（遗传学专业论文）人类sgkl基因和九个低分子量gtp酶基因的克隆及其功能初步研究.pdf

戴方彦夏旦大学博士论文 摘要 由于生物基因组进化中的保守性，具有某一功能的基因在不同物种之间常具有一定的 同源性这种同源性对于新基因的功能研究具有提示式的指导作用。而利用这种基因间的 同源性，有目的的克隆基因家族新成员，已经成为一种新基因克隆的有效策略本论文分 为两部分，第一部分是利用酵母双杂交技术对一个已获克隆的人丝氨酸苏氨酸激酶进行 功能上的探讨，鉴定了人糖原合成激酶3b e t a 是该激酶的一个下游靶蛋白；第二部分是以 若干已知具有重要功能和相似结构的基因为信息探针，分离和鉴定了r a s 超家族中的9 个 新成员，并初步研究了它们在人肝癌细胞中的表达变化情况。 ，7 血清和糖皮质激素诱导激酶样激酶( s e r u ma n d g 1 u c o c o r t i c o i d - i n d u c i b l e i k i n as e - l i k ek if t as e ，s g k l ) 因能被磷酸肌醇3 一激酶( p h o s p h o i l l o s i t i d e3 - k i n as e ，p i3 k ) 磷酸化产生的磷脂信号所激活，而被证实为p i3 k 信号通路中的一个新的效应子。s g k l 利 用它的蛋白n 端的p h o x 同源结构域( p h o xh o m 0 1 0 9 yd o m a i n ，p xd o m a i n ) 来应答p i3 k 激活后产生的磷脂信号。然而，s g k l 作为效应子在p i3 k 信号传递中所参与的细胞生物学 功能至今没有报道。鉴定在人细胞中能与s g k l 互作的蛋白，尤其是其敞酶活性的下游耙 蛋白将有助于揭示s g k l 涉及的生物学功能。在本文第一部分中，我们利用酵母双杂交技 术，在人脑c d n a 丈库中筛选得到一个能特异和s g k l 互作的蛋白一一糖原合成酶激酶3b e t a ( g i y o o g e ns y n t h a s ek i f t as e3b e t a ，g s k 一3p ) 通过体内免疫共沉淀实验，s g k l 和 g s k 3p 的互作在人胚肾细胞2 93 ( h u m a ne m b r y o n i ck i d n e y ，h e k 2 93 ) 中得到进一步的证 实利用g s k 3 蛋白磷酸化位点( 丝氨酸2 l 9 ) 特异的抗体，体外激酶活性测试实验表明： 野生型的s g k l 能磷酸化6 s k 一3 融合蛋白的第2 1 9 位的丝氨酸；但激酶失活的s g k l 突变 蛋白s g k l ( k 19 l m ) 则不能。这充分表明了s g k l 能通过细胞内的直接互作磷酸化g s k 一3p 第 9 位的丝氨酸 在真核细胞中，r as 超家族成员调控着囊泡运输的不同步骤本文第二部分中，我们 克隆了9 个编码人类低分子量g t p 酶的新基因：r a b l b ，r a b 4 b ，r a b l0 ，r a b 2 2 a ，r a b 24 ， r a b 2 5 ，a r l 5 ，s a r a l 和s a r a 2 ，其中前6 个基因属于r a b 家族，后3 个基因属于a r f s a r l 家族这大大增加了现有r as 家族成员的数目因为消化和解毒是肝脏的两个重要功能， 所以肝细胞总是保持着较高水平的新陈代谢和主动性囊泡运输肝癌细胞中的生物功能异 戴方彦夏旦大学博士论文 常和肝细胞囊泡运输系统的功能障碍有一定的关系，因此研究参与囊泡运输的这些r as 家 族成员在肝脏细胞癌变过程中的表达变化十分有意义n or t h e m 印迹表明：这9 个r as 超 家族成员的m r n a 表达水平在11 例肝细胞癌( h c c ) 和i 个c h o l a n g i o h e p a t o m a ( c h ) 病例 中大多上调。此外，我们分析了这9 个基因在16 种正常人体组织中的表达谱、染色体定 位和基因结构。以上结果对于更好地理解囊泡运输系统和阐明肝癌发生的分子机制有一定 价值 、 关键词：兰暨一一s k 一3d ，憋杂交，m 3 k - 删，磷酸化，r a b ，a r f s a r l ，克隆，表达 竖萎 苎变生：墨兰查兰堡主丝墨 一 a b st r a c t b a s e do nt h ec o n s e r v a t i o n o f g e n o m e i n e v o l u t i o n ，g e n e s i n d i f f e r e n ts p e c i e sw i t ht h es a m ef u n c t i o no f t e ns h a r eh o m o l o g yw i t h d i f f e r e n td e g r e e s t h eh o m o l o g yi si n s t r u c t i v ei np a v i n gaw a yt o i n i t i a lf u n c