（遗传学专业论文）枯草芽孢杆菌植酸酶phyc基因的克隆及其表达研究.pdf

四川大学博士学位论文 枯草芽抱杆菌植酸酶 1) 加 基因的克隆及其表达研究 遗传学专业 博士研究生:吴琦指导教师:刘世贵( 教授) 王红宁( 教授) 植酸酶作为一种绿色添加剂，已日益广泛使用于饲料工业中。研究表明， 来源于芽抱杆菌的植酸酶属于中性植酸酶不仅具有较好的热稳定性，有助于抵 抗饲料制粒或者膨化过程中引起的酶失活，而且其酶促反应的p h有效作用范 围在6 . 5 -7 . 5 之间， 适合用于消化道呈中性的鲤科鱼类， 以及在单胃动物中p h 值呈中性的肠道段中表现酶活力。目前，国内外尚无商品化的中性植酸酶投入 市场。 本研究从己筛选获得的中性植酸酶产酶菌株枯草芽抱杆菌 ( b a c i l l u s s u b t i l i s ) w h n b 0 2 出 发， 根据g e n b a n k 上的芽抱杆菌p h y c 基因 序列设计了 一对引物，采用 p c r法获得芽抱杆菌植酸酶的全长 p h y c 基因，并将其克隆到 p u c 1 8 一载体。序列分析表明，该基因全长 1 1 5 2 b p ，编码一个3 8 3 氨基酸的多 肤。通过与g e n b a n k 中登录的其他6 个植酸酶基因的核酸序列和氨基酸序列进 行比较，建立了系统进化树，结果表明:所有芽抱杆菌植酸酶具有较高的同源 性，来源于7 株芽抱杆菌的植酸酶在遗传上分为两大类。利用在线生物信息学 数据库及生物软件对本基因进行了信号肚序列、n - 糖基化位点、密码子偏爱性 等分析， 并对其二级结构、 疏水区和三维结构进行了预测。 b . s u b t i l i s w h n b 0 2 植酸酶 p h y c基因序列及其氨基酸序列在 g e n b a n k中登录，登录号分别为 a f 2 2 0 0 7 5 和 a a 0 4 3 4 3 4 . 1 根据芽抱杆菌植酸酶p h y c 基因序列及大肠杆菌表达载体p e 丁 一 3 0 b ( +) 多克 隆位点序列， 采用p c r 法获得不含有信号肤序列的植酸酶p h y c 基因的非融合和 融合表达片段。经克隆及序列测定后，构建了带有 t 7 1 a c 启动子的大肠杆菌的 植酸酶p e t 3 0 n f p h y c 和p e t 3 0 f p h y c 表达载体， 并转入大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ， 实 四川大学博士学位论文 现了有生物学活性的表达。 研究了诱导温度、 i p t g 诱导浓度和乳糖诱导浓度对 植酸酶非融合和融合表达的影响，并对表达目的蛋白的可溶性进行了分析。结 果表明，非融合表达在3 7 和3 0 表达产物以包含体形式存在，无表观酶活， 而 2 5 诱导的表观酶活最高;融合表达载体在 3 7 表观酶活较低，而 3 0 诱 导的表观酶活最高。表明降低诱导温度有助于实现目的蛋白的可溶性表达。两 种表达方式的工 p t g 最适诱导浓度为0 . 4 m m o l / l ，乳糖最适诱导浓度为1 yo，但 乳糖诱导表达的时间推迟 1 -2 h ， 且表达量不及i p t g 的诱导。 s d s - p a g e 分析表 明， 非融合和融合植酸酶的表达量分别约占菌体总蛋白的1 3 %和1 5 %， 分子量 分别为4 0 . 1 3 k d 和4 3 . 2 7 k d o 为实现芽抱杆菌植酸酶p h y 基因的分泌表达， 以及由酵母翻译后加工可能 带来的酶学性质改善，首次进行了该基因在酵母中的表达研究。根据芽抱杆菌 植酸酶p h y c 基因序列及毕赤巴斯德酵母表达载体p p i c 3 . 5 k 和p p 工 c 9 k 多克隆位 点序列， 采用p c r 法获得不含有信号肤序列的植酸酶p h y 基因胞内表达和分泌 表达片段。经克隆及序列测定后，构建了重组表达载体 p p i c 3 . 5 k p h y c和 p p i c 9 k p h y c ，经 b g l 1 1 线性化后，电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌 g s 1 1 5 。经 md和mm平板筛选、p c r检测和酶活性测定，获得阳性重组酵母，首次在毕 赤巴斯德酵母中实现了有生物学活性芽抱杆菌植酸酶的胞内表达和分泌表达。 s d s - p a g e分析表明，胞内植酸酶表达量约占菌体总可溶性蛋白的2 4 ， 分子 量为4 2 . 0 1 k d;而分泌表达的植酸酶为5 3 . 5 k d 和5 0 . 9 k d 两种分子量的蛋白， 去糖基化试验证明这是由于产物糖基化程度不同引起的糖蛋白。用麦芽汁半合 成培养基对分泌表达重组酵母进行培养， 经4 8 h 诱导酶活可达到2 4 5 3 u / m l ， 表 达量为出发菌株的1 0 . 5 倍。 将本研究获得的芽抱杆菌植酸酶的4 种基因工程菌表达产物，即大肠杆菌 表达的非融合植酸酶和融合植酸酶、酵母胞内表达的植酸酶和分泌表达的植酸 酶， 通过初步纯化后， 对其最适反应温度、 热稳定性和最适反应p h 值进行了测 定。