，降解非生长基质的效率 提高，也称为共代谢作用。共代谢降解和矿化降解有很大的差别。有机体不利用多环芳 烃进行生长，共代谢降解经初始氧化达到了一个停滞状态。除白腐真菌担子菌纲 ( b a s i d j o m y c e t e s ) ，其他所有研究过的真菌都是在共代谢的条件下把多环芳烃转化为 反一二醇。和细菌不同的是真菌对多环芳烃的初始氧化反应是在单加氧酶的催化作用下 进行的。 1 2 3 不确定激发氧化 b o u c h e z ( 1 9 9 5 ) 讨论了白腐真菌不明激发氧化。这种类型的多环芳烃降解最明显 的特征是反应机制和白腐真菌降解木质素的能力有关。因为木质素酶可以作为过氧化物 酶，并且具有底物不确定性，所以木质素降解酶系能攻击和氧化芳香污染物，氧化由氢 过氧化物酶得到的激发物开始。另外这些酶能在细胞外作用并转化非水溶性底物或化合 物，尽管这些化合物吸附于固体上。不确定激发氧化多环芳烃导致一系列代谢产物的形 成，除了酚类氧化产物，这些反应还能产生聚合物或其他有机分子的联合物。 1 3 影响多环芳烃生物降解的因素 1 3 1 与基质有关的因素 作为基质的有机物化学组成与分子结构，对生物降解性能有着决定性的影响。与生 命物质的分子结构越是类似的有机物，越容易被生物降解。非生命有机物分子中常带有 生理学中少见或完全不存在的某些特殊的基团，这些特殊基团的性质、数量和位置都会 影响有机物的生物降解性能，如卤素、氮基、氰基等都是典型的特殊基团，都会使有机 6 沈阳农业大学硕士学位论文 物的可生物降解性降低，而且这种基团的数量越多，生物降解性就越差。对于该影响因 素的研究，已经引起了人们越来越多的兴趣，以便认清化学结构与生物降解性之间的关 系，有利于根据化合物的结构预测其生物降解性。但从目前的情况来看，有关研究仍处 在初级阶段。此外，实际废水和水体中往往是多种有机物( 基质) 共存的。对于生物反 应来说，各基质之间往往存在着互相竞争、抑制、协同代谢等作用。单基质条件下的可 生物降解性可能与两种或多种基质共存( 共基质) 条件下的可生物降解性有所不同。选 择相对毒性较低，价格便宜，较容易获得的能用来维持多环芳烃降解菌生长，不容易被 其他非多环芳烃降解菌消耗的物质可以用作多环芳烃的共代谢底物。与目标底物相似或 是其代谢的中间产物，能够明显提高降解率的物质可以作为多环芳烃的共代谢底物。文 献中经常提到的有水杨酸邻苯二甲酸、联苯等。矿物油中含有很多有机物，文献报道其 中有些成分可以起到共代谢底物的作用。如果对矿物油进行透彻分析，并能证明它确实 能作为共代谢底物那么把矿物油污染的土壤和其他多环芳烃污染的土壤混合进行共代 谢降解将为污染土壤的生物修复提供一种新方法。共代谢底物的选择是应用共代谢作用 降解多环芳烃的关键问题之一。 1 3 1 1 初级基质的选择 一般选择葡萄糖、蛋白胨、蔗糖、甲醇、乳酸盐、乙酸盐、丁酸盐、淘米水、谷氨 酸、生活污水等生物易降解的物质作为初级基质，但并不是所有生物易降解的物质的加 入都能获得较高的共代谢率。 另外，在某些情况下也可以选择二级基质的类似物和中间代谢产物作为初级基质， 这主要是针对代谢酶的可诱导性而提出的。巩宗强等( 2 0 0 1 ) 报道，向土壤中加入多环 芳妊盼代谢中间产物水杨酸、邻苯二甲酸、琥珀酸钠等有机物，能提高微生物酶的活 性，促进芘共代谢降解过程的进行，处理2 5 天后的芘的降解率可达8 0 n , 6 ，其中以琥珀酸 钠作为共代谢的初级基质最好。 1 3 1 2 初级基质与二级基质的浓度比 s p e e c e ( 1 9 9 6 ) 报道，共代谢过程要求初级基质和二级基质保持合适的浓度比。对 于许多难降解物质，初级基质与二级基质的浓度比比难降解物质的初始浓度对其降解率 的影响更大。 1 1 3 能量物质 除了初级基质的产能代谢为微生物的生长和生物难降解物质的降解提供能量外，也 7 前言 可以考虑外加适量能量物质提供额外能量，以提高难降解物质代谢的速率。