t i o n a ls t u d i e so nn o v e lh u m a ng e n e s b e s i d e s ，u s i n gt h e h o m o l o g ya m o n gg e n e s t oc l o n en e wm e m b e r so fg e n ef a m i i i e sb e c o m e s a ne f f i c i e n tw a yi nt h el a b sw i t h1 i m i t e d f u n d s i nt h ef i r s tp a r t o ft h i s s t u d y ，w ec a r r i e do nf u n c t i o n a la n a l y s i s o fac l o n e dh u m a n s e r t h rk i n a s ew i t hy e a s tt w o h y b r i ds y s t e ma n di d e n t i f l e dt h a th u m a n g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a e s 3 b a t ei sad o w n s t r e a mt a r g e to ft h i sk i n a s e i i nt h es e c o n dp a r t ，w er e p o r tt h ei d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f9h o v e ig e n e sb e l o n g i n gt ot h i sf a m i l yw e r ec l o n e d i no u ri n i t i a l e f f o r tt oi n v e s t i g a t et h er 0 1 e so fv e s i c u l a rt r a f f i ci n1 i v ec a n c e r ， t h e i rm r n a e x p r e s s i o n l e v e li nh u m a n1 i v e rcancerw a sf u r t h e r a n a i y z e d s e r u ma n dg l u c o c o r t i c o i d i n d u c i b l ek i n a s e 一1 i k ek i n a s e ( s g k l ) h a s b e e ni d e n t i f l e da san e w i n t e g r a t o r t h a td e c o d e s i i p i ds i g n a l s p r o d u c e db yt h ea c t i v a t i o no fp h o s p h o i n o s i t i d e3 一k i n a s e ( p 1 3 k ) s g k l i sa c t i v a t e dv i ai t s l i p i d b i n d i n gd o m a i n ( p h o xh o m o l o g yd o m a i n ) i n r e s p o n s et o p 1 3 ks i g n a l i n g h o w e v e r ，d o w n s t r e a mt a r g e t so fs g k la s w e l ia st h er o l eo fs g k la sam e d i a t o ri np 1 3 k s i g n a l i n gi n h u m a n t i s s u e s r e m a i n st ob ee s t a b l i s h e d w ei d e n t i f l e dh u m a n g l y c o g e n s y n t h a s e k i n a s e3b e t a ( g s k 一3 b ) a sa s p e c i f i ci n t e r a c t i n gp a r t n e r w i t hs g k li nay e a s tt w o h y b r i ds c r e e n i n go fh u m a nb r a i nc d n ai i b r a r y t h ea s s o c i a t i o nb e t w e e nt h e s et w o p r o t e i n si sc o n f i r m e di n d e p e n d e n t l y i nh u m a ne m b r y o n i ek i d n e y ( h e k 2 9 3 ) c e l l sb yc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n