结果表明，4 种基因工程植酸酶的最适反应温度分别为5 5 0c , 7 5 0c, 7 0 0c 和6 5 c，与天然植酸酶相比，分别降低了5 和增加了1 5 0c, 1 0 和5 0c 。热 稳定性测定表明，经7 5 处理时，4 种基因工程植酸酶分别表现为酶活急剧下 降，几乎没有损失，损失较小和几乎没有损失:在 9 0 水浴 5 m i n 和 1 0 m i n 后 四川大 学博士学位论文 的残留酶活性分别为 4 3 . 8 %和 3 5 . 5 %, 9 4 . 9 %和 7 5 . 7 %, 5 4 .6 %和 4 2 .2 %, 以及8 8 . 0 %和7 8 . 2 %， 均比天然植酸酶的有所提高0 4 种基因工程植酸酶的最 适反应p h分别为7 . 0 , 7 . 5 , 7 . 5 和7 . 0 , 催化效率在7 0 %以 上的 有效反应p h范 围分别为p h 5 . 5 - 8 , p h 5 . 5 - 9 , p h 6 . 5 - 9 和p b 6 - 8 ，比天然植酸酶的 扩大了0 . 5 - 1 个p h . 关键词: 枯草芽抱杆菌， 植酸酶， p h y c基因， 大肠杆菌， 毕赤巴斯德酵母， 表达 四川大学博 上 学位论文 c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f p h y t a s e p h y c g e n e f r o m ba c i l l u s s u b t i l i s ma j o r : g e n e t i c s p h . d . c a n d i d a t e : wu q i a d v i s o r s : p r o f . l i u s h i - g u i 另一方面，粪便中排出的大量的磷又 造成了对土壤和水源的污染。 磷存在于土壤表面， 不仅能在土壤中渗透和扩散， 还会与铜、铝、钙等元素形成不溶性复合物而保留在土壤中.如果土壤中磷大 量积聚并溢出，将随着土壤的侵蚀流动，造成自 然界水体的污染。一些国家从 环保的角度对集约化畜牧场己 提出了限制排磷的要求。荷兰于 1 9 9 8年通过了 m i n a s( 一种新的矿物元素结帐系统) 的立法， 其中严格限制了动物粪便中磷酸 盐的排放量。此外，植酸盐通过鳌合作用还可降低动物对锌、锰、铁、钙、钾 等主要微量元素的利用率，通过与蛋白质结合成植酸复合体而降低动物对蛋白 质的消化吸收率，从而使整个饲料的利用率降低。 随着人们对绿色食品消费需求的增加和对畜牧业生产与过程中生态环境 保护的重视，饲用酶制剂以其高效、安全、低成本等特点，已成为世界新型饲 料添加剂研究和应用的热点。植酸酶 ( p h y t a s e )即肌醇六磷酸水解酶 ( m y o - i n o s i t o l h e x a p h o s p h a t e p h o s p h o h y d r o t a s e ) . 是催化 植酸 ( 即 肌醇 六磷酸) 及植酸盐水解成肌醇与磷酸 ( 或磷酸盐)的一类酶的总称。大量研究表明， 在 猪、禽日粮中添加植酸酶，可使饲料中磷的利用率提高 4 0 - 6 0 %.粪便中磷 的排出量减少3 0 - 5 0 % 左右。目前全世界已公认，要提高饲料中植酸磷的利 用率，减少猪、禽粪便中植酸磷对环境的污染，降低植酸磷对其它微量元 素及蛋白质利用率的影响，应用植酸酶是一种有效的方法。 目前，以对真菌来源的酸性植酸酶研究最多，目 前已构建各种基因工程菌 并得到高效表达，并进行了规模化发酵生产，大大提高了酶产量和降低生产成 本， 己 在饲料工业中 得到 广泛应用。 由 于酸性 植酸酶其酶催反 应的 有效作 用p h 四川人学博士学位论文 范围在2 . 5 - 5 . 5 之间，因此主要使用于p h值呈酸性的单胃动物及少数鱼类如红 鲜等，但不适合用于消化道呈中性的鲤科鱼类，以及在单胃动物中p h值接近 中性的肠道中表现酶活力。 随着水产养殖业的发展， 水体磷的污染越来越严重， 急需开发出适于鱼类饲料用的植酸酶，这限制了酸性植酸酶的应用范围。研究 表明， 来源于芽抱杆菌的 植酸酶 属于中 性植酸酶 ( 3 - p h y t a s e , e c 3 . 1 ,3 .8 ) ， 不 仅具有较好的热稳定性，有助于抵抗饲料制粒或膨化过程中引起的酶失活，而 且其酶促反应的有效作用p h范围在6 .5 - 7 . 5 之间， 可以有效弥补酸性植酸酶的 不足。同时也可与真菌植酸酶混合使用，一个在胃中起作用，一个在肠道中起 作用，从而更有效地在单胃动物中水解植酸盐，提高植酸磷的利用率。 目 前，国内外己分离出多株产中性植酸酶的芽抱杆菌 ( b a c i l l u s )，克隆 了其植酸酶基因， 并在此基础上进行了表达研究。 由于芽抱杆菌属于原核生物， 所以目前用于芽抱杆菌植酸酶基因的表达系统主要使用的是大肠杆菌表达系统 和芽抱杆菌表达系统，也有在乳酸杆菌中进行表达的研究。作为原核生物基因 的模式表达系统，用大肠杆菌表达芽抱杆菌植酸酶，具有培养简单、生长速度 快的特点，但由于其分泌表达较为困难和容易形成包含体等原因，使得酶产量 提高有限。用枯草芽抱杆菌表达芽抱杆菌植酸酶，具有生物活性好，胞外分泌 等特点， 特别是基于p s t 启动子的p g t 4 4 表达系统 不仅 有精密的表 达调控机制， 而且有表达效率高，是很有前途的一类表达系统。