能量物质是 指在难降解物质代谢过程中，只产生能量而不能够转化为细胞的物质。试验中观察到， 适量甲酸( 作为能量物质) 的加入能较大幅度地提高甲烷细菌共代谢的速率，但长期投 加甲酸会抑制甲烷细菌的活性，这是因为长期投加甲酸会导致微生物细胞的逐渐衰竭。 1 3 1 4 营养物质 微生物的生长必须有足够的营养，共代谢不仅需要加入初级基质提供碳源，而且还 需要足够的氮、磷、硫等营养。并不是所有的碳源的加入都能获得较高的共代谢率，罗 宇煊等( 2 0 0 0 ) 采用不同碳源对嗜碱性木质素降解菌降解木质素的能力进行了比较实验， 发现在葡萄糖、乳搪、蔗糖、可溶性淀粉等碳源中，蔗糖是嗜碱性木质素降解菌最理想 的碳源，所以对各种难降解物质应选择各自合适的碳源。碳氮比对菌株产酶的能力有很 大影响，限碳培养基有利于酶的合成，限氮培养基对酶的合成极为不利，而且碳氮质量 比以1 ：1 2 为宜，在此条件下，能大幅度地提高酶的活性和木质素的降解率。微量营养 元素对微生物生长也是必须的( s p e e e e ，1 9 9 6 ) ，营养不足会使厌氧处理的有机负荷减 小和处理负荷降低。b l 。( s a w y e r ，2 0 0 0 ) 的加入能有效地提高氯化脂肪族化合物的共代 谢脱氯率。g u i o t ( 1 9 8 8 ) 报道，微量元素的补充可以提高所有种群微生物中活细胞的 浓度及其酶活性。 1 3 1 5 表面活性剂 使用表面活性剂的费用比较高，因此在多环芳烃降解过程中使用能产生生物表面活 性剂的微生物将会节约成本。但这需要对能产生生物表面活性剂并降解多环芳烃的微生 物进行鉴定，必须证明它们在场地上的应用。使用表面活性剂还存在许多问题，如抑制 性、毒性、生物降解性，人们一直在研究解决问题的方法。 1 3 2 与生物体有关的因素 主要是微生物的种类、数量，以及微生物是否具备分解该种有机物的酶系统。尤其 是难降解有机物的降解过程一般较长，会有中问产物的生成。因此，系统中还必须具备 分解各种中间产物的酶的微生物，即要求有各种微生物共存的微生物群体。 1 3 3 与环境有关的因素 1 3 3 1 环境温度和p h 值可影响石油的降解速率 在一定温度范围内，生化反应遵循的一个原则就是反应速度随温度升高而升高微 生物的分解活动需要酶的参与，酶活性的发挥都有一个适宜的温度范围。对于好氧菌来 8 沈阳农业大学硕士学位论文 说，最佳的石油降解温度一般在1 5 3 0 之间。另一方面，温度还直接影响油的物理状 态和化学组成。随着温度升高，烃的膜毒性增大；低温下油粘度升高，有毒的短链烷烃 挥发性下降，生物降解启动滞后。微生物的代谢活动也都有一个最适的p h 范l $ 1 ，大多数 土壤微生物适宜的p h 值在6 8 之间。 1 3 3 2 微生物生长代谢需要一定数量和比例的营养元素 这些元素必须保持一定的数量、形式和比例才能维持好氧菌的生长。这些元素包括 n 、p 、k 、n a 、s 、c a 、m g 、f e 、f , n 、z n 和c u ，另外几种厌氧菌必需的微量元素包括n i 、 c o 和s 。在污染环境中通常有机碳含量较高，而n 、p 相对缺乏。因为石油能够提供生物 较易利用的有机碳，而不能提供n 、p 及其他营养物。因此，n 和p 是常见的石油生物降解 的限制因素，添加适量n 和p 可以促进生物降解。一般认为w ( c ) ；w ( n ) ：w ( p ) = 1 0 0 ： 1 0 ：1 时晟适于烃类的生物降解。w ( c ) ：w ( n ) ：w ( p ) 达不到细菌代谢所需的比例， 就会限制细菌的代谢速度，从而制约污染物的降解。如1 9 8 9 年美国油轮在阿拉斯加海峡 触礁后，污染了4 5 0 k i n 海岸线，后来就是利用添加n 和p 到沙滩或石滩，而成功地加速了 土著细菌对石油的分解( 牛炳旭，2 0 0 4 ) 。 