（遗传学专业论文）小鼠早期胚胎发育相关功能基因作用机理研究.pdf

河南农业人学硕 ：论文 捅晏 背景与目的“d d k 综合症”( d d ks y n d r o m e ) 是d d k 近交系小鼠的特异繁殖现象，同 品系交配或d d k 雄鼠能够使其它近交系雌鼠正常受孕，但d d k 雌鼠与同亚种内其它近交 系雄鼠交配时，d d k 雌鼠几乎不孕。有研究证明这种极性不育的特性由位于小鼠第ll 条染 色体的卵子突变( o v u mm u t a n t 或o m ) 位点上的1 对等位基因所控制。 目前在小鼠早期胚胎发育过程中，主要表达的功能基冈有原癌基因、生长因子、生长发 育及凋亡基因、白细胞抑制因子等几大类，其中各个功能基因表达量的变化会对胚胎的正常 发育造成不同的影响，并且与o m 基冈引发的胚胎致死现象在胚胎学及生理学上极为相似， 杂交胚胎与本交胚胎在发育过程中候选基因片段的表达差异，可认为是直接导致胚胎死亡的 因素。本研究运用半定量r t - p c r 技术对候选功能基因在表达水平上检测不同交配组合胚胎 早期发育过程中存在的表达差异，分析并阐明这些已知基因与砌基因作用机理的联系。为 开仓, j o o 子突变基因作用机理研究的新思路提供依据；进一步完善小鼠胚泡形成过程中多基因 调控的相关理论；扩大d d k 这一模式动物的应用领域和实验范围；为卵子突变基因导致的不 孕症研究提供必要的准备。 材料与方法选取正常d d k 品系小鼠和b a l b e 品系小鼠，进行不同组合交配。以 ( d d k 早xb a l b c6 ) 交配组合致死胚胎为主要研究对象，以( d d k 早xd d k6 ) 、 ( b a l b e 竿xb a l b c 古) 两组交配组合正常胚胎为对照组，选用8 1 0 局龄的未经产母鼠按照 雌雄比例l ：1 方式合笼交配，通过对正常交配后植入前期受精卵的采集、观察；选取8 个 功能基因e g f 、e g f r 、t g f a 、b c l 2 、m c l 1 、c m y c 、h r a s 、l i f 作为候选基因；利用 半定量r t p c r 技术半定量检测相同基因在不同交配组合小鼠受精卵中的表达情况。 结果采集到形态学上发育正常的2 细胞至8 细胞期各9 0 枚11 0 枚，杂交胚胎桑葚期 开始发生细胞核弥散现象；在2 细胞期有e g f 、b c l 2 、m c l 1 三个基因进行表达，且三个基 因表达差异显著：在4 细胞期有6 个基因进行表达，e g f 、b c l 2 、m c l 1 、e g f r4 个基因 表达差异显著；在8 细胞期有7 个基因进行表达，e g f 、b c l 2 、m c l 1 、e g f r4 个基因表 达差异显著。 结论杂交胚胎从8 细胞期之后即桑葚期开始发生凋亡现象，因胚泡形成障碍，而导致 胚胎早期死亡；候选基冈中m c l 1 ，b c l 2 ，e g f ，e g f r 基冈在2 细胞一8 细胞期三种遗传 背景胚胎细胞中表达量差异显著( p 0 0 1 ) ，并且与正常胚胎相比杂交胚胎中差异基冈的表达 均下调，这些基冈表达水平的下调可能间接地引发早期胚胎致死现象。 关键词：d d k t 、鼠；卵子突变基因；候选基因；r t - p c r 河南农业人学硕一f ：论文 e x p r e s s i o no ff u n c t i o n a lg e n e si ne a r l ye m b r y o n i c d e v e l o p m e n t s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h e n gz h e n y u m a s t e rc a n d i d a t e ：c h a i b a o g u o b a c k g r o u n d a n dp u r p o s e d d ks y n d r o m e s h o w st h ed d km a l e sc a n n o r m a l l yf e r t i l i z et h ef e m a l e so fo t h e rs t r a i n sl i k ei nt h es a m es t r a i n ，w h i l et h ef e m a l e s o fd d ks t r a i na r en e a r l yi n f e r t i l ew h e nc r o s s e dt om a l e so fo t h e rs t r a i n s s t u d i e s s u p p o r t e dt h a t t h e p o l a r i n f e r t i l ec h a r a c t e r i s t i ci sc a u s e db ya l l i n c o m p a t i b i l i t y b e t w e e nt h e c y t o p l a m i cm a t e r i a l s i nd d ko o c y t ea n ds p e r mf a c t e r si no t h e r s t r a i n s ，t h e yw e r ea l lc o n t r o l l e db ya l la l l e l e so fo m l o c u sw h i c hh a sb e e nm a p p e do m m o u s ec h r o m o s o m e c u r r e n t l yi nt h ep r o c e s so fe a r l ye m b r y o n i cd e v e l o p m e n ti nm i c e ，t h em a i n f u n c t i o no ft h e e x p r e s s i o no fp r o t o o n c o g e n eg e n e s ，g r o w t hf a c t o r s ，g r o w t ha n d a p o p t o s i sg e n e s ，s u c ha sl e u k o c y t ei n h i b i t o r yf a