但培养较为复杂，而且其产 量还难以用于实际的工业化生产，仍需进一步改造。此外，利用芽抱杆菌植酸 酶基因构建转基因植物，对于提高农学和园艺生产力是有意的尝试，但并不适 合作为生产本酶的生物发酵器。尽管目 前尚无将芽抱杆菌植酸酶在酵母表达系 统中进行表达的报道，但笔者认为，如果对芽袍杆菌植酸酶基因采取合适的改 造，借助成熟的酵母高效表达系统，是实现工业化生产芽抱杆菌植酸酶的必然 趋势。 作为用于饲料工业的酶制剂，由于饲料制粒工艺和动物生理生化的要求， 真正得到推广利用的植酸酶必须是具有良好热稳定性，同时又必须在动物正常 体温下具有较高的酶活性。 如何解决使其耐短暂制粒高温、又能在动物正常体 温下具有高酶活性这一对矛盾是目 前包括植酸酶在内的所有饲用酶制剂均需解 决的问题。此外，植酸酶催化的反应p h也必须与动物消化道相适应。不同的 四川大学博士学位论文 动物消化道的p h值不同，即使是一种动物在消化道的不同部位p h值也不同， 一般的p h值胃为1 . 5 - 3 .5 ，小肠为5 - 7 、 大肠为7 左右。因此要求饲用酶对p h 值有较大的适应范围。 真菌来源的酸性植酸酶主要作用p h 范围在2 . 5 - 5 , 5 之间， 芽抱杆菌来源的中性植酸酶主要作用p h 范围在6 - 8 之间， 如果酶催化反应的有 效p h 范围更广， 酶则能随食糜在各个消化部位持续发挥作用， 从而提高其对底 物的利用率。目 前，采用基因工程、蛋白质工程技术等对酸性植酸酶的热稳定 性和催化p h 进行改造己有许多成功的报道，但对于中性植酸酶尚无类似报道。 本研究拟从中性植酸酶产酶菌株枯草芽抱杆菌 wh n b 0 2出发，采用 p c r 法获得中性植酸酶p h y c基因全序列的克隆，并进行生物信息学分析。首次选 用大肠杆菌表达载体p e t - 3 0 b ( 十 ) 构建芽 抱杆菌植酸酶p h y c的原核表达载体， 设计非融合和融合表达两种表达策略，通过诱导表达条件的改变比较不同表达 方式对植酸酶表达的影响，进而通过部分酶学性质的测定，分析造成酶学性质 差异的原因。 首次选择毕赤巴 斯德酵母表达载体p p i c 3 . 5 k和p p i c 9 k进行芽抱 杆菌植酸酶真核表达载体的构建，设计胞内表达和分泌表达两种表达策略，以 期在酵母中获得有生物学活性的表达，并分析分泌表达中糖基化对表达产物可 能造成的影响， 进而通过部分酶学性质的测定， 分析造成酶学性质差异的原因。 通过以上研究，一方面，可以了解多种不同表达方式对芽抱杆菌植酸酶的 表达及其酶学性质的影响，为进一步的植酸酶蛋白 质工程提供试验素材和设计 方向; 另一方面， 可望获得在诸如热稳定性和反应 p h方面有良好改进的植酸酶， 为饲用植酸酶提供新品种，为实现中性植酸酶的工厂化发酵生产提供有益的实 践。目前，国内外尚无商品化的中性植酸酶投入市场。因此，加快利用现代生 物技术对中性植酸酶进行研究与开发， 使我国自行生产成本低廉的中性植酸酶， 对缓解我国磷资源的缺乏，降低饲料成本，减少磷对环境的污染，具有重大的 经济效益和社会生态环境效益。 四川大学博士学位论文 第一章 枯草芽抱杆菌 w h n b 0 2 植酸酶p h y c 基因的克隆及序列分析 摘 要:根据g e n b a n k 上注册的芽抱杆菌p 勺c 基因序列设计一对引 物， 采用 p c r法获得产植酸酶枯草芽抱杆菌 ( b a c i l l u s s u b t i l i s ) w h n b 0 2株植酸酶的全长 p h y 基因，并将其克隆到p u c 1 8 - t 载体。 序列分析表明该基因全长 1 1 5 2 b p ， 编码 一个3 8 3 氨基酸的多肤。 通过与g e n b a n k 中的其他6 个芽抱杆菌植酸酶基因的核酸 序列和氨基酸序列进行比较，建立了系统进化树，结果表明:所有芽抱杆菌植酸酶 具有较高的同源性， 来源于 7 株芽泡杆菌的植酸酶在遗传上分为两大类。 利用在线 生物信息学数据库及生物软件对本基因进行了生物信息学的分析和预测，结果表 明: 本芽抱杆菌植酸酶基因存在信号 肤序列， 其切割位点位于编码的第 2 6 个与第 2 7 个氨基酸残基之间:在全长多肤序列中共有 4 个潜在的n 一 糖基化位点，当取闲 值=0 . 5 时，第 1 0 1 位、1 1 8 位和2 2 3 位的a s n 残基可被糖基化;成熟肤的理论分 子量为3 9 . 2 4 k d ; 一些密码子具有明显的偏爱性; 二级结构富含 5 9 . 1 %的无规卷曲; 存在 8段主要的疏水区;三级结构预测结果与已知的芽抱杆菌植酸酶结构一致。 b a c i l l u s s u b t i l i s w h n b 0 2 植酸酶p h y 基因序列及其氨基酸序列在g e n b a n k 中登 录，登录号分别为a f 2 2 0 0 7 5 和a a 0 4 3 4 3 4 . 1 诱导 培养后获 得了 有活性的 胞内 表达， 表达产 物与 出发菌株植酸酶具有相同的分子量，这在国内外尚无同类研究报道。 另一方面，由于芽抱杆菌植酸酶在天然菌株中是分泌表达的，分泌表达也 有利于纯化。