1 3 3 3 环境中的氧是制约石油降解速度的重要因素 微生物对石油的生化降解过程随烃类的不同而各异，但其降解的起始反应却是相似 的，即在加氧酶的催化作用下，将氧加入基质中形成一种含氧的中间产物。据估算每 分解1g 石油需要3 4g 氧气。无氧条件下，石油烃类的微生物降解也发生，但是速率 很低。有试验表明，在有氧时烃类经1 4d 可降解2 0 以上。而厌氧条件下经2 3 3 d 降解不 到5 。也有人认为厌氧降解对底泥及深水中烃类的降解具有一定意义。 1 3 3 4 微生物需要水来维持新陈代谢过程 土壤含水量过低会抑制微生物活性，而过高又会防碍空气的通透，影响氧的供应。 所以在生物治理土壤石油污染时应注意土壤的通气和含水量。另外，土壤含盐过多也会 降低微生物的降解效果室内试验证明土壤中油的生物降解率随盐度增大而减小。 1 3 3 5 有毒物质等所有微生物生命活动的环境因素 有毒物质等所有微生物生命活动的环境因素对有机物生物降解性都会产生影响。在 考察有机物的生物降解性能时，还必须十分重视有机物对生物体的毒性和抑制性。 1 3 3 6 不同降解菌株的混培 自然环境中总是多种p a i l s 同时存在的混合体系，研究中发现混合存在的p a i l s 在降解 9 前言 过程中除了通过共代谢方式的协同作用外，还观察到了它们之阃强烈的互相抑制现象。 多种微生物的混合培养则可减缓多环芳烃之间的降解抑制现象。 1 4 多环芳香烃化合物的降解途径 耳前，研究人员已经知道了降解多环芳香烃化合物( p 矗i l s ) 的许多微生物及其分解 代谢途径；但很难证实这些生物体能够积极的降解自然界中的污染物。m a d s e n 和他的同 事用“c 标记的萘把i n 豇f 硇q 生物降解产物连接到未知细菌基团( 1 0 u s s a i n t ，2 0 0 3 ) 。 菌株c j 2 已经被分离出来，并且与i n 酊罐f 切相关。研究表明，c j 2 与p o l a r o m o n a s v b c u o l a 抬密切相关，而与通常从污染场所分离出的萘降解菌p s e u d o m o n a s s p p 关系不 大。 l i 中 “n 游 西 图1 - 1 细菌降解萘( a ) 、菲( b ) 、慧( c ) 和芘( d ) 的上游途径 f | 培1 1p m p o s e d u p r i v 日p a t h w a y o f n a p l h a l i n e 、p h e 衄m t n 、p y r e = 、a n t h r a c e n e b y b a c t c r 衙 细菌对萘的降解也研究得最清楚。土壤中假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p p ) 对萘的 降解最早报道于1 9 6 4 年，后来在恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 0 u s 8 2 株中进行 1 0 毋疗 圆毋叫甲眇 弘驴馨 菠 酗忐节帮藩出骝枣拶如势持。 沈阳农业大学硕士学位论文 了深入研究。明确的发现是萘通过l ，2 一位初始双加氧化而分解，即目前已知的萘上游分 解代谢基本途径( 图i - i a ) 。在该途径中，每一步反应都包括了特定的酶：萘双加氧酶 ( n a p h t h a l e n ed i o x y g e n a s e ，n d o ) ( n a h a a a b a c a d ) ( a t 步) ，顺一萘双氢二醇脱氢酶 ( c s - n a p h t h a l e n ed i h y d r o d i o ld e h y d r o g e n a s e ) ( n a h b ) ( a 2 步) ，l ，2 一双羟萘双 加氧酶( 1 ，2 一d i b y d r o x y n a p h t h a l e n ed i o x y g