c t o rf o rs e v e r a lc a t e g o r i e s ，i n c l u d i n g v a r i o u sf u n c t i o n a lc h a n g e si ng e n ee x p r e s s i o nw o u l de m b r y o sd i f f e r e n ti m p l i c a t i o n s f o rn o r m a l d e v e l o p m e n t ，a n d w i t ht h eo mg e n ei n d u c e d e m b r y o n i cl e t h a l p h e n o m e n o n i ne m b r y o l o g ya n dp h y s i o l o g ya r ev e r ys i m i l a r , h y b r i de m b r y o sa n dt h e e m b r y od u r i n gd e v e l o p m e n to ft h ed e l i v e r yo fc a n d i d a t eg e n ee x p r e s s i o nd i f f e r e n c e s c a nb ec o n s i d e r e da sad i r e c tr e s u l to ff e t a ld e a t hf a c t o r i nt h i s s t u d y ，u s i n g s e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c rd e t e c t e dt h ed i f f e r e n c e so ft h r e el e t h a lh y b r i de m b r y o sa n d c l a r i f i e dt h ec o n t a c tm e c h a n i s m so fo m g e n ea n do t h e rf u n c t i o ng e n e s p r o v i d e da n e wr e s e a r c hi d e a sf o rc r e a t i n gam e c h a n i s mo fe g gm u t a t i o n s f u r t h e ri m p r o v e dt h e f o r m a t i o no fm o u s eb l a s t o c y s t si nt h et h e o r yo fm u l t i p l e g e n er e g u l a t i o n t h e a p p l i c a t i o n so fd d km o d e l a n dt h ee x p e r i m e n t a lr a n g ea r ee x p a n d e d a sar e s u l to f n o n - e g gm u t a t i o nd i s e a s eo fp r e g n a n c y t op r o v i d ea n e c e s s a r yp r e p a r a t i o n m a t e r i a l sa n dm e t h o d si nt h i ss t u d 5c a r r i e do u tb yl e t h a lh y b r i de m b r y o s ( d d k 9 x b a l b c c 3 i ) a st h em a i ns t u ( 1 y w h i l et h eu s eo fn o r m a le m b r y o so ft h ec r o s s ( d d k 早xd d k 艿) f o rc o n t r o lo ft h er e s e a r c hw o r k u s e df e m a l em i c e8 10w e e k so f a g ew i t h o u tp r o d u c i n gm a l ea n df e m a l er a t i oo fl ：li na c c o r d a n c ew i t hm a t e dw a y m a l ea n df e m a l em a t i n gc a g et o g e t h e r t h e nw es e l e c t e de i g h tg e n e se g f , e g f - 凡 t g f - a ，b c l 一2 ，m c l l ，c - m y c ，h r a s ，l i f 硒ac a n d i d a t eg e n et h o u g hm i c r o s c o p e o b s e r v a t i o na n dc o l l e c t i n ge g g sa td i f f e r e n ts t a g e s u s i n gs e m i q u a n t i t a t i v er t - p c r d e t e c t e dt h es a m eg e n ei nd i f f e r e n tm a t i n gc o m b i n a t i o n si nt h ee x p r e s s i o no fm o u s e e g g s 4 7 河南农业大学硕十论文 r e s u l t sw ec o l l e c t e d9 0 110p i e c e si nm o r p h o l o g i c a ld e v e l o p m e n to fn o r m a l2 c e l lt o8c e l ls t a g e ，a n dh y b r i de m b r y o so c c u r s d i s p e r s i o np h e n o m e n o ni n8 - c e l l a p o p t o s i s i nt h e2c e l ls t a g e ，e g f , b c l 一2 ，m c l - 1a r ee x p r e s s i o nd i f f e r e n c e ss i g n i f i c a n t a t4c e l ls t a g ew i t h6g e n ee x p r e s s i o n ，e g f , b c l 2 ，m c l 一1 ，e g f r4g e n e sw e r e d i f f e r e n c e ss i g n i f i c a n t i n8c e l ls t a g et h e r ea r es e v e ng e n e se x p r e s s i o n ，e g f , b c l 一2 ， m c l - 1 ，e g f r4g e n e sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t c o n c l u s i o nh y b r i de m b r y o sf r o mt h e 8c e l l s t a g eo c c u r r e da f t e rt h es t a g eo f m u l b e r r ya p o p t o s i s ，b l a s t o c y s tf o r m a t i o nd u et oo b s t a c l e s ，w h i c hl e dt oe a r l y e m b r y o n i cd e a t h c a n d i d a t eg e n e sm c l - 1 ，b c l - 2 ，e g f , e g f rg e n ei nt h eg e n e t i c b a c k g r o u n do ft h r e ed i f f e r e n tp e r i o d so fe m b r y o n i cc e l l se x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p o 0 5 ) ，字母不相同表示差异极显著( p o 0 1 ) 图7 2 - c e ii 候选基因半定量检测 f i 9 7 m r n ai e v e l so fc a n d i d a t eg e n ei n2 - c e iib ys e m i q u a n t i t a t i o n 根据图7 所示，候选基冈小鼠的2 细胞期胚胎中的表达存在差异。经过方差分析，e g f 、 b c l 一2 、m c l 一1 三种候选基冈在实验组2 细胞期胚胎中表达量分别与两组对照组2 细胞期胚 胎中表达量差异显著( p o 0 5 ) ，字母不相同表示差异极显著( p o 0 5 ) ；而e g f 、e g f - r 、b c l 一2 、m c l 一1 在三种交配组合4 细胞期胚胎中表达 差异显著( p o 0 5 ) ，宇母不相同表示差异极显著( p 0 0 5 ) ：而e g f 、e g f r 、b c l 一2 、m c 卜1 在三种交配组合8 细胞期胚胎中表达颦著异显著( p 芷zefi n m2 0 7 6 5 5 21 圃m u s m u s c u l u 5e p i d e r m lg r o w t hf a 吐。r 础e p t o z 但g f r ) rt r 叫c r i p t v a r 】a x x t1 皿k 腿 l e n g t h = 5 9 8 3 璺! ! ! 堡! 望! ! i ! ! ! 曼g 兰三ie p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o rc - 岫m t i s = u l u s j ( o v e r1 0 0p h 刨1 1 丑k s ) s c o r e27 3 2b i t s1 3 9 6 ，e x p e c t20 0 i d e n t i t i e s = 4 0 0 4 0 21 9 9 ，g a p s = 0 4 0 2l o ) s t r e m d = p l u s p l u s q u e r y1 s b 3 c t 1 7 7 1 q u e z y6 1 跚c t1 8 3 1 q u e r y1 2 1 铀，c e 1 8 9 1 q u e r y 1 8 1 s b 3 c t1 9 5 1 q u e r y2 4 1 哂】c c2 0 1 1 q u e r y3 0 1 靳，c 七2 0 7 1 q u e r y 3 6 1 s b 3 c 七2 1 3 1 a g a c t g c a a g g c c g t g a a c c a c g t c t g c a a t c c m a t g c r o c t c g 国抽g g c t g c r g 瞄 i l il li lii ii ii ii ii i i i l ii il iii ll il li ii ii i | ii i i ii li i i i i i i i i ii l a g a c t g c a a g g c c g t g a a c c j l c g t c c g c a at i ：c t t r a 蛋弓c t c c t c 0 圄u 6 g c t g c r g g c c c t g a g c c c a g g g a c t g t g t c t c c t g c c a g a a 卫咖矗g c a g a g g c 矗g g g a g t g a ；t g 6 a i i i iii ij ii | | | i il l i i i il il ii ii l i i i iii i | ii l i i i l i ii l | i | il i i i i il l c c c t g a g c c c a g g g a c t g t g t c t c c t g c c a g q a t g t g 矗g c a g a g g c a g g g a g 曩g c g t g g g a a a t g c 柚啪0 c t g g 叠g o g a a c c 置a g g