因 此，在p . p a s t o r i s 酵母胞内 成功表达的 基础上， 本研究进行了 芽抱杆菌植酸酶在酵母中的分泌表达研究，并希望能通过宿主对蛋白翻译后的 一系列修饰作用给酶蛋白带来一些酶学性质上有益的改变。本研究构建了芽抱 杆菌植酸酶基因的p p i c 9 k p h y c真核表达载体，转化、筛选获得p . p a s t o r i s 重 组酵母 p p 9 k c ，诱导培养后获得了有植酸酶活性的分泌表达，其胞内表达产物 的 分子量远大于出发菌株植酸酶的分子量。 使用p . p a s t o r i s 表达系统，实 现有 生物学活性的芽抱杆菌植酸酶在酵母中的分泌表达， 国内外尚无同类研究报道。 四川大学博士学位论文 4 . 2 本 研究中 使用的p . p a s t o r i s 真核 表达载体p p i c 3 . 5 k 和p p i c 9 k 是两 种可以 进行多拷贝插入的表达载体，而且在与宿主细胞发生同源重组时，其插入的拷 贝数与表达载体采用不同酶切进行线性化有很大关系.有研究表明，以 b g 1 1 1 线性化的表达载体主要以双交叉置换方式 ( d o u b l e c r o s s o v e r e v e n t )整合到 宿主染色体中，发生多拷贝重组的几率极低，基本为单拷贝转化子，为甲醇利 用慢型。而以 s a l i 和 s a c i 线性化的表达载体主要以插入方式 ( i n s e r t i o n e v e n t )整合到宿主染色体中，有 1 %- 1 0 %的几率发生多拷贝重组，为甲醇利 用快型。本研究选用 b g 1 i i 进行酶切，转化酵母后，产生的是单拷贝重组， 单 拷贝转化子的优点是具有更好的遗传稳定性， 一方面可以省略用g 4 1 5 进行高拷 贝转化子的抗性筛选，减少了筛选工作量，另一方面由于转化子数量不多，可 直接进行酶活检测、筛选。此外，由于是首次使用酵母表达系统进行芽抱杆菌 植酸酶的表达，为避免基因剂量过大造成表达困难和/ 或表达产物包含体的形 成，本研究选用了产生单拷贝重组酵母的b g 1 1 1 线性化方式。 4 . 3由于酵母细胞壁较厚，特别是经过较长时间培养后的细胞，给获取酵母胞 内 有生物学功能的d n a 和蛋白质带来困难。本研究的经验表明，在直接使用酵 母细胞做菌体p c r 时， 最好使用培养 1 6 - 2 0 h 正处于对数生长期的细胞， 因此时 的细胞比较柔嫩， 依靠p c r 反应中的预变性和每轮循环中的9 4 0c 高温就足以使 细胞有效破裂，释放出d n a 作为模板。而对于培养时间长的酵母，即使先将细 胞单独进行沸水裂解，离心取上清液做p c r ，也容易出 现假阴性。 为获取胞内有活性的蛋白质，本研究先后使用了蜗牛酶法、玻璃珠法、液 氮研磨法以及n o v a g e n 公司的酵母蛋白 抽提试剂盒。结果发现，蜗牛酶可以 使 酵母一定程度的原生质体化，并造成胞内物质渗漏，但进一步超声波处理仍难 以有效破碎细胞。而且蜗牛酶的酶解产物细腻润滑，很难离心沉淀。此外，由 于蜗牛酶是一种复合酶，它的使用势必会给纯化带来更多的杂蛋白。玻璃珠法 是处理少量细胞的最好方法，通过交替高速涡旋和冰浴处理，可以有效破碎细 胞，将胞内蛋白有效释放，而且这种物理性破壁不会带来杂蛋白污染，但必须 调整好细胞浓度和玻璃珠的用量。液氮研磨法适合处理中等量细胞， 但由于酵 母是单细胞生长，体积小，即使添加石英砂，能真正磨碎的细胞仍相当有限。 四川大学博士学位论文 n o v a g e n公司的酵母蛋白 抽提试剂盒，不同细胞量都可以处理，尽管该公司宣 称是目 前最温和的酵母胞内蛋白提取试剂，但在本研究中用于诱导后的细胞并 没取得好的效果，即使将作用条件提高到3 7 0c 3 h 也未能有效破壁，细胞仅发 生一定程度的原生质体化后引起胞内物质渗漏， 可能仅适合于柔嫩细胞的破壁。 此外， 还有z y m o l y a s e 酶消化以 及高压细胞破碎机等方法对酵母进行破壁， 但 因试剂和仪器价格高，难以普及使用。本研究认为，对于小量酵母细胞破壁， 最好使用玻璃珠法，而对于量稍大的细胞破壁，使用液氮研磨仍然不失为一种 较为稳妥的方法。 4 . 4由于b m g y 和 b m m y培养基价格昂贵，不适合进行大规模发酵，而且由于该 培养基中磷酸盐本底水平太高，影响了对植酸酶活性的测定。本研究改用价格 低廉而且磷酸盐本底水平很低的麦芽汁半合成培养基，分泌表达植酸酶的重组 酵母p p 9 k c 经甲醇诱导培养4 8 h ，产酶活性达到2 4 3 3 u / m l ，为出发菌株产酶量 ( 2 3 3 u / m l )的 1 0 . 5 倍。 尽管产量比出发菌株有所提高，但表达效率偏低。除培养条件和培养基等 发酵工艺原因外，这与密码子的偏爱性也很重要。根据密码子偏爱性统计氨基 酸密码子，结果表明，在酵母中表达的芽抱杆菌植酸酶基因序列中使用酵母稀 有密码子达到5 0 %的氨基酸有:脯氨酸p r o ( 8 / 1 6 ) ，精氨酸a r g ( 6 / 1 0 ) ，丙 氨酸a l a ( 2 0 / 3 0 ) ， 苏氨酸 t h r ( 1 5 / 2 1 ) ， 甘氨酸g l y ( 3 1 / 3 6 ) ， 亮氨酸l e u ( 1 3 / 1 3 ) e 可见，宿主使用的稀有密码子含量太高，可能严重影响了翻译水平的表达，从 而造成表达量的低下。