e n a s e ) ( n a h c ) ( a 3 步) ，2 - 羟一2 h - 苯并 吡喃一2 一羧基异构酶( 2 一h y d r o x y 一2 h e h r o m e n e 一2 - c a r b o x y l a t ei s o m e r a s e ) ( n a h d ) ( a 4 步) ，反一o - 羟基苯脱萘丙酮酸水合一醛缩酶( t r a n s 一0 一h y d r o x y b e n z y l l d e n e p y r u v a t e h y d r a t a s e a l d o l a s e ) ( n a h e ) ( a 5 步) ，以及水杨醛脱氢酶( s a l i c y l a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ) ( n a l l f ) ( a 6 步) 。菲和蒽也常被用作p a h s 生物降解的模式化合物。 而萘转化为水杨酸( s a l i c y l a t e ) ，直至完全代谢为c o 。和h 2 0 过程( 图1 - 2 ) 其中所涉及 的酶，也可通过相似的代谢步骤降解菲和蒽，分别形成卜羟2 一萘酸 ( 1 一h y d r o x y 一2 一n a p h t h o e ) 和2 羟3 一萘酸( 2h y d r o x y 一3 一n a p h t h o a t e ) ( 图卜1 b ，c ) 。 一些研究还检测了3 、4 环的多环芳香烃的分解代谢途径。菲被p s e u d o m o n a ss p 菌株降 解，这个途径包含了萘的降解途径( p r a b h u ，2 0 0 3 ) 。利用m y c o b a c t e r i u ms p 菌株l b 5 0 1 t 降解菲的一条新途径被提出( v a nh e r w i j n e n ，2 0 0 3 a ) 。己知途径与所提出的途径在3 一 羟基一2 一萘酸形成之后出现差异。邻苯二甲酸和原儿茶酸被认为是后者的中间体，而不 是萘降解的中间体水杨酸盐和儿茶酚。已知菲降解的主要路径是通过3 ，4 - 位双加氧化而 开始的。但也曾提出鞘氨醇单胞菌p 2 株( s p h i n g o 衄o n a s 印) 可通过l ，2 一位双加氧化 而降解菲，与主要路径稍有差异。白腐菌对多环芳香化合物的降解能力很强，降解途径 也较清楚，如黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ) 对菲的降解过程中，菲 分子中9 一和l o 一位上先氧化断裂生成2 ，2 一联苯二甲酸( d p a ) ( 图卜3 ) ，这与细菌的降解不 同， 前言 c 0 一h 2 0 邻苯二甲酸途径 c o r 卜h 力 水杨酸途径 水杨酸) 图i - 2 细菌降解菲的代谢途径 f 喀i 一2 p r o p o s e d p a t h w a y o f d e g r a d a t i o n o f p h e n a n t h r e n e i n b a c t e r k r 菲 p q 豳i - 3 自腐菌对菲降解选径 f i g 1 - 3p r o p o s e dp a t h w a ytf d e g r a d a t l o no f p h e n a n t h r c n eb yw l l 缸r o t i 雌u s 徘t 园 沈阳农业大学硕士学位论文 1 ，2 芘( 1 r e n e ) 的降解芘通常被作为高分子p a h s ( 含有3 个以上芳环) 降解的模式 化合物。细菌主要通过4 ，5 一位初始双加氧化而降解芘( 图卜1 d ) ，如分枝杆菌 ( m y c o b a c t e r i u ms p ) p y r - 1 株。