f u r t h e r m o r e ，t h ek i n a s ea c t i v i t yo fw i i d t y p es g k lw e sr e q u i r e df o r t h ei nv i t r op h o s p h o r y l a t i o no fag s k 一3c r o s s t i d ef u s i o np r o t e i na t s e r i n e 一2 1 9 a sd e m o n s t r a t e dw i t ha p h o s p h o g s k 一3 a b ( s e r 2 1 9 ) s p e c i f i ca n t i b o d y t h ep r e s e n tr e s u l t sp r o v i d es t r o n ge v i d e n c e st h a t 墼查生：墨兰苎兰堡主塑墨一 一。一 s g k lc o u l d u t i i i z eg s k 一3 8a sad i r e c td o w n s t r e a m t a r g e tb y p h o s p h o r y l a t i n gg s k 一3 b a ts e r i n e 一9 t h er a ss u p e r f a m i l yi sk n o w nt or e g u l a t ev a r i o u ss t e p so fv e s i c u l a r t r a f f i ci n e u k a r y o t i cc e l l s i nt h ep r e s e n ts t u d y ，w eh a v e c l o n e d n i n en o v e lg e n e se n c o d i n gh u m a ns m a l ig t p a s e s ：r a b i b ，r a b 4 b ，r a b l0 ， r a b 2 2 a ，r a b 24 | r a b 2 5a r l 5 ，s a r a ia n ds a r a 27a m o n gw h i c ht h ef o r m e r s i xb e l o n gt oz a bf a m i l ya n dt h el a t t e rt h r e eb e l o n gt oa r f s a r if a m i i y t h ei d e n t i f i c a t i o no ft h e s en e wg e n e sh a sg r e a t l ye n l a r g e dt h ep o o l o ft h er a ss u p e r f a m i l y c t h ea b n o r m a lb i o l o g i c a lb e h a v i o ro fc a n c e r o u s 1 i v e rc e i i sm i g h tb ep a r t i a l l yr e l a t e dw i t ht h em a l f u n c t i o no f t h e v e s i c u l a rt r a f f i cs y s t e m ，s i n c ed i g e s t i o na n dd e t o x i f i c a t i o na r et h e m o s t i m p o r t a n tt w of u n c t i o n so f 1 i v e ra n d1 i r e rc e l i sk e e pah i g h m e t a b 0 1 i s m1 e v e la n da c t i v ev e s i c u l a rt r a f f i c i tw o u l db es i g n i f i c a n t t od e t e r m i n et h ec h a n g eo fy e s i c u l a rt r a n s p o r tm o l e c u l e ss u c ha st h e m e m b e r so fr a s s u p e r f a m i l yi nc a r c i n o g e n e s i so f i i v e rc e i l s w i t h n o r t h e r nh y b r i d iz a t i o n ，i ti s i n t e r e s t i n gt o f i n dt h a tt h e s en i m e n o v e l g e n e s a r e u p r e g u l a t e d i nm o s to ft h e1 l h e p a t o c e l l u l a r c a r e i n o m aa n d1 c h o l a n g i o h e p