此外，由于转化子均为单拷贝整合，从而从转录水平影 响了目的蛋白的表达量。 4 . 5根据本研究结果，认为提高芽袍杆菌植酸酶在毕赤巴斯德酵母中的分泌表 达量仍有较大的潜力。本课题组己在进行芽抱杆菌植酸酶基因密码子的改造工 作，通过点突变和人工合成基因的方法，将芽抱杆菌植酸酶基因中的部分密码 子换成酵母高频使用的密码子，并对表达载体采用多种线形化处理方式，筛选 获得高拷贝高表达的重组酵母。 拟进一步对芽抱杆菌植酸酶酵母基因工程菌进 行高密度发酵工艺研究， 可望提高表达量，实现中性植酸酶的规模化生产。 四川大学博士学位论文 第四章基因工程芽袍杆菌植酸酶的 纯化及最适 p h 、最适反应温度、热稳定性的测定 摘要:将本研究获得的芽饱杆菌植酸酶的4 种基因工程菌表达产物，即 大肠杆菌非融合植酸酶、大肠杆菌融合植酸酶、酵母表达的胞内植酸酶和分泌 植酸酶，通过纯化处理后， 进行了s d s - p a g e 分析。 通过去糖基化试验， 确定了 分泌表达植酸酶的分子量为5 3 . 5 k d 和5 0 . ad 糖基化程度不同的两个糖蛋白。 进一步对其最适反应温度、热稳定性和最适反应p h 值进行了测定。结果表明， 4 种基因工程植酸酶的最适反应温度分别为5 5 0c, 7 5 0c , 7 0 和6 5 0c ， 与天然 植酸酶相比，分别降低了5 和增加了1 5 0c, 1 0 和 5 c。热稳定性测定表明， 经7 5 处理时，4 种基因工程植酸酶分别表现为酶活急剧下降，酶活几乎没有 损失，酶活损失较小和酶活几乎没有损失，在 9 0 水浴 5 m i n 和 1 0 m i n 后的残 留酶活性分别为 4 3 . 8 %和 3 5 . 5 %, 9 4 . 9 %和 7 5 . 7 %, 5 4 . 6 %和 4 2 . 2 %，以及 8 8 . 0 %和 7 8 . 2 %，均比原植酸酶都有所提高。最适反应 p h测定结果表明，4 种基因工程植酸酶的最适反应p h分别为7 .0 , 7 . 5 , 7 . 5 和7 . 0 ， 催化效率在7 0 %以 上的 有效反 应p h范围 分别为p h 5 .5 - 8 , p h 5 .5 - 9 , p h 6 .5 - 9 和p h 6 - 8 ， 均比 原植酸酶有所提高。 关键词:基因工程，植酸酶，纯化，最适反应温度，热稳定性， 最适反应p h 四川大学博士学位论文 1 引言 目前，通过基因工程微生物发酵来大规模廉价生产饲料用酸性植酸酶酶制 剂使这一问题己基本得到解决，但植酸酶制剂应用上的另一个关键性问题始终 没有能够得到解决，即酶的热稳定性。加工饲料都需经过一个制粒工艺，在制 粒过程中有一个短暂的高温过程， 温度一般在7 5 -9 3 c ， 一般的植酸酶活性在 此高温下大幅度地不可逆丧失。真正得到推广利用的植酸酶必须是具有良好热 稳定性的;但另一方面，饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性，因为饲 料用酶最终的作用场所又是猪、鸡等动物正常体温( 3 7 左右) 的肠胃道中，特 而鱼类的体温则更低，这与工业上所使用的一些高温酶不同。如何解决使其又 耐短暂的制粒高温、又能在动物正常体温下具有高酶活性这一对矛盾是目前包 括植酸酶在内的所有饲料用酶制剂均需解决的问题。此外，真菌来源的酸性植 酸酶主要作用 p h范围在 2 . 5 - 5 . 5之间，芽抱杆菌来源的中性植酸酶主要作用 p h 范围在 6 - 8 之间，如果酶催化反应的有效p h 范围更广，酶则能随食糜在各 个消化部位持续发挥作用，从而提高其对底物的利用率。因此，如能通过基因 工程、蛋白质工程技术等使植酸酶本身就具有良好的热稳定性和更广的有效反 应p h 范围，无疑是很有意义的。 通过基因工程菌表达植酸酶， 由于表达宿主的不同， 表达基因序列的改造， 宿主对产物的表达后修饰作用，以及表达产物在不同宿主中可能存在蛋白折叠 的差异，可以给基因工程表达的植酸酶带来一些性质上的变化。本研究对芽抱 杆菌植酸酶基因在大肠杆菌的非融合表达产物、融合表达产物，以及在毕赤巴 斯德酵母的胞内表达产物和分泌表达产物进行初步纯化的基础上，测定了其最 适反应温度、 热稳定性和最适反应p h ， 发现它们这些性质与其天然植酸酶相比， 都出现了不同程度的改变，并分析了 造成这些性质差异可能的原因。 本研究结 果为进一步对该基因进行改造和优化表达方式，奠定了基础。 材料与方法 . 1 材料 2 . 1 . 1 植酸酶重组基因工程菌株 四川大学博士学位论文 表 4 - 1 本试验使用的植酸酶重组基因工程菌株 t a b . 4 - 1 r e c o mb i n e d e n g i n e e r i n g s t r a i n s u s e d i n t h e e x p e r i me n t 菌种来源 云c o l i p e t 3 0 n f p h y c 丑c o l i p e t 3 0 f p h y c 只 p a s t o r i s p p 3 . 5 k c 只 p a s t o r i s p p 9 k c 本研究 本研究 本研究 本研究 2 . 1 . 