p y r - 1 株初始氧化攻击芘，可以产生顺一和反4 ，5 一芘 双氢二醇( 4 ，5 - p y r e n e d i h y d r o d i o l s ) 。双氢二醇重新环化及随后的剪切形成了4 ，5 - 菲 二羧酸( 4 。5 - p h e n a n t h r e n ed i c a r b o x y l i ca c i d ) ( i v ) ，并进一步代谢_ 磅弛一菲酸 ( 4 一p h e n a n t h r o i ca c i d ) ( 化合物v ) 。通过第二双加氧酶反应，形成随后的中间代谢 物顺3 ，4 一菲双氢二醇4 一羧酸( c i s 一3 ，4 - p h e n a n t h r e n e d i h y d r o d i o l 一4 - c a r b o x y l i ca c i d ) ( v i ) 。它重新环化产生3 ，4 _ 二羟菲( 3 ，4 - d i h y d r o x y p h e n a n t h r e n e ) ( v i i ) ，该化合 物也是菲降解的中间物。随后的代谢沿类似于菲的代谢途径而进行。 芴通过涉及起始单加氧酶降解维持t s p h i n - g o m o n a ss p l b1 2 6 的生长( v a n h e r w i j n e n ，2 0 0 3 b ) 。这种菌株也可共氧化蒽、菲和荧蒽而没有中间体的积聚。然而， 菌株l b l 2 6 不能断裂二苯并噻吩5 氧化物和二苯并噻吩5 ，5 一氧化物中的c - s 键，它们作为 共氧化产物而积聚。高温下通过提高溶解度，扩散和反应速率而增强了疏水性污染物的 生物利用度。f e i t k e n h a u e r 等( 2 0 0 3 ) 指出，混合的3 环到5 环的多环芳香烃混合物在6 5 ，十六烷作为降解溶剂时被嗜热b a c i l l u s 鳓阢和t h e z u sb r o c k l 癌成混合培养基 降解。雷萍等( 2 0 0 4 ) 研究表明，混合多环芳烃之间具有降解竞争抑制特征，且其生物 降解具有规律性。另外，tb r o c k i i 在7 04 c 下，十六烷和芘作为唯一碳源的生物反应器 中生长迅速。这种菌通过堆肥或者在温控生物反应器中对污染土壤和工业废水的快速修 复是有益的。 细菌降解菲时主要氧化3 一和4 一位。菲经过氧化生成9 ，1 0 一二醌菲( p q ) 后，进一步氧 化成d p a ，菲和p q 都可以降解生成d p a ，p q 生成d p a 的速度比菲的速度快的多( 是5 倍) ， 因此在培养过程中几乎不能检测到p q 的存在。有些研究结果显示，菲在白腐菌降解过 程中有少量的2 ，2 一联苯二甲醇和二氧化碳代谢生成，2 ，2 一联苯二甲醇是由d p a 还原而来， 不是菲直接氧化还原生成的，因为它的产生比d p a 要慢得多。d p a 的最终氧化产物是二 氧化碳，不过二氧化碳只占总代谢物的很少一部分，这说明菲结构的稳定性使得它的完 全降解比较困难。 1 5 基因组和生物降解 最近，基因组测序开始转向与环境相关的细菌。研究人员已经完全测定并公布了具 有潜在生物降解和生物修复能力的4 种生物体的基因组。这些基因组序列的有效性将会 1 3 前言 有利于对这些细菌新陈代谢能力的分析，并且揭示了它们在生物修复应用中的全部潜 能。从基因组序列中识别出的具有潜在效用的酶和蛋白质列于表1 1 中。 襄1 - 1 量新基因组测序中鉴别出的潜在用途的酶 t a b l e 1 1t h en e w e s t g e n eg r o u ps u r v e y s t h ee n z y m e o f p o t e m i a l u w h i c h d i s t i n g u i s h e d o u t i n t h eo r d d 生物体酶，蛋白质 1 8 双加