a 七o m ac a s e s t h ee x p r e s s i o ni n 16n o r m a l h u m a na d u l tt i s s u e s ，t h ec h r o m o s o m e1 0 c ia n dt h eg e n es t r u c t u r e so f t h en i n e g e n e s a r ea l s od e s c r i b e d t h ea b o v e f i n d i n g s c o u l db e v a l u a b l ef o r u n d e m s t a n d i n g t h ev e s i c u l a r t r a n s p o r ts y s t e m a n d e i u c i d a t i n gt h em o i e c u i a rb a s i so f 1 i v e rc a n e e r k e y w o r d s ： s g k l ，g s k 一3 p ，p 1 3 ks i g n a lp a t h w a y ， p h o s p h o r y l a t i o n ，r a b ， a r f s a r l ，c l o n i n g ，e x p r e s s i o n ，l i v e rc a n c e r 4 利用酵母双杂交技术研究人血清和糖皮质激素诱导激酶样激酶 第一部分 人血清和糖皮质激素诱导激酶( n g k ) 样激酶s g k l 通过直接互作能够磷酸化人糖原合成激酶3b e ta ( g s k 一3p ) 笫9 位丝氨酸 利用酵母双杂交技术研究人血清和糖皮质激素诱导激酶样激酶 前言1 磷酸肌醇3 - 激酶( p h o s p h o i n o s i t i d e3 - k i n a s e ，p i3 k ) 是涉及调控许多重要细胞功 能的关键蛋白之一【1 3 1 在胰岛素和一些生长因子的激活下，p l3 k 启动细胞内依赖 p i3 k 的信号通路中最初的信号传导，这是通过其磷酸化产生的三个不同磷脂酰肌醇磷酸化 衍生物作为第二信使来实现的。这三个衍生物分别为磷脂酰肌醇3 单磷酸，( p t d - i n s ( 3 ) p ) ， 磷脂酰肌醇3 4 二磷酸( p t d i n s ( 3 ，4 ) f 2 ) ，磷脂酰肌醇3 4 5 二磷酸( p t d - i n s ( 3 ，4 ，5 ) p 3 ) 【4 】p i3 k 能够调控不同细胞生物功能的机理则主要是通过第二信使和一系列能够解读 这些第二信使信号的下游效应子，例如：磷酸肌醇3 依赖的蛋白激酶 ( 3 一p h o s p h o i n o s i t i d e d e p e n d e n tp r o t e i nk i n as e l ，p d k i ) 和a k t 【5 】这两个p i3 k 信号通路中关键效应激酶在蛋白的n 端都具有一个对磷脂酰肌醇磷酸化衍生物高亲和性的 普列克底物蛋白同源结构域( p 1 e c k s tr i nh o m 0 1 0 9 y ，p t td o m a l n ) 。磷脂分子和p h 结构 域之间的互作不仅对于效应子的激酶活性是必需的，而且对于这些效应子在细胞内的重新 靶向以及随后对下游底物的识别和作用也是必需的【6 ，7 】。例如：p t d - i n s ( 3 ，4 ) p 2 和 a k t 的p h 结构域结合后能够诱导a k t 靶向到细胞质膜，位于细胞质膜的a k t 被p d k l 磷酸 化后导致了a k t 的激活【7 9 】。一般而言：这些p i3 k 信号通路中的效应子的活性和细 胞定位都受磷脂分子与蛋白( 结构域) 互作的影响。正是这些不同的效应子负责应答p i3 k 产生的第- = t - 言4 t t $ 号，并沿各自的通路传递这些信号从而产生最终不同的细胞生物学效 应。 血清和糖皮质激素诱导激酶样激酶( s e r u ma n dg i u c o c o r t ic o i d i n d u c ib 1e k i n 88 e l ik ek i o a s e ，s g k l ) 最初是被鉴定为血清和糖皮质激素诱导激酶( s e r u ma n d g u c o c o r t ic o l d - i n d u c i b l ek i n a s e ，s 6 k ) 家族中的一个新成员，它在大多数人体组织中 都有表达【l0 ，1 1 】目前，已经发现的s g k 激酶家族成员有三个，分别是s g k 【12 】，s g k 2 【1 1 】，s g k l 【1o l ( 又名s g k3 1 1 1 】和非细胞因子依赖的存活激酶( c y t o k i n e l n d e p e n d e n t s u r v i v a lk i n as e ，c i s k ) 【l 3 1 ) 这三个成员的蛋白n 端都缺乏能够结合磷脂酰肌醇 磷酸化衍生物的p h 结构域但是，s g k