2 主要试剂 氨节青霉素/ 卡拉霉素为成都天泰生命科技有限公司进口分装;i p t g购自 北京赛百胜生物工程有限公司; e n d o h f 购自英国b i o l a b s 公司植酸钠购自美 国s i g m a 公司; 4 0 0 - 6 0 0 u m 玻璃珠购自 北京欣经科生物技术公司;甲 醇等试 齐 u 为国产分析纯。 2 . 1 . 3 培养基 l b培养基、y p d 培养基、b m g y 和b m m y 等培养基配方见第三章2 . 1 . 3 . 2 . 1 . 4 植酸酶活性测定溶液 玻璃珠破碎液、酶稀释液、底物溶液、终止液、显色液、磷酸盐标准溶液 见第三章 2 . 1 .4 . 不同p h 值的底物溶液: p h 2 . 0 , 2 . 5 : 1 0 m m o l / l 甘氨酸一 h c l , 2 m m o l / l c a c 1 2 , 2 m m o l / l植酸钠: p h 3 . 5 , 4 . 0 ，5 . 0 ，5 . 5 : 1 o m m o l / l n a a c - h a c , 2 m m o l / l c a c l 2 m m o l / l 植酸钠; p h 6 . 0 , 6 . 5 . 1 o m m o l / l 马来酸一 t r i s , 2 m m o l / l c a c 1 2 , 2 m m o l / l植酸钠; p h 7 . 0 , 7 . 5 , 8 . 0 , 9 . 0 : 1 0 m m o l / l t r i s - h c 1 , 2 m m o l / l c a c l 2 m m o l / l 植 酸钠; p h 1 0 , 1 1 ，1 2 , 1 3 : 1 o m m o l / l 甘氨酸一 n a o h , 2 m m o l / l c a c l , , 2 m m o l / l植 酸钠。 四川大学博士学位论文 2 . 1 . 5 植酸酶纯化缓冲液 透析缓冲液:2 m m o 1 / l c a c l , , 1 0 m m o l / l t r i s - h c 1 , p h 7 . 0 亲和树脂缓冲液: 1 x e x t r a c t / w a t c h b u f f e r : 5 0 m m o l / l t r i s - h c 1 , 3 0 0 m m o l / l n a c l , 2 m m o 1 / l c a c 1 2 , p h 7 . 0 含 5 m m o l / l咪哇的 i x w a s h b u f f e r : 5 0 m m o 1 / l t r i s - h c 1 , 3 0 0 m m o l / l n a c l ， 2 m m o l / l c a c i 2 , 5 m m o 1 / l 咪哇，p h 7 . 0 1 x e l u t i o n b u f f e r : 5 0 m m o l / l t r i s - h c 1 , 3 0 0 m m o 1 / l n a c l , 2 m m o 1 / l c a c 1 2 , 1 5 0 m m o 1 / l 咪哇，p h 7 . 0 2 . 1 . 5 主要仪器 d y y - 1 1 恒压恒流电泳仪 ( b i o - r a d ) , u v p 凝胶成像仪 ( b i o - r a d ) , m i n i 涡 旋振荡器等，恒温水浴锅 ( 士0 . 5 c) . 2 . 2方法 2 . 2 . 1 在大肠杆菌中非融合表达植酸酶产物的纯化 将用 i p t g诱导培养后大肠杆菌细胞，经超声波破碎，上清用 5 0 %饱和硫 酸钱沉淀杂蛋白， 取上清液将硫酸钱的饱和度调至8 5 %， 沉淀溶于酶稀释液中， 装入透析袋。 在透析缓冲液中透析至硫酸盐除尽， 经p g e 2 0 0 0 0 浓缩后， 一部分 酶液- 2 0 保存，用于酶学性质的测定。 另一部分酶液过s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶柱， 用透析缓冲液洗脱， 流速2 0 m 1 / h , 每管收集洗脱液2 m 1 ， 用核酸蛋白 检测仪2 8 0 n m 波长下检测，同时用记录仪记 录洗脱曲线， 收集植酸酶活性为峰值的1 -2 管洗脱液。 将该洗脱液用3 倍体积 预冻无水乙醇- 2 0 过夜沉淀，经预冻无水乙醇、丙酮各洗涤 1 次，室温干燥， 再溶于微量酶稀释缓冲液中，用于s d s - p a g e 电泳，检测分子量. . 2 . 2 在大肠杆菌中融合表达植酸酶产物的纯化 . 2 . 2 . 1 初步纯化 将用 工 p t g诱导培养后大肠杆菌细胞，经超声波破碎，上清用 5 0 %饱和硫 四川大学博士学位论文 酸按沉淀杂蛋白， 取上清液将硫酸钱的饱和度调至 8 5 %， 沉淀溶于酶稀释液中， 装入透析袋。 液一 2 0 保存， 在透析缓冲液中透析至硫酸盐除尽， 于 p g e 2 0 0 0 0 浓缩后， 部分酶 用于酶学性质的测定。 2 . 2 . 2 . 2 亲和层析纯化 1 ) 充分重悬树脂， 取一定体积树脂转入一个 1 0 -2 0 倍柱床体积达灭菌试管中。 