g a g 明阿g t 0 田i c a 础吁c 到卫嘎t g c a t c c l ii i i ilj i i il ii i | ii i i i i i i i i ili ii | i | i ji li i j i l li i i ii ii il i | il g a a a t g c 矗a c a ，c c t g g 甬g g g g g i a c c 再a g g g 矗g 曩t t g t g g a a a a t t c t g a a 卫g c a t c c 气 gtgccatccagaatgtctgccccaggccatgaacatcaga i ii | iiiiii i i i i i i il li i i ll | i ii ii i i ii li li i i i i i l il ii ii ii ii ll li g t g c c a t c c a g 】临t c t g c c 0 c a o g c c 矗卫g a a c 舀l t c a c c t g t a c 矗g g c 矗g g g 6 a c c a g a c a a c ：t g c a ；t c c a g t g t g c c c a c t a c a t t g a t g g c c c a c a c t g t g t c 矗a g a c c t 0 0 c c g c l ii | liii ii lii i i ii ii ii ii ii fi ii ii | i | i ii ii i i i i il il ii ii il li ll ll c a a c t g c a t c c 】晦躔g t g c c c a c t 矗c a m a t g 0 0 文c a c t g t g 到，国g a c c 豇；c c 吣c t c a 陀a t g a g m a a c a a c a c t g 理g g t c l g g a a g t 矗t g c a g a t g c c a a t a a t g t c i ii fil i i iii ii i l il ii il il ill i il iii i li li i | ii i l li ii li ii ii iii i t g g c 置卫c 姐g a g a g 矗a c a a c 矗c t c t g 6 t c ：t g g a a g t a t g c a g 爵t g c c a a t a a t g 理c t g c c a c c t x ：c a c g c c m k 叮g t a c c 哪g g 般g t g c t g g g c c4 0 2 l il ll ii ii ii l i i i ii | l ii ii li ii i i il il i | l | ii i i i c c a c c 2 a t g c c a c 。c c a a c t g t a c c t a t g g a 卫g t g c r g g g o c2 1 7 2 4 9 6 0 1 8 3 0 1 2 0 1 8 9 0 1 8 0 1 9 5 0 2 4 0 2 0 1 0 3 0 0 2 0 7 0 3 6 0 2 1 3 0 3 t g f - 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2 基因 圆胁m u s c u l u sb _ c e l ll e u k e m i a l 扣讪锄2 f 配1 2 ) ，t r 蚺c r i p t 可a n 蛆t l e n g t h = 2 5 2 9 c 黜猢碍翟錾撬丞1 1k 址咄l l 弼p h o m2 嘶一饥l 叫 s c o e e 。5 4 9b i t s ( 2 9 7 ) ， e x p e c t = 5 e 一1 5 4 i d e n t i t l e s = 2 9 9 3 0 01 9 9 鲁，g a p s = 0 3 0 0 o s t r a n d = p l u s p 1 。 ( 2 u e r y 髓j c t q u e r y s 叼c t q u e r y 铀，c t q u e r y 砧j c t q u e r y 5 h ，陡 1 1 6 0 3 6 1 1 6 6 3 1 2 1 1 7 2 3 1 8 1 1 7 8 3 2 4 1 1 8 4 3 6 0 1 6 6 2 1 2 0 1 7 2 2 1 8 0 1 7 8 2 2 4 0 1 8 4 2 3 0 0 1 9 0 2 一 河南农业人学硕士论文 、一i 一_ 5 m c i - 1 基因 錾暮藩裳麓幽圈团鼬，越s 伽- 衄曩严1 。i d l - - t u 衄as e 驰e n 强tl l - ) ，蠊醯 笪坠望：銎要娶! 三! m y e l o i dc e l ll e u k e 毗as e q u e n c e1 1 t u s 眦5 c i d 删】 ( o v e r1 0p | l b 陬癌i i n k o 一4 5 c o r e25 9 5b i t s ( 3 2 2 ) ， e x p e c t ：= 7 e 一1 6 8 i d e n t i t i e s 。3 2 4 3 2 51 9 9 i ，g a p s = 0 3 2 5l o q s t r a n d = p l u s p l u s o u e r y1 s 叼c t7 4 4 g u e r y 6 1 s 叼c 七8 0 4 q u e r y 1 2 1 s b ，c t8 6 4 q u e r y1 8 1 曲j c t9 2 4 q l 抡r y 2 4 1 班j c 七9 8 4 q u e r y3 0 1a g g a c c t a g a a g g c g g c a t c a g a a a3 2 5 i i i ii l | ii i i i i ii li iij ii i i i s b 3c t1 0 4 4a g g a c 黜g g c a t c a g a a a1 0 6 8 6 c - 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