l 蛋白的n 端有一个p h o x 同源结构域( p h o x h o m 0 1 0 9 yd o m a i n ，p xd o m a i n ) ，这个结构域在s g k 和s g k 2 中都没有发现最近研究暗示 s g k l 能借助p x 结构域作为p i3 k 信号通路中的一个新的下游效应子，因为j u nx u 等人证 实谷胱甘肽s - 转移酶( g l u t a t h l o n es - t f a n s f e r as e ，g s t ) 和p x 结构域的融合蛋白在体外 6 利用酵母双杂交技术研究人血清和糖皮质激素诱导激酶样激酶 也能够与不同的磷脂酰肌醇磷酸化衍生物分子互作进一步的体内研究也表明：p x 结构域 与磷脂分子的结合对于s g k l 在3 t 3 细胞中内吞体( e n d o s o m e ) 的亚细胞定位是必需的。 因为当p x 结构域引入一个能破坏磷脂分子结合能力的点突变( r 90 a ) 时，s g k l 在3 t 3 细 胞中的内吞体亚细胞定位被破坏：而能引起激酶失活的a t p 结合位点的点突变的引入则不 能破坏这一亚细胞定位而且，s g k l ( r 9 0 a ) 突变也导致s g k l 体内激酶活性的降低在 c o s 细胞中，j o s e p h v v ir b a s l l l s 等人证实s g k l 的p x 结构域对p t d i n s ( 3 ) p 有高亲和力， 并且这种结合能力对于s g k l 内吞体亚细胞定位和由胰岛素样生长因子( i n s u l i n 一1 i k e g r o w t hf a c t o r 一1 ) 及表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o t ) 诱导导致的激酶激活是 必需的【1 4 】。s g k l 在大鼠中的同源物，c i s k 通过p i3 k 信号通路介导了白介素一3 ( i l 一3 ) 依赖的造血细胞的存活【1 4 】c i l k 的下游作用靶蛋白的研究揭示大鼠c i s k 和a k t 共有 几种相同底物大鼠c i s k 在体外能磷酸化组蛋白h 2 b 和b c l _ 2 家族的b a d ，体内能抑制 f o r k h e a d 转录调节因子f k h r l 的活性【13 】被a k t 磷酸化的b a d 和f k h r l l 能抑制这些 蛋白的促细胞凋亡活性【20 ，2 1 】，这提示大鼠c i s k 可能通过这种机制来促进造血细胞 的存活。 p i3 k 和a k t 已被发现是神经元细胞存活的两种重要调节因子【1 5 】。目前发现的p i3 k 对细胞存活的主要效应子是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶a k t 。在神经元细胞中，a k t 能通过p 【3 k 信号通路被神经生长因子( n g f ) 激活【1 6 】p i3 k 和a k t 的抑制物能阻断n g f 的细胞存 活促进作用。相反，激活的p i3 k 和a k t 在缺乏外部细胞存活因子刺激的情况下也能促进 神经元的存活【17 19 】虽然s g k l 作为p i3 k 下游效应子在人体细胞中所起的作用目前 还不是十分清楚，但s g k l 被推测认为在p i3 k 依赖的信号通路中起着和a k t 相似的作用。 因为s g k l 和a k t 为p i3 k 产生的磷脂信号所激活且都有相似的依赖磷脂分子结合结构域的 机制然而，s g k l 的p x 结构域和h k t 的p h 结构域对p i3 k 产生的磷脂类分子有不同的亲 和力【9 ，13 】。在体外，a k t 的p h 结构域更易与p t d i n s ( 3 ，4 ) p 2 结合【9 】，而s g k l 的 p x 结构域更易与p t d i i l s ( 3 ) p 结合【14 】。这种差异暗示s g k l 和a k t 在p i3 k 信号通路中 的激活可能存在着时空上的隔离然而，目前为止，s g k l 在人体细胞中的作用及其下游作 用蛋白还没有更多的报道因此寻找s c k l 在人体细胞中接受磷脂信号的激活并能被作用 的下游靶蛋白显得非常必要，这将为揭示s g k l 在人体的生物学作用提供更多的有益信息 为此，我们以s g k l 作为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术在人脑c d n a 文库中筛选能和s g k l 互作的蛋白，发现了人糖原合成激酶3b e t a ( g 1 y c o g e ns y n t h as ek i n as e3b e t a ，g s k 一3 利用酵母双杂交技术研究人血清和糖皮质激素诱导激酶样激酶 p ) 是s g k l 的一个特异的互作蛋白g s k - 3p 是一个在细胞中普遍表达的丝氨酸苏氨酸 激酶最初的研究表明g s k 一3d 位于p i3 k 依赖的信号通路中并能调节糖原合成【2 2 】最 近的研究别发现g s k 一3d 是介导许多不同细胞生物效应( 包括细胞存活、肿瘤发生和发育 过程【23 ，24 】) 的一个关键蛋白g s k - 3p 激酶的内源活性通过其第九位丝氨酸的被磷 酸化而受到抑制是其参与调控这些不同细胞功能的主要机制【25 】借助磷酸化位点特异 的抗体( 丝氨酸2 1 9 ) ，通过比较野生型s g k l 和激酶失活的突变型s g k l ( k 1 9 i m ) 的体外激 酶活性，我们在本文中进一步证明：s g k l 的激酶活性可以磷酸化g s k 一3 融合蛋白的第2 l 9 位的丝氨酸。 