2 ) 7 0 0 x g 离心2 m i n ，弃上清，加入1 0 倍柱床体积1 x e x t r a c t / w a s h b u f f e r , 混匀树脂，预平衡。 3 ) 7 0 0 x g 离心2 m i n ， 弃上清， 加入清亮的经超声波破碎的细胞裂解液上清， 轻轻搅动， 在室温下于水平振荡器上使组氨酸融合蛋白与树脂充分结合， 2 0 m i n o 4 ) 7 0 0 x g 离心5 m i n ，用移液器小心将上清尽量吸走，不能搅动树脂。 5 )加入 1 0 -2 0 倍柱床体积的1 x e x t r a c t / w a s h b u f f e r ，洗涤树脂，在室温下 于水平振荡器上搅动，充分清洗树脂。 6 ) 7 0 0 x g 离心5 m i n ， 弃上清。 7 )重复 5 - 6 步。 8 )加入 1 倍柱床体积 1 x e x t r a c t / w a s h b u f f e r ，涡旋重悬。 9 )将树脂转移到5 m 1 注射器 ( 底部放一层滤纸挡住出口，防止漏胶) ，封住下 端出口。 1 0 )松开下端出口，放掉缓冲液，使液面刚好降到树脂最顶部，确保树脂内不 含有空气。 1 1 )加入5 倍柱床体积的 1 x e x t r a c t / w a s h b u f f e r ,清洗一次。 1 2 )用含 5 m m o l / l 咪哇的 1 xw a s h b u f f e r ，洗脱一次。 1 3 )加入 5 倍柱床体积的 1 x e l u t i o n b u f f e r ，松开下端出口，每 0 . 5 m 1收集 一管。 1 4 ) s d s - p a g e ，活性测定。 2 . 2 . 3 在毕赤巴斯德酵母中胞内表达产物的初步纯化 将酵母细胞用蒸馏水洗涤2 次后， 用玻璃珠裂解液重悬， 二5 0 -1 0 0 。加入等体积经酸洗过的直径为0 . 5 m m的玻璃珠， 使之浓度达到mo o 涡旋混匀 3 0 s ，再 四川大学博士学位论文 冰浴3 0 s ，重复 1 0 次。4 0c 八2 0 0 0 r p m离心 1 0 m i n ，收集上清液。上清液经3 0 % 饱和度硫酸钱过夜沉淀，离心取上清，将硫酸钱饱和度调至 8 5 % 过夜沉淀，离 心取沉淀。沉淀溶解于酶稀释液，装入透析袋，在透析缓冲液中透析至硫酸盐 除尽，于p g e 2 0 0 0 0 浓缩后，部分酶液一 2 0 保存，用于酶学性质的测定。 另一部分酶液过 s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶柱， 用透析缓冲液洗脱， 流速2 0 m l / h , 每管收集洗脱液2 m l ，用核酸蛋白 检测仪 2 8 0 n m波长下检测，同时用记录仪记 录洗脱曲线， 收集植酸酶活性为峰值的1 -2 管洗脱液。 将该洗脱液用3 倍体积 预冻无水乙醇一 2 0 过夜沉淀，经预冻无水乙醇、丙酮各洗涤 1 次，室温干燥， 再溶于微量酶稀释液中，用于s d s - p a g e 电泳，检测分子量。 2 . 2 . 4 在毕赤巴斯德醉母中分泌表达产物的纯化 m y诱导培养液上清用 3倍体积预冻无水乙醇- 2 0 过夜沉淀，8 0 0 0 r p m 离心收集沉淀，分别用预冻无水乙醇、丙酮各洗涤 1 次，室温干燥，再溶于酶 稀释液中。粗酶液用9 5 %饱和硫酸钱4 沉淀过夜，收集上清，在透析缓冲液 中4 透析至硫酸盐除尽。 将酶液用聚乙二醇2 0 0 0 0 浓缩，再经无水乙醇沉淀， 溶于小体积酶稀释缓冲液中。 然后过s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶柱， 用透析缓冲液洗 脱， 流速2 0 m l / h ， 每管收集洗脱液2 m l ， 用核酸蛋白检测仪2 8 0 n m 波长下检测， 同时用记录仪记录洗脱曲线，收集具有植酸酶酶活性部分溶液。 洗脱液经聚乙 二醇2 0 0 0 0 浓缩， 同法第二次过s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶柱， 将有活性的洗脱液用 聚乙二醇2 0 0 0 0 浓缩， 用于s d s - p a g e 电泳， 检测分子量。 剩余酶液- 2 0 保存， 用于酶学性质测定。 2 . 2 . 5 表达产物的 s d s - p a g e 按照第二章2 . 2 . 4 的方法进行。 2 . 2 . 6 分泌表达植酸酶的去糖基化 将纯化的分泌表达植酸酶液用l o x 变性缓冲液沸水浴l o m i n ， 自 然冷却后， 加入 i o x g 5缓冲液和去糖基化酶 ( e n d o h f ) , 3 7 水浴孵育 3 h ，全部样品用 于s d s - p a g e电泳，以未去糖基化的酶液和e n d o h f 作对照。 四川大学博士学位论文 2 . 2 . 7 植酸酶最适反应温度的测定 将待测酶液作适当稀释后， 分别在2 3 0c , 2 6 0c, 3 7 0c , 4 5 0c , 5 0 0c , 5 5 0c, 6 0 0c , 6 5 0c, 7 0 0c, 8 0 0c , 9 0 0c 和沸水中与p h 7 . 0 的底物缓冲液反应 3 0 m i n 后 测定酶活。 2 . 2 . 8 植酸酶热稳定性的测定 将待测酶液作适当稀释后， 酶液分别置于3 7 0c , 7 5 0c , 8 5 0c , 9 5 和沸水 水浴 5 m i n 和 1 0 m i n ，自 然冷却至室温后，于3 7 与p h 7 . 0 的底物缓冲液在 3 7 反应3 0 m i n 后，测定酶活。 2 . 2 . 9 植酸酶最适反应p h 值的测定 酶活测定按照第二章2 . 2 . 3 的方法进行。 将待测酶液作适当稀释后，与不同p “值的底物缓冲液于 3 7 反应 3 0 m i n 后，测定酶活: p h 2 . 0 , p h 2 . 5 , p h 3 . 5 , p h 4 . 0 , p h 5 . 0 , p h 5 . 5 , p h 6 . 0 , p h 6 . 5 , p h 7 . 0 , p h 7 . 5 , p h 8 . 0 , p h 9 . 0 , p h 1 0 , p h 1 1 ，p h 1 2 , p h 1 3 ,共 1 6 个p h 值。 3结果 3 . 1 纯化产物的 s d s - p a g e 4株基因工程菌所产植酸酶的纯化后样品的 s d s - p a g e结果见图4 - 1 a , b , c 和 d 。通过凝胶成像系统分析， 测算出的4 个植酸酶样品的分子量分别为:( 1 ) p e t 3 0 n f p h y c非融合植酸酶4 0 . 7 k d ; ( 2 ) p e t 3 0 f p h y c融合植酸酶4 2 . 8 k d ; ( 3 ) p p 3 . s k c胞内表达的植酸酶4 2 . 2 k d o ( 4 ) 而p p 9 k c分泌表达的植酸酶则 得到5 3 . 5 k d 和5 0 . 9 k d 两个分子量很接近的蛋白 条带，远大于出发菌株芽抱杆 菌w h n b 0 2 所产天然植酸酶的表观分子量4 2 . 0 4 k d 。除p p 9 k c胞外分泌的植酸 酶外，其余3 个样品的分子量与第二章和第三章测算的分子量完全一致。第一 章中对本研究的芽抱杆菌植酸酶氨基酸序列分析表明，此序列中存在3 个潜在 糖基化位点，所以有可能是在酵母分泌表达过程中因糖基化造成分子量偏大， 而不同程度的糖基化则造成表达蛋白质分子量的差异。 四川大学博士学位论文 r.rl!l 内了rud遥仲3口补、.山0 氏众氏仓氏众氏 户之七叱。之拐乞国 : : ! 0 1 0 2 0“ 马 4 0 5 06 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 ( 亡 图4 - 4 c反应温度对p . p a s t a r is 胞内 表达植酸酶活性的影响 f i g . 4 - 4 c e f f e c t i o n o f re a c t i o n t e m p e r a t u r e o n i n t r a c e ll u l a r p h y t a s e e x p r e s s e d i n p . p a s t o r i s rllesesesfes 胜.liil.es gq陀了6匕43n-0 氏众认氏认以众认住 洲衬。v。一衬川工a已 t e m p e r a t u r e ( c) 图4 - 4 d反应温度对p . p a s t o r i s 分泌表达植酸酶活性的影响 f i g . 4 - 4 d e f f e c t i o o o f r e a c t i o n t e m p e r a t u r e o n s e r e c t o r y p h y t a s e e x p r e s s e d i n p . p a s t o r i s 3 . 4 表达产物热稳定性的测定 以3 7 热处理的植酸酶酶液活性作为对照，经各温度处理后的残留酶活， 见图4 - 5 a , b , c 和d 。由图可知: ( 1 ) p e t 3 0 n f p h y c非融合植酸酶经7 5 处理 后，酶活急剧下降，在9 0 水浴5 m i n 和1 0 m i n 后的残留酶活性仅为4 3 . 8 %和 3 5 . 5 %; ( 2 ) p e t 3 0 f p h y c融合植酸酶经7 5 水浴后， 酶活基本上没有损失， 四川大学博士学位论文 在 9 0 0c处理 5 m i n 和 1 0 m i n 后的残留酶活性高达9 4 . 9 %和7 5 . 7 %; ( 3 ) p p 3 . 5 k c 胞内植酸酶表达经 7 5 水浴后，酶活损失较小.经 9 0 水浴 5 m i n 和 1 0 m i n 后 的残留酶活分别为5 4 . 6 %和4 2 . 2 %; ( 4 ) 而p p 9 k c分泌植酸酶经 7 5 水浴后， 酶活基本上没有损失，在9 0 水浴5 m i n 和 1 0 m i n 后的残留酶活性高达8 8 . 0 % 和 7 8 . 2 5 /o 。而该基因天然植酸酶在9 0 水浴 1 0 m i n 后的残留酶活仅有2 6 % 。 可 见，与原植酸酶相比，4种表达植酸酶的热稳定性都有所提高，且以融合植酸 酶和 p p