利用酵母双杂交技术研究人血清和糖皮质激素诱导激酶样激酶 材料方法 一、材料 i 1 s g k l 基因 g e n b a n ka c c e ssi o nn u m b e rs g k l ：a f 0 85 233 1 2 c d n a 文库 酵母双杂交用的人脑m a t c h m a k e rl e x ae d n a 文库 滴度为 l0 。c f u m i 1 3 质粒载体 酵母双杂交诱饵蛋白构建载体p l e x a 酵母双杂交文库构建载体p b 4 2 a d 酵母双杂交载体的实验背景资料( 表1 ) 哺乳动物表达载体p c m v h a 哺乳动物表达载体p c m v - m y c 表1酵母双杂交所用载体的实验背景资料 购自c l o n t e c h 公司：丈库载体为p b 4 2 a d ( c l o n t e c h ) i 4 菌株和细胞株 大肠杆菌d h 5 d 人胚肾2 93 细胞株 ( 本室保存) ( 本室保存) m a t c h m 蠊卟酵母双杂交体系( 表2 ) 表2 酵母双杂交体系所用菌株的实验背景资料 9 利用酵母双杂交技术研究人血清和糖皮质激素诱导激酶样激酶 1 5 1 6 p c r 引物 1 5 1l e x a 酵母双杂交体系表达载体上的鉴定引物： o k 黼o g r f a ga g ct i ca c ca t fg i l e x a - b ：a t r 艘 f i gg c r 鼢g g r f f , a r m 2 a d - a = c c ag c c 研3 3 c f g a a t g 曲z m ) - b ：c r gg c 瞄t a ga c aa g cc g ac 1 5 2 p c m y m y c 和p c m v h a 载体的两侧引物： 叭叭mc i cc t c 廊姒1 g 帆1 c c i gc a t l c ra g t 研c 6 1 5 3 s g k l ( k i 9 1 m ) 基因点突变引物： s g k l k i9 i m ：g i tt a t ( e tg i ca a ag t gi t a a a a a t ag s g k l k 1 9 i m - r ：t c tg t aa c ac t tt g ac a gc a ta a ac i 5 4 p l e x a s g k l 载体构建用的引物 s g k l b d a ：h a tg g at c ct a at g gc c ct g aa g at t cc t g s g k l - b d b ：g c cg c tc g ag t ca c aa a aa t aa g t c t tc t g l 5 5 免疫共沉淀用载体构建的引物： s g k l - i p a ：t a ta g at c tt a at g ca a ag a ga t c a c ac c s g k l i p b ：a a tg g ta c ct c ac a aa a at a ag t ct t ct g g s k 3 - i p a ：c t aa g at c ta t gt c ag g gc g gc c c a g aa c c g s k 3 一i p b ：t a ag a at t ct c ag g tg g ag t tg g aa g ct g a 以上引物均由上海生_ t - 生物工程有限公司合成 实验材料及试剂盒 16 1 蛋白标准分子量购自上海西巴斯生物技术开发公司 1 6 2 d n ah i n di i i e c o r i 双酶切d n a 标准分子量购自上海华关生物工程公司 l6 3 p c r 扩增试剂盒：购自上海p r o m e g a 公司；d n a 连接试o r 】盒( pr o m e g a 公司) ：p c r 产物 纯化试剂盒( b o e h r i n g er 公司) ；凝胶回收纯化试剂盒( b o e h r i n g er 公司) ：质 粒抽提试剂盒( b o e h r i n g e r 公司) 1 6 4 限制性内切酶( b i o l a b s 公司，b o e h r i n g e r 公司，g i b c ob r l 公司或pr o m e g a 公司) 1 6 5 d n a 测序试剂盒：b ig d y et er m i n a t o rc y c l es e q u e n c i n gr e a d yr e a c t i o l l ( p e 公司) 。 1 6 6 l i p o f e c t i n 转染试剂盒，磷酸钙转染试剂盒为g i b c ob r l 公司产品：酵母转化试剂盒 购自c l o n t e c h 公司 1 6 7 硝酸纤维素膜购自a m e r s h a m 公司；新生小牛血清和胎牛血清购自杭州四季青生物i 程材料公司；g 4 1 8 购自g i b c o 公司，g s k 3cr o ss t i d e 融合蛋白( g s k 一3a b c r o ss t i d e ) 3 0 k d ，融合在p a r a m y o c i n 的n 端，含有对应于g s k 一3 d b 两种异 构体s er 2 u 9 位附近的c g p k g p g r r g r r r t s s f a e g 的氧基酸残基 1 6 8 鼠抗c m y c 的单克隆抗体，兔抗h a 多克隆抗体，蛋白l 琼脂糖珠子购自c l o n t e c h 公司，抗鼠免疫球蛋白g ( h + l ) h r p 结合物，抗兔免疫球蛋白g ( h + l ) h r p 结合 物购自pr o m e g a 公司，磷酸化位点特异的抗体( 丝氨酸2 1 9 ) 兔多抗购自c e l l s i g n a lt e c h n o l o g y 公司 1 6 9 s d s p a g e 胶配方： 1 6 10 161 1 d s 加水至 1 l 2 s o s p a g e 上样缓冲液：2 0m l05mt r is h c l ，2 0m l 甘油，20m 12 0 ( w v ) s d s ，0 5m l0 1 ( w v ) 溴酚蓝，1 0m l d 一巯基乙醇，2 5m ld d h ，0 0 型旦壁兰璺圭奎垫查堡壅垡童塑翌生堕整苎堡墼苎壁整竺 1 6 12 1 6l3 16 1 4 1 6 1 5 161 6 1 6 17 1 6 1 8 1 6 1 9 1 6 20 16 2 l 丽春红染色液：o 5g 丽春红中加入1m t 冰醋酸，溶解后再加入1 0 0m 1 水，使 用前配置 1 x 磷酸缓冲液( 细胞用) 4 0g ，n a c l ；lg ，k c l ；5 7 5g ，n a , h p o ；i g ，k h , p o - 调 节p h 至72 - 7 5 ，1 2 0 。c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ，备用 e d t a 试剂：0 2ge d t a 溶解于1 x 磷酸缓冲液中 5 x 胰酶： n a c l4 0 g k c l 0 2 g n a2 h p o 1 2 h 1 0 0 0 6 g khlpo0 0 3 g 葡萄糖0 5 g 胰酶 1 2 5 g 过滤灭茵，一2 0 。c 储存用时用e d t a 试剂稀释至1 x 5 x 磷酸缓冲液( p h74 ) ( 免疫共沉淀实验用) n a ，h p o - 8 23 g ；n a h i p o ，2 0 4g ：n a c i ，4 0 0g 用0 i nn a o h 调节p h 至7 4 用双蒸水定容至2 升 洗涤缓冲液为含0 2 x 吐温2 0 的1 x 磷酸缓冲液 封闭缓冲液为含5 的脱脂奶粉的洗涤缓冲液 激酶缓冲液( t r is ( p h 7 5 ) 25 r a m ，d 一磷酸甘油5 m m ，d t t2 j l l m ，n a 3 v 0 4 0 i m m ，m g c l2 10 m m ) ；上样缓冲液含t r is h c l ( p h 68 ) 18 7 5 【1 1 m ，s d s6 w v ， 甘油3 0 d t t1 50 札，溴酚兰0 0 3 w v 。 裂解缓冲液( 储备) ：5 xp b s ，10 0m l ：0 5 me d t a ，5m l ：t r i t o n x i0 0 ，25m l 用双蒸水定容至5 0 0m l ，4 。c 储存裂解缓冲液( 实际用液) ；在裂解缓冲液( 储 备) 中加入01 i i i m 的p m s f ，l0 洲的p o p s t a i na ，i0 州的le u p o p t i n 和2 5g g m 1 a p r o ti n i n 10 d o ( 一h i s ，一l e u ，- t r p ，一ur a ) 溶液：为不舍h is ，t r p ，l e u ，u r a 等成份的l 0 d r o p o u t 溶液： ( 1 ) l - is 0 1 e u c i n e3 0 0m g ( 2 ) l v a l i n e l5 0 0m g ( 3 )a d e n i n e 2 0 0m g ( 4 ) l - a r g i n i n eh c l2 0 0m g ( 5 ) l l ys 1 n eh c l 3 0 0m g ( 6 ) l - m e t h io n i n e20 0m g ( 7 ) l - p h o n y l a l a n i i r e50 0m g ( 8 ) l - t h r e o n i t o 20 0 0m g 【9 ) l - t y r o s i n e3 0 0m g d d h2 0 定容至10 0 0m 1 ，4 保存 i 6 2 2 20 氨基酸储备液：每i0 0m l 溶液中分别含有下列成份，配制后保存于4 2 0xh isl - h isl i d i n oh c lm o n o h y dr a t e40 m g 2 0 t r pl - t r y t o p h a n 2 0 xl e ul l e u c i n e 2 0 ur au r a c i l 4 0m g 2 0 0m g 4 0m g 加d d h 2 0 定容至10 0m l ，4 6 保存 1 6 23 酵母转化缓冲液： 缓冲液体积缓冲液配制 l0 t e “10 0m 1t r is1 2 1 g ，e d t a n a ：2 h2 0 0 3 7 g ，盐酸 调p h 7 5 d d h t o 定容 10 xl i a c10 01 1 1 l l i a c 2 h j 0 10 2 0 g ，冰醋酸调p h 7 5 ， 5 0 p e g “10 0m lp e g 3 3 505 0o g ，d d h2 0 定容 型里壁兰苎童奎苎查!塞垡堕童苎壅堕整查堡塾竺堂堂竺 1 7 其它常用试剂 表3 常用试荆的配制 ， 试菊百丽而广一 1xs m 0 1 m n a c i , 1 0 “m m g s 0 4 , 5 0 m m t r i s h c l , 0 0 1 明胶 2 0xs s c 6 5 甘油一s 0 缓 冲液” 10 b u 缓冲液。 酵母裂解液 3mn a c l ，0 3i 柠檬酸三钠，口h 7 0 甘油6 50 m l ，m g s o 7 h ：02 4 6 5g ，2 0it r is c l ( p h 8 0 ) 1 2 5m l ，d d h 2 0 定容 n a2 h p o 12 hz 0 9 3 0 g ，n a hz p o 。2 h 1 03 9 0g ，d d h ：0 定 容 10 t r i t o i lx - 10 0 2 0 0m l ，10 s d si0 0m 1 n a c l 0 5 8g ，t r is0 1 2 g ，e o t a n a i 2 h 2 00 0 4g 1 0nh c i 调f h 8 0 ，d d h ：o 定容 5 。m 9 缓冲液“ n az h 12 h 1 08 55 g ，k h 】p o 。1 5 0g ，n a c l 0 2 5 g ， n h , c l05 0 g ，d d h 2 0 定容 1 8 雨两一 1 - 8 1 - o u l b e c c o sm o d i f l e de a g lem e d i u m 高糖培养基，抽滤除菡 1 8 2 l b 液体培养基： f o i y p e p t o n100 g b a c t o y e a sce x t r a c t 50 g n a c l i00e 1 8 3 s o 一u r a 液体培养基b ) ： 0 6 7 g 2 0 0 g l00m l 50m 1 5 0m 1 2 0 。t r p 50m 1 s ，o 一- u r “、h is 孽i 固体培养基、s d 一u r a ，一h i s ，一t r p 固体培养基、s o 一t r p 液体 培养基b)：分别减去或补充相应的氨基酸溶液，固体培养基含2o琼脂，妻寨最i w n 日) - o h s d 一u r a ，一h is 液体培养基一致 1 8 4 s d g al r a f 一u r a ，一h i s ，一t r p ，- l e u 固体诱导培养基”： s d g a l r a f ( c l o n t e c h 公司)3 7 9 g 10 。d o ( - h i s ，一l e u ，一t r p ，一u r a )10 0m 1 兰忑- 五一 ! ：! ! ! 灭菌( 儿5 ，高压湿热灭菌) 2 0m i n ，冷却至5 0 c ，加入下列成分后混匀铺板 10 b u 10 0m l 20 m g m lx - g a l 0 4m 1 1 8 5 ，m g d o t r p 固体培养基” 葡萄糖 a g a r 12 g 6 0 g 2 aru p r1 o k 驴 一， m t u m 卜o oo 糖叭h h 萄x x 叭一莉如加如 利用酵母双杂交技术研究人血清和糖皮质激素诱导激酶样激酶 5 m 9 缓冲液 10 d 0 ( 一h i s ，一l e u ，一t r p ，一u r a ) 20 xh is 20 xl e u 20 xu r a 6 0m 3 0m l5 l i t 15f f l l5m 加d d h 2 0 定容至 3 0 0m 灭菌( 1 15 ，10 1 b f t n 2 ) 20m i n ， l0mt h ia m i n e h c l ( v b 。) 10 0m g m l a m p 1 8 6 y